WO2001034838A1 - Methode de detection d'une variation ou d'un polymorphisme - Google Patents

Methode de detection d'une variation ou d'un polymorphisme Download PDF

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WO2001034838A1
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complementary strand
base sequence
complementary
region
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Hidetoshi Kanda
Tsugunori Notomi
Kentaro Nagamine
Toshihiro Yonekawa
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Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha
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    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a mutation or polymorphism in a nucleotide sequence.
  • Mutations in the gene region may cause missense mutations involving changes in translated amino acids, silent mutations involving no amino acid changes, and frameshift mutations in which the translation frame is shifted due to base deletion or insertion. There is. Missense mutations include nonsense mutations that cause a stop codon at the wrong position. Mutations in the gene region may lead to abnormal gene translation through abnormal splicing and the like. Mutations other than silent mutations often involve structural or functional changes in the protein.
  • abnormalities in the expression control region may affect the protein expression control mechanism.
  • mutations that occur at a frequency of 1% or more in a certain population among nucleic acid base sequence differences are particularly called polymorphisms.
  • Population means a population that is distinguished by geographical segregation or subspecies. For example, even if the mutation is less than 1% in Japanese, if it is found at a frequency of 1% or more in other races, it is not a mutation but a polymorphism.
  • polymorphisms due to single nucleotide insertion, deletion, or substitution are particularly called single nucleotide polymorphisms (hereinafter abbreviated as SNPs; single nucleotide polymorphisms).
  • SNPs are attracting attention because they are the most frequently occurring polymorphisms in the human genome. Since polymorphisms are spread to the population at a certain frequency, polymorphisms are not accompanied by any change in traits, or are not traits that are particularly disadvantageous for survival (reproduction), but rather traits that can be described as constitutional. It is thought that it is controlling.
  • the susceptibility to typical adult illnesses such as diabetes, rheumatism, allergy, autoimmune disease, obesity, or cancer
  • it may be determined by polymorphism. Conceivable.
  • polymorphisms such as drug metabolism ⁇ human leukocyte histocompatibility antigen (hereinafter abbreviated as HLA).
  • HLA human leukocyte histocompatibility antigen
  • polymorphisms are used to narrow down disease-related genes, such as microsatellite polymorphisms, by chromosome mapping and linkage analysis. Since SNPs exist at a ratio of 300 to 600 bases, a detailed map can be obtained, and it is expected to facilitate gene narrowing.
  • HCV hepatitis C virus
  • HCV HCV
  • the results of typing are important information in the selection of treatment methods, because there is a subtype difference in the therapeutic effect of HI-Yuichiferon.
  • influenza virus, malaria, and Helicobacter pylori are other pathogens that have been shown to have different therapeutic effects depending on the subtype.
  • typing also provides important information in determining treatment strategies. Mutations found in less than 1% of the polymorphisms are mutations that do not spread in the population in humans, and can be said to be mostly related to the disease. That is, mutations found in genetic diseases correspond. Also, among mutations found in individuals, there are mutations related to diseases, such as mutations found in cancer and the like. Detection of such mutations provides critical information in diagnosing the corresponding disease.
  • nucleotide sequence of a gene differs from the predicted nucleotide sequence can be confirmed by hybridization of a complementary nucleotide sequence. Specifically, hybridization of primers and probes is used.
  • a primer for PCR can act as a primer only when the target nucleotide sequence has a nucleotide sequence complementary to the primer. Based on this principle, it is possible to know whether or not the target base sequence is complementary to the primer, using the PCR amplification product as an index.
  • the primer sequence checking mechanism is incomplete. In the PCR method, a method of detecting a single base difference by an amplification reaction has been devised (allele-specific PCR ⁇ ucleic Acids Res 17: p25031989, Genomics 5: p535 1989, J. Lab. 114: pl05 1989). However, as reported by S.
  • the method of detecting slight base sequence differences based on the hybridization of complementary base sequences includes the possibility that errors may occur.
  • incorrectly generated synthetic products function as perfect type II, triggering exponential amplification.
  • the high degree of amplification based on the wrong reaction is a problem in discriminating a small number of base sequences.
  • the second problem with the PCR method is that, in principle, it can only set the Braimer to two regions. Therefore, when multiple genes having similar nucleotide sequences are present in the same sample, it is extremely difficult to confirm the mutation or polymorphism in each gene by using the presence or absence of an amplification product based on PCR as an index. is there. This is because, even if a mutation is present in one gene, the reaction proceeds if the primer hybridizes to the other gene.
  • a primer for detecting a mutation in one gene acts as a primer for another gene.
  • Figure 6 shows the similar nucleotide sequences found in the human CYP2C19 family.
  • a primer for detecting a mutation in one gene acts as a primer in the wild type of another gene. Under such conditions, it is difficult to simultaneously identify similar genes and detect mutations in only two regions.
  • the known nucleotide sequence confirmation method cannot accurately discriminate a small number of nucleotide sequences in one step, or it is difficult to simultaneously identify a similar gene and detect a mutation. There was a problem. In addition, even if it is possible to identify and detect mutations in technically similar genes such as PCR-dependent technology, it is difficult to maintain the accuracy or it is complicated due to the need for multiple steps. Operation was required. In addition, improvement in economics was also desired. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a novel reaction principle that can simultaneously achieve the identification of similar genes and the accurate detection of slight nucleotide sequence differences. More specifically, in the process of complementary strand synthesis, mutations and polymorphisms in the target base sequence are detected by using a nucleic acid synthesis method capable of repeatedly checking the base sequence in the target base sequence. It is an object of the present invention to provide a method which can be performed.
  • the inventors have paid attention to a problem of a known method of confirming a base sequence based on a nucleic acid amplification reaction in that most primers cannot hybridize to a target base sequence. That is, in the PCR method, the base sequence derived from the primer And used for complementary strand synthesis. Therefore, the mechanism for checking the target nucleotide sequence by hybridization of the primer works in effect only for a small part of the entire reaction. (Most of the reaction is performed only for the complementary strand obtained by simply copying the base sequence of the primer. It is hard to say that we are checking the target nucleotide sequence.
  • the present inventors can use a nucleic acid synthesis reaction that includes many steps of hybridizing to a base sequence derived from a target base sequence, instead of a primer, to accurately detect slight base sequence differences in the target base sequence. Thought it could be detected.
  • the present inventors have found that a more rigorous check mechanism for the target base sequence can be achieved by using the 3 ′ end having completed complementary strand synthesis as a starting point for the next complementary strand synthesis. Was completed.
  • a primer for nucleotide sequence discrimination is first obtained by complementary strand synthesis, and this primer is based on a method for synthesizing a nucleic acid that is a starting point of complementary strand synthesis with itself as a type II.
  • an advanced check mechanism can be realized.
  • the present inventors have already reported such a nucleic acid synthesis reaction (Nucleic Acid Res. 2000 Vol. 28 No. 12 e63, WO 00/28082).
  • the present invention has achieved the above object based on the method for synthesizing a nucleic acid. That is, the present invention relates to a method for detecting the following mutation and / or polymorphism, and a reagent kit therefor.
  • [1] Incubate the following elements under conditions that allow complementary strand synthesis starting from the second and first primers, and identify the amount of a complementary strand synthesis reaction product whose target base sequence is type II.
  • a method of detecting a mutation and / or polymorphism of a specific region in a target nucleotide sequence comprising a step of associating the mutation with a mutation and / or the presence of a polymorphism of the region of at least one of the second and first primers.
  • the base sequence located at the terminal end contains a base sequence complementary to the predicted base sequence of the specific region or its complementary strand, and the base sequence located at the 5 ′ end is synthesized as type III.
  • the complementary strand is annealed to a specific region or its complementary strand.
  • a second primer wherein the second primer can anneal at its 3 ′ end to a region defining the 3 ′ side of one of the strands constituting the target base sequence;
  • a nucleotide sequence complementary to the predicted nucleotide sequence constituting the region on the complementary strand synthesis reaction product starting from this primer is provided.
  • a first primer wherein the first primer can anneal to a region defining the 3 ′ side of the other strand constituting the target base sequence at its 3 ′ end; and On the fifth side of the first primer, a base sequence complementary to a predicted base sequence constituting a region on a complementary strand synthesis reaction product starting from this primer is provided.
  • Both the second primer and the first primer have a base sequence located at the 5 'end thereof, the base sequence complementary to the specific region or the predicted base sequence of the complementary strand thereof.
  • the complementary strand synthesized with the base sequence located at the 5 ′ end containing the sequence as a ⁇ -type is used as a starting point for complementary strand synthesis by annealing to a specific region or its complementary strand.
  • the third primer is the starting point of the complementary strand synthesis reaction starting from the 3rd side of the region to be annealed by the first primer in type I.
  • the fourth primer is the starting point of the complementary strand synthesis reaction starting from the 3' side of the region to be annealed by the second primer in type I,
  • the family one gene and / or the pseudogene is any gene selected from the group consisting of a cytochrome P450 family, a human leukocyte histocompatibility antigen, and a platelet alloantigen (5).
  • the target nucleotide sequence is selected from the nucleotide sequence of a gene of any pathogenic virus or pathogenic microorganism selected from the group consisting of hepatitis C virus, influenza virus, malaria, and Helicobacter pylori The method according to [1].
  • first loop primer is a region derived from the first primer in the extension product of the first primer, and the above-mentioned arbitrary region relative to the first primer; Can provide a starting point for complementary strand synthesis between
  • a second loop primer wherein the second loop primer is a region derived from the second primer in the extension product of the second primer, and Can provide a starting point for complementary strand synthesis between the regions.
  • the base sequence located at the 5, terminal of the first primer and / or the second primer is defined as a type III.
  • kits for detecting mutation and / or polymorphism in a specific region in a target nucleotide sequence comprising the following elements, wherein the kit is located at at least one 5 'end of the second and first primers:
  • the base sequence complementary to the specific region or the predicted base sequence of the complementary strand thereof, and the complementary sequence synthesized with the base sequence disposed at the 5 ′ end as a type III is When a specific region or its complementary strand is annealed and becomes a starting point for complementary strand synthesis, the complementary strand synthesis is inhibited if the nucleotide sequence constituting the specific region is not as expected.
  • a kit comprising:
  • a second primer wherein the second primer is at its 3, terminal It is possible to anneal to a region that defines the 3 'side of one of the strands constituting the target base sequence, and to generate a complementary strand synthesis reaction starting from this primer on the fifth side of the second primer.
  • a first primer wherein the first primer can anneal at its 3, terminal to a region defining the 3 ′ side of the other strand constituting the target base sequence, and On the fifth side of the first primer, a nucleotide sequence complementary to the predicted nucleotide sequence constituting the region on the complementary strand synthesis reaction product starting from this primer is provided.
  • the fifth primer capable of amplifying an internal standard; here, the fifth primer defines the 3 'end of one strand constituting the target base sequence of the internal standard at its 3' end
  • the base can be annealed to the region, and a base complementary to a base sequence constituting an arbitrary region of a complementary strand synthesis reaction product starting from this primer is provided on the 5 ′ side of the fifth primer.
  • a sixth primer capable of amplifying an internal standard; wherein the sixth primer is located at the 3 'end of a region defining the 3' side of one strand constituting the target base sequence of the internal standard. Can be annihilated and the sixth bra The 5 'side of the primer has a base sequence complementary to the base sequence constituting the region of the complementary strand synthesis reaction product starting from the primer.
  • a method for detecting a mutation and / or polymorphism in a specific region of a target base sequence comprising the following steps, wherein the base sequence arranged at the 5 ′ end of at least one of the second and first primers Contains a nucleotide sequence complementary to the predicted nucleotide sequence of the specific region or the complementary strand thereof, and the complementary strand synthesized with the base sequence located at the 5 ′ end as type III has a specific structure.
  • the base sequence constituting a specific region is not as expected, complementary strand synthesis is inhibited.
  • step b) In the extension product of the first primer synthesized in step a), the region to be annealed by the second primer is allowed to undergo base pairing, and both are annealed to extend the first primer.
  • step c) Annealed the 3 ′ end of the complementary strand synthesized in step c) and the predicted base sequence for the second primer in the extension product to perform complementary strand synthesis to make itself a ⁇ -type Process
  • Step b) is performed by replacing the third primer in the type III in the type III with the third strand starting from the third side of the region to be annealed by the complementary strand synthesis reaction.
  • the method according to [20] comprising a step of converting the extension product of the first primer into a single strand.
  • step c) the extension product of the second primer is replaced by the complementary strand synthesis reaction of the fourth primer starting from the third side of the region to be annealed by the second primer in type I.
  • step c) The method according to [20], comprising a step of forming a single strand.
  • extension product from its own 3 'end is displaced by a complementary strand synthesis reaction starting from the primer which anneals to the loop-forming region, and the 3' end and the predicted nucleotide sequence are again base-paired. A state in which is possible,
  • step 7 After step 7), and / or in parallel with step 7), the production of single-stranded nucleic acid in which the target base sequence and its complementary strand are repeatedly linked is observed, and the amount of the production is mutated and / or Process to associate with polymorphism 4]
  • step 4) The 3 ′ end of the single-stranded nucleic acid generated in step 4) is annealed to the predicted base sequence for the second primer, and the base sequence complementary to the 3 ′ end of the second primer
  • a second primer can be annealed to the loop-forming region formed by annealing the 3 'end with the specific region of itself to catalyze complementary strand synthesis involving strand displacement.
  • a complementary strand synthesis reaction starting from a primer that anneals to the loop-forming region replaces the extension product from its own 3 'end, and re-base pairs the 3' end with the predicted base sequence. The step of bringing into a state where binding is possible,
  • step 12 Perform a complementary chain synthesis reaction in which the 3 ′ end at which base pairing is enabled by step 1 1) is annealed to the predicted nucleotide sequence as a starting point for complementary strand synthesis, and is itself a ⁇ -type. Generating a single-stranded nucleic acid by displacing the complementary strand synthesized from the loop-forming region as a starting point,
  • step 15) After step 15) and / or in parallel with step 15) Observing the generation of single-stranded nucleic acid in which a sequence and its complementary strand are repeatedly linked, and associating the amount of production with mutation and / or polymorphism
  • step 12) The 3 ′ end of the single-stranded nucleic acid generated in step 12) is annealed to its own predicted base sequence to contain a complementary base sequence to the 3 ′ end of the first primer A step of forming a loop-forming region capable of base pairing, performing a complementary strand synthesis reaction using the 3 ′ end of itself as a starting point for complementary strand synthesis, and making itself a ⁇ -type;
  • the nucleotide sequence arranged at the 5 'end thereof is a nucleotide complementary to the specific region or a nucleotide sequence predicted to be a complementary strand thereof.
  • the complementary strand synthesized with the base sequence located at the 5 ′ end containing the sequence as a ⁇ -type is used as a starting point for complementary strand synthesis by annealing to a specific region or its complementary strand.
  • the method according to [20] wherein complementary strand synthesis is inhibited when the nucleotide sequence constituting the specific region is not the one expected.
  • mutations refers to a difference in nucleic acid base sequence between organisms (including viruses) having the same origin.
  • mutations include differences between organs and cells within an individual. Mutations result from point mutations, deletions, insertions, duplications, inversions, and translocations. Mutations can occur in gene regions (coding regions and intron sequences of proteins) or in expression regulatory regions such as promoters and promoters. Alternatively, mutations may include base sequence differences found on other genomic sequences.
  • Polymorphism Among the above mutations, those that occur at a frequency of 1% or more in a certain population are particularly called polymorphisms. Among the polymorphisms, polymorphisms consisting of single nucleotide substitution, insertion, or deletion are called single nucleotide polymorphisms (SNPs).
  • the target nucleotide sequence is a nucleotide sequence containing a mutation or polymorphism to be detected, and means a nucleotide sequence constituting a region defined on the 3 ′ side by a primer.
  • a primer means a nucleotide sequence constituting a region defined on the 3 ′ side by a primer.
  • each of them when simply expressed on the 5 ′ side or the 3 ′ side, each of them means the direction in the chain of the ⁇ type.
  • the base sequence present between the regions where the primers of the present invention anneal constitutes the target base sequence of the present invention.
  • the base sequence of a nucleic acid describes the base sequence of the sense strand from the 5 'side to the 3' side.
  • the target base sequence in the present invention includes, in addition to the base sequence of the sense strand, the complementary strand thereof, that is, the base sequence of the antisense strand. That is, the term “target base sequence” is used as a term meaning at least one of a base sequence to be synthesized and a complementary strand thereof.
  • the target base sequence contains a specific region described later.
  • a region that is included in the target nucleotide sequence and has a mutation or polymorphism to be detected is a specific region.
  • a complementary strand in which a base sequence complementary to a base sequence predicted for a specific region is added to the 5 ′ side is synthesized.
  • a base sequence complementary to a specific region must be added so as to constitute the 5 'end of the complementary strand to be synthesized.
  • the predicted nucleotide sequence can be a wild-type nucleotide sequence or a nucleotide sequence containing a specific mutation can be used as the predicted nucleotide sequence.
  • a wild-type nucleotide sequence is used as the predicted nucleotide sequence, the presence or absence of the wild-type nucleotide sequence in the target nucleotide sequence is found, and a specific mutation or polymorphism in the predicted nucleotide sequence is determined.
  • the use of the nucleotide sequence enables detection of the presence or absence of a specific mutation or polymorphic nucleotide sequence in the target nucleotide sequence.
  • 3 'end or 5' end means not only one terminal base but also one terminal base and a region located at the terminal . More specifically, 500 bases, desirably 100 bases, or at least 20 bases from either end are contained at the 3 ′ end or 5 ′ end. On the other hand, in order to indicate one base at the end or a base at a specific position near the end, the position shall be indicated by specifying a numerical value.
  • Type I and complementary strand means a nucleic acid on the type III side of complementary strand synthesis.
  • a complementary strand having a base sequence complementary to type III has a meaning as a strand corresponding to type III, but the relationship between the two is merely relative. That is, a chain synthesized as a complementary chain can again function as a ⁇ type. In other words, the complementary strand can be ⁇ -shaped.
  • Synthesis and amplification of nucleic acid means extension of a nucleic acid from an oligonucleotide used as a synthesis starting point.
  • a series of reactions is collectively called amplification.
  • anil means that nucleic acids form a double helix structure by base-pairing based on the Watson-Crick model. Therefore, even if the nucleic acid strand constituting the base pair bond is a single strand, the nucleic acid strand is an anilase or hybrid if the complementary base sequence in the molecule forms a base pair bond.
  • anneal and “hybridization” are synonymous in that a nucleic acid forms a double helix structure by base pairing.
  • the 3 'end bonded to the base group is the starting point of the complementary strand synthesis, it may be particularly referred to as anneal. However, this does not deny that hybridization is the starting point of complementary strand synthesis.
  • a complementary sequence synthesized using a certain sequence as type II anneals to the target base sequence to provide a starting point for complementary strand synthesis
  • this certain sequence is Are substantially identical to the base sequence of
  • the terms identical or complementary include the case where they are not completely identical or the case where they are not completely complementary. That is, the same as a certain sequence may include a sequence complementary to a base sequence capable of annealing to a certain sequence.
  • the term "complementary" means a sequence that can be annealed under stringent conditions and that can provide a 3 'end that serves as a starting point for complementary strand synthesis.
  • a base sequence having 50 to 100%, usually 70 to 100%, and preferably 80 to 100% identity to a certain base sequence is: It can be said that they are substantially the same. The identity can be determined based on a known algorithm such as BLAST.
  • the method for detecting a mutation or polymorphism according to the present invention implements a mechanism for checking a base sequence of a specific region in a target base sequence based on the following principle.
  • the following second primer and first primer are used.
  • Each of the second primer and the first primer used in the present invention has a base sequence at its 3 ′ end that can anneal to the base sequence on the 3 ′ side of the target base sequence; and At the 'end, a nucleotide sequence complementary to an arbitrary region in the extension product starting from the 3' end is arranged.
  • the base sequence arranged at the 5 ′ end of at least one of the second and first primers contains a base sequence complementary to the above-mentioned specific region or a predicted base sequence of its complementary strand.
  • the complementary strand synthesized with the base sequence located at the 5 'end of the primer as a ⁇ type forms a specific region, or a specific region when it anneals to its complement and becomes the starting point for complementary strand synthesis. If the base sequence to be synthesized is not the one expected, the base sequence is picked up by utilizing the fact that complementary strand synthesis is inhibited. Does the check mechanism always work when the 3 'end anneals to a specific region (or its complementary strand) and becomes the starting point for complementary strand synthesis? Thus, a difference in the nucleotide sequence of a specific region can be clearly detected as a difference in the amount of a reaction product.
  • the present invention provides a method for detecting a mutation and / or polymorphism in a specific region of a target nucleotide sequence, comprising the following steps, wherein the method comprises placing at least one of the second and first primers at the 5 ′ end.
  • the base sequence thus obtained contains a base sequence complementary to the predicted base sequence of the specific region or its complementary strand, and the base sequence arranged at the 5 ′ end is synthesized as a ⁇ type complementary strand.
  • the complementary chain synthesis is initiated when the specific region or its complementary strand is annealed and becomes the starting point for complementary chain synthesis.
  • the first primer is one of the three ends thereof, one of the strands constituting the target base sequence.
  • step b) The region where the second primer in the extension product of the first primer synthesized in step a) should be annealed is in a state where base pairing is possible, and both are annealed to elongate the extension product of the first primer.
  • a base sequence complementary to a predicted base sequence constituting a region on a complementary strand synthesis reaction product starting from this primer is provided.
  • step d) a step of annealing the 3′-end of the complementary strand synthesized in step c) and the predicted base sequence for the second primer in the extension product to synthesize a complementary strand to make itself a ⁇ -type;
  • the 3 ′ end of the extension product of the first and / or first primer anneals to a specific region of the product and serves as a starting point for synthesis of a complementary strand having the ⁇ shape.
  • the base sequence constituting the specific region is a predicted base sequence
  • complementary strand synthesis proceeds from the 3 ′ end as a starting point.
  • the nucleotide sequence is different from the predicted nucleotide sequence, the 3 ′ end cannot be used as a starting point for complementary strand synthesis, and complementary strand synthesis is inhibited.
  • nucleotide sequence in a specific region is predicted by using, as an index, a synthesis product of a complementary strand having the 3 ′ end as a primer and having itself as a ⁇ type.
  • the complementary strand synthesized at this time reaches its own 5 'end and is completed.
