WO2001035093A1

WO2001035093A1 - Methode de detection de la mort cellulaire, et reactif de detection

Info

Publication number: WO2001035093A1
Application number: PCT/JP2000/007838
Authority: WO
Inventors: Fumio Endo; Naoto Adachi; Hiroyuki Nunoi; Keisuke Watanabe
Original assignee: Eisai Co. Ltd.
Priority date: 1999-11-08
Filing date: 2000-11-08
Publication date: 2001-05-17
Also published as: EP1229328B1; DE60035286D1; JP3869722B2; DE60035286T2; US20060183176A1; EP1229328A4; ATE365327T1; US7070924B1; ES2288877T3; EP1229328A1

Description

明細書

細胞死の検出方法及び検出試薬技術分野

本発明は、細胞死の検出方法及び検出試薬に関する。背景技術

骨髄移植後に起きる多臓器を傷害する疾忠である移植片対宿主反応疾忠 (GVHD) や、血球が贪食細胞に食食される疾忠である血球食症候]洋 (hemophagocytic s yndrome； HPS) そのうち特にウィルス感染後に起こるウィルス i ]迚 ΐίιΐ球 ^症候群 (Virus assoc iated hemophagocytic syndrome ; VAHS) などは、臓器不全を生じ最後に死に到る重篤な病気である。現在これらの疾患の診断は、生検などによる細胞学診断が一般的であるが、検査における患者の苦痛、診断までの時問や操作法において欠点を持っている。

近年、 GVHD及び HPSの主な原因が、生体内の細胞のアポトーシスによることが明らかになり、アポ卜一シスを検出することにより GVHD及び HPSを^断することが可能ではないかと考えられるようになった。

アポトーシスを検出する方法として、従来から 1 )形態学的方法、 2 )紐織化的方法、 3 )生化学的方法、及び、 4 )免疫化学的方法が用いられている。

1 )形態学的方法：アポトーシスに特異的に生じる DNA断片化を染色法で検出するクロマチン凝縮判定法やアポトーシスに特有な形態的変化を電子顕微鏡観察や細胞サイズの測定により検出する方法が用いられている。

2 )組織化学的方法： MA断片の末端に、標識したヌクレオチドを結合させ、蛍光顕微鏡で検出する方法が用いられており、別法として、細胞内物質の量を個々の細胞について測定するフローサイトメトリ一法を用いることも行われている。

3 )生化学的方法：ァガロースゲル電気泳動により MAラダ一を検出する方法が用いられており、現在アポトーシスの最も確かな証明法とされているが、組織あるレ、は細胞群全体から MAを抽出するのでアポ卜一シス細胞の割合が多くないと感度及び定量性に問題があると言われている。 4)免疫化学的方法：ヒストン結合 DNA断片（モノヌクレオソ一ムあるいはオリゴヌクレオゾーム）を検出する固相酵素免疫検定法（ELISA) (セルデテクシヨン ELI SA: Boehringer Mannheim，国産化学) が開発されている。

しかしこれらの方法には、手技が複雑である、感度及び定量性が悪い等の問題点があり、 GVHD及び HPSを診断する方法としては実用化に到っていないのが現状である。発明の開示

本発明の課題は、生体内で起こっているアポト一シスを検出するための、簡便で感度及び定量性に優れた方法及び試薬を開発することにある。

チトクロム Cは、ミトコンドリアにおける電子伝達系の遠要な蛋白質として知られているが、細胞がアポト一シスの引き金となる刺激に曝され、アポトーシスの状態になると、ミトコンドリアにあったチトクロム Cが急速にサイトゾルへと放出されることが報告されている (Dinsdale, D. et al .， American J.Pathol . 155 :607-18, 1999) 。そしてサイトゾルのチトクロム Cは、アポトーシスのキ一ファクタ一であるカスパーゼ（caspase)- 3の活性化に関与し、チトクロム Cの增加が、アポト一シス進行と関係することが報告されている（Medina, V. et al . , Cancer Research 57 : 3697-707, 1999) 。

本発明者らは、生体内でアポト一シスが起これば、ミトコンドリアより放出されたチトクロム Cが、血中でも測定できるのではないかと考えた。そして、チトクロム Cを測定する EL I SAを確立し、血中のチトクロム Cの量力 VHD、 HPS, 急性リンパ性白血病及びインフルエンザ脳症の進行と強く相関することを見出して、本発明を完成するに到った。

すなわち本発明は、下記のような、体液中のチトクロム Cを定量することにより、生体内で起こっている細胞死を検出する方法、並びに、その方法に使用できるチトクロム Cの測定方法及びチトクロム C測定試薬を提供する。

( 1 )体液中のチトクロム Cを定量し、定量値に基づいて細胞死を検出することを含む、細胞死を検出する方法。

(2)チトクロム Cを免疫化学的方法により定量する、（1 )の細胞死を検出する方法。 (3)体液中のチトクロム Cをサンドィツチ法により定量することを含む、チトクロム Cを測定する方法。

(4)チトクロム Cに対する抗体を構成成分とする、体液中のチトクロム Cのサンドィツチ法による定量用のチトクロム C測定試薬。

(5)細胞死の検出用である、（4)のチトクロム C測定試薬。

(6)移植片対宿主反応疾患（GVHD) の診断用である、（4)のチトクロム C測定試薬。

(7)血球貪食症候群（HPS) の診断用である、（4)のチトクロム C測定試薬。

(8)急性リンパ性白血病の診断用である、（4)のチトクロム C測定試薬。

(9)ウィルス性脳炎 ·脳症の診断川である、（4)に記載のチトクロム C測定試薬。

(10)ウィルス性脳炎 ·脳症がインフルエンザ脳炎，脳症である、（10)に記載のチトクロム C測定試薬。図面の簡単な説明

図 1は、 HPS患者血清中の LDH、 AST, ALT, フェリチン及びチトクロム C (Cyto- C)の値の推移を示す。

図 2は、高熱、熱性けいれん及び脳炎 ·脳症を伴うインフルエンザ患者血清中のチトクロム C量を示す。

図 3は、インフルェンザ脳症を発症した患者血中の G0T、 LDH及びチトクロム C の値の推移を示す。

図 4は、高熱、熱性けいれん及び脳炎 ·脳症を伴うインフルエンザ患者血清中の各種サイトカイン量を示す。発明を実施するための最良の形態

以下に本発明の実施の形態について詳細に説明する。

アポト一シスシグナルを受けて、ミトコンドリアから細胞質に移行したチトクロム Cは、細胞死の結果、細胞膜が崩壊することにより細胞外へ放出されると考えられる。本発明は、細胞死により細胞外へ放出されたチトクロム Cが、体液中例えば血液中のチトクロム Cの定量によって検出可能であり、体液中のチトクロム Cを定量することによって生体内で起こっている細胞死を検出できることを見出したことに基づくものである。従って、体液中のチトクロム Cを定量することにより、細胞死を検出する方法であれば、本発明に含まれるものである。

ここで細胞死とは、主にアポトーシスを指すものであるが、一般的に生体内で起こっている細胞死がアポト一シスであることを特定することは容易ではなく、体液中のチトクロム Cの増加を伴う細胞死であれば、本発明における細胞死に含まれる。

また体液とは、生体より採取された血液、血漿、血清、脳脊髄液等を意味するものである。

チトクロム Cを測定する方法としては、免疫化学的方法、 ii気泳動による方法、クロマトグラフィーによる方法等が考えられる。電気泳動による方法としては、ポリァクリルアミドゲル電気泳動を行ってチトクロム Cをバンドとして検出する方法、キヤビラリ一電気泳動でピークとして検出する方法等がある。また、クロマトグラフィ一による方法としては、高速液体ク口マトグラフィ一でピークとして検出する方法等がある。場合によっては感度を上げるために、 ¾光標識することも許されるが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