  • a base sequence complementary to an arbitrary region in the extension product is added to the 5 ′ end of type III. Therefore, in the complementary strand synthesized using this as a type III, a base sequence capable of annealing to an arbitrary region is reproduced at the 3 'end. After that, if the 3, terminal and any region to be annealed are in a state capable of base pairing by some means, the synthesis of a complementary strand with itself as a type II is started again.
  • At least one of the second primer and the first primer has a specific region (or its complement) in the extension product generated from the 3 ′ end of the primer. ) Is located at its 5 'end.
  • a specific region or The second primer or the first primer, in which a complementary nucleotide sequence is arranged on the complementary strand of the second primer or the first primer, may be particularly described as a check primer.
  • the above reaction for actually detecting a mutation and / or polymorphism based on the principle of the present invention is actually performed by incubating the following elements under appropriate conditions. It progresses with just one drop. That is, the present invention provides a method for incubating the following elements under conditions that allow complementary strand synthesis starting from the second and first primers, and the amount of a complementary strand synthesis reaction product having a target base sequence of type ⁇ : And a step of associating the presence of a mutation and / or polymorphism in a specific region with a check primer for at least one of the second and first primers. It is a method characterized by the following.
  • a second primer wherein the second primer can anneal at its 3 ′ end to a region defining the 3 ′ side of one of the strands constituting the target base sequence, and On the 5 'side of the primer 2 is a nucleotide sequence complementary to the predicted nucleotide sequence constituting the region on the complementary strand synthesis reaction product starting from this primer.
  • a first primer wherein the first primer can anneal at its 3 ′ end to a region that defines the 3 ′ side of the other strand constituting the target base sequence, and On the fifth side of the first primer, a base sequence complementary to a predicted base sequence constituting a region on a complementary strand synthesis reaction product starting from this primer is provided.
  • the method of amplifying nucleic acid based on the second primer and the first primer includes the LAMP method (Nucleic Acid Res. 2000 Vol.28 No.12 e63, W0000 / 28082) already reported by the present inventors. No. However, a novel base sequence can be expected to be used when at least one of the primers constituting the LAMP method is used as a check primer in a mutation or polymorphism detection method. It is an important finding.
  • the first primer constituting the above reaction is composed of the following regions.
  • X 2 a region having a base sequence complementary to X 2 c that defines the 3 ′ side of the target base sequence
  • X 1 c located on the 5 ′ side of the X 2 c and on the extension product of the first primer It has a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence predicted for the region X1 existing in the DNA.
  • XI is the sequence of an arbitrary region between the 3, terminal of the extension product of the first primer and the sequence containing the specific base sequence.
  • XIc can also be expressed as a region having a nucleotide sequence substantially the same as the nucleotide sequence predicted for the arbitrary region X1c.
  • the FA is composed of F2 corresponding to X2 and Flc corresponding to XIc.
  • Flc constituting FA contains a base sequence substantially identical to Flc.
  • the region to be synthesized can anneal a polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to that region, and so long as the complementary strand synthesized from the polynucleotide as a synthesis starting point has the functions required for the present invention.
  • the second primer RA in the present invention a primer composed of R2 corresponding to X2 and R1c corresponding to X1c can be selected. it can.
  • the nucleotide sequence predicted as the specific region R 1c where the mutation and / or polymorphism to be detected in the extension product of R lc ⁇ i FA is present R 2 comprises a base sequence complementary to the base sequence R 2c constituting an arbitrary region in the FA extension product.
  • the FA may be a check primer.
  • the extension product of the FA is always in a state where the 3 'end is capable of base pairing, and the complementary strand synthesis with itself as a ⁇ type Repeat the reaction.
  • the extension product of RA is continuously produced in a single-stranded state.
  • the extension product of R A itself repeats the complementary strand synthesis reaction to make itself ⁇ -shaped by its 3 ′ end similarly to F A.
  • the mechanism for checking the nucleotide sequence in a specific region by the complementary strand synthesis provided by FA actually proceeds on the same principle as the mechanism for checking the nucleotide sequence by RA described above. In other words, the same principle is applied to the complementary strand of a specific region.
  • FIGS. 1 to 4 F1 and R1c (or R1 and F1c) are shown separately. These figures show the reaction when only one of FA and RA is used as a check primer.
  • RA (or FA) does not assume a specific primer that anneals to any strand of the target base sequence. , You can also say. In other words, it is simply described as RA for the one that has been annealed earlier for convenience. Based on such facts, it is easy to understand the significance of RA as a check primer in addition to FA. In other words, a check mechanism similar to the check mechanism using the complementary strand of FA described above also works on the complementary strand, and as a result, more check mechanisms work as a result in the reaction system as a whole. Therefore, using both FA and RA as check primers is one of the desirable embodiments of the present invention.
  • the check mechanism according to the present invention will be further described.
  • the extension product from the annealed primer has its 3 and 3 ends terminated in a specific region. And will eventually anneal to the base sequence derived from the primer. If the 3 'end anneals to a primer-derived base sequence instead of a specific region, the check mechanism will not work.
  • the check mechanism operates many times before a product is created in which such a check mechanism does not work.
  • the rate at which the reaction proceeds despite the fact that the specific region is not the predicted nucleotide sequence is A
  • n is the number of times the check mechanism operates before a product that does not work the check mechanism is formed.
  • the ratio X that can product does not work checking mechanism in the present invention is represented by A n.
  • the danger can be reduced to about 1/500, compared to the case where the check mechanism can only operate once.
  • the present invention significantly reduces the likelihood of producing a product for which the check mechanism does not work, as compared to a reaction in which only one check mechanism works.
  • the target base sequence constitutes a part or all of a detection target or a nucleic acid derived from the detection target.
  • the target base sequence may be double-stranded or single-stranded. In the case of a double strand, the 3 ′ end of each strand that defines the target nucleotide sequence, and at least a part of the specific region located in the target nucleotide sequence are known, Or it is in a state where it can be guessed.
  • the base sequence defining the 3 'side, the base sequence on the 3' side of the assumed complementary strand, and a specific region located in the target base sequence Is in a state where at least a part of its nucleotide sequence is known or can be inferred.
  • the part whose nucleotide sequence is to be clarified is the aforementioned 3 ′ terminal X 2 c and a specific region X 1 c located on the 5 ′ side thereof.
  • Certain regions of the invention include those predicted to be mutated and Z or polymorphic.
  • the check primer in the present invention must be designed so that the complementary strand synthesis reaction is inhibited when the base predicted to have a mutation and / or polymorphism in a specific region is not the predicted base. No.
  • the check primer of the present invention is designed, for example, as follows.
  • the complementary strand is synthesized using the check primer as The vicinity of the 3 'end is designed so as to correspond to a position complementary to a base where a mutation or polymorphism is expected. If there is a mismatch at or near the 3 'end, which is the starting point of the complementary strand synthesis, the complementary strand synthesis reaction of the nucleic acid is significantly inhibited. More specifically, there is a mismatch at the 3 'end to 10 bases, particularly preferably the 2nd to 4th base, more preferably the 2nd to 3rd base counted from the 3' end, which is the starting point of complementary strand synthesis.
  • phase complement synthesis is significantly inhibited. Therefore, it is desirable to design the nucleotide sequence on the 5 ′ side of the check primer so that a mismatch occurs in this portion depending on the presence (or absence) of the mutation or polymorphism to be detected in the present invention.
  • the terminal structure of the product at the beginning of the reaction does not lead to a high amplification reaction unless the reaction is repeated. Therefore, even if erroneous synthesis is performed, the synthesis of the complementary strand constituting the amplification reaction is hindered at any stage, so that high-level amplification does not occur in the presence of the mismatch. As a result, the mismatch effectively suppresses the amplification response and ultimately gives accurate results. That is, it can be said that the nucleic acid amplification reaction according to the present invention has a more complete base sequence checking mechanism.
  • the region X1c characterizing the primer used in the present invention becomes a synthesis starting point only after the complementary sequence is synthesized, and this complementary sequence anneals to the newly synthesized sequence X1 in the same chain.
  • a synthesis reaction with self-type ⁇ proceeds.
  • the primer used in the present invention does not form a loop, even if a so-called primer dimer, which is often an important problem in the prior art, is generated. Therefore, non-specific amplification due to the primer dimer cannot occur in principle, and contributes to the improvement of the specificity of the reaction.
  • These two regions X2c and X1c (X2 and XI in the nucleic acid to be the target base sequence) can be assumed to be continuous or separated. Due to the relative positional relationship between the two, the product nucleic acid is self-annealed. Then, the state of the loop formed is determined. Also, in order for the product nucleic acid to preferentially perform self-annealing rather than intermolecular annealing, it is desirable that the distance between the two is not unnecessarily large. Therefore, it is generally desirable that the positional relationship between the two be continuous over a distance of 0 to 500 bases.
  • the distance between the region X2c and the region X1c located on the 5 'side thereof is designed to be 0 to 100 bases, more preferably 10 to 70 bases. This value indicates the length not including X 1 c and X 2.
  • the number of bases constituting the loop portion is a length obtained by adding a region corresponding to X2.
  • the regions X2 and XIc constituting the primer used in the present invention with respect to the nucleic acid having the above specific base sequence are usually arranged continuously without overlapping. Alternatively, if both base sequences have a common part, they can be partially overlapped. Since X2 must function as a primer, it must always be at the 3 'end. On the other hand, XIc is placed at the 5 ′ end, as described later, since it is necessary to give the 3 ′ end of the complementary strand synthesized as type III a function as a primer.
  • the complementary strand obtained by using this primer as a starting point of synthesis becomes a ⁇ type of complementary strand synthesis from the opposite direction, and finally a part of the primer is copied to the complementary strand as a ⁇ type.
  • the 3 'end resulting from the transcription has the base sequence X1, anneals to X1c on the same strand, and forms a loop.
  • XIc anneals to a specific region.
  • the primer used in the present invention means an oligonucleotide that satisfies the following two conditions: it can form a complementary base pair bond, and it has a ⁇ 0H group at its 3 ′ end, which is a starting point for complementary strand synthesis. . Therefore, its backbone is not necessarily limited to phosphodiester bonds. For example, it may be a phosphochoate body having S as a backbone instead of 0. Further, the base may be any as long as it enables complementary base pairing. In the natural state, there are generally five types, ACTG and U, but it can also be an analog such as, for example, bromodeoxyuridine. It is desirable that the oligonucleotide used in the present invention not only functions as a starting point of synthesis but also functions as a type II of complementary strand synthesis.
  • the primer used in the present invention is a strand that is capable of undergoing base pairing with a complementary strand while maintaining the required specificity in a given environment in various nucleic acid synthesis reactions described below.
  • the chain length exemplified here is the chain length of the portion that anneals to the complementary strand.
  • the oligonucleotide according to the present invention can ultimately be individually anneal to at least two regions. Therefore, the chain length exemplified here should be understood as the chain length of each region constituting the primer.
  • the primer used in the present invention can be labeled with a known labeling substance.
  • the labeling substance include binding ligands such as digoxin and biotin, enzymes, fluorescent substances and luminescent substances, and radioisotopes.
  • binding ligands such as digoxin and biotin
  • enzymes such as digoxin and biotin
  • fluorescent substances such as luminescent substances
  • radioisotopes such as radioisotopes.
  • Ah a technique of substituting a base constituting an oligonucleotide with a fluorescent analog (W095 / 05391, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6644-6648, 1994) is also known.
  • the primers used in the present invention may be themselves bound to a solid phase.
  • any part of the primer may be labeled with a binding ligand such as biotin, and then indirectly immobilized with a binding partner such as immobilized avidin.
  • the solid-phased primer is used as the synthesis starting point, the nucleic acid synthesis reaction product is captured on the solid phase, which facilitates separation. Detection can also be performed by hybridizing the separated product with a nucleic acid-specific indicator or a labeled probe. Alternatively, the target nucleic acid fragment can be recovered by digestion with an arbitrary restriction enzyme.c
  • the primer used in the present invention can contain not only the above two regions but also additional regions. .
  • X2 and X1c are located at the 3 ′ end and 5 ′ end, respectively, it is possible to interpose an arbitrary sequence between the two. It can be, for example, a restriction enzyme recognition sequence, a promoter recognized by RNA polymerase, or MA encoding a ribozyme.
  • a restriction enzyme recognition sequence By using a restriction enzyme recognition sequence, a nucleic acid having a complementary nucleotide sequence alternately linked on a single strand, which is a synthetic product of the present invention, is cut into double-stranded nucleic acids having the same length. Will be able to If a promoter sequence recognized by RNA polymerase is provided, the synthetic product of the present invention will be further transcribed into RNA with the type II as the type II.
  • a complementary strand synthesis reaction is performed using the first primer having the same nucleotide sequence as an arbitrary region in the target nucleotide sequence on the 5 ′ side, with the target nucleotide sequence being ⁇ .
  • this extension product as a type II
  • complementary strand synthesis is further performed using a second primer.
  • the region to be annealed is brought into a state capable of base pairing.
  • This step can be carried out by substitution involved in a complementary strand synthesis reaction starting from a third primer which anneals to the third side of the target nucleotide sequence with respect to the region where the first primer anneals.
  • the third primer anneals to the third side of the first primer, and serves as a starting point for a complementary strand synthesis reaction that proceeds toward the region where the first primer anneals.
  • This step is performed by a DNA polymerase that can catalyze complementary strand synthesis with strand displacement.
  • the extension product of the first primer can be made into a single strand by a method such as heat denaturation.
  • the extension product of the second primer initiates a complementary strand synthesis reaction in which the third end of the second primer is used as a primer and its own is ⁇ .
  • the 5'-end of the first primer used as the type II complementary strand synthesis based on the second primer has a complementary nucleotide sequence to the predicted nucleotide sequence of any region in the extension product of the first primer.
  • the base sequence has been added. Therefore, the 3 ′ end of the extension product of the second primer that generates it as a ⁇ -form has a nucleotide sequence substantially identical to the arbitrary region.
  • the extension product of the second primer and the region to be annealed capable of base pairing.
  • This step is usually performed by converting the extension product into a single strand.
  • the extension is performed on the 3 side from the region where the second primer is annealed, and the extension is performed by a displacement accompanying a complementary strand synthesis reaction starting from the fourth primer. .
  • a primer for substitution reaction such as the third primer or the fourth primer used herein, is referred to as an outer primer.
  • the second primer has a base sequence complementary to a base sequence predicted for a specific region at the 5 'end. That is, the second primer is a check primer.
  • This nucleotide sequence is the nucleotide sequence introduced by the primer. Therefore, the 3 ′ end synthesized using this as a ⁇ -type has a base sequence complementary to its own specific region at the 3 ′ end. At this stage, you are ready to check the nucleotide sequence of a specific region. Then, the base sequence is actually checked in the subsequent reactions.
  • the reaction for checking the nucleotide sequence proceeds as follows. First, the 3′-end and a specific region of the single-stranded polynucleotide thus synthesized are brought into a state in which base pair binding is possible. This step can be preferably performed as follows. That is, the 3 'end is replaced by a complementary synthesis reaction starting from the loop-forming region of the hairpin structure.
  • a base sequence for forming a loop between complementary base sequences of the single-stranded polynucleotide is included.
  • this sequence is called a loop-forming sequence.
  • the single-stranded polynucleotide is substantially composed of a complementary base sequence linked by a loop-forming sequence.
  • a single strand that does not separate into two or more molecules when a base pair bond is dissociated, regardless of whether it is partially associated with a base pair bond is called a single strand.
  • Complementary base sequences can form base pairing on the same strand.
  • An intramolecular salt-pair binding product that can be obtained by base-pairing the single-stranded polynucleotide on the same chain is composed of an apparently double-stranded region and a base-bond-free region. Give the hoop part.
  • this single-stranded polynucleotide contains a complementary base sequence that can anneal on the same strand, and the anneal product forms a loop without base pairing at the bent hinge 1 It can also be defined as a single-stranded nucleic acid.
  • nucleotides having a complementary base sequence are included in the loop without base pairing.
  • the loop-forming sequence can be any base sequence. It is capable of base-pairing so that complementary strand synthesis for substitution can be initiated, and preferably has a sequence that can be distinguished from a base sequence present in another region to achieve specific annealing. .
  • it contains a nucleotide sequence complementary to the first primer.
  • FIG. 5 shows a state in which the FA anneals to the loop-forming region.
  • the hybridizing portion of the single-stranded polynucleotide is displaced, and the specific region of the single-stranded polynucleotide and the 3 ′ end are replaced. Is ready for base pairing. Both anneals to give 3'-0H at the 3 'end, which is the starting point for complementary strand synthesis. By the way, the 3 'end is annealed at this stage in the specific region whose nucleotide sequence should be checked. Therefore, if the nucleotide sequence in this region is the predicted nucleotide sequence, the complementary ii synthesis reaction starting from the 3 ′ end will proceed. Alternatively, if the sequence differs from the predicted base sequence, the complementary strand synthesis reaction is inhibited.
  • the greatest feature of the present invention is that the use of the LAMP method allows the check mechanism of this base sequence to function repeatedly in subsequent reactions. For example, suppose that the complementary strand synthesis reaction has proceeded even though the nucleotide sequence was different from the expected one.
  • the product of the complementary chain synthesis reaction using a single-stranded polynucleotide of the present invention as a type III is a product having a complementary chain to a specific region again at the 3 ′ end. Since the 5 'end of itself has a nucleotide sequence predicted for a specific region, this structure does not change even if the complementary strand synthesis is repeated many times.
  • the specific region to be annealed at the 3 'end is a transcript of the target nucleotide sequence as type III, so that the annealing between the two remains mismatched. Therefore, inhibition occurs in the second and subsequent reactions. It can be said that the nucleotide sequence checking mechanism according to the present invention has a mechanism for minimizing the influence of a complementary strand synthesis reaction that has occurred erroneously.
  • the nucleic acid obtained when the complementary strand synthesis proceeds is a nucleic acid in which complementary base sequences are alternately linked on a single strand.
  • the amount of the generated nucleic acid is associated with the presence of the predicted nucleotide sequence in the specific region. If they are different, the production of a nucleic acid having such a structure is inhibited.
  • the nucleic acid in which complementary nucleotide sequences are alternately linked on a single strand, which is used as an index in the present invention means a nucleic acid in which mutually complementary nucleotide sequences are linked adjacently on a single strand.
  • the product accompanying the progress of the complementary strand synthesis reaction can be detected by a known technique.
  • the amplification product unique to the present invention can be confirmed as a clear band.
  • the amplification product of the present invention is composed of a repeating base sequence having a target base sequence and its complementary strand as one unit. When this is separated by electrophoresis, ladder-like bands appear at regular intervals.
  • a technique of tracking the progress of complementary strand synthesis while reacting it is also known. For example, a double-stranded nucleic acid-specific fluorescent dye such as ethidium mouth mid-cyber green can track the accumulation of complementary strand synthesis products as a change in fluorescence intensity.
  • the amount of the complementary strand synthesis product can be compared with an internal standard.
  • an internal standard for example, a nucleic acid which is derived from the same nucleic acid sample and which has no obvious mutation or polymorphism can be used.
  • a base sequence whose mutation or polymorphism is not known in the genome can be used as an internal standard.
  • the detection method of the present invention is performed using mRNA as type III, for example, a gene whose expression level is observed in any cell can be used as an internal standard.
  • Complementary strand synthesis reaction was performed on these internal standards under the same conditions as in the present invention using the base sequence as the target base sequence, and the results obtained from the base sequence for which mutation was to be detected using the amount of the product as a control. Can be compared to When the same level of product is generated as the internal standard, it can be confirmed that the specific nucleotide sequence is identical to the predicted nucleotide sequence. Conversely, if the nucleotide sequence of a particular region is different from the predicted sequence, the amount of the complementary strand synthesis reaction product should be smaller than that of the internal standard.
  • an internal standard can be used as long as the same sample is reacted under common conditions. For example, when a standard is measured in the first reaction system and a sample nucleic acid is measured in the second reaction system for the same sample, this standard is also called an internal standard.
  • the number of complementary base sequences constituting a nucleic acid synthesized when a specific region has a predicted base sequence is at least one set. According to a desirable mode of the present invention, it may be an integral multiple thereof. In this case, theoretically, there is no upper limit to the number of pairs of complementary base sequences constituting the nucleic acid in the present invention. No.
  • the nucleic acid which is a synthetic product of the present invention is composed of a plurality of sets of complementary base sequences, this nucleic acid is composed of a repetition of the same base sequence. It goes without saying that some of the reaction products may not be able to reach the 5 'end of the phase complementary chain synthesis reaction, and may end in the middle of type III.
  • a nucleic acid synthesized according to the present invention in which complementary base sequences are alternately linked on a single strand, does not necessarily have to have the same structure as a natural nucleic acid. It is known that a nucleic acid derivative can be synthesized by using a nucleotide derivative as a substrate when synthesizing a nucleic acid by the action of DNA polymerase. As such a nucleotide derivative, a nucleotide labeled with a radioisotope or a nucleotide derivative labeled with a binding ligand such as biotin or digoxin is used. By using these nucleotide derivatives, labeling of the product nucleic acid derivative is achieved.
  • the product nucleic acid can be converted to a fluorescent derivative by using a fluorescent nucleotide as a substrate.
  • the product can be DNA or RNA. Which one is produced is determined by the structure of the primer, the type of substrate for polymerization, and the combination with the polymerization reagent that performs nucleic acid polymerization.
  • the nucleic acid can be DNA or RNA, or a chimeric molecule thereof.
  • Nucleic acids can be natural or artificially synthesized.
  • a nucleotide derivative partially or wholly composed entirely of an artificial structure, as long as it can form base pairing, or as long as it functions as a type III for complementary strand synthesis It is included in the nucleic acid of the present invention.
  • the number of constituent bases of the nucleic acid in the present invention is not limited. Nucleic acid is synonymous with the term polynucleotide.
  • oligonucleotide in the present invention is used as a term indicating a polynucleotide having a particularly small number of constituent bases among polynucleotides.
  • oligonucleotides range from 2 to 100, more usually from about 2 to 50
  • a polynucleotide having the same number of bases is referred to as an oligonucleotide, but is not limited to these values.
  • the detection method of the present invention can be applied to any nucleic acid.
  • the genomes of prokaryotic and eukaryotic cells the genomic DNA and genomic RNA of viruses, the genomes of intracellular parasites such as mycoplasma and rickettsia, cDM derived from the mA of these species, Further, libraries derived from these gene sources, clones isolated from the libraries, and the like can be shown. If the gene whose mutation or polymorphism is to be detected is MA, it can be converted into cDNA by the action of a DNA polymerase having reverse transcriptase activity.