チトクロム cを測定する方法としては、感度及び簡便性から免疫化学的方法が好ましい。ここで免疫化学的方法とは、チトクロム cに対する抗体を川いて、チトクロム cを定量する方法である。免疫化学的方法としては、チトクロム cを標識する競合法、抗体を標識するサンドイッチ法、抗体コートしたビーズの凝集を観察するラテックスビーズ法等、様々な方法があるが、チトクロム Cに対する抗体を用いた方法であれば、本発明の好ましい態様に含まれる。抗体はモノクロ一ナル抗体でも、ポリクローナル抗体でも良い。また標識する方法にも、放射性同位元素による標識、電気化学発光する化合物による標識、蛍光標識、酵素標識、ビ才チン標識等、様々な方法があるが、本発明はこれらの例に限られるものではない。

チトクロム Cを測定する免疫化学的方法の例として、以下にサンドィツチ法についてステップを追って説明する。

1 )チトクロム Cに対する抗体をビーズ又は力ヅプ上に固相化する。ビーズはマイクロビーズでもよく、その場合は磁性体のマイクロビーズが好ましい。固相化は、共有結合により結合させても非共有結合により結合させても構わない。通常、ビーズ又はカップ上の非特異的な結合部位をふさぐため、ゥシ血清アルブミン（BS A)、カゼイン等の蛋白質、又は、 Tween 20等の界面活性剤でブロッキング操作を行う。

2 )検体を、必要であれば BSA、カゼイン等の蛋白質、又は、 Tween 20等の界面活性剤を含むバッファーで希釈し、ビーズ又はカップに加える。また、既知の量のチトクロム Cも同様に希釈して加える。

3)ビーズ又はカップを、できれば Tween 20等の界面活性剤を含むバッファ一で洗浄後、できれば BSA、カゼイン等の蛋白質、又は、 Tween 20等の界面活性剤を含むバッファーで希釈された標識抗体を加える。

4)ビーズ又は力ップを、できれば Tween 20等の界面活性剤を含むバッファーで洗浄後、標識に応じた方法で測定する。例えば、放射性標識であれば放射活性を、酵素標識であれば酵素活性を測定する。また、ピオチン化標識であれば更に標識アビジンを加えて、標識に応じた方法で測定する。

5 )既知量のチトクロム Cから検量線を作成し、検体中に含まれるチトクロム C量を計算する。

以上のステップにより、検体中のチトクロム Cが定量される。

チトクロム Cの定量値が正常値よりも高い場合に、細胞死が検出されたとすることができる。

また本発明は、体液中のチトクロム Cをサンドィツチ法により定量することを含むチトクロム Cを測定する方法に関する。サンドイッチ法は、固定化抗体と標識抗体により抗原がサンドィツチされた状態を利用する、 EL I SAなどの免疫化学的方法である。

チトクロム Cを免疫化学的方法により測定する方法としては、ドットブロット法が多く用いられている (Souichi A. et . al . , J. Biological Chem. 273 : 1989 2-4, 1998) 。しかしながら、この方法はチトクロム Cの含有量が高く蛋白質濃度の低い細胞ホモジェネート中のチトクロム Cは測定できても、チトクロム Cの含有量が低く蛋白質濃度の高い体液中のチトクロム Cを高感度に定量するには不向きであった。本発明は、蛋白質濃度の高い体液中のチトクロム Cを高感度で定量するために、サンドイッチ法の ELI SAを適用し、生体内で起こった細胞死で放出される程度に微量の、体液中のチトクロム Cをも検出できることを見出したものである。