  • the nucleic acid used as the sample of the present invention is generally included in a biological sample.
  • a biological sample can be an animal, plant, or microbial tissue, cell, culture, excreta, or an extract thereof.
  • the present invention is intended to detect nucleic acids derived from such organisms, or nucleic acids derived from infectious parasites, microorganisms, viruses, etc., which are contained in these biological samples or host organisms. be able to.
  • the nucleic acid according to the present invention may be derived from the nucleic acid contained in the biological sample.
  • a cDNA synthesized based on mRNA, a nucleic acid amplified based on a nucleic acid derived from a biological sample, or the like can be used as a sample for the detection method according to the present invention.
  • These genes can be used as a sample for the detection method according to the present invention either by denaturation into a single strand or, as described later, as a double strand.
  • the nucleic acid containing the target base sequence in the present invention can be used as a sample in a double-stranded state when it is incubated with the primer anneal under conditions in which the complementary strand synthesis reaction starting from the primer anneal proceeds. .
  • a nucleic acid sample is analyzed by hybridization with a probe or primer, a step of denaturing to a single strand is required.
  • the complementary strand synthesis reaction from the primers is performed under the conditions that the double-stranded nucleic acid is destabilized, it is possible to omit the step of completely converting the single-stranded nucleic acid.
  • the present inventors have found that there is a problem (filed on April 7, 2000, Japanese Patent Application 2000-111939)
  • the nucleic acid amplification method applicable to the present invention proceeds isothermally when applied to a single-stranded ⁇ -type nucleic acid.
  • This method uses MA polymerase, which can catalyze complementary strand synthesis involving strand displacement, as well as anneal to itself and complementary strand synthesis, and a new primer for loops. It is based on a reaction principle in which complementary strand synthesis is repeated under isothermal conditions by repeating complementary strand synthesis. Therefore, a double-stranded nucleic acid can be used for the target base sequence in the present invention.
  • a method for detecting a mutation or polymorphism by directly using a double-stranded nucleic acid as type ⁇ will be described.
  • the process of complementary strand synthesis which is started when the base sequence constituting the specific region is the predicted base sequence is described. If the nucleotide sequence of a specific region is different from the predicted nucleotide sequence, the three ends of itself will anneal to the specific region and self-evaluate in several complementary strand synthesis reactions described below. A step of inhibiting the complementary strand synthesis reaction that proceeds as a template is incorporated.
  • double-stranded nucleic acid examples include cDNA and genomic DNA. Alternatively, those obtained by inserting these DNAs into various vectors can be used as the double-stranded nucleic acid of the present invention.
  • the double-stranded nucleic acid of the present invention may be purified or unpurified.
  • the method of the present invention can be applied in a state where it is present in a cell (in situ). By making the double-stranded nucleic acid in the cell type II, in situ analysis of the genome becomes possible.
  • the step of synthesizing the cDNA and the method of synthesizing a nucleic acid based on the present invention can be performed under the same conditions.
  • MA When the first strand of cDNA is synthesized as type III, a double-stranded nucleic acid by DNA-RNA hybrid is completed. Using this double-stranded nucleic acid as type III in the present invention, a method for synthesizing a nucleic acid can be carried out. If the DNA polymerase used in the nucleic acid synthesis method of the present invention has reverse transcriptase activity, nucleic acid synthesis can be performed using a single enzyme under the same conditions.
  • Bca DNA polymerase is a DNA polymerase that has strand displacement activity and also has reverse transcriptase activity.
  • the method for synthesizing a nucleic acid according to the present invention can be applied after the second strand is synthesized to obtain a complete double-stranded cDNA.
  • a polymerase capable of catalyzing complementary strand synthesis involving strand displacement is used.
  • this type of polymerase the same DNA polymerase as used in SDA and the like is used.
  • SDA DNA polymerase
  • a complementary strand is synthesized using a primer complementary to the 3 ′ side of a certain base sequence as a synthesis starting point, if there is a double-stranded region on the 5 ′ side of the ⁇ type, complementation is performed while displacing the double strand.
  • Specialized polymerases that perform chain synthesis are known.
  • the type 5 side is the 3 'side of the primer, that is, the direction in which the complementary strand synthesis reaction proceeds.
  • a substrate required for complementary strand synthesis is further added.
  • an arbitrary primer is added to the double-stranded nucleic acid, and the mixture is incubated under conditions that can achieve a complementary strand synthesis reaction starting from this primer.
  • the optional primer of the present invention is used to make a region where FA should anneal into a state capable of base pairing. Therefore, the optional primer must be capable of annealing to the complementary strand to the nucleic acid strand to be FA-annealed of the double-stranded nucleic acid to be type III.
  • the complementary strand synthesis using an arbitrary primer as a replication origin in the present invention should be in a positional relationship such that the FA proceeds toward the region to be annealed.
  • any primer can be used in any area as long as this condition is met. You can choose from a range.
  • RA or an outer primer (described later) that anneals further to the third side from the region where RA anneals in type I can be used as an arbitrary primer.
  • Such an embodiment is one of the desirable embodiments in the present invention because it reduces the components required for the reaction.
  • One strand of the double-stranded nucleic acid can be displaced by complementary strand synthesis starting from an arbitrary primer, so that base pairing by FA can be performed.
  • the method of the present invention was able to be realized using a double-stranded nucleic acid as a sample without a temperature change.
  • the anneal for a double-stranded nucleic acid of any primer and the conditions under which a complementary strand synthesis reaction starting from this primer can be achieved are actually conditions under which the following multiple steps can proceed under the same conditions. be able to.
  • a primer could only be annealed if it had at least one region to anneal. Therefore, conventionally, in the case where a double-stranded nucleic acid is converted into a ⁇ -form, a step of converting the double-stranded nucleic acid into a single-strand by denaturation is always performed prior to annealing of the primer. However, even if it is not necessarily a single strand, it is possible to anneal the primer by incubating with the primer under conditions where the duplex is destabilized by some means . As a condition for destabilizing the duplex, for example, a method of heating to a temperature close to the melting temperature (hereinafter abbreviated as Tm) can be shown. Alternatively, it is also effective to further include a Tm modifier.
  • Tm melting temperature close to the melting temperature
  • the series of reactions consist of a buffer that provides a suitable pH for the enzymatic reaction, maintenance of the catalytic activity of the enzyme, salts necessary for annealing, a protective agent for the enzyme, and a modifier for the melting temperature (Tm) if necessary. And so on.
  • a buffering agent one having a neutral to weak buffering action such as Tris-HCl is used. Adjust the pH according to the DNA polymerase used. KC1, NaCl or as a salt (NH 4) 2 S0 4 or the like, the active enzyme It is added as appropriate for maintaining the property and adjusting the melting temperature (Tm) of the nucleic acid. Serum albumin and sugars are used as enzyme protectants.
  • melting temperature (Tm) regulator generally used are quinone, proline, dimethyl sulfoxide (hereinafter abbreviated as DMS0), or formamide.
  • Tm melting temperature
  • betaine (N, N, N, -1 rimethylglycine) -tetraalkylammonium salt is also effective in improving the efficiency of strand displacement by its isostabilize action.
  • the action of promoting the nucleic acid amplification reaction of the present invention can be expected. Since these melting temperature modifiers act in the direction of lowering the melting temperature, experience conditions that give appropriate stringency and reactivity in consideration of other reaction conditions such as salt concentration and reaction temperature. To set.
  • Tm temperature condition suitable for the enzyme reaction.
  • Tm varies depending on the relationship between the primer and the target base sequence. Therefore, it is desirable to adjust the amount of the Tm adjuster so that the conditions for maintaining the enzyme activity and the conditions for the incubation satisfying the conditions of the present invention are satisfied.
  • an appropriate dose of the Tm adjusting agent according to the nucleotide sequence of the primer For example, Tm can be calculated based on the length of the base sequence to be annealed and its GC content, salt concentration, and concentration of the Tm modifier.
  • the anneal of the primer to the double-stranded nucleic acid is presumably unstable.
  • a complementary strand is synthesized using the unstable primer as an origin of replication.
  • the anneal of the primer becomes increasingly stable. less than The DNA polymerase as shown is capable of catalyzing the synthesis of the complementary strand under conditions that allow the primer to anneal to the double-stranded nucleic acid.
  • mutants of these enzymes can be used in the present invention as long as they have a sequence-dependent complementary strand synthesis activity and a strand displacement activity.
  • mutant refers to a product obtained by extracting only a structure that provides the catalytic activity required by the enzyme, or a product obtained by altering the catalytic activity, stability, or heat resistance by amino acid mutation or the like.
  • DeepVent DNA polymerase Excluding exonuclease activity from DeepVent DNA polymerase
  • Bst DNA polymerase Bca (exo-) DNA polymerase is a particularly desirable enzyme because it has some heat resistance and high catalytic activity.
  • the primer anneal and the complementary strand synthesis reaction are performed on the double-stranded nucleic acid under the same conditions. Such reactions often require some warming Therefore, it is one of the desirable conditions that the enzyme be thermostable. A wide range of reaction conditions can be accommodated by using a thermostable enzyme.
  • Vent (Exo-) DNA polymerase is an enzyme that has high heat resistance as well as strand displacement activity.
  • the complementary strand synthesis reaction involving strand displacement by DNA polymerase is promoted by the addition of a single strand binding protein (Paul M. Lizardi et al, ature Genetics). 19, 225-232, July, 1998).
  • the effect of promoting the complementary strand synthesis can be expected by adding a single-stranded binding protein.
  • T4 gene 32 is effective as a single-stranded binding protein.
  • DNA polymerases that do not have 3, -5, exonuclease activity have a complementary strand synthesis that does not stop at the 5 'end of type I, but extends one base over.
  • the phenomenon that proceeds is known. In the present invention, such a phenomenon is not desirable because the sequence at the 3 ′ end when the complementary strand synthesis reaches the end leads to the start of the next complementary strand synthesis.
  • the addition of a base to the 3 'end by DNA polymerase is A with a high probability. Therefore, the sequence may be selected so that the synthesis from the 3 'end starts at A so that there is no problem even if dATP is added by one base by mistake.
  • the 3' ⁇ 5 'exonuclease activity can be used to digest it and make it a blunt end.
  • natural Vent DNA polymerase has this activity, it can be avoided by mixing it with Vent (Exo-) DNA polymerase and using it.
  • DNA polymerases such as Taq polymerase generally used in PCR and the like have substantially no strand displacement effect under ordinary conditions.
  • this type of DNA polymerase can be used in the present invention if conditions that allow strand displacement can be provided.
  • a loop primer can be used to increase the amplification efficiency of the LAMP method.
  • the loop primer refers to the origin of complementary strand synthesis between a region derived from FA in the above-mentioned FA extension product and an arbitrary region for FA (that is, a region consisting of a base sequence complementary to the 5 'end of FA). Primer that can give.
  • the origin of complementary strand synthesis between a region derived from RA in the RA extension product and an arbitrary region for RA that is, a region consisting of a base sequence complementary to the 5 'end of RA.
  • a loop primer for FA is referred to as loop primer F
  • a loop primer for RA is referred to as loop primer R.
  • Loop primers were conceived by focusing on the fact that some LAMP products contain loops that RA and FA cannot anneal.
  • the applicant has filed a patent application for the LAMP method using a loop primer (filed on September 19, 2000, Japanese Patent Application No. 2000-28386 2).
  • Efficiency is significantly improved.
  • the reaction is initiated by adding loop primer F and / or loop primer R together with RA, FA, and, if necessary, primers.
  • the effect can be expected even if only the loop primer is added later, it is reasonable to make it exist from the start of the reaction because the purpose is to increase the efficiency of the reaction.
  • the components constituting the reaction of the present invention can be combined in advance to form a kit.
  • the present invention comprises a primer set consisting of two inner primers, a DNA polymerase capable of catalyzing complementary strand synthesis involving strand displacement, and a nucleotide substrate, and an inner primer constituting the primer set.
  • the kit of the present invention includes an outer primer for the inner primer and another primer set for an internal standard. Can be combined. Also, a loop primer that improves the reaction efficiency can be combined. Alternatively, standard samples used as positive and negative controls, handling instructions, etc. can be attached.
  • an indicator component for detecting an amplification product can be combined.
  • a fluorescent dye such as EtBr
  • a kit for hetero / homo genotyping can be prepared by combining two types of primer sets, one for wild type and the other for mutant type, as a primer set comprising the inner primer.
  • a kit can be used to determine homozygous and heterozygous all genotypes by using a set of primers according to the type of the mutant. The determination of heterozygous or homozygous is important in pedigree analysis and genotype-based phenotype prediction.
  • the inner primers RA and FA constitute a set of amplification primers
  • RA is a base pair in the target nucleotide sequence existing as a double-stranded region to be annealed by FA. It also acts as an optional primer to make the bond possible.
  • R1 is composed of a predicted nucleotide sequence
  • the complementary strand synthesis reaction is inhibited each time the 3'-terminal R 1c repeats anneal with respect to R1, and in principle, the amplification reaction is stopped. Does not progress. Also, if the synthesis of the complementary strand starting from Rlc with a certain probability occurs erroneously, only a small amount of the product will be produced, and there is substantially no effect on the final result.
  • S o The above-mentioned arbitrary primer (RA in FIG. 1- (1)) first anneals to X2 c (corresponding to R2 c) in the double-stranded nucleic acid of type III and becomes the starting point of complementary strand synthesis.
  • the double-stranded nucleic acid is placed under destabilizing conditions, and the primer directly functions as a starting point for a complementary strand synthesis reaction for the double-stranded nucleic acid.
  • the region F 2 where the complementary strand synthesized starting from RA replaces one strand of the double-stranded nucleic acid in ⁇ form and the other inner primer FA anneals c is ready for base pairing ( Figure 1- (2)).
  • the outer primer F3 that initiates complementary strand synthesis from the 3 'side of FA further anneals (FIG. 2- (4)).
  • the outer primer is designed to initiate complementary strand synthesis from the 3 'side of each primer, and is used at a lower concentration than the inner primer, so there is a high probability that the inner primer will be used. Initiate complementary strand synthesis with a lower probability.
  • the strictness of the check mechanism mainly depends on the Tm of F1 / F1c. .
  • the Tm of F1 / F1c By setting the Tm of F1 / F1c as low as possible within the permissible range, a strict base sequence checking mechanism can be realized. However, if the Tm of F1 / F1c is set lower than the allowable limit, an efficient amplification reaction will occur even if the nucleotide sequence of the specific region is the predicted nucleotide sequence. May not be expected.
  • efficient synthesis occurs under the condition that the Tm of F1 / F1c is 45 ° C with respect to the reaction condition of 60 ° C.
  • Reaction temperatures as high as 15 ° C above Tm generally do not allow hybridization of different polynucleotide molecules. In other words, efficient complementary strand synthesis cannot be expected.
  • the anneal of F1 / F1c occurs in the same molecule, even if the Tm is slightly lower than the reaction temperature, the base sequence can be sufficiently strictly controlled without sacrificing the reaction efficiency. Checks can be realized.
  • the Tm of each primer used in Example 5 described below is as follows.
  • Loop primer FL 56 ° C
  • Loop primer RL 58 ° C
  • the efficiency of the entire reaction is increased, and therefore, even if the Tm of Flc (R1c) is set low, a high amplification reaction can be expected in a short time. That is, the length of the primer can be shortened accordingly.
  • the synthesized product elongated from the inner primer FA is displaced into a single strand (FIG. 2- (5)).
  • the primer R3 for RA and RA further initiates complementary strand synthesis with anneal (FIG. 3- (6)).
  • the resulting extension product from RA has a structure that can anneal its 3 'end F1 to itself ( Figure 3- (8)).
  • Fig. 3-(8) The chain synthesis reaction starts (Fig. 3-(8)).
  • Fig. 5 shows the positional relationship of the primer primer FA that anneals to the loop.
  • the complementary strand synthesis reaction from the FA annealed to the loop displaces the product of the phase complementary chain synthesis reaction that started from the 3 'end with itself as the ⁇ type, and the 3' end R1 was reannealed to itself.
  • Fig. 4-(9) Thereafter, a phase complementary chain synthesis reaction starting from the 3 'end and using itself as a ⁇ -type, and a complementary chain synthesis reaction starting from a loop and starting from an initiator-primer-RA occur alternately. In this way, the reaction of repeating the extension at the 3 'end with itself as a ⁇ and the extension by a new primer from the loop portion repeatedly occur, and the nucleic acid amplification reaction is established.
  • nucleic acid synthesis in which complementary base sequences are alternately linked above is in progress. That is, the synthesis of the complementary strand from the loop portion is completed when R 1 is reached, for example, in FIG. 4- (9). Then, the synthesis of the complementary chain starts from the 3 ′ end substituted by the synthesis of the nucleic acid (FIG. 4— (9)).
  • a reaction that continues to supply a new nucleic acid that starts extension separately proceeds.
  • the chain further elongates, not only the ends but also a plurality of loop-forming sequences are provided on the same chain.
  • the The primer anneals and becomes the starting point for the reaction of generating a new nucleic acid.
  • the present invention by making FA a check primer in addition to R A, it is possible to increase the chance that the check mechanism works.
  • the complementary strand synthesis reaction proceeds through a check of the base sequence in the specific region.
  • the amount of the product when there is a difference is greatly reduced.
  • the mutation and / or polymorphism detection method can provide a detection method with an excellent S / N ratio in principle.
  • the use of a primer having a specific structure causes elongation and accompanying generation of a new nucleic acid. Further, in the present invention, the newly generated nucleic acid itself elongates, which results in the generation of a further new nucleic acid.
  • the series of reactions can theoretically last forever and achieve very efficient nucleic acid amplification. Moreover, in the method of the present invention, all the reactions can be performed under isothermal conditions.
  • RA and FA are used as the primer in the present invention, it is an important feature that a series of reactions does not proceed unless the positional relationship of a plurality of regions is always maintained.
  • at least six regions are involved in the reaction. This feature effectively prevents non-specific synthesis reactions associated with non-specific complementary strand synthesis. In other words, even if any non-specific reaction occurs, the possibility that the product becomes a starting material for the subsequent amplification step is reduced.
  • a primer can be designed so that a high-level amplification reaction occurs only when a plurality of regions have a predicted nucleotide sequence and have a specific positional relationship.
  • the present invention is useful for detecting fine base sequence differences between a plurality of genes having similar base sequences, such as typing of HLA, platelet alloantigen, or pathogenic microorganism. Most of the genes that determine these traits are common, and typing is performed based on the pattern of mutation in some regions.
  • the method of the present invention which cannot produce a certain level of amplification product unless the nucleotide sequences in a plurality of regions are as expected, is suitable for such analysis.
  • a primer that amplifies when the nucleotide sequence constituting the specific region is a wild-type nucleotide sequence and a primer that amplifies when the nucleotide sequence constituting the specific region is a mutant type are combined to obtain the same sample.
  • genomic DNA By analyzing genomic DNA, heterozygous and homozygous Can be clearly determined. That is, if amplification is observed in only one of the primers, it indicates that the subject has either the wild type or the mutant type homozygously, while if amplification is observed in both primers, the mutation is observed. It indicates that it has both a wild type and a wild type.
  • the present invention is also useful as a technique for analyzing drug metabolism genes that supports tailor-made medicine.
  • Drug metabolism genes are important genes that affect drug sensitivity. The difference in activity is thought to be due to slight nucleotide sequence differences found in genes encoding enzymes involved in the metabolism of the drug. The results of the Human Genome Project are trying to reveal the standard human genes. The most important practical application of this result is the analysis of drug metabolism genes. Therefore, the present invention provides a technology having high utility in the post-genome era.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a part (1)-(2) of the reaction principle of a desirable embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a part (3)-(5) of the reaction principle of a desirable embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a part (6)-(8) of the reaction principle of a desirable embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic view showing a part (9)-(11) of the reaction principle of a desirable embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the structure of a loop formed by the single-stranded nucleic acid according to the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing mutually similar nucleotide sequences found in human CYP2C19 family.
  • FIG. 7 is a diagram showing a target nucleotide sequence from which SNPs were detected in the examples and a positional relationship between primers in the target nucleotide sequence.
  • FIG. 8 is a photograph showing the result of the method for detecting a mutation according to the present invention.
  • target template when the specific region has the predicted nucleotide sequence
  • single nucleotide difference Template when the nucleotide sequence differs by one nucleotide from the predicted nucleotide sequence, and when only the primer as a control is used: This shows that there is no template.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of the mutation detection method according to the present invention.
  • the vertical axis indicates the fluorescence intensity
  • the horizontal axis indicates the reaction time (hour).
  • FIG. 10 is a diagram showing a target base sequence from which SNPs were detected in Example 3 and a positional relationship between primers in the target base sequence.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of the mutation detection method according to the present invention. a) shows the results obtained by reacting the wild-type (WT) primer set and b) the mutant-type (MUT) primer set with each type III DNA. In the figure, the vertical axis represents the fluorescence intensity, and the horizontal axis represents the reaction time (minutes). —Hata—: Wild type (WT), — ⁇ —: Mutant type (MUT), A_: No DNA
  • FIG. 12 is a photograph showing the result of the mutation detection method according to the present invention. Each lane shows the results of reacting a set of wild type (WT) primers and a set of mutant (MUT) primers with each type I DNA. No DNA: no type II DNA, MUT DNA: mutant type CYP2C19 gene type II, WT DNA: wild type CYP2C19 gene type II
  • FIG. 13 is a graph showing the results of examining the specificity of the mutation detection method according to the present invention. a) shows the results obtained by reacting the wild-type (WT) primer set, and b) shows the results obtained by reacting the mutant-type (MUT) primer set with each type III DNA. In the figure, the vertical axis shows the fluorescence intensity, and the horizontal axis shows the reaction time (minutes). 1 ⁇ —: No DNA, 1 ⁇ 1: CYP2C9 gene, 1X—: CYP2C18 gene, -Qin—: CYP2C19 wild type (WT), — ⁇ —: CYP2C19 mutant type (MUT),
  • FIG. 14 is a diagram showing a target base sequence from which SNPs were detected in Example 5 and a positional relationship between primers in the target base sequence.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of the mutation detection method according to the present invention using a loop primer. a) shows the result of reacting a set of primers for wild type (WT), and b) shows the result of reacting a set of primers for mutant type (MUT) with each type III DNA. In the figure, the vertical axis indicates the fluorescence intensity, and the horizontal axis indicates the reaction time (minute).