更に本発明は、チ卜クロム Cに対する抗体を構成成分とする、体液中のチトクロム Cをサンドイッチ法により定量するチトク口ム C測定試薬にも関する。測定試薬は、抗体として抗チトクロム C抗体を用いる以外は、通常のサンドイッチ法に用いられる試薬（キット）と同様の構成でよい。その一例としてサンドイッチ法によりチトクロム Cを測定する測定試薬は、例えば 1 )抗チトクロム C抗体コートカップ、抗チトクロム C抗体コートビーズなどの抗チトクロム C抗体コ一ト固相、 2 )標識抗チトクロム C抗体、 3 )既知濃度のチトクロム C標準溶液、 4)希釈液、 5 )洗浄液、を含有する試薬である。更に、酵素標識であれば、 6 )発色 ¾質、 7)反応停止液が含まれてもよい。

本発明で開示されるチトクロム Cの測定方法及び測定試薬により、細胞死の検出が可能になる。従って、アポト一シスを伴う様々な疾患の、鑑別や経過観察などの診断のための指標を提供することが可能となる。従って、細胞死の検出ゃァポトーシスを伴う疾患の診断を 0的とするチトクロム Cの測定方法及び測定試薬が提供される。

ここでアポトーシスを伴う疾患とは、例えば以下の例があげられる。

1 )生体防御を担う免疫系の細胞が発するシグナルにより、アポ卜一シスが' j |き起こされる疾患、例えば GVHD、自己免疫性疾患（全身性エリテマトーデス（SLE )、関節リウマチ（ )、強皮症、シェ一グレン症候群、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、潰瘍性大腸炎）。

2 )ウィルス感染による細胞死、あるいはウィルスに感染した細胞に対して免疫系細胞が反応してアポトーシスが引き起こされる疾患、例えばウィルス関連血球貪食症候群（VAHS) 、その他のウィルス感染（HCV、 HIV, インフルエンザウイルス），

3 )異常なアポト一シスシグナルによる細胞死が引き起こされる疾患、例えば神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病）。

4)白血病、例えば急性リンパ性白血病。

5 )人為的にアポト一シスが引き起こされる疾患、例えば放射線照射、薬剤（抗ガン剤など）投与などに対するもの。

6 )全身性炎症反応症候群（SIRS) ：生体に対する侵襲に反応して非特異的に免疫系が活性化し、サイトカイン産生が制御不能になり臓器陣害が発生する疾忠 (HP

S、重症滕炎） o

ウィルス感染により引き起こされる疾患で、重篤でかつ後遺症として残りやすいのは、脳炎 '脳症である。特にインフルエンザウイルスにより起こされる脳炎 •脳症は、ィンフルェンザによる死亡原因の大きな割合を占めるにもかかわらず、熱性けいれんとの鑑別が難しく、的確な治療を行うための的確な早期診断の方法が求められている。本発明の測定方法及び測定薬によれば的確な早期診断が可能になる。

体液中のチトクロム Cを測定することにより、生体内で進行している細胞死を測定することが可能となり、これら疾患の進行をモニターすることができる。特に GVHD、血球貪食症候群（HPS)、中でもウィルス関連血球貪食症候群（VAHS) 、急性リンパ性白血病、及びィンフルェンザ脳炎 ·脳症では、病状を把握するためにチトクロム Cを定量することは有用である。

発明者らによる更なる研究の結架、 HPS及びインフルエンザ脳症において、血中チ卜クロム Cの量が細胞死の指標とされる LDHと Aく W関することがかめられ、更にチトクロム C力 LDHに先行して堦加及び減少することが明らかにされた。