  • WT Wild type
  • MUT Mutant
  • A— No DNA
  • FIG. 16 is a graph showing the results of examining the specificity of the mutation detection method according to the present invention using a loop primer. a) shows the results obtained by reacting the wild-type (WT) primer set, and b) shows the results obtained by reacting the mutant-type (MUT) primer set with each type III MA.
  • the vertical axis shows the fluorescence intensity
  • the horizontal axis shows the reaction time (min).
  • FIG. 17 is a graph showing the results of detecting a mutation in a blood sample by the mutation detection method according to the present invention using a loop primer.
  • Sample No. 10 is wild type homozygous (WT / WT), sample! ⁇ , Indicates wild-type / mutant heterozygous ⁇ ! 1 / ⁇ ! 1 ), and sample No. 8 is mutant homozygous (MUT / MUT).
  • the vertical axis shows the fluorescence intensity
  • the horizontal axis shows the reaction time (min).
  • the human CYP2C19 gene was amplified by PCR, digested with the restriction enzyme Smal that recognizes the SNPs portion, and typed as wild type (WT) or single nucleotide mutation (ml). Furthermore, the PCR products determined to be WT and ml based on the results were cloned into EcoRV of pBluescript II, the nucleotide sequence was determined, and the nucleotide sequence of the SNPs portion was confirmed.
  • the wild type nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 5. In ml, the 11th position of SEQ ID NO: 5 was A instead of G (Fig. 7).
  • a primer consisting of the following nucleotide sequence was designed as a primer for discriminating between WT and ml of human CYP2C19.
  • the relationship between each primer and the target nucleotide sequence is as shown in FIG.
  • the 5 'end of the FA contains the portion where the mutation is to be detected. Therefore, when the predicted nucleotide sequence does not exist in this region of the target nucleotide sequence, the complementary strand synthesis reaction is inhibited.
  • Example 2 Using the same primers one as in Example 1, as a detection method were performed (target nucleotide sequence of the mutant according to the invention, WT, and ml in pBluescript II (EcoRI incorporating those linearized) 10- 21 mol The reaction was performed at 64 ° C. with the same composition as in Example 1 except for using / tube (about 600 molecules), and EtBr was added to the reaction solution to a final concentration of 0.25 g / ml. The reaction was monitored for 6 hours using ABI Prism 7700 (PerkinElmer).
  • primers were set for the case where the nucleotide sequence predicted for a specific region was a mutant type and the case where the nucleotide sequence was a wild type, and the mutation detection method according to the present invention was attempted.
  • the base sequences of the prepared primers are as follows.
  • the human CYP2C19 gene is type I, and a set of primers (a predicted nucleotide sequence is a variant) whose amplification occurs when there is a mutation (MUT) for the mutation to be detected
  • a primer set (a predicted base sequence is a wild type), which causes amplification in the case of the type (WT), was used.
  • the relationship between each primer and the target nucleotide sequence is as shown in FIG.
  • the fifth and second base from the end of both F A and R A correspond to SNPs.
  • a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 was used for outer primer R3 and SEQ ID NO: 4 was used for outer primer F3 (the same as in Example 1).
  • pBluescript II linearized with EcoRI
  • 600 molecules / tube was type- ⁇ , and treated at 95 ° C for 3 minutes.
  • the reaction solution was added to the following reaction solution, and the reaction was performed at 60 ° C. for 3 hours at a reaction solution volume of 25 / L.
  • the composition of the reaction solution is as follows.
  • EtBr was added to the reaction solution to a final concentration of 0.25 ⁇ g / ml, and the reaction was followed for 3 hours using ABI Prism 7700 (PerkinElmer).
  • FIG. 12 shows the results of electrophoresis of 5 / L of the reaction solution after the reaction in the same manner as in Example 1.
  • the amplification reaction was proceeding only when the type III had the predicted nucleotide sequence in both the wild-type primer set and the mutant primer set. Only 6 0
  • the amplification reaction reached a plateau in about 100 minutes despite the experiment using type ⁇ of 100 molecules, demonstrating the high sensitivity of the detection method according to the present invention.
  • Six hundred thousand molecules of DNA correspond to the number of leukocyte-derived genomes contained in exactly 1 L of blood.
  • the white blood cell count in adults is said to be between 400 and 800, an intermediate value of 600 is exactly equivalent to the white blood cell count.
  • the number of leukocytes means the number of DNA present in blood. That is, the condition under which the DNA of 600 molecules can be analyzed means that the gene can be analyzed using lAdL blood as a sample.
  • the mutation detection method according to the present invention can discriminate a target nucleotide sequence from a similar nucleotide sequence in a gene group consisting of mutually similar nucleotide sequences, and It was shown that it could be detected accurately.
  • nucleotide sequences of p450CYP2C19, p450CYP2C9, and p450CYP2C18 have extremely high similarities. It can be said that it is impossible to detect a nucleotide sequence having such high similarity and detect a mutation at the same time by a known nucleotide sequence detection method.
  • a primer consisting of the following nucleotide sequences and a c-loop primer for which a loop primer was designed are primers that can provide a starting point for complementary strand synthesis between F2 and F1 on the extension product of FA.
  • a primer capable of providing a starting point for complementary strand synthesis between R2 and R1 in the extension product of RA is used as a loop primer.
  • a loop primer having the following base sequence was set. The loop primer is common to each primer set for wild type (WT) and mutant type (MUT).
  • Figure 14 shows the relationship between each primer used in the reaction and the target nucleotide sequence.
  • the second base from the 5 'end of both F A and R A corresponds to SNPs.
  • a primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 was used for the outer primer R3, and a primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 was used for the outer primer F3 (the same as in Example 1).
  • the reaction solution was added to the following reaction solution to make the reaction solution volume 25 L, and reacted at 60 ° C. for 3 hours.
  • the composition of the reaction solution is as follows.
  • the specificity of the mutation detection method according to the present invention when the loop primer was applied was examined using 100 times the amount of DNA having a similar base sequence as type ⁇ . Replace the human p450CYP2C19 with 600 molecules and replace it with 600,000 molecules of human p450CYP2C9. The reaction was carried out under the same conditions as in Example 5, except that the offspring and the human P450CYP2C18 gene were added as type III to the tube.
  • DM was extracted from blood (35 samples) provided by volunteers using QIAamp DNA Blood Kit (Qiagen).
  • Qiagen QIAamp DNA Blood Kit
  • the ml region of the human P450CYP2C19 gene was amplified by PCR using the primer sequence described in JP-A-10-14585.
  • Amplification was performed using Z-Taq polymerase (Takara Shuzo) according to the protocol for Z-Taq.
  • the obtained PCR product was analyzed by PCR-RFLP.
  • the operation is as follows. First, 3 ⁇ L of the PCR product was digested with the restriction enzyme Msp I at 37 ° C for 3 hours, and electrophoresed with 4% agarose per gel (Amplify Agarose, BIO-RAD). After the electrophoresis, the gel was stained with SYBR-Green I (FMC), and the DNA band pattern was detected to perform ml region evening.
  • nucleotide sequence of the amplified nucleic acid was determined, and it was confirmed that the nucleic acid was the CYP2C19 gene.
  • Specimens MA derived from blood contain many similar sequences such as CYP2C9 and CYP2C18 in addition to the CYP2C19 gene.
  • the reaction of discriminating a single base difference was performed in a single amplification reaction. Therefore, there are many similar sequences It was confirmed that SNP tving of a gene can be determined only by the presence or absence of one amplification reaction.
  • the method of the present invention is useful for nucleic acid mutation and polymorphism analysis. This method is based on a simple enzymatic reaction. Therefore, it does not require special equipment or reaction components, and can be implemented at low cost and easily. Further, since the method for detecting a mutation or polymorphism according to the present invention involves a reaction involving amplification of a target base sequence, the base sequence identification result can be detected using the amount of a nucleic acid amplification reaction product as an index. As a result, it is possible to analyze base sequences with high sensitivity and reproducibility.
  • the initiation of complementary strand synthesis is repeatedly progressing through the check of the target base sequence. Therefore, even if incorrect complementary strand synthesis occurs, the reaction does not affect the final analysis results.
  • the PCR method which is a well-known gene amplification reaction
  • accurate determination cannot be performed, so that it cannot be practically applied to such analysis. It is a fatal characteristic that the checking mechanism of the base sequence based on the hybridization of the primer always has a certain error.
  • the present invention has realized a high S / N ratio that always minimizes the effects of errors in the synthesis of complementary strands of nucleic acids, while at the same time accumulating large amounts of products based on accurate reactions. Therefore, the present invention can be said to be a pioneering invention that is the first to be realistic with a method for identifying a nucleotide sequence by a nucleic acid amplification reaction.
  • the feature of the present invention that the progress of the reaction is controlled by a plurality of regions is useful for detecting slight nucleotide sequence differences under the condition that there are a plurality of genes containing similar nucleotide sequences. is there.
  • the present invention provides accurate and simple typing of HLA, platelet alloantigen, or pathogenic microorganism. Can be. Further, the detection of SNPs related to the activity of a drug metabolizing enzyme can also be easily performed according to the present invention.

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Description

明細書 変異および/または多型の検出方法 技術分野
本発明は、 塩基配列の変異や多型の検出方法に関する。 背景技術
遺伝子領域における変異は、 翻訳アミノ酸の変化を伴うミスセンス変異、 アミ ノ酸の変化を伴わないサイレント変異、 更に塩基の欠質や挿入によって翻訳フレ ームがずれるフレームシフト変異などの原因となる可能性がある。 ミスセンス変 異には、 誤った位置にストップコドンが生じてしまうナンセンス変異が含まれる また、 遺伝子領域における変異は、 スプライシングの異常等を通じて遺伝子の翻 訳異常につながる可能性もある。 サイレント変異以外の変異は、 タンパク質の構 造的な、 あるいは機能的な変化を伴うケースが多い。
更に、 発現調節領域の異常は、 タンパク質の発現調節機構に影響を与える恐れ がある。
さて、 核酸の塩基配列上の差異のうち、 ある集団内で 1 %以上の頻度で存在 する変異は、 特に多型と呼ばれている。 集団とは、 地理的な隔離や亜種によって 区別される集団を意味する。 例えば日本人では 1 %に満たない変異であっても、 他の人種で 1 %以上の頻度で見出されれば、 変異ではなく多型である。
多型の中でも、 一塩基の挿入、 欠失、 置換による多型は、 特に一塩基多型 （以 下、 SNPs; single nucleotide polymorphismsと省略する） と呼ばれている。 SN Psは、 ヒトゲノムの中で最も出現頻度が高い多型であるため注目されている。 多型は、 一定の頻度で集団に広がっていることから、 全く形質の変化を伴わな いものか、 特に生存 （生殖） に不利な形質ではなく、 いわば体質といえる形質を 左右しているものと考えられる。 たとえば、 糖尿病、 リュウマチ、 アレルギー、 自己免疫疾患、 肥満、 あるいは癌などの代表的な成人病に対する罹りやすさが遺 伝的な特性に支配されているとすれば、 多型によって決定されていると考えられ る。 その他、 薬剤代謝ゃヒト白血球組織適合型抗原 （以下、 HLAと省略する） な ども多型によって支配されている。 そして、 その多くは SNPsであることが明ら かにされつつある。
多型にはこのような特徴があることから、 マイクロサテライ ト多型のように、 染色体へのマッビングと連鎖解析などによって疾患関連遺伝子の絞り込みに用い られる。 SNPsは、 3 0 0〜6 0 0塩基に一つの割合で存在するため詳細なマツ プが得られ、 遺伝子の絞り込みを容易にすることが期待されている。
更に、 多型の位置と変動に関する情報を集積し、 ある表現型との関連性を解析 することによって、 多くの情報を得られる可能性があると期待されている。 たと えば、 薬剤に対する副作用に関連する SNPsを明らかにすることができれば、 副 作用を未然に防ぐことが可能となる。 副作用の克服によって、 実用化を諦めざる を得なかった多くの薬剤を、 安全な薬剤として再評価できる可能性がある。 細菌やウィルスの場合においても、 C型肝炎ウィルス （以下、 HCVと略する） のサブタイプ等は、 一定の割合で共通して見出される塩基配列の特徴に基づく分 類であることから、 多型と考えることができる。 変異解析のなかでも、 これら多 型の遺伝子型を調べることを目的とする場合を、 タイビングと呼んでいる。
HCVでは、 ひイン夕一フエロンによる治療効果にサブタイプによる違いがある ことから、 タイビングの結果は治療方法の選択において重要な情報である。 HCV のほか、 インフルエンザ · ウィルス、 マラリア、 あるいはへリコバクタ一 ' ピロ リなども、 サブ夕ィプによつて治療効果に違いのあることが明らかにされている 病原体である。 これらの病原体においても、 タイピングは治療方針の決定におけ る重要な情報を与える。 多型に対して、 1 %未満で見出される変異は、 人の場合は集団内で広がらない 変異で、 ほとんどが疾患にかかわるものといって良い。 すなわち、 遺伝病におい て見出される変異が相当する。 また、 個体内で見出される変異においても、 癌等 において見出される変異のように疾患にかかわるものがある。 このような変異の 検出は、 対応する疾患の診断において決定的な情報を与える。
ある遺伝子について、 その塩基配列が予測された塩基配列と比較して相違して いるのかどうかは、 相補的な塩基配列のハイブリダィズによって確認できる。 具 体的には、 プライマ一やプローブのハイブリダィズが利用される。
たとえば PCR用のプライマ一は、 標的塩基配列がプライマーに相補的な塩基 配列を持つ場合にのみプライマーとして作用することができる。 この原理に基づ いて、 PCRの増幅産物を指標として、 標的塩基配列がプライマーに相補的である かどうかを知ることができる。 しかし PCRに基づく塩基配列の確認方法には、 いくつかの問題点がある。 第一に、 プライマーによる塩基配列のチェック機構が 不完全である。 PCR法においても、 1塩基の違いを増幅反応で検出する方法が考 案されている (allele-specific PCRヽ ucleic Acids Res 17:p25031989, Geno mics 5 :p535 1989, J. Lab. Cl in. Med 114:pl05 1989) 。 しかし、 S.Kwokら が報告しているとおり （Nucleic Acids Res 18:p999 1990) 、 1塩基の違いの プライマ一を用いた場合、 完全に相補的なプライマーに比べて、 増幅サイクルあ たり約 0. 〜 85% (配列の違いによって異なる） の反応が進行してしまう。 言い かえれば、 塩基配列がプライマーと完全に相補的な塩基配列でなくてもしばしば 相補鎖の合成が起きてしまう。 このため、 allele-specific PCRで 1塩基の違 いを区別するためには、 人為的にもう一力所ミスマッチをいれる必要があるとさ れている。 しかしこの場合も配列の違いにより厳密な条件設定が必要であり、 汎 用技術とはなっていない。 したがって、 通常の条件では PCR法によって SNP sの ような 1塩基の相違を識別することは困難である。 言いかえれば、 相補的な塩基配列のハイブリダィズに基づいてわずかな塩基配 列の相違を検出する方法は、 誤りが起きる可能性を含んでいると言える。 PCR法 では、 誤って生成された合成産物が完全な銪型として機能するため、 指数的な増 幅をトリガーしてしまう。 つまり、 誤りが起きる可能性があるのにもかかわらず、 誤った反応に基づいて高度な増幅が起きてしまう点が、 わずかな塩基配列の識別 においては問題となる。
PCR法の第 2の問題点として、 その原理上ブラィマーが 2つの領域にしか設定 できないことが挙げられる。 したがって、 類似した塩基配列からなる複数の遺伝 子が同一の試料中に存在する場合、 各遺伝子における変異や多型を PCR法に基 づく増幅生成物の有無を指標として確認することはきわめて困難である。 ある遺 伝子に変異が存在していたとしても、 他方の遺伝子にプライマーがハイブリダィ ズすれば反応が進行してしまうためである。
たとえばヒト CYP2C19のようなフアミリー遺伝子においては、 ある遺伝子の 変異を検出するためのプライマ一は、 他の遺伝子に対してもプライマ一として作 用してしまう。 図 6にヒト CYP2C19ファミリ一に見出される互いに類似した塩 基配列を示した。 この図からわかるように、 ある遺伝子の変異を検出するための ブラィマ一は、 他の遺伝子の野生型においてブライマ一として作用してしまう。 このような条件下では、 2つの領域のみで、 類似する遺伝子の識別と変異の検出 とを同時に行うことは困難である。
以上の 2つの問題点より、 PCIUこよる変異検出では、 まず標的遺伝子を PCRに より特異的に増幅し、 その後、 プローブ、 あるいはプライマ一を用いて変異を検 出するといういわゆる PCR依存型変異検出技術が多数報告されている。 その中 でも、 DNAチップ法は特に注目されている検出技術である。 MAチップ上には、 数多くの類似する塩基配列を微小な区画に整列させることができる。 DNAチップ 上では、 微細な空間の反応環境を制御することによって、 わずかな塩基配列の相 違に基づくハイブリダィズの有無を、 検出できるとされている。 しかし現実には、 解析デ一夕の再現性が最大の課題とされている。 DNAチップ上でのハイブリダィ ズの条件は、 反応空間が微細なために、 繊細な条件設定が求められる。 一定の水 準で再現性を維持するには、 高度な技術と、 細心の注意が要求される。 さらに、 PCR依存技術であるため大きく分けて 2工程が必要であること、 加えて、 現状で は DNAチップの価格が高いことも、 解決が望まれる課題である。
一方、 PCR非依存型変異検出技術としては、 Invader法 （Mol Diagn. 4:pl35 1999) や、 RCA法 （Nat Genet 19 :p225 1998) が報告されている。 しかし、 いず れの方法も、 その反応特異性は近接する 2つの領域に設定されたプローブに依存 している。 P C Rについて指摘したように 2つの領域のみで、 類似する遺伝子の 識別と変異の検出とを同時に行うことは困難である。
以上のように、 公知の塩基配列の確認方法は、 一工程でわずかな塩基配列を正 確に識別することができない、 あるいは類似する遺伝子の識別と変異の検出とを 同時に行うことが困難であるという問題点があった。 また、 PCR依存技術のよう に技術的には類似する遺伝子の識別と変異の検出を行うことが可能であっても、 精度の維持が困難であったり、 複数の工程が必要なために煩雑な操作が必要とな つていた。 加えて、 経済性の面でも改善が望まれていた。 発明の開示
本発明の課題は、 類似する遺伝子の識別と、 わずかな塩基配列の相違の正確な 検出を同時に達成することができる新規な反応原理を提供することである。 より 具体的には、 相補鎖合成の過程において、 標的塩基配列における塩基配列を繰り 返しチェックすることが可能な核酸の合成方法を利用して、 標的塩基配列におけ る変異や多型を検出することができる方法の提供が本発明の課題である。
発明者らは、 公知の核酸増幅反応に基づく塩基配列の確認方法の問題点として、 大部分のプライマーが標的塩基配列にハイプリダイズできなくなる点に着目した。 すなわち PCR法においては、 プライマーに由来する塩基配列がそのまま鍊型と して相補鎖合成に利用される。 したがってプライマーのハイブリダィズによる標 的塩基配列のチェック機構が働くのは、 事実上、 反応全体のごく一部にすぎない ( 反応の大部分は、 単にプライマーの塩基配列を写し取った相補鎖に対してプライ マーがハイブリダィズすることによって進行している。 これでは、 標的塩基配列 のチェックを行っているとは言いがたい。
そこで本発明者らは、 プライマ一ではなく、 標的塩基配列に由来する塩基配列 に対してハイブリダィズする工程を多く含む核酸の合成反応を利用すれば、 標的 塩基配列のわずかな塩基配列の相違を正確に検出できると考えた。 そして本発明 者らは、 標的塩基配列に対するより厳密なチェック機構が、 相補鎖合成を完了し た 3'末端を次の相補鎖合成の起点として利用することによつて達成できること を見出し、 本発明を完成した。
より具体的には、 塩基配列の識別のためのプライマーが相補鎖合成によって初 めてもたらされ、 しかもこのプライマーが自身を铸型とする相補鎖合成の起点と なる核酸の合成方法に基づいて、 高度なチェック機構が実現できることを見出し た。 このような核酸の合成反応は、 本発明者らが既に報告している（Nucleic Ac id Res. 2000 Vol.28 No.12 e63、 WO 00/28082)。 本発明は、 この核酸の合成方 法に基づいて前記課題の解決を達成した。 即ち本発明は、 以下の変異および/ま たは多型の検出方法、 ならびにそのための試薬キットに関する。
〔1〕 次の要素を、 第 2および第 1のプライマ一を起点とする相補鎖合成 が可能な条件下でィンキュベートし、 標的塩基配列を錶型とする相補鎖合成 反応生成物の量と特定の領域の変異および/または多型の存在と関連付ける 工程を含む、 標的塩基配列における特定の領域の変異および/または多型の 検出方法であって、 第 2および第 1のプライマーの少なくとも一方の 5，末 端に配置された塩基配列が、 前記特定の領域、 またはその相補鎖の予測され る塩基配列に相補的な塩基配列を含み、 この 5'末端に配置された塩基配列 を銪型として合成された相補鎖は、 特定の領域、 またはその相補鎖にァニ一 ルして相補鎖合成の起点となるとき、 特定の領域を構成する塩基配列が予測 していたものでなかった場合に、 相補鎖合成が阻害されることを特徴とする 方法。
(a)標的塩基配列を含む核酸試料、
(b)鎖置換を伴う相補鎖合成を触媒することができる DNAポリメラーゼ
( c )第 2のプライマー； ここで第 2のプライマーはその 3'末端において前記 標的塩基配列を構成する一方の鎖の 3'側を規定する領域に対してァニール することができ、 かつ第 2のプライマーの 5'側には、 このプライマ一を起 点とする相補鎖合成反応生成物上の領域を構成する予測される塩基配列に相 補的な塩基配列を備える、
(d)第 1のプライマ一； ここで第 1のプライマ一はその 3'末端において前記 標的塩基配列を構成する他方の鎖の 3'側を規定する領域に対してァニール することができ、 かつ第 1のプライマーの 5，側には、 このプライマ一を起 点とする相補鎖合成反応生成物上の領域を構成する予測される塩基配列に相 補的な塩基配列を備える、
( e )ヌクレオチド基質
〔2〕 第 2のプライマ一、 および第 1のプライマーが、 いずれもその 5， 末端に配置された塩基配列が、 前記特定の領域、 またはその相補鎖の予測さ れる塩基配列に相補的な塩基配列を含み、 この 5'末端に配置された塩基配 列を錶型として合成された相補鎖は、 特定の領域、 またはその相補鎖にァニ ールして相補鎖合成の起点となるとき、 特定の領域を構成する塩基配列が予 測していたものでなかった場合に、 相補鎖合成が阻害されることを特徴とす る 〔 1〕 に記載の方法。
〔3〕 更に付加的に次の要素を存在させる 〔 1〕 に記載の方法。
'第 3のプライマー； ここで第 3のプライマ一は、 鍊型における第 1のブラ イマ一がァニールすべき領域の 3，側を起点とする相補鎖合成反応の起点とな る、 および
'第 4のプライマ一； ここで第 4のプライマ一は、 鎵型における第 2のブラ イマ一がァニールすべき領域の 3'側を起点とする相補鎖合成反応の起点とな る、
〔 4〕 標的塩基配列の塩基配列と類似する塩基配列を含む遺伝子が同じ試 料中に存在する可能性があるものである、 〔1〕 に記載の方法。
〔5〕 標的塩基配列の塩基配列と類似する塩基配列を含む遺伝子が、 ファ ミリ一遺伝子および Zまたは擬似遺伝子である 〔4〕 に記載の方法。
〔6〕 ファミリ一遺伝子および/または擬似遺伝子が、 チトクロム P 4 5 0ファミリー、 ヒト白血球組織適合型抗原、 および血小板同種抗原からなる 群から選択されるいずれかの遺伝子である 〔5〕 に記載の方法。
〔7〕 多型が 1塩基多型である、 〔 1〕 に記載の方法。
〔8〕 標的塩基配列が、 C型肝炎ウィルス、 インフルエンザウイルス、 マ ラリア、 およびへリコパクター ·ピロリからなる群から選択されるいずれか の病原性ウィルスまたは病原性微生物の遺伝子の塩基配列から選択される 〔 1〕 に記載の方法。
〔9〕 融解温度調整剤の存在下でインキュベートする 〔1〕 に記載の方法。 〔1 0〕 融解温度調整剤が、 ベタイン、 プロリン、 およびジメチルスルホキ シドから選択される少なくとも 1つの化合物である 〔9〕 に記載の方法。 〔1 1〕 核酸試料が 2本鎖の形態である 〔 1〕 に記載の方法。
〔1 2〕 核酸の検出剤存在下で 〔1〕 に記載の方法を行い、 検出剤のシグナ ル変化に基づいて変異および/または多型の存在を検出することを特徴とす る 〔 1〕 に記載の方法。
〔1 3〕 変異および または多型を検出すべき生物と同一の生物に由来し、 変異および/または多型を伴わないことが明らかな塩基配列を内部標準とし て利用し、 両者を錡型とする合成生成物の量の比較によって、 変異および/ または多型の存在を検出することを特徴とする 〔1〕 に記載の方法。
〔1 4〕 更に次の要素（f )および Zまたは (g)を存在させる 〔1〕 に記載の方 法。
( f )第 1のループプライマ一；ここで第 1のループプライマーは、 第 1のプ ライマ一の伸長生成物における第 1のプライマーに由来する領域と、 第 1の プライマ一に対する前記任意の領域の間において相補鎖合成の起点を与える ことができるものである
(g)第 2のループプライマ一；ここで第 2のループプライマ一は、 第 2のプ ライマ一の伸長生成物における第 2のプライマーに由来する領域と、 第 2の プライマ一に対する前記任意の領域の間において相補鎖合成の起点を与える ことができるものである、
〔1 5〕 前記特定の領域を構成する塩基配列が予測された塩基配列でなかつ た場合に、 第 1のプライマーおよび/または第 2のプライマーの 5，末端に 配置された塩基配列を鎵型として合成された相補鎖が、 特定の領域、 または その相補鎖にァニールするとき、 当該相補鎖の 3'末端から 2〜 4番目の塩 基においてミスマッチを生じることを特徴とする 〔1〕 に記載の方法。
〔1 6〕 次の要素を含む、 標的塩基配列における特定の領域の変異および/ または多型の検出用キットであって、 第 2および第 1のプライマーの少なく とも一方の 5'末端に配置された塩基配列が、 前記特定の領域、 またはその 相補鎖の予測される塩基配列に相補的な塩基配列を含み、 この 5'末端に配 置された塩基配列を錶型として合成された相補鎖は、 特定の領域、 またはそ の相補鎖にァニールして相補鎖合成の起点となるとき、 特定の領域を構成す る塩基配列が予測していたものでなかった場合に、 相補鎖合成が阻害される ことを特徴とするキット。
i )第 2のプライマ一；ここで第 2のプライマ一はその 3，末端において前記 標的塩基配列を構成する一方の鎖の 3'側を規定する領域に対してァニール することができ、 かつ第 2のプライマーの 5，側には、 このプライマーを起 点とする相補鎖合成反応生成物上の領域を構成する予測される塩基配列に相 補的な塩基配列を備えるものであり、
ii )第 1のプライマ一； ここで第 1のプライマ一はその 3，末端において前記 標的塩基配列を構成する他方の鎖の 3'側を規定する領域に対してァニール することができ、 かつ第 1のプライマーの 5，側には、 このプライマ一を起 点とする相補鎖合成反応生成物上の領域を構成する予測される塩基配列に相 補的な塩基配列を備えるものである、
ii i ) 鎖置換を伴う相補鎖合成を触媒することができる DNAポリメラーゼ iv)ヌクレオチド基質
〔1 7〕 更に次の要素を含む 〔1 6〕 に記載のキット。
V )錶型における第 1のプライマーがァニールすべき領域の 3，側にァニールし て相補鎖合成の起点となることができる第 3のプライマー、 および
V i )銪型における第 2のプライマ一がァニールすべき領域の 3'側にァニール して相補鎖合成の起点となることができる第 4のプライマー
〔1 8〕 更に次の要素を含む 〔1 6〕 に記載のキット。
vi i )内部標準を増幅することができる第 5のプライマー； ここで第 5のブラ イマ一は、 その 3'末端において内部標準の標的塩基配列を構成する一方の 鎖の 3'側を規定する領域に対してァニールすることができ、 かつ第 5のプ ラィマーの 5'側には、 このプライマ一を起点とする相補鎖合成反応生成物 の任意の領域を構成する塩基配列に相補的な塩基配列を備えるものであり、 そして
iix)内部標準を増幅することができる第 6のプライマー； ここで第 6のブラ イマ一はその 3'末端において内部標準の標的塩基配列を構成する一方の鎖 の 3'側を規定する領域に対してァニールすることができ、 かつ第 6のブラ イマ一の 5'側には、 このプライマ一を起点とする相補鎖合成反応生成物の 領域を構成する塩基配列に相補的な塩基配列を備えるものである、 〔1 9〕 更に次の要素を含む 〔1 8〕 に記載のキット。
ix)銪型における第 5のプライマーがァニールすべき領域の 3，側にァニール して相補鎖合成の起点となることができる第 7のプライマー、 および
X )錡型における第 6のプライマーがァニールすべき領域の 3 '側にァニールし て相補鎖合成の起点となることができる第 8のプライマ一
〔2 0〕 以下の工程を含む標的塩基配列の特定の領域における変異および/ または多型の検出方法であって、 第 2および第 1のプライマーの少なくとも 一方の 5'末端に配置された塩基配列が、 前記特定の領域、 またはその相補 鎖の予測される塩基配列に相補的な塩基配列を含み、 この 5'末端に配置さ れた塩基配列を錶型として合成された相補鎖は、 特定の領域、 またはその相 補鎖にァニールして相補鎖合成の起点となるとき、 特定の領域を構成する塩 基配列が予測していたものでなかった場合に、 相補鎖合成が阻害されること を特徴とする方法。
a ) 標的塩基配列に第 1のプライマ一をァニールさせ、 これを起点とする相 補鎖合成反応を行う工程；ここで第 1のプライマ一はその 3'末端において 前記標的塩基配列を構成する一方の鎖の 3'側を規定する領域に対してァニ ールすることができ、 かつ第 1のプライマ一の 5，側には、 このプライマー を起点とする相補鎖合成反応生成物上の領域を構成する予測される塩基配列 に相補的な塩基配列を備える、
b ) 工程 a ) で合成された第 1のプライマーの伸長産物における第 2のブラ イマ一がァニールすべき領域を塩基対結合が可能な状態とし、 両者をァニー ルさせて第 1のプライマーの伸長産物を錡型とする相補鎖合成を行う工程； ここで第 2のプライマーはその 3'末端において前記標的塩基配列を構成す る他方の鎖の 3'側を規定する領域に対してァニールすることができ、 かつ 第 2のプライマーの 5'側には、 このプライマ一を起点とする相補鎖合成反 応生成物上の領域を構成する予測される塩基配列に相補的な塩基配列を備え る、
c ) 第 2のプライマーの伸長生成物の 3'末端と、 該伸長生成物における第 1 のプライマ一に対する前記予測される塩基配列をァニールさせて自身を錄型 とする相補鎖合成を行う工程、
d ) 工程 c ) で合成された相補鎖における 3'末端と、 該伸長生成物におけ る第 2のプライマーに対する前記予測される塩基配列をァニールさせて自身 を踌型とする相補鎖合成を行う工程、
e ) 第 2のプライマーを起点とする合成生成物の量を特定の領域における変 異および/または多型の存在と関連付ける工程、
〔2 1〕 工程 b ) が、 錡型における銪型における第 1のプライマーがァニ一 ルすべき領域の 3，側をを起点とする第 3のプライマーの相補鎖合成反応によ る置換によって第 1のプライマーの伸長生成物を 1本鎖とする工程を含む 〔2 0〕 に記載の方法。
〔2 2〕 工程 c ) が、 鍊型における第 2のプライマーがァニールすべき領域 の 3，側を起点とする第 4のプライマーの相補鎖合成反応による置換によって 第 2のプライマーの伸長生成物を 1本鎖とする工程を含む 〔2 0〕 に記載の 方法。
〔2 3〕 更に以下の工程を含む 〔2 0〕 に記載の方法であって、 第 2および 第 1のプライマ一の少なくとも一方の 5'末端に配置された塩基配列が、 前 記特定の領域、 またはその相補鎖の予測される塩基配列に相補的な塩基配列 を含み、 この 5'末端に配置された塩基配列を錡型として合成された相補鎖 は、 特定の領域、 またはその相補鎖にァニールして相補鎖合成の起点となる とき、 特定の領域を構成する塩基配列が予測していたものでなかった場合に、 相補鎖合成が阻害されることを特徴とする方法。 1 ) 〔2 0〕 に記載の方法において、 工程 c ) の 3'末端と自身の前記予測 される塩基配列とのァニールによって、 第 1のプライマーの 3'末端に相補 的な塩基配列を含む塩基対結合が可能なループ形成領域を形成するとともに、 自身の 3'末端を相補鎖合成の起点とし、 自身を鍊型とする相補鎖合成反応 を行う工程、
2 ) ループ形成領域に第 1のプライマ一をァニールさせて、 鎖置換を伴う相 補鎖合成を触媒することができる DNAポリメラ一ゼによりそれを起点とする 相補鎖合成を行う工程、
3 ) ループ形成領域にァニールするブラィマーを起点とする相補鎖合成反応 によって、 自身の 3'末端からの伸長生成物を置換し、 その 3'末端と前記予 測される塩基配列を再び塩基対結合が可能な状態とする工程、
4 ) 工程 3 ) によって塩基対結合が可能となった 3'末端を前記予測される 塩基配列にァニールさせて相補鎖合成の起点とし、 自身を銪型とする相補鎖 合成反応を行うことによって、 ループ形成領域を起点として合成された相補 鎖を置換して 1本鎖の核酸を生成する工程
5 ) 3'末端の第 2のプライマーに対する前記予測される塩基配列に対するァ ニールと相補鎖合成によって、 第 2のプライマ一の 3'末端に相補的な塩基 配列を含む塩基対結合が可能なループ形成領域を形成する工程、
6 ) ループ形成領域に第 2のプライマ一をァニールさせて、 鎖置換を伴う相 補鎖合成を触媒することができる DNAポリメラーゼによりそれを起点とする 相補鎖合成を行う工程、
7 ) 工程 3 ) - 6 ) を繰り返す工程、 および
8 ) 工程 7 ) の後に、 および/または工程 7 ) と並行して標的塩基配列とそ の相補鎖とが繰り返し連結された 1本鎖核酸の生成を観察し、 その生成量を 変異および/または多型と関連付ける工程 4〕 更に次の工程を含む、 〔23〕 に記載の方法。
9) 工程 4) で生成する 1本鎖の核酸の 3'末端を第 2のプライマーに対す る前記予測される塩基配列にァニールさせて、 第 2のプライマーの 3'末端 に相補的な塩基配列を含む塩基対結合が可能なループ形成領域を形成すると ともに、 自身の 3'末端を相補鎖合成の起点とし、 自身を錶型とする相補鎖 合成反応を行う工程、 予測される塩基配列
10) 3'末端と自身の前記特定の領域とのァニールによって形成された、 ル ープ形成領域に第 2のプライマ一をァニールさせて、 鎖置換を伴う相補鎖合 成を触媒することができる DNAポリメラーゼによりそれを起点とする相補鎖 合成を行う工程、
1 1) ループ形成領域にァニールするプライマ一を起点とする相補鎖合成反 応によって、 自身の 3'末端からめ伸長生成物を置換し、 その 3'末端と前記 予測される塩基配列を再び塩基対結合が可能な状態とする工程、
12) 工程 1 1) によって塩基対結合が可能となった 3'末端を前記予測さ れる塩基配列にァニールさせて相補鎖合成の起点とし、 自身を錡型とする相 補鎖合成反応を行うことによって、 ループ形成領域を起点として合成された 相補鎖を置換して 1本鎖の核酸を生成する工程、