体液中のチトクロム Cは、生体内で起こっている細胞死の良い指標であり、病態を早く的確に知るための有用な指標となり得る。実施例

以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。％は、特記しない限り質量％である。

[実施例 1 ] チトクロム Cの ELI SAによる測定

チトクロム Cの測定法は、以下の手順で実施する。

1 )抗チトクロム C抗体の精製

ラットのチトクロム C (シグマ社）をゥサギに免疫し、チトクロム Cに対する抗血清を得る。その抗血清に最終濃度 2 Mになるように硫安を添加し、室温（20 〜30°C) で 5時間撹拌する。撹拌した溶液を 10000回転で 30分遠心し上清を捨て、沈殿物を 0.1 Mリン緩衝液 pH 7.2で溶解後、同一緩衝液に対して透析する。透析した溶液は、 CNBr- Sepharose 4B (フアルマシア社）にゥシのチトクロム Cを結合させて得た担体のカラムに流す。 0.15 M NaClを含む 0.01 Mトリス塩酸緩衝液 p H 7.5でカラムを洗浄後、 0.1 M塩酸グァニジンで抗チトクロム C抗体を溶出し、溶出液を、 0.15 M NaClを含む 0.01 M リス塩酸緩衝液 pH 7.5に対して透析し抗体（IgG)精製物とする。

2)抗チトクロム C抗体 F(ab' の調製

精製した IgGを 0.1 M酢酸緩衝液 pH 4.2に対して透析する。透析した IgG; 液にペプシン（シグマ社）を質量濃度比で 20:1の割合になるように加え、 37°Cで 16時間反応させる。反応後の溶液の pHを 1 N ^011で7.5に調整した後、 0.15 M NaClを含む 0.01 Mトリス塩酸緩衝液 pH 7.5で平衡化した86 11&(； 1 S-200 (フアルマシァ社）カラムでゲル濾過を行う。ゲル濾過したフラクションの! ¾一ピークを集め、濃縮し抗チトクロム C抗体 F(ab' )₂液とする。

3)西洋ヮサビペルォキシダ一ゼ（HRP)標識抗チトクロム C抗体 F(a ）₂抗体の作製 4 mg/mlに調整した HRP (東洋紡）溶液の 1 mlに 0.1 Mメタ過ヨウ素酸ナトリゥムを 60〃1加え、室温（20〜30°C) で 20分撹拌後、 0.001 M酢酸緩衝液 pH 4.4に対して透析する。透析後、 0.2 M炭酸ナトリウム液で ρΗ 9.0〜9·5に調整する。この溶液に 0.1 Μ炭酸緩衝液 pH 9.5に対して透析した抗チトクロム0抗体1^(&1₃' )；；溶液 (4 mg/ml)を 1 ml加え、室温（20〜30°C) で 2時間撹拌する。 4 mg/mlに調整した水素化ホウ素ナトリウム液を 50 1加え、 4°Cで 2時間撹拌後、 16時間静置保存する。この溶液を 0.15 M NaClを含むリン酸緩衝液 pH 7.2に対して透析後、 Sephac ryl S-200 (フアルマシア社）カラムでゲル濾過を行う。ゲル濾過したフラクシヨンの第一ピークを集め、 25% ゥサギ血清（日本生物材料）を含む 0.2 Mリン酸ニナトリウム緩衝液 pH 5.4で希釈し、 HRP標識抗チトクロム C抗体 F(ab' )₂液（標識抗体液）とする。

4)抗チトクロム C抗体固相化力ップの作製

1)で得られた IgG精製物を、 0.01 Mトリス塩酸緩衝液 pH 7.5で吸光度 0.1に調整する。この抗体溶液を、ポリスチレンカップに 100〃 1注入し 4°Cで 16時間反応させた後、 EIA法専用洗浄機によって 0. 15 M NaCl及び 0.01% Tween 20を含む 0.01 M トリス塩酸緩衝液 pH 7.5で 3回（各 4秒間）洗浄する。洗浄したカップに、 0.5%ゥシアルブミンを含む 0.01 Mトリス塩酸緩衝液 pH 7, 5を200 1加ぇ、再度 4°Cで 16 時間反応させ固相化カップとする。

5 )標準抗原の調製

ラヅトのチトクロム C (シグマ社）を、 1 BSA、 0.01 M EDTA 2Na、 0. 1% NaN₃、

0.01% Tween 20及び 0. 15 M NaClを含む 0.05 M リス緩衝液 pH 7.5で希釈し、 50 ng/ml〜0.05 ng/mlの希釈液を作製する。