13) 3'末端の前記予測される塩基配列に対するァニールと相補鎖合成によ つて、 第 1のプライマーの 3'末端に相補的な塩基配列を含む塩基対結合が 可能なループ形成領域を形成する工程、
14) ループ形成領域に第 1のプライマ一をァニールさせて、 鎖置換を伴う 相補鎖合成を触媒することができる DNAポリメラ一ゼによりそれを起点とす る相補鎖合成を行う工程、
15) 工程 1 1) 一 14) を繰り返す工程、 および
16) 工程 15) の後に、 および/または工程 15) と並行して標的塩基配 列とその相補鎖とが繰り返し連結された 1本鎖核酸の生成を観察し、 その生 成量を変異および/または多型と関連付ける工程
〔2 5〕 更に次の工程を含む、 〔2 4〕 に記載の方法。
1 7 ) 工程 1 2 ) において生成する 1本鎖の核酸の 3'末端を自身の前記予 測される塩基配列にァニールさせて、 第 1のプライマーの 3'末端に相補的 な塩基配列を含む塩基対結合が可能なループ形成領域を形成するとともに、 自身の 3'末端を相補鎖合成の起点とし、 自身を鍊型とする相補鎖合成反応 を行う工程、
〔2 6〕 第 2のプライマー、 および第 1のプライマーが、 いずれもその 5， 末端に配置された塩基配列が、 前記特定の領域、 またはその相補鎖の予測さ れる塩基配列に相補的な塩基配列を含み、 この 5'末端に配置された塩基配 列を錶型として合成された相補鎖は、 特定の領域、 またはその相補鎖にァニ ールして相補鎖合成の起点となるとき、 特定の領域を構成する塩基配列が予 測していたものでなかった場合に、 相補鎖合成が阻害されることを特徴とす る 〔2 0〕 に記載の方法。
[用語の定義]
本発明において、 以下の用語はそれぞれ次のような意味で用いられる。
変異：本発明において、 変異とは、 起源を同一とする生物 （ウィルスを含む） 個体間に見られる核酸塩基配列の差異をいう。 多細胞生物においては個体内での 器官や細胞などの間に見られる差異も変異に含まれる。 変異は、 点変異、 欠質、 挿入、 重複、 逆位、 転座によって生じる。 また、 変異は遺伝子領域 （タンパク質 のコード領域およびイントロン配列） に生じることもあれば、 プロモ一夕一ゃェ ンハンサ一のような発現調節領域に生じる場合もある。 あるいは、 それ以外のゲ ノム配列上に見いだされる塩基配列の差異も変異に含むものとする。 多型：上記変異のうち、 ある集団内で 1 %以上の頻度で存在するものを特に多 型と呼ぶ。 多型の中でも、 特に 1塩基の置換、 挿入、 あるいは欠失からなる多型 を、 1塩基多型（Single Nucleic Polymorphism; SNPs)と呼ぶ。
標的塩基配列：標的塩基配列は、 検出すべき変異や多型が含まれる塩基配列で あって、 プライマ一によって 3'側が規定された領域を構成する塩基配列を意味 する。 以下本明細書において単に 5'側、 あるいは 3'側と表現するときには、 い ずれも錡型となっている方の鎖における方向を意味している。 言いかえれば、 本 発明におけるプライマーがァニールする領域に挟まれて存在する塩基配列が、 本 発明における標的塩基配列を構成する。 一般に核酸の塩基配列は、 5'側から 3' 側に向けてセンス鎖の塩基配列を記載する。 本発明における標的塩基配列とは、 センス鎖の塩基配列に加えて、 その相補鎖、 すなわちアンチセンス鎖の塩基配列 も含む。 すなわち、 用語「標的塩基配列」 とは、 合成すべき塩基配列、 およびそ の相補鎖の少なくともいずれかを意味する用語として用いる。標的塩基配列は、 後に述べる特定の領域を含んでいる。
特定の領域：前記標的塩基配列に含まれ、 検出すべき変異や多型が存在する領 域が、 特定の領域である。 本発明の検出方法においては、 特定の領域に予測され る塩基配列に相補的な塩基配列を 5'側に付加した相補鎖が合成される。 なお特 定の領域に相補的な塩基配列は、 合成される相補鎖の 5'末端を構成するように 付加しなければならない。
予測される塩基配列：予測される塩基配列とは、 野生型の塩基配列であること もできるし、 特定の変異を含む塩基配列を予測される塩基配列として用いること もできる。 予測される塩基配列に野生型の塩基配列を用いた場合は、 標的塩基配 列中の野生型塩基配列の有無が見出されることになり、 予測される塩基配列に特 定の変異や多型の塩基配列を用いれば、 標的塩基配列中の特定の変異や多型の塩 基配列の有無が検出される。 3'末端、 あるいは 5'末端： 3'末端、 あるいは 5'末端とは、 単にいずれかの末 端の 1塩基のみならず、 末端の 1塩基を含み、 かつ末端に位置する領域を意味す る。 より具体的には、 いずれかの末端から 5 0 0塩基、 望ましくは 1 0 0塩基、 あるいは少なくとも 2 0塩基は、 3'末端、 あるいは 5'末端に含まれる。 これに 対して、 末端の 1塩基や末端付近に存在する特定の位置の塩基を示すためには、 その位置を数値で特定することによって示すものとする。
錡型と相補鎖：本発明において用いられる鎵型という用語は、 相補鎖合成の鎵 型となる側の核酸を意味する。 錶型に相補的な塩基配列を持つ相補鎖は、 錶型に 対応する鎖としての意味を持つが、 両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎ ない。 すなわち、 相補鎖として合成された鎖は、 再び錶型として機能することが できる。 つまり、 相補鎖は铸型になることができる。
核酸の合成（synthesis)と増幅（ampl ification)：本発明における核酸の合成 とは、 合成起点となったオリゴヌクレオチドからの核酸の伸長を意味する。 合成 に加えて、 更に他の核酸の生成と、 この生成された核酸の伸長反応とが連続して 起きるとき、 一連の反応を総合して増幅という。
ァニール： 「ァニール」 と 「ハイブリダィズ」 は、 核酸がワトソン—クリック のモデルに基づく塩基対結合によって 2重らせん構造（double helix structur e )を形成することを意味する。 したがって、 塩基対結合を構成する核酸鎖が 1 本鎖であっても、 分子内の相補的な塩基配列が塩基対結合を形成すれば、 ァニ一 ル、 あるいはハイブリダィズである。 本発明において、 ァニールとハイブリダィ ズは、 核酸が塩基対結合による 2重らせん構造を構成する点で同義である。 塩 基対結合した 3'末端が相補鎖合成の起点となるときに、 特にァニールという場 合がある。 ただし、 ハイブリダィズが相補鎖合成の起点となることを否定するも のではない。
実質的に同じ塩基配列：ある配列を錡型として合成された相補鎖が、 目的の塩 基配列に対してァニールし相補鎖合成の起点を与えるとき、 このある配列は目的 の塩基配列に対して実質的に同一である。 本発明において同一、 あるいは相補的 という用語は、 いずれも完全に同一でない場合、 あるいは完全に相補的でない場 合を含む。 すなわち、 ある配列と同一とは、 ある配列に対してァニールすること ができる塩基配列に対して相補的な配列をも含むことができる。 他方、 相補的と は、 ストリンジヱントな条件下でァニールすることができ、 相補鎖合成の起点と なる 3'末端を提供することができる配列を意味する。 具体的には、 ある塩基配 列に対して、 一般に 5 0— 1 0 0 %、 通常は 7 0— 1 0 0 %、 好ましくは 8 0— 1 0 0 %の同一性を有する塩基配列は、 実質的に同一と言うことができる。 同一 性は BLAST等の公知のアルゴリズムに基づいて決定することができる。
[原理の説明]
本発明による変異や多型の検出方法は、 次のような原理に基づいて標的塩基配 列における特定の領域の塩基配列チェック機構を実現している。 まず本発明にお いては、 下記第 2のプライマ一および第 1のプライマ一を用いる。 本発明に用い る第 2のプライマ一と第 1のプライマ一は、 それぞれその 3'末端に標的塩基配 列の 3'側の塩基配列に対してァニールすることができる塩基配列を備え、 かつ 5'末端には、 その 3'末端を起点とする伸長生成物における任意の領域に相補的 な塩基配列を配置する。 そして第 2および第 1のプライマーの少なくとも一方の 5'末端に配置された塩基配列が、 前記特定の領域、 またはその相補鎖の予測さ れる塩基配列に相補的な塩基配列を含むようにする。 ブライマーの 5'末端に配 置された塩基配列を錶型として合成された相補鎖は、 特定の領域、 またはその相 補鎖にァニールして相補鎖合成の起点となるとき、 特定の領域を構成する塩基配 列が予測していたものでなかつた場合に、 相補鎖合成が阻害されることを利用し て、 塩基配列がチヱックされる。 3'末端が特定の領域 （またはその相補鎖） に ァニールして相補鎖合成の起点となるときには、 常にチヱック機構が働くことか ら、 特定の領域の塩基配列の相違を反応生成物の量の差として明瞭に検出するこ とができる。
以上のような反応原理に基づいて実際に変異および/または多型の検出を行う には、 例えば以下のような反応を利用することができる。 すなわち本発明は、 以 下の工程を含む標的塩基配列の特定の領域における変異および/または多型の検 出方法であって、 第 2および第 1のプライマーの少なくとも一方の 5'末端に配 置された塩基配列が、 前記特定の領域、 またはその相補鎖の予測される塩基配列 に相補的な塩基配列を含み、 この 5'末端に配置された塩基配列を錡型として合 成された相補鎖は、 特定の領域、 またはその相補鎖に対してァニールして相補鎖 合成の起点となるとき、 特定の領域を構成する塩基配列が予測していたものでな かった場合に、 相補鎖合成が阻害されることを特徴とする方法に関する。
a ) 標的塩基配列に第 1のプライマーをァニールさせ、 これを起点とする相補鎖 合成反応を行う工程；ここで第 1のプライマ一はその 3，末端において前記標的 塩基配列を構成する一方の鎖の 3'側を規定する領域に対してァニールすること ができ、 かつ第 1のプライマーの 5'側には、 このプライマ一を起点とする相補 鎖合成反応生成物上の領域を構成する予測される塩基配列に相補的な塩基配列を 備える、
b ) 工程 a ) で合成された第 1のプライマーの伸長産物における第 2のプライマ —がァニールすべき領域を塩基対結合が可能な状態とし、 両者をァニールさせて 第 1のプライマーの伸長産物を銪型とする相補鎖合成を行う工程；ここで第 2の プライマ一はその 3'末端において前記標的塩基配列を構成する他方の鎖の 3'側 を規定する領域に対してァニールすることができ、 かつ第 2のプライマーの 5' 側には、 このプライマーを起点とする相補鎖合成反応生成物上の領域を構成する 予測される塩基配列に相補的な塩基配列を備える、
c ) 第 2のプライマーの伸長生成物の 3，末端と、 該伸長生成物における第 1の プライマ一に対する前記予測される塩基配列をァニールさせて自身を鎵型とする 相補鎖合成を行う工程、
d ) 工程 c ) で合成された相補鎖における 3'末端と、 該伸長生成物における第 2のプライマーに対する前記予測される塩基配列をァニールさせて自身を錡型と する相補鎖合成を行う工程、
e ) 第 2のプライマーを起点とする合成生成物の量を特定の領域における変異お よび/または多型の存在と関連付ける工程
本発明において、 第 および/または第 1のプライマーの伸長生成物の 3'末 端は自身が持つ特定の領域にァニールし、 自身を錶型とする相補鎖合成の起点と なる。 このとき、 特定の領域を構成する塩基配列が予測された塩基配列であれば、 3'末端を起点として相補鎖合成が進行する。 逆に予測された塩基配列と異なつ ていた場合には、 3'末端を相補鎖合成の起点とすることができず、 相補鎖合成 が阻害される。 その結果、 3'末端をプライマーとする自身を踌型とした相補鎖 の合成生成物を指標として、 特定の領域における塩基配列が予測されたものかど うかを知ることができる。
このとき合成される相補鎖は、 自身の 5'末端に達して完了する。 本発明にお いては、 5'末端には常にプライマーの 5'末端に配置された塩基配列が存在する。 つまり、 鎊型の 5'末端には伸長生成物における任意の領域に相補的な塩基配列 が付加されている。 したがつてこれを鍊型として合成される相補鎖においては、 その 3'末端に任意の領域に対してァニールすることができる塩基配列が再現さ れることになる。 この後、 何らかの手段でその 3，末端と、 それがァニールすベ き任意の領域とが塩基対結合が可能な状態となれば、 再び自身を鎵型とする相補 鎖合成が開始される。
さて、 本発明においては、 第 2のプライマーおよび第 1のプライマーの少な くともいずれか一方には、 そのプライマーの 3'末端を起点として生成された伸 長生成物における特定の領域 （またはその相補鎖） に相補的な塩基配列がその 5 '末端に配置されている。 以下の説明において、 5'末端に特定の領域 （またはそ の相補鎖） に相補的な塩基配列が配置された第 2のプライマ一または第 1のプ ライマ一を、 特にチェックプライマーと記載することがある。
したがって、 チヱックプライマーの 5'末端を錡型として生成した伸長生成物 の 3，末端は、 特定の領域 （またはその相補鎖） にァニールするたびに、 その塩 基配列をチェックすることになる。 そしてこの相補鎖合成が開始するかどうかは、 特定の領域が予測された塩基配列で構成されているかどうかによつて決定される c このように、 自身を銪型として進行する相補鎖合成反応が、 繰り返し特定の領域 における塩基配列のチェックを経て進行することが本発明の重要な特徴である。 この特徴により、 たとえ誤って相補鎖合成が行われた場合であっても、 その産物 が銪型として次の相補鎖合成が行われるときに、 再び塩基配列のチェック機構が 働く。 その結果、 以降の相補鎖合成が阻害されることから、 本発明においては、 誤った相補鎖合成によって生じるノィズを劇的に抑制することができる。
さて、 本発明の原理に基づいて実際に変異および/または多型の検出を行うた めの上記のような反応は、 実際には、 以下のような要素を適切な条件の基でイン キュべ一卜するだけで進行する。 すなわち本発明は、 次の要素を、 第 2および第 1のプライマーを起点とする相補鎖合成が可能な条件下でィンキュベートし、 標 的塩基配列を鎵型とする相補鎖合成反応生成物の量と特定の領域における変異お よび/または多型の存在と関連付ける工程を含む、 前記変異および/または多型 の検出方法であって、 第 2および第 1のプライマーの少なくとも一方にチェック プライマーを用いることを特徴とする方法である。
( a )標的塩基配列を含む核酸試料、
(b)鎖置換を伴う相補鎖合成を触媒することができる DNAポリメラーゼ
( c )第 2のプライマー； ここで第 2のプライマ一はその 3'末端において前記標的 塩基配列を構成する一方の鎖の 3'側を規定する領域に対してァニールすること ができ、 かつ第 2のプライマーの 5'側には、 このプライマーを起点とする相補 鎖合成反応生成物上の領域を構成する予測される塩基配列に相補的な塩基配列を 備える、
(d)第 1のプライマー； ここで第 1のプライマ一はその 3'末端において前記標的 塩基配列を構成する他方の鎖の 3'側を規定する領域に対してァニールすること ができ、 かつ第 1のプライマーの 5，側には、 このプライマーを起点とする相補 鎖合成反応生成物上の領域を構成する予測される塩基配列に相補的な塩基配列を 備える、
(e)ヌクレオチド基質
第 2のプライマ一および第 1のプライマーに基づく核酸の増幅方法は、 既に 本発明者らが報告した LAMP法 （Nucleic Acid Res. 2000 Vol .28 No.12 e63、 W 0 00/28082)に他ならない。 しかし LAMP法を構成するプライマーの少なくとも いずれかをチェックプライマ一として変異や多型の検出方法に用いたときに、 塩 基配列の高度なチェック機能を期待できることは、 本発明によって明らかにされ た新規な知見である。
上記反応を構成している第 1のプライマーは、 次の領域から構成されている。 X 2 ：標的塩基配列の 3'側を規定する X 2 cに相補的な塩基配列を持つ領域 X 1 c ：前記 X 2 cの 5'側に位置し、 第 1のプライマーの伸長生成物上に存 在する領域 X 1に予測される塩基配列に対して相補的な塩基配列を備えるもので ある。 X Iは、 第 1のプライマーの伸長生成物におけるそのプライマーの 3，末 端から特定の塩基配列を含む配列の間の任意の領域の配列である。 ここで X I c は、 任意の領域 X 1 cに予測される塩基配列と実質的に同じ塩基配列を持つ領域 と表現することもできる。
以下に、 LAMP法の反応原理と、 本発明への応用について、 図 1〜図 4を参照 しながら説明する。 ここで、 仮に第 1のプライマ一 F A、 および第 2のプライ マー R Aを想定する。 F Aは、 前記 X 2に相当する F 2と、 X I cに相当する F l cとで構成されている。 F Aを構成する F l cは、 F l cに対して実質的に同 一な塩基配列を含む。 本発明において、 たとえば前記 F 1のように任意に選択さ れる領域は、 その領域に相補的な塩基配列を持つポリヌクレオチドをァニールす ることができ、 そしてそのポリヌクレオチドを合成起点として合成される相補鎖 が本発明に必要な機能を備えている限り、 任意の領域から選択することができる 一方本発明における第 2のプライマー R Aとしては、 前記 X 2に相当する R 2 と、 X 1 cに相当する R 1 cとで構成されるプライマーを組み合わせることがで きる。 ここで、 たとえば R Aをチェックプライマ一とする場合には、 R l c^i F Aの伸長生成物における検出すべき変異および/または多型が存在する特定の領 域 R 1 cとして予測される塩基配列で構成され、 また R 2は F Aの伸長生成物に おける任意の領域を構成する塩基配列 R 2 cに相補的な塩基配列からなる。
チェックプライマ一 R Aを用いて本発明の検出方法を行うとき、 F Aをチエツ クプライマ一とすることもできる。 後に述べるように、 チェックプライマー R A を用いて相補鎖合成反応を行うとき、 F Aの伸長生成物は、 その 3'末端が常に 塩基対結合が可能な状態となり、 自身を錶型とする相補鎖合成反応を繰り返す。 その一方で、 R Aの伸長生成物が 1本鎖の状態で連続的に生成される。 更に R A の伸長生成物自身も F Aと同様に、 その 3'末端によって自身を錄型とする相補 鎖合成反応を繰り返す。 このとき、 F Aをチェックプライマ一とすることにより、 F Aの伸長生成物による塩基配列のチ ック機構をも実現することができるので ある。 本発明において、 F Aによってもたらされる相補鎖合成による特定の領域 の塩基配列のチヱック機構は、 実は前記 R Aによる塩基配列のチェック機構と全 く同じ原理で進行している。 つまり、 特定の領域の相補鎖に対して、 同じ原理を 適用することに他ならない。
ここで、 F Aと R Aの両方をチェックプライマーとして用いる場合の反応をよ り詳細に説明する。 R Aがチ:! Iックプライマーであれば、 R 1を起点とする相補 鎖合成 [図 4— ( 9 ) ] は阻害を受けるはずである。 同様に F Aがチェックブラ イマ一の場合は F 1を起点とする相補鎖合成反応 [図 3— ( 8 ) ] が阻害される。 しかし PCRがそうであったように、 わずかな塩基配列の相違をポリヌクレオチ ドのァニールの特異性によって識別することは、 現実的ではない。 本発明に基づ く反応も例外ではなく、 特定の領域が予測した塩基配列でない場合に相補鎖合成 が阻害されるとはいえ、 反応を完全に阻止できない場合を想定するのが現実的で ある。
さて、 特定の領域が予測した塩基配列でないのにもかかわらず、 万が一相補鎖 合成が阻止できなかった場合について以下に考察する。 なお図 1〜図 4では、 F 1と R 1 c (あるいは R 1と F 1 c ) が分離して記載されている。 これらの図で は、 F Aと R Aのいずれか一方のみをチェックプライマ一として用いる場合の反 応を示している。
他方、 F Aと R Aの両方をチェックプライマーとするときには、 いずれの方向 からも特定の領域に対して相補的な塩基配列がァニールすることになる。 したが つて、 R 1がァニールすべき R 1 cの少なくとも一部は、 F 1と重複する。 同時 に、 その相補鎖である F 1 cは、 少なくともその一部が R 1と重複する。
まず F 1を起点とする相補鎖合成反応 [図 3— ( 8 ) ] で誤って相補鎖合成が 行われた場合を想定する。 誤って合成された伸長生成物に対して、 まず最初に R 1が特定の領域にァニールして相補鎖合成が行われる。 R Aはチェックプライマ 一だが、 それを錡型として合成された 3'末端 R 1がァニールするのは、 実は F Aの 3'末端であった領域を含んでいる。 つまり、 予測した塩基配列となってい るためにチェック機構が働かず相補鎖合成が進んでしまう。 しかし、 この相補鎖 合成が 5'末端に達したときには、 その 3'末端はチェックブライマーである F A の 5'末端を鎵型とする相補鎖となっている。 そしてこの 3'末端は、 再び特定の 領域に対してァニールすることになり、 このときにはチェック機構が働く。 以上のように、 F Aと R Aの両方をチェックプライマ一とする場合、 F Aのチ ェック機構が機能するときには、 R Aのチェヅク機構が機能できない場合がある ことは事実である。 しかし現実には、 標的塩基配列が 2本鎖の場合には、 R Aと F Aが図 1〜図 4に示すとおりの順番で反応する確率は、 理論的には 1 / 2であ る。 残る 1 / 2の反応は、 図 1〜図 4とは対称的な順番で反応する。 言い換えれ ば、 残る 1 / 2の反応を説明するために、 図 1〜図 4における 「F」 と 「R」 を 読み換える必要がある。 なぜなら、 R Aと F Aは、 標的塩基配列を構成する 2本 鎖のそれぞれに対してァニールし、 以降の反応もまったく同じように進行するた めである。
あるいは、 本発明による反応を図 1〜図 4に基づいて説明するときに、 R A (あるいは F A ) は、 標的塩基配列のいずれかの鎖にァニールする特定のプライ マーを想定しているのではない、 と言うこともできる。 つまり、 単に先にァニ一 ルした方を便宜上 R Aとして説明しているのにすぎないということになる。 このような事実に基づけば、 F Aに加えて R Aがチェックプライマーであるこ との意義が容易に理解できるであろう。 つまり、 先に述べた F Aの相補鎖による チェック機構と同様のチェック機構が、 相補鎖においても働くことから、 反応系 全体で見ると、 結果としてより多くのチェック機構が働くことになるのである。 したがって、 F Aと R Aの両方をチェックプライマーとすることは、 本発明の望 ましい態様の一つである。
本発明に基づくチェック機構について、 更に説明する。 本発明においては、 た とえ F Aと R Aの両方をチェックプライマ一とした場合であっても、 理論的に本 発明のチヱック機構が作用しない反応もいくつか起きることは事実である。 具体 的には、 チェックプライマーの 5'末端由来の塩基配列を含んだ領域に近接する ループ部分に対して、 ァニールしたプライマ一からの伸長生成物は、 その 3，末 端が、 特定の領域ではなく、 いずれプライマーに由来する塩基配列に対してァニ —ルすることになる。 3'末端が特定の領域ではなくプライマー由来の塩基配列 にァニールするときは、 チェック機構が働かなくなる。 しかし、 本発明において 重要なことは、 このようなチエツク機構が働かなくなる生成物ができるまでに、 何度もチェック機構が作用することである。 ここで、 特定の領域が予測した塩基配列でないのにも関わらず、 反応が進行す る割合を仮に Aとし、 チヱック機構が働かない生成物ができるまでにチヱック機 構が作用した回数を nとすると、 本発明においてチェック機構が働かない生成物 ができる割合 Xは、 A nで表される。 たとえば 5 %の割合でチェック機構をすり 抜ける反応が生じてしまう場合であっても、 チェック機構が 3回作用するだけで、 割合 Xは 0 . 0 5 3 = 0 . 0 0 0 1 2 5 ( 0 . 0 1 % ) となる。 つまりチェック 機構が 1回しか作用できない場合に比べて、 その危険性をおよそ 1 / 5 0 0にす ることができるのである。 このように、 本発明では 1回のチェック機構しか働か ない反応に比べて、 チエツク機構が働かない生成物を生じる可能性が著しく小さ くなることが明らかである。
前記標的塩基配列とは、 検出対象、 あるいは検出対象から誘導された核酸の一 部、 あるいは全てを構成する。 標的塩基配列は 2本鎖であっても、 1本鎖であつ ても良い。 2本鎖の場合には、 標的塩基配列を規定する各鎖の 3'末端、 並びに この標的塩基配列の中に位置する特定の領域は、 少なくともその一部の塩基配列 が明らかとなっている、 あるいは推測が可能な状態にある。 また標的塩基配列が 1本鎖として存在する場合には、 その 3'側を規定する塩基配列と、 想定される 相補鎖の 3'側の塩基配列、 そして標的塩基配列中に位置する特定の領域は、 少 なくともその一部の塩基配列が明らかとなっている、 あるいは推測が可能な状態 にある。 塩基配列を明らかにすべき部分とは、 前記 3'末端 X 2 cおよびその 5' 側に位置する特定の領域 X 1 cである。 本発明の特定の領域には、 変異および Z または多型が予測される塩基が含まれている。 そして本発明におけるチェックプ ライマーは、 特定の領域における変異および/または多型が予測される塩基が、 予測された塩基ではなかつた場合に、 相補鎖合成反応が阻害されるように設計し なければならない。
本発明のチェックプライマーは、 たとえば次のように設計される。 すなわち、 チェックプライマーを錡型として相補鎖を合成したときに、 合成された相補鎖の 3'末端付近が、 変異や多型が予想される塩基に相補的な位置に相当するように 設計される。 相補鎖の合成起点となる 3'末端や、 その付近にミスマッチが存在 すると核酸の相補鎖合成反応は著しく阻害される。 より具体的には、 相補鎖合成 の起点となる 3'末端〜 1 0塩基以内、 特に望ましくは 3'末端からカウントして 2〜4番目、 より望ましくは 2〜3番目の塩基にミスマッチがある場合には、 相 補鎖合成が著しく阻害される。 したがって、 本発明において検出すべき変異や多 型の存在 （あるいは不存在） によって、 この部分にミスマッチを生じるようにチ エックブライマ一の 5'側の塩基配列を設計するのが望ましい。
本発明においては、 反応初期の生成物における末端構造が繰り返し反応を行わ なければ高度な増幅反応に結びつかない。 したがって、 たとえ誤った合成が行わ れたとしても、 増幅反応を構成する相補鎖合成がいずれかの段階で妨げられるの でミスマッチを含んだままでは高度な増幅は起きない。 結果的にミスマッチが増 幅反応を効果的に抑制し、 最終的には正確な結果をもたらすことになる。 つまり 本発明に基づく核酸の増幅反応は、 より完成度の高い塩基配列のチ工ック機構を 備えていると言うことができる。 これらの特徴は、 たとえば単純に 2つの領域で 増幅反応を行っている P C R法などでは期待しにくい利点である。
更に本発明に用いるプライマ一を特徴付ける領域 X 1 cは、 相補配列が合成さ れてはじめて合成起点となり、 この相補配列が、 新たに合成された同一鎖内の配 列 X 1にァニールすることにより、 自己を錶型とする合成反応が進行する。 この ため、 たとえ先行技術でしばしば重要な問題となるいわゆるプライマーダイマ一 を生成しても、 本発明に用いるプライマーはループを形成しない。 したがって、 プライマーダイマーに起因する非特異的な増幅は原理的に生じ得ず、 反応の特異 性向上に貢献する。
これらの 2つの領域 X 2 cおよび X 1 c (標的塩基配列となる核酸においては、 X 2および X I ) は、 連続する場合、 そして離れて存在する場合とを想定するこ とができる。 両者の相対的な位置関係により、 生成物である核酸が自己ァニール したときに形成されるループ部分の状態が決定される。 また、 生成物である核酸 が分子間のァニールではなく自己ァニールを優先的に行うためには、 両者の距離 が不必要に離れないほうが望ましい。 したがって、 両者の位置関係は、 通常 0-5 00塩基分の距離を介して連続するようにするのが望ましい。 ただし、 後に述べ る自己ァニールによるループの形成において、 両者があまりにも接近している場 合には望ましい状態のループの形成を行うには不利となるケースも予想される。 ループにおいては、 新たなプライマ一のァニールと、 それを合成起点とする鎖置 換を伴う相補鎖合成反応がスムーズに開始できる構造が求められる。 したがって より望ましくは、 領域 X 2 cおよびその 5'側に位置する領域 X 1 cとの距離が、 0〜 1 0 0塩基、 さらに望ましくは 1 0〜7 0塩基となるように設計する。 なお この数値は X 1 cと X 2を含まない長さを示している。 ループ部分を構成する塩 基数は、 更に X 2に相当する領域を加えた長さとなる。
上記特定の塩基配列を持つ核酸に対して本発明に用いるプライマーを構成す る領域 X 2および X I cは、 通常は重複することなく連続して配置される。 ある いはもしも両者の塩基配列に共通の部分があるのであれば、 部分的に両者を重ね て配置することもできる。 X 2はプライマ一として機能する必要があることから、 常に 3'末端となるようにしなければならない。 一方 X I cは、 後に述べるよう に、 これを銪型として合成された相補鎖の 3'末端にプライマーとしての機能を 与える必要があることから、 5'末端に配置する。 このプライマ一を合成起点と して得られる相補鎖は、 次のステップにおいては逆向きからの相補鎖合成の錶型 となり、 最終的にはプライマ一部分も錡型として相補鎖に写し取られる。 写し取 られることによって生じる 3'末端は塩基配列 X 1を備えており、 同一鎖上の X 1 cにァニールするとともに、 ループを形成する。 このとき、 錶型における 5' 末端に含まれているプライマーがチェックプライマ一であれば、 X I cは、 特定 の領域に対してァニールすることになる。 本発明に用いるプライマーとは、 相補的な塩基対結合を形成できること、 そし てその 3'末端において相補鎖合成の起点となる- 0H基を与えること、 の 2つの 条件を満たすオリゴヌクレオチドを意味する。 したがって、 そのバックボーンは 必ずしもホスホジエステル結合によるものに限定されない。 たとえば 0ではな く Sをバックボーンとしたホスホチォェ一ト体であることもできる。 また、 塩 基は、 相補的な塩基対結合を可能とするものであれば良い。 天然の状態では、 一 般には ACTGおよび Uの 5種類となるが、 たとえばブロモデォキシゥリジン（bro modeoxyur i d i ne )といった類似体であることもできる。 本発明に用いるオリゴヌ クレオチドは、 合成の起点となるのみならず、 相補鎖合成の錶型としても機能す るものであることが望ましい。
本発明に用いるプライマ一は、 以下に述べる各種の核酸合成反応において、 与 えられた環境の下で必要な特異性を維持しながら相補鎖との塩基対結合を行うこ とができる程度の鎖長を持つ。 具体的には、 5-200塩基、 より望ましくは 7-50 塩基対とする。 配列依存的な核酸合成反応を触媒する公知のポリメラーゼが認識 するプライマーの鎖長が、 最低 5塩基前後であることから、 ァニールする部分 の鎖長はそれ以上であることが望ましい。 加えて、 塩基配列としての特異性を期 待するためには、 一般的には 6塩基以上、 好ましくは 7塩基以上の長さを利用す るのが望ましい。 一方、 あまりにも長い塩基配列は化学合成によって調製するこ とが困難となることから、 前記のような鎖長が望ましい範囲として例示される。 なお、 ここで例示した鎖長はあくまでも相補鎖とァニールする部分の鎖長である c 後に述べるように、 本発明によるオリゴヌクレオチドは最終的には少なくとも 2 つの領域に個別にァニールすることができる。 したがって、 ここに例示する鎖長 は、 プライマ一を構成する各領域の鎖長と理解するべきである。
更に、 本発明に用いるプライマーは、 公知の標識物質によって標識することが できる。 標識物質としては、 ジゴキシンやピオチンのような結合性リガンド、 酵 素、 蛍光物質や発光物質、 あるいは放射性同位元素などを示すことができる。 あ るいは、 オリゴヌクレオチドを構成する塩基を蛍光性のアナログに置換する技術 (W095/05391 , Proc . Natl . Acad. Sc i . USA, 91 , 6644-6648, 1994)も公知である。
この他本発明に用いるプライマーは、 それ自身を固相に結合させておくことも できる。 あるいは、 プライマーの任意の部分にピオチンのような結合性のリガン ドで標識しておき、 これを固相化アビジンのような結合パートナーによって間接 的に固相化することもできる。 固相化プライマーを合成開始点とする場合には、 核酸の合成反応生成物が固相に捕捉されることから、 分離が容易となる。 分離さ れた生成物に対して、 核酸特異的な指示薬や、 あるいは更に標識プローブをハイ ブリダィズさせることによって、 検出を行うこともできる。 あるいは、 任意の制 限酵素で消化することによって、 目的とする核酸の断片を回収することもできる c 本発明に用いるブラィマーは前記 2つの領域のみならず、 更に付加的な領域を 含むことができる。 X 2と X 1 cとがそれぞれ 3'末端と 5'末端に配置される一 方、 両者の間に任意の配列を介在させることが可能である。 それは、 たとえば制 限酵素認識配列、 RNAポリメラーゼが認識するプロモーター、 あるいはリボザィ ムをコードする MA等であることができる。 制限酵素認識配列とすることによ り、 本発明の合成産物である 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核 酸を同じ長さを持った 2本鎖核酸に切りそろえることができるようになる。 RNA ポリメラーゼが認識するプロモーター配列を配置すれば、 本発明の合成生成物を 錡型として更に RNAへの転写が行われる。 このときに、 更にリボザィムをコ一 ドする DNAを配置すれば、 転写生成物を自身で切断する系が実現する。 なお、 これらの付随的な塩基配列はいずれも 2本鎖となった場合に機能するものである c したがって、 本発明による 1本鎖の核酸がループを形成しているときには、 これ らの配列は機能しない。 核酸の伸長が進み、 ループを含まない状態で相補的な塩 基配列を持つ鎖とァニールした状態になったときにはじめて機能する。
さて、 本発明を構成する上記反応工程 a ) 〜f ) を具体的に説明する。 まず、 5'側に標的塩基配列における任意の領域と同一の塩基配列を持った第 1のプライマーによつて標的塩基配列を銪型とする相補鎖合成反応を行う。 この 伸長産物を銪型として更に第 2のプライマーによる相補鎖合成が行われる。 第 2 のプライマーによる相補鎖合成のために、 それがァニールすべき領域が塩基対結 合が可能な状態とされる。 この工程は、 標的塩基配列における第 1のプライマー がァニールしている領域よりも 3，側にァニールする第 3のプライマーを起点と する相補鎖合成反応に伴う置換によって行うことができる。 本発明において第 3 のプライマーは、 第 1のプライマーよりも 3，側にァニールし、 第 1のプライマ 一がァニールする領域に向かって進行する相補鎖合成反応の起点となる。 このェ 程は、 鎖置換を伴う相補鎖合成を触媒することができる DNAポリメラ一ゼによ つて行われる。 この他、 第 1のプライマーの伸長生成物を過熱変性などの方法に よって 1本鎖とすることもできる。
次に、 第 2のプライマーの伸長生成物は、 その 3，末端をプライマ一として自 身を鍊型とする相補鎖合成反応を開始する。 第 2のプライマーに基づく相補鎖合 成の錡型として用いられた第 1のプライマーの 5'末端には、 第 1のプライマー の伸長生成物における任意の領域の予測される塩基配列に相補的な塩基配列が付 加されている。 したがって、 それを錡型として生成する第 2のプライマーによる 伸長生成物の 3'末端には、 前記任意の領域と実質的に同一の塩基配列が備わる ことになる。
このとき、 第 2のプライマ一の伸長生成物の 3，末端と、 それがァニールすベ き領域を塩基対結合が可能な状態とする必要がある。 この工程は、 通常、 この伸. 長生成物を 1本鎖とすることによって行われる。 伸長生成物を 1本鎖とするには、 たとえば第 2のプライマ一がァニールしている領域よりも 3，側にァニールする 第 4のプライマーを起点とする相補鎖合成反応に伴う置換によって行われる。 本 発明においては、 前記第 3のプライマーや、 ここで用いる第 4のプライマ一のよ うな、 置換反応用のブラィマ一をアウターブラィマーと記載する。 さて、 第 2のプライマーは、 5'末端に特定の領域に予測される塩基配列に相 補的な塩基配列を備えている。 すなわち第 2のプライマーはチェックプライマー である。 この塩基配列は、 プライマ一によって導入された塩基配列である。 した がってこれを錡型として合成された 3'末端には、 その 3'末端に自身の特定の領 域に対して相補的な塩基配列を備えることになる。 この段階で特定の領域の塩基 配列をチェックする準備が整えられたことになる。 そして、 以降の反応で実際に 塩基配列のチェックが行われる。
塩基配列のチェックのための反応は、 次のようにして進行する。 まず、 このよ うにして合成された 1本鎖ポリヌクレオチドの 3'末端、 および特定の領域を.塩 基対結合が可能な状態とする。 この工程は、 望ましくは次のようにして行うこと ができる。 すなわち、 ヘアピン構造のループ形成領域を起点とする相補合成反応 によって 3'末端を置換するのである。
本発明の望ましい態様においては、 1本鎖ポリヌクレオチドの相補的な塩基配 列の間にループを形成するための塩基配列が含まれる。 本発明においては、 この 配列をループ形成配列と呼ぶ。 前記 1本鎖ポリヌクレオチドは、 実質的にループ 形成配列によって連結された相補的な塩基配列で構成される。 なお一般的には、 それが部分的に塩基対結合を伴っているかどうかにかかわらず、 塩基対結合を解 離させたときに 2つ以上の分子に分離しないものを 1本鎖と呼ぶ。 相補的な塩基 配列は、 同一鎖上で塩基対結合を形成することができる。 前記 1本鎖ポリヌクレ ォチドを、 同一鎖上で塩基対結合させることによって得ることができる分子内塩 基対結合生成物は、 見かけ上 2本鎖を構成する領域と、 塩基対結合を伴わないル ープ部分を与える。
すなわち、 この 1本鎖ポリヌクレオチドは、 同一鎖上でァニールすることが可 能な相補的な塩基配列を含み、 そのァニール生成物は折れ曲がったヒンジ部分に 塩基対結合を伴わないループを構成する 1本鎖核酸と定義することもできる。 そ して塩基対結合を伴わないループには、 相補的な塩基配列を持つヌクレオチドが ァニールすることができる。 ループ形成配列は任意の塩基配列であることができ る。 置換のための相補鎖合成を開始することができるように塩基対結合が可能で あり、 望ましくは特異的なァニーリングを達成するために他の領域に存在する塩 基配列から識別可能な配列を備える。 たとえば望ましい態様においては、 第 1の プライマーと相補的な塩基配列を含む。 ループ形成領域に対して F Aがァニール する状態を、 図 5に示した。
ループ形成領域に第 1のプライマーをァニールさせて相補鎖合成反応を行うと、 1本鎖ポリヌクレオチドのハイプリダイズしている部分が置換されて 1本鎖ポリ ヌクレオチドにおける特定の領域、 並びに 3'末端は塩基対結合が可能な状態と なる。 両者がァニールして 3'末端は相補鎖合成の起点となる 3' -0Hを与える。 さて、 この段階で 3'末端がァニールしているのは、 塩基配列をチェックすべき 特定の領域である。 したがって、 この領域の塩基配列が予測した塩基配列であれ ば、 3'末端を起点とする相補 ii合成反応が進行する。 あるいは予測した塩基配 列と相違していた場合には、 相補鎖合成反応が阻害される。
本発明の最大の特徴は、 LAMP法を利用したことによって、 この塩基配列のチ エック機構が以降の反応でも繰り返し機能できる点にある。 たとえば、 塩基配列 が予測されていたものと異なっていたにもかかわらず、 相補鎖合成反応が進行し てしまったと仮定する。 本発明における 1本鎖ポリヌクレオチドを錄型とする相 補鎖合成反応の生成物は、 その 3'末端に、 再び特定の領域に対する相補鎖を備 えたものとなる。 自身の 5'末端が、 特定の領域に予測される塩基配列を備えて いるため、 この構造は何度相補鎖合成を繰り返しても変わらない。 一方 3'末端 がァニールすべき特定の領域は、 標的塩基配列を錡型として写し取ったものであ るから、 両者の間のァニールは、 ミスマッチをともなつたままである。 そのため、 2回目以降の反応においても、 阻害が起きることになる。 本発明による塩基配列 のチヱック機構は、 誤って起きてしまった相補鎖合成反応の影響を最小限度にと どめる機構を備えていると言うことができる。 以上のように、 特定の構造を持つプライマ一を用い、 鎖置換を伴う相補鎖合成 を触媒することができる DNAポリメラーゼによつて標的塩基配列の存在下で相 補鎖合成を行えば、 塩基配列のチェック機構を伴った相補鎖合成反応が進行する その結果、 特定の領域を構成する塩基配列が予測される塩基配列であった場合に は、 相補鎖合成産物の連続的な生成が開始される。 他方、 もしも予測される塩基 配列でなかった場合には、 本発明による塩基配列のチヱック機構によって、 相補 鎖合成が著しく阻害される。 したがって、 一定時間の反応の後に、 増幅生成物が 検出できれば、 その試料の特定の領域を構成する塩基配列が予測された塩基配列 であると判定される。
本発明において、 相補鎖合成が進行した場合にもたらされる核酸は、 1本鎖上 に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸となる。 本発明においては、 この核 酸の生成量が、 特定の領域における予測される塩基配列の存在と関連付けられる すなわち、 予測された塩基配列であった場合の生成量に対して、 塩基配列が予測 と異なっていた場合にはこのような構造の核酸の生成が阻害される。 本発明にお いて指標としている 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸とは、 1本鎖上に互いに相補的な塩基配列を隣り合せに連結した核酸を意味する。 相補鎖合成反応の進行に伴う生成物は、 公知の手法によつて検出することがで きる。 たとえばゲル電気泳動によって反応液を分析すれば、 本発明に固有の増幅 生成物を明瞭なバンドとして確認することができる。 本発明における増幅生成物 は、 標的塩基配列とその相補鎖を 1単位とする塩基配列の繰り返しからなつてい る。 これを電気泳動で分離すると、 一定の間隔で並んだラダー状のバンドが表れ る。 この他、 相補鎖合成の進行を反応させながら追跡する手法も公知である。 た とえば、 ェチジゥムブ口マイ ドゃサイバーグリーン等の 2本鎖核酸特異的な蛍光 染料によって、 相補鎖合成産物の蓄積を蛍光強度の変化として追跡することがで きる。 後に述べる内部標準を用いた場合には、 内部標準におけるシグナルの増大 が確認できたとき、 あるいは内部標準におけるシグナル変化がブラトーに達した ときに、 試料におけるシグナルが実質的に増大していなければ、 試料の特定の領 域が予測された塩基配列でなかったことを意味する。
本発明の検出方法において、 相補鎖合成産物の量は内部標準と比較することが できる。 内部標準には、 たとえば同一の核酸試料に由来し変異や多型が存在しな いことが明らかな核酸を用いることができる。 ゲノムの塩基配列の解析を目的と する場合には、 ゲノムにおいて変異や多型が知られていない塩基配列を内部標準 として利用することができる。 あるいは mRNAを銪型として本発明の検出方法を 行う場合には、 たとえばいずれの細胞でも一定の発現量が観察される遺伝子を内 部標準とすることができる。 これら内部標準に対しても、 その塩基配列を標的塩 基配列として本発明と同じ条件で相補鎖合成反応を行い、 その生成物の量を対照 として変異を検出すべき塩基配列から得られた結果と比較することができる。 内 部標準と同レベルの生成物が生じた場合には、 特定の塩基配列が予測された塩基 配列と同一であったことが確認できる。 逆に、 特定の領域の塩基配列が予測され たものと相違していれば、 相補鎖合成反応生成物の量は内部標準よりも少なくな るはずである。
更に、 本来相補鎖合成反応生成物を生じるべき内部標準において生成物が検出 できないとき、 あるいは少ないときには、 反応自体に何らかの問題があった可能 性が疑われる。 一般に内部標準は、 試験用のプライマ一とともに同一の反応液で 反応させるものが多い。 しかし本発明においては、 同一試料を用いて共通の条件 で反応させる限り、 内部標準とすることができる。 たとえば、 同一試料について 第 1の反応系で標準を測定し、 第 2の反応系で試料核酸を測定するような場合も、 この標準を内部標準という。
本発明において、 特定の領域が予測される塩基配列を備えていた場合に合成さ れる核酸を構成する相補的な塩基配列の数は、 少なくとも 1組である。 本発明の 望ましい態様によれば、 その整数倍となることもある。 そしてこの場合、 理論的 には本発明における前記核酸を構成する相補的な塩基配列のペアの数に上限はな い。 本発明の合成生成物である核酸が複数組の相補的な塩基配列で構成されると き、 この核酸は同じ塩基配列の繰り返しからなる。 なお反応生成物の中には、 相 補鎖合成反応が 5'末端に至らず、 錡型の途中で終了しているものなどが混在す る可能性のあることは言うまでも無い。
本発明に基づいて合成される 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結した 核酸は、 必ずしも天然の核酸と同じ構造である必要はない。 DNAポリメラ一ゼの 作用によつて核酸を合成するときに基質としてヌクレオチド誘導体を利用すれば、 核酸の誘導体の合成が可能なことは公知である。 このようなヌクレオチド誘導体 には、 ラジオアイソトープで標識したヌクレオチドや、 ピオチンやジゴキシンの ような結合性リガンドで標識したヌクレオチド誘導体などが用いられる。 これら のヌクレオチド誘導体を用いることにより、 生成物である核酸誘導体の標識が達 成される。 あるいは、 蛍光性のヌクレオチドを基質として用いることによって、 生成物である核酸を蛍光性の誘導体とすることができる。 更にこの生成物は、 D NAであることもできるし、 RNAとすることもできる。 いずれを生成するかは、 プライマーの構造、 重合のための基質の種類、 そして核酸の重合を行う重合化試 薬との組み合わせによって決定される。
本発明において、 核酸とは、 DNA、 または RNA、 あるいはそれらのキメラ分子 であることができる。 核酸は、 天然のものであることもできるし、 人工的に合成 されたものであることもできる。 また部分的に、 あるいは全体が完全に人工的な 構造からなるヌクレオチド誘導体であっても、 それが塩基対結合を形成しうるも のであるかぎり、 あるいは相補鎖合成のための铸型として機能する限り、 本発明 の核酸に含まれる。 本発明における核酸の構成塩基数は、 制限されない。 核酸は、 用語ポリヌクレオチドと同義である。 一方本発明におけるォリゴヌクレオチドと は、 ポリヌクレオチドの中でも特に構成塩基数が少ないものを示す用語として用 いる。 一般にオリゴヌクレオチドは、 2〜1 0 0、 より一般的には、 2〜5 0程 度の塩基数のポリヌクレオチドを指してオリゴヌクレオチドと呼ぶが、 これらの 数値に限定されるものではない。 ' 本発明の検出方法は、 あらゆる核酸に対して応用することができる。 具体的に は、 たとえば原核細胞や真核細胞のゲノム、 ウィルスのゲノム DNAやゲノム RNA、 マイコプラズマやリケッチアのような細胞内寄生体のゲノム、，これらの生物種の m Aから誘導された cDM、 更にこれらの遺伝子ソースから誘導されたライブラ リーや、 ライブラリーから単離されたクローンなどを示すことができる。 変異や 多型を検出すべき遺伝子が MAであれば、 逆転写酵素活性を持つ DNAポリメラ ーゼの作用によって cDNAとすることができる。 本発明の試料とする核酸は、 一 般に生物学的な試料に含まれる。 生物学的試料とは、 動物、 植物、 あるいは微生 物の組織、 細胞、 培養物、 排泄物あるいはそれらの抽出物を示すことができる。 本発明は、 これらの生物学的試料に含まれる、 その生物に由来する核酸、 あるい はその生物を宿主としている感染性の寄生生物、 微生物、 並びにウィルスに由来 する核酸等を検出対象とすることができる。 また本発明における核酸は、 前記生 物学的試料に含まれる核酸から誘導されたものであってもよい。 たとえば、 mRN Aをもとに合成された cDNAや、 生物学的試料に由来する核酸をもとに増幅され た核酸等を本発明による検出方法の試料とすることができる。 これらの遺伝子は、 変性によって 1本鎖とすることにより、 あるいは後で述べるように 2本鎖のまま、 本発明による検出方法の試料とすることができる。
本発明における標的塩基配列を含む核酸は、 プライマーのァニールと、 これを 起点とする相補鎖合成反応が進行する条件下でインキュベートされる場合、 2本 鎖の状態のままで試料とすることができる。 通常、 核酸試料をプローブやプライ マーとのハイプリダイズによって解析するとき、 変性処理によって 1本鎖とする 工程が必要とされている。 しかし、 プライマーからの相補鎖合成反応は、 2本鎖 核酸が不安定化される条件の元では、 完全に 1本鎖とする工程を省略できる場合 のあることを本発明者らは見出している （2000年 4月 7日出願、 特願 2000- 111 939)
すなわち、 単に 2本鎖核酸を不安定化する条件とするのみでは、 相補鎖を効率 的に合成することは難しいが、 もともと等温で進行する核酸の増幅反応と組み合 わせるときに、 1本鎖核酸を錡型とする場合と比べて遜色の無い増幅効率を達成 することができるのである。 本発明に応用することができる核酸の増幅方法は、 1本鎖の錡型核酸に応用した場合には、 等温で進行する。 この方法は、 鎖置換を 伴う相補鎖合成を触媒することができる MAポリメラーゼを用いているととも に、 自身へのァニールと相補鎖合成、 そしてループへの新たなプライマ一のァニ ールと相補鎖合成とを繰り返すことによって、 等温条件下での相補鎖合成が繰り 返し行われる反応原理に基づいている。 したがって、 本発明における標的塩基配 列には、 2本鎖核酸を用いることができる。