6 )測定

抗チトクロム C抗体を固相化したカップ中のゥシアルブミン液を吸い取り、全カップに、 1 BSA、 0.01 M EDTA 2Na、 0. 1¾ NaN₃、 0.01% Tween 20及び 0. 15 M N aClを含む 0.05 Mトリス緩衝液 pH 7· 5を 50〃 1注入する。そのカップに標準抗原希釈液及び検体を 50〃 1加え、室温（20〜30°C ) で 1時問反応させる。反応後、 EIA 専用洗浄機を用い、 0.01% Tween 20、 0.0015 M NaCK 0.0015% パラォキシ安息香酸メチル及び 0.005 2 -クロロアセトアミドを含む 0.005 M リス緩衝液 pH 7. 5で 3回（各 4秒間）洗浄する。洗浄後、標識抗体液を 100 1加え室温（20〜30°C) で 1時間反応させる。反応後、 EIA専用洗浄機を用い 0.01% Tween 20、 0.15 M NaC

1、 0.0015% パラォキシ安息香酸メチル及び 0.005 2 -クロロアセトアミドを含む 0.005 M リス緩衝液 pH 7.5で 3回（各 4秒間）洗浄する。洗浄後、 1.5 mg/mlの ABTS (2，2-アジノ-ビス-（3-ェチルベンゾチアゾリン- 6-スルホン酸）を含む 0. 1 Mクェン酸緩衝液 pH 4.2を100〃1加ぇ室温（20〜30°C ) で 1時間反応させ、次いで 0.013% NaN₃液を 100 i l加え反応を停止する。発色した溶液の 405nmの吸光度を分光光度計で測定する。

7)標準抗原曲線の特性

各濃度のチトク口ム C及び検体の吸光度値からプランクの吸光度値を引く。横軸に標準抗原濃度、縦軸は標準抗原の吸光度をプロットし、標準曲線を描く。その標準抗原曲線を基に、検体中に含まれるチトクロム C量を計算する。 [実施例 2] GVHD, HPS及び急性リンパ性白血病患者血清中のチトクロム Cの定実施例 1に記載したチトクロム Cの EL I SA系を用いて、 GVHD、 HPS及び急性リンパ性白血病患者並びに健常人の血清中のチトクロム C量を測定した。

その結果、表 1に示すように、健常人 15人では全て陰性（く 0.05 ng/ml) であつたが、 GVHDでは 6例中 4例 (67%) 、 HPSでは 4例中 4例 (100%) 、急性リンパ性白血病では 2例中 2例（100%) が陽性であった。また HPSでは、血中チトク口ム C濃度の高い患者で、予後が悪い傾向が見られた。

アポトーシスが起こっていると考えられる患の血清中では、叨らかなチトクロム C定量値の高値が認められた。

表 1

GVHD, HPS及び急性リンパ性白血病患者血清中チトクロム Cの定量値疾患名血清中チトクロム Cの定量値（ ng/ml )

GVHD 1.1

く 0.05

0.4

0.3

く 0.05

0.3

HPS (VAHSを含む） 3.1

22.0

38.0

2.9 急性リンパ性白血病 0.4

0.4 健常人 ⁼ く 0.05

*:健常人 15人は全て検出限界以下（<0.05 ng/ml)であった, また図 1には HPS患者血清中の、 LDH、 AST, ALT, フェリチン及びチトクロム C の値の推移を示した。チトクロム Cは LDHの値とほぼ相関し、更に LDHに先行して推移して、病態の変化を鋭敏に捉える指標として有用であると考えられる。

[実施例 3 ] ィンフルェンザ脳炎 ·脳症患者血清中のチトクロム Cの定量実施例 1に記載した ELISA系を用いて、インフルエンザ患者のうち、高熱、熱性けいれん及び脳炎 ·脳症を伴った患者の血清中のチトクロム C量を測定した。図 2に、 1症例で複数回測定した場合も含めて結果を示す。脳炎 ·脳症を伴つた例では、全 27検体 (8例) が 5 ng/ml以上の高値を示し、その中でも 17検体が 30 ng/ml以上の高値を示していた。また、血中チトクロム Cの濃度が高い忠者で、予後が悪い傾向が見られた。

熱性けいれんを繰り返していた患者の中にやや高値を示す患がおり、これらの患者については、十分な注意が必要であろうと考えられた。高熱を伴う患者では、高値のチトクロム C定量値を示した患者がいなかった。

また図 3には、インフルエンザ脳症を発症した患者の、血中 G0T、 LDH及びチトクロム Cの値の推移を示す。チトクロム Cは LDHに先行して上昇及び下降し、チトクロム Cが脳症のインフルエンザ脳症の病態を反映する、先行指標として有川であることが示された。

[実施例 4 ] インフルエンザ脳炎 ·脳症患者血清中の各種サイトカイン濃度高熱、熱性けいれん及び脳炎 ·脳症を伴ったインフルエンザ患者の血清中の、 E -セレクチン（selectin)、可溶性卜ロンボモジュリン（soluble thrombomodul in )

(sTM) 、腫瘍壊死因子（TNF )、 Fas、 FasL及びチトクロム Cの濃度を定量した。 E -セレクチンは sE-セレクチン ELISAキット（version 2、 Bender med systems社製）、 sTMは TMテスト（Teij in Diagnostics社製）、 TNFはヒト TNF-ひサイトスクリーンィムノアッセィキット（Bioscurce International社製）、 Fasは sFas ELISAキット、 FasLは sFasリガンド ELISAキット (共に Medical and Biological Laboratori es社製）にて測定し、チトクロム Cは実施例 1に記載した ELISA系を用いて測定した。

図 4に示すように、どのサイトカインも脳炎 ·脳症患者血清中で高値を示す例が増加したが、チトクロム Cが脳炎 '脳症で最も顕著に増加し、脳炎 ·脳症の鑑別にはチトクロム Cが最も適していることが示された。産業上の利用の可能性

本発明により、体液中のチトクロム Cを定量するのに適した免疫化学的方法が提供される。また、チトクロム Cは生体内で起こっている細胞死の良い指標であり、病態を早く的確に知るための有用な指標であることが明らかにされ、従って、チトクロム Cの測定は、アポトーシスが病態の進行に関わる疾患、特に GVHD、 HP S、急性リンパ性白血病及びィンフルェンザ脳炎 ·脳症の、鑑別及び経過観察などの診断に有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 体液中のチトクロム cを定量し、定量値に基づいて細胞死を検出することを含む、細胞死を検出する方法。

2 . チトクロム Cを免疫化学的方法により定量する、請求項 1に記載の細胞死を検出する方法。

3 . 体液中のチトクロム Cをサンドイッチ法により定量することを含む、チトクロム Cを定量する方法。

4 . チトクロム Cに対する抗体を構成成分とする、体液中のチトクロム Cのサンドィツチ法による定量用のチトクロム C測定試薬。

5 . 細胞死の検出川である、請求項 4に記載のチトクロム C測定試薬。

6 . 移植片対宿主反応疾患の診断用である、求項 4に記載のチトクロム C測定試薬。

7 . 血球貪食症候群の診断用である、請求項 4に記載のチトクロム C測定試薬。

8 . 急性リンパ性白血病の診断用である、詰求項 4に記載のチトクロム C測定試薬。

9 . ウィルス性脳炎 ·脳症の診断用である、請求項 4に記載のチトクロム C測疋 Γ 薬。

1 0 . ウィルス性脳炎 ·脳症がインフルエンザ脳炎 ·脳症である、詰求頌 9に記載のチトクロム C測定試薬。