本発明に基づき、 2本鎖核酸を直接錶型として変異や多型の検出を行う方法に ついて述べる。 なお以下の説明においては、 特定の領域を構成する塩基配列が予 測される塩基配列であった場合に開始される相補鎖合成の過程を説明している。 特定の領域の塩基配列が予測した塩基配列と相違している場合には、 以下に述べ るいくつかの相補鎖合成反応に、 自身の 3，末端が特定の領域にァニールして自 身を錶型として進行する相補鎖合成反応を阻害する工程が組みこまれる。
2本鎖核酸としては、 たとえば cDNAやゲノム DNAを示すことができる。 ある いはこれらの DNAを各種のベクターに挿入したものを本発明の 2本鎖核酸とし て用いることもできる。 本発明の 2本鎖核酸は、 精製されたものであっても良い し、 未精製のものであることもできる。 また、 細胞内に存在する状態（in situ) で、 本発明の方法を適用することもできる。 細胞内の 2本鎖核酸を錶型とするこ とによって、 ゲノムの in situ解析が可能となる。
本発明において cDNAを鍊型として用いる場合、 cDNAを合成する工程と、 本発 明に基づく核酸の合成方法とを、 同一の条件下で実施することができる。 MAを 錶型として cDNAの第 1鎖を合成すると、 DNA-RNAハイプリヅドによる 2本鎖核 酸が完成する。 この 2本鎖核酸を本発明における銪型として、 核酸の合成方法を 実施することができる。 本発明の核酸の合成方法に用いる DNAポリメラ一ゼが、 逆転写酵素活性を備えるものであれば、 単一の酵素を用い、 同一の条件下で核酸 の合成を行うことができる。 たとえば Bca DNA ポリメラ一ゼは、 鎖置換活性を 有し、 逆転写酵素活性を併せ持つ DNAポリメラ一ゼである。 なお、 第 2鎖を合 成したうえで完全な 2本鎖 cDNAとした後に、 本発明による核酸の合成方法を適 用しうることは言うまでも無い。
本発明の変異や多型の検出には、 鎖置換を伴う相補鎖合成を触媒することがで きるポリメラーゼが利用される。 この種のポリメラーゼは、 SDAなどに用いられ た DNAポリメラーゼと同様のものが用いられる。 すなわち、 ある塩基配列の 3' 側に相補的なプライマーを合成起点として相補鎖合成を行うときに、 踌型の 5' 側に 2本鎖の領域が有るとその 2本鎖を置換しながら相補鎖の合成を行う特殊な ポリメラ一ゼが公知である。 鍊型の 5，側とは、 プライマーの 3'側、 すなわち相 補鎖合成反応が進行する方向である。 本発明においては、 更に相補鎖合成に必要 な基質が添加される。
本発明においては、 2本鎖核酸に任意のプライマ一を加え、 このプライマ一を 起点とする相補鎖合成反応が達成できる条件のもとでインキュベートされる。 本 発明の任意のプライマーとは、 F Aがァニールすべき領域を塩基対結合可能な状 態とするために用いられる。 したがって、 任意のプライマーは、 錡型となる 2本 鎖核酸の、 F Aがァニールすべき核酸鎖に対して、 その相補鎖にァニールするこ とができるものである必要がある。 更に、 本発明における任意のブライマーを複 製起点とする相補鎖合成は、 F Aがァニールすべき領域の方向に向かって進行す るような位置関係にあるべきである。 言いかえれば、 F Aを起点とする相補鎖合 成反応において錶型として機能する領域の、 任意の領域に対してァニールするも のであることができる。 任意のプライマ一は、 この条件を満たす限り、 任意の領 域から選択することができる。 たとえば、 R Aや、 錡型における R Aがァニール する領域よりも更に 3，側にァニールするアウタープライマ一 （後述） を、 任意 のプライマーとして用いることもできる。 このような態様は反応に必要な成分を 少なくすることから、 本発明における望ましい態様の一つである。
任意のプライマーを起点とする相補鎖合成で 2本鎖核酸の一方の鎖を置換し、 F Aによる塩基対結合が可能な状態とすることができる。 この条件を採用したこ とによって、 本発明の方法を 2本鎖核酸を試料として温度変化無しで実現するこ とができた。 任意のプライマ一の 2本鎖核酸に対するァニール、 およびこのブラ ィマーを起点とする相補鎖合成反応が達成できる条件とは、 実際には次の複数の 工程を同じ条件下で進めることができる条件ということができる。
i ) 2本鎖核酸からなる錄型に対してプライマーがァニールする
ii ) ァニールしたプライマーを複製起点とする相補鎖合成が進む
一般にプライマーは少なくともそれがァニールすべき領域が 1本鎖でなければ ァニールすることはできないと考えられていた。 そのため従来は、 2本鎖の核酸 を錶型とする場合には、 プライマ一のァニールに先立って必ず変性によって 1本 鎖とする工程が実施されてきた。 しかし必ずしも完全な 1本鎖としなくとも、 何 らかの手段によって 2本鎖が不安定化される条件のもとで、 プライマーとインキ ュべ一トすることにより、 プライマーのァニールが可能となる。 2本鎖が不安定 化される条件としては、 たとえば融解温度 （以下、 Tmと省略する） 近くにまで 加温する方法を示すことができる。 あるいは、 更に Tm調整剤を存在させること も有効である。
一連の反応は、 酵素反応に好適な pHを与える緩衝剤、 酵素の触媒活性の維持 ゃァニールのために必要な塩類、 酵素の保護剤、 更には必要に応じて融解温度 (Tm)の調整剤等の共存下で行う。 緩衝剤としては、 Tris-HCl等の中性から弱ァ ル力リ性に緩衝作用を持つものが用いられる。 pHは使用する DNAポリメラ一ゼ に応じて調整する。 塩類としては KC1、 NaCl あるいは（NH4)2S04等が、 酵素の活 性維持と核酸の融解温度 (Tm)調整のために適宜添加される。 酵素の保護剤とし ては、 ゥシ血清アルブミンや糖類が利用される。
更に融解温度（Tm)の調整剤には、 ぺ夕イン、 プロリン、 ジメチルスルホキシ ド （以下、 DMS0と省略する） 、 あるいはホルムアミ ドが一般に利用される。 融 解温度（Tm)の調整剤を利用することによって、 前記オリゴヌクレオチドのァニ —ルを限られた温度条件の下で調整することができる。 更にべタイン（N，N,N，- 1 rimethylglycine )ゃテトラアルキルアンモニゥム塩は、 その isostabi lize作用 によって鎖置換効率の向上にも有効である。 ベ夕インは、 反応液中 0.2〜3.0 M、 好ましくは 0.5〜： 1.5 M程度の添加により、 本発明の核酸増幅反応の促進作用を 期待できる。 これらの融解温度の調整剤は、 融解温度を下げる方向に作用するの で、 塩濃度や反応温度等のその他の反応条件を考慮して、 適切なストリンジェン シ一と反応性を与える条件を経験的に設定する。
Tm調整剤を利用することにより、 酵素反応に好適な温度条件を容易に設定す ることができる。 Tmはプライマーと標的塩基配列の関係によって変動する。 し たがって、 酵素活性を維持できる条件と、 本発明の条件を満たすインキュベーシ ヨンの条件とがー致するように、 Tm調整剤の使用量を調整することが望ましい。 本発明の開示に基づいて、 プライマーの塩基配列に応じて適切な Tm調整剤の使 用量を設定することは、 当業者にとって自明である。 たとえば、 ァニールする塩 基配列の長さとその GC含量、 塩濃度、 および Tm調整剤の濃度に基づいて、 Tm を算出することができる。
このような条件下における 2本鎖の核酸に対するプライマーのァニールは、 お そらく不安定であると推測される。 しかし鎖置換を伴う相補鎖合成を触媒するこ とができる DNAポリメラ一ゼとともにィンキュベ一トすることにより、 不安定 ながらァニールしたプライマ一を複製起点として相補鎖が合成される。 相補鎖が 合成されれば、 プライマーのァニールは次第に安定化されることになる。 以下に 示すような DNAポリメラ一ゼは、 2本鎖核酸に対するプライマ一のァニールが 可能な条件下で、 相補鎖の合成を触媒することができる。
本発明による変異や多型の検出方法を支えているのは、 鎖置換を伴う相補鎖合 成を触媒することができる MAポリメラ一ゼである。 この種の DNAポリメラ一 ゼには、 以下のようなものが知られている。 また、 これらの酵素の各種変異体に ついても、 それが配列依存型の相補鎖合成活性と鎖置換活性を有する限り、 本発 明に利用することができる。 ここで言う変異体とは、 酵素の必要とする触媒活性 をもたらす構造のみを取り出したもの、 あるいはアミノ酸の変異等によって触媒 活性、 安定性、 あるいは耐熱性を改変したもの等を示すことができる。
Bst DNAポリメラーゼ
Bca( exo- )DNAポリメラ一ゼ
DNA ポリメラーゼ Iのクレノウ ·フラグメント
Vent DNAポリメラーゼ
Vent( Exo- )DNAポリメラ一ゼ （Vent DNAポリメラ一ゼからェクソヌクレアーゼ 活性を除いたもの）
DeepVent DNAポリメラーゼ
DeepVent(Exo- )DNAポリメラ一ゼ （DeepVent DNAポリメラ一ゼからェクソヌク レアーゼ活性を除いたもの）
Φ 29ファ一ジ DNAポリメラ一ゼ
MS-2ファージ DNAポリメラ一ゼ
Z-Taq DNAポリメラーゼ （宝酒造）
KOD DNAポリメラーゼ （東洋紡績）
これらの酵素の中でも Bst DNAポリメラ一ゼゃ Bca( exo- )DNAポリメラ一ゼは、 ある程度の耐熱性を持ち、 触媒活性も高いことから特に望ましい酵素である。 本 発明は 2本鎖の状態にある核酸に対して、 プライマーのァニールと相補鎖合成反 応とを同一条件下で行う。 このような反応は、 しばしばある程度の加温を必要と することから、 酵素が耐熱性であることは望ましい条件の一つである。 耐熱性の 酵素を用いることにより、 幅広い反応条件に対応することができる。
たとえば Vent(Exo-)DNAポリメラ一ゼは、 鎖置換活性と共に高度な耐熱性を 備えた酵素である。 ところで DNAポリメラーゼによる鎖置換を伴う相補鎖合成 反応は、 1本鎖結合タンパク質（single strand binding protein)の添加によつ て促進されることが知られている（Paul M.Lizardi et al, ature Genetics 19, 225-232， July，1998)。 この作用を本発明に応用し、 1本鎖結合タンパク質を 添加することによって相補鎖合成の促進効果を期待することができる。 Vent(Ex o-)DNAポリメラーゼに対しては、 1本鎖結合タンパク質として T4 gene 32が有 効である。
なお 3， -5，ェクソヌクレア一ゼ活性を持たなレ、 DNAポリメラ一ゼには、 相補鎖 合成が鎢型の 5'末端に達した部分で停止せず、 1塩基突出させた状態まで合成 を進める現象が知られている。 本発明では、 相補鎖合成が末端に至ったときの 3 '末端の配列が次の相補鎖合成の開始につながるため、 このような現象は望まし くない。 しかし、 DNAポリメラーゼによる 3'末端への塩基の付加は、 高い確率 で Aとなる。 したがって、 dATPが誤って 1塩基付加しても問題とならないよう に、 3'末端からの合成が Aで開始するように配列を選択すれば良い。 また、 相 補鎖合成時に 3'末端がたとえ突出してしまっても、 これを消化して blunt end とする 3'→5 'ェクソヌクレアーゼ活性を利用することもできる。 たとえば、 天 然型の Vent DNAポリメラーゼはこの活性を持つことから、 Vent(Exo- )DNAポリ メラ一ゼと混合して利用することにより、 この問題を回避することができる。 これらの DNAポリメラ一ゼに対して、 PCRなどで一般に用いられている Taqポ リメラーゼ等の DNAポリメラ一ゼは、 通常の条件では鎖置換作用は実質的に見 られない。 しかし、 この種の DNAポリメラ一ゼであっても、 鎖置換が可能な条 件を与えることができる場合には、 本発明に利用することができる。 本発明においては、 LAMP法の増幅効率を高めるためにループプライマーを利 用することができる。 ループプライマーとは、 前記 F Aの伸長生成物における F Aに由来する領域と、 F Aに対する任意の領域 （つまり F Aの 5'末端に相補的 な塩基配列からなる領域） の間において相補鎖合成の起点を与えることができる プライマ一である。 R Aについても同様に、 前記 R Aの伸長生成物における R A に由来する領域と、 R Aに対する任意の領域 （つまり R Aの 5'末端に相補的な 塩基配列からなる領域） の間において相補鎖合成の起点を与えることができるプ ライマーをループプライマーとして利用することができる。 本発明においては、 便宜上、 F Aに対するループプライマ一をループプライマ一 F、 R Aに対するル —ププライマ一をループプライマ一 Rと記載する。 ループプライマ一は、 LAMP 法の生成物の中に、 R Aや F Aがァニールすることができないループを含むもの があることに着目して考え出された。 ループプライマ一を利用した LAMP法につ いて、 本出願人は特許出願している （2000年 9月 19日出願、 特願 2000-28386 2) o ループプライマーを LAMP法に組み合わせることにより、 その反応効率は 著しく改善される。 ループプライマーを利用するときには、 ループプライマー F および/またはループプライマ一 Rを R A、 F A、 そして必要に応じてァゥ夕一 プライマーとともに加えて反応を開始する。 ループプライマーのみを後から加え てもその効果を期待することはできるが、 反応の効率化を目的とするのであるか ら、 反応開始時より存在させておくのが合理的である。
本発明に基づいて、 前記本発明の反応を構成する成分を予め組み合わせてキッ トとすることができる。 すなわち本発明は、 2つのインナープライマーからなる プライマ一セット、 鎖置換を伴う相補鎖合成を触媒することができる DNAポリ メラーゼ、 およびヌクレオチド基質で構成され、 前記プライマーセッ トを構成す るィンナープライマーの少なくとも 1つがチェックプライマーである、 変異およ び/または多型の検出用キットに関する。 本発明のキッ卜には、 前記インナープ ライマーに対するアウタープライマ一や、 内部標準用の別のプライマーセットを 組み合わせることができる。 また、 反応効率を改善するループプライマーを組み 合わせることもできる。 あるいは、 陽性対照や陰性対照として用いる標準試料、 取り扱い指示書などを添付することもできる。 更に、 増幅生成物を検出するため の指示薬成分を組み合わせることもできる。 指示薬としては、 たとえば EtBrの ような蛍光染料、 あるいは増幅生成物の塩基配列を認識してシグナルを生成する プロ一ブなどを用いることができる。
また、 前記インナープライマ一からなるプライマ一セットとして、 野生型用お よび変異型用の 2種類のプライマ一セットを組み合わせることによって、 ヘテロ /ホモの genotyping用のキットとすることができる。 genotypeが複数の変異型 を含む場合には、 変異型の種類に応じた数のプライマ一セットを用いれば、 あら ゆる genotypeのホモとヘテロを判定することができるキットとなる。 ヘテロと ホモの判定は、 家系の解析や、 genotypeに基づく phenotypeの予測において重 要である。
前記ィンナ一プライマー R Aおよび F Aを利用し、 鎖置換活性を持つた DNA ポリメラ一ゼと組み合わせて 2本鎖の核酸を増幅する反応について、 基本的な原 理を図 1 —図 4に基づいて以下に説明する。 この例においては、 インナ一プライ マーである R Aおよび F Aが増幅用プライマーのセッ トを構成しており、 更に R Aは 2本鎖として存在する標的塩基配列における F Aがァニールすべき領域を塩 基対結合が可能な状態とするための任意のブライマ一としても作用する。 本発明 においては特定の領域、 すなわち R 1が予測された塩基配列で構成されている場 合に、 以下に述べるような増幅反応が進行する。 一方、 予測した塩基配列とは異 なっていた場合には、 R 1に対して 3'末端である R 1 cがァニールを繰り返す たびに相補鎖合成反応が阻害され、 原理的には増幅反応は進行しない。 また、 あ るいは一定の確率で R l cを起点とする相補鎖合成が誤って生じたとしても、 そ の生成物はわずかしか生じないので、 最終的な結果に与える影響は実質的に無い ご Sん o 上記任意のプライマ一 （図 1- (1)における RA) は、 まず鍊型となる 2本鎖 核酸における X2 c (R2 cに相当） にァニールし相補鎖合成の起点となる。 こ のとき 2本鎖核酸は不安定化する条件下に置かれており、 2本鎖の核酸に対して プライマーが直接相補鎖合成反応の起点として機能する。 図 1- (2)においては R Aを起点として合成された相補鎖が、 錡型となった 2本鎖核酸の一方の鎖を置 換し、 他方のィンナープライマ一である F Aがァニールする領域 F 2 cが塩基対 結合が可能な状態となっている （図 1- (2)) 。
得られた塩基対結合が可能となった領域 F 2 cに対して FAをァニールさせて 相補鎖合成を行う。 この例においては、 更に F Aの 3'側から相補鎖合成を開始 するアウタープライマー F 3がァニールする （図 2-(4)) 。 アウタープライマ —は、 各ィンナ:一プライマーの 3'側からの相補鎖合成を開始するように設計さ れており、 しかもインナ一プライマーよりも低濃度で用いるので、 高い確率でィ ンナ一プライマ一よりも低い確率で相補鎖合成を開始する。
インナ一プライマ一として RA、 および FAを用い、 ループプライマーを組み 合わせて本発明による変異の検出方法を実施するとき、 チェック機構の厳しさは、 主として F 1/F 1 cの Tmに左右される。 F 1/F 1 cの Tmを、 許される範 囲でできるだけ低く設定することにより、 塩基配列の厳密なチェック機構を実現 できる。 ただし F 1/F 1 cの Tmが許容限度を越えて低く設定された場合には、 特定の領域の塩基配列が予測された塩基配列であつた場合であつても、 効率的な 増幅反応が期待できなくなる場合がある。 たとえば後に述べる実施例においては、 60°Cの反応条件に対して、 F 1/F 1 cの Tmが 45°Cという条件で、 効率的 な合成が起きている。 Tmよりも 15°Cも高い反応温度は、 一般的には、 異なる ポリヌクレオチド分子のハイブリダィズは期待できない。 つまり、 効率的な相補 鎖合成は期待できない。 しかし本発明においては、 F 1/F 1 cのァニールが同 一分子内で起きるために、 反応温度よりも多少低い Tmでも、 反応効率を犠牲に することなく、 十分な厳しさで塩基配列のチェックが実現できるのである。 した がって、 異なるポリヌクレオチド間ではハイブリダィズできないが、 同一分子内 であればハイブリダィズすることができるように F 1/F 1 c間の Tmを設定す ることは、 本発明における有利な条件と言うことができる。 たとえば後に述べる 実施例 5で用いた各プライマーの Tmは、 以下のとおりである。
アウタープライマ一 F 3 (R 3) ： 60°C
ループプライマ一 FL ： 56°C
ループプライマー RL ： 58°C
インナープライマ一 FAの 3，側 F 2 (または RAの 3，側 R 2) ： 55 °C インナープライマー FAの 5，側 F 1 c (または RAの 5，側 R 1 c) ： 45°C 本発明においては、 ループプライマ一を組み合わせる場合、 反応全体の効率が 上がるので、 F l c (R 1 c) の Tmが低く設定されていても短時間で高度な増 幅反応を期待することができる。 つまり、 それだけプライマーの長さを短くする ことができる。
アウタープライマー F 3を起点とする相補鎖合成の結果、 ィンナープライマー FAを起点として伸長した合成生成物が置換されて 1本鎖となる （図 2-(5)) 。 この 1本鎖を錶型として、 RA、 および R Aに対するァゥ夕一プライマー R 3が 更にァニールと相補鎖合成を開始する （図 3- (6)) 。 その結果として生成する R Aからの伸長生成物は、 その 3'末端 F 1を自身に対してァニールすることが できる構造を備える （図 3-(8)) 。
なお図 3-(6)においては 5'末端が自身にァニールしている。 しかし 5'末端は 相補鎖合成の起点とならないことから、 この構造では増幅反応を開始することは できない。 図 3 -(6)に対する相補鎖を合成し、 更にその 3'末端において自身に ァニールすることができる構造 （図 3-(8)) が実現して初めて、 増幅反応がス タートする。 ここまでの反応は、 言わば、 本発明に用いる増幅反応の準備段階と 言える。 続いて、 本発明によって達成される核酸の増幅反応と特定の領域 R 1 cを構成 する塩基配列のチェック機構について、 引き続き図面に基づいて具体的に説明す る。 自身にァニールした 3'末端 F 1 (図 3 - (8) ) は、 相補鎖合成の起点となる ことができる。 このとき 3，末端へのァニールは F 1 / F 1 c間で生じるので、 同じく F 1 cを持つ F Aと競合する可能性がある。 しかし現実には、 同一鎖の隣 接する領域に存在する相補的な塩基配列 F 1 / F 1 cは、 優先的にァニールする。 したがって、 自身を錄型とする相補鎖合成反応が優先的に始まる。 この反応によ つて、 標的塩基配列が 1本鎖上に交互に連結された核酸が合成される。 更に、 3 ，末端 F 1の自身へのァニールによって形成されたループ形成領域には、 インナ 一プライマ一 F Aがァニールすることができる F 2 cが存在しており、 ここに F Aがァニールして相補鎖合成反応が始まる （図 3 - (8)) 。 ループ部分にァニ一 ルするィンナ一プライマー F Aの位置関係を図 5に示した。 ループにァニールし た F Aからの相補鎖合成反応は、 先に自身を铸型として 3'末端から開始した相 補鎖合成反応の生成物を置換し、 その 3'末端 R 1を再び自身にァニール可能な 状態とする （図 4 - ( 9)) 。 この後は、 3'末端を起点とする自身を铸型とする相 補鎖合成反応と、 ループ部分を起点とするィンナ一プライマ一 R Aを起点とする 相補鎖合成反応が交互に起きる。 こうして、 自身を錶型として 3'末端が繰り返 し伸長する反応と、 ループ部分からの新たなプライマーによる伸長とが繰り返し 生じて、 核酸の増幅反応が成立する。
一方、 自分自身を錡型として伸長を継続する 1本鎖の核酸に対して、 そのルー プ部分にァニールするオリゴヌクレオチドを合成起点として相補鎖合成される核 酸に注目すると、 ここでも 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸 の合成が進行している。 すなわち、 ループ部分からの相補鎖合成は、 たとえば図 4— (9)においては、 R 1に達した時点で完了する。 そして、 この核酸の合成に よって置換された 3'末端を起点として補鎖合成が始まる （図 4— ( 9 ) ) 。 すると、 やがてその反応はかって合成起点であったループ部分に達して再び置換が始まる。 こうしてループ部分から合成を開始した核酸も置換され、 その結果同一鎖上にァ ニールすることができる 3，末端 R 1を得る （図 4一（11 )) 。 この 3，末端 R 1は 同一鎖の R 1 cにァニールして相補鎖合成を開始する。 さて、 この反応の Fと R を読みかえれば、 図 3—(8)で起きている反応と同じである。 したがって図 4— ( 11 )に示す構造は、 自身の伸長と新たな核酸の生成を継続する新しい核酸とし て機能することができる。
以上のように、 この方法においては、 1つの核酸の伸長に伴って、 これとは別 に伸長を開始する新たな核酸を供給しつづける反応が進行する。 更に鎖が伸長す るのに従い、 末端のみならず、 同一鎖上に複数のループ形成配列がもたらされる これらのループ形成配列は、 鎖置換合成反応により塩基対形成可能な状態となる と、 インナ一プライマーがァニールし、 新たな核酸の生成反応の基点となる。 末 端のみならず鎖の途中からの合成反応も組み合わされることにより、 さらに効率 のよい増幅反応が達成されるのである。
更に本発明においては、 R Aに加えて F Aもチェックプライマ一とすることに よって、 チヱック機構が働く機会を増やすことができる。 あるいは R Aを鎵型と して生成した 3'末端のみで特定の領域における塩基配列のチェックを行わせる 場合であつても、 特定の領域の塩基配列のチエックを経て相補鎖合成反応が進行 する。 その結果、 特定の領域が予測される塩基配列であった場合に生成する相補 鎖合成生成物の量と比較して、 相違があった場合の生成物の量は大幅に減少する したがって本発明による変異および/または多型の検出方法は、 その原理上、 た いへん S /N比に優れた検出方法を提供することができる。
以上のように特定構造のプライマーの利用により、 伸長とそれに伴う新たな核 酸の生成が起きる。 更に本発明においては、 この新たに生成した核酸自身が伸長 し、 それに付随する更に新たな核酸の生成をもたらす。 一連の反応は、 理論的に は永久に継続し、 きわめて効率的な核酸の増幅を達成することができる。 しかも 本発明の方法は、 すべての反応を等温条件のもとで行うことができる。 本発明においてィンナ一プライマ一として R A、 および F Aを用いるときは、 一連の反応が常に複数の領域の位置関係を維持した状態でなければ進行しないこ とが重要な特徴である。 更にアウタープライマ一を組み合わせる態様においては、 少なくとも 6つの領域が反応に関与する。 この特徴によって、 非特異的な相補鎖 合成に伴う非特異的な合成反応が効果的に防止できるのである。 すなわち、 たと え何らかの非特異的な反応が起きたとしても、 その生成物が以降の増幅工程に対 して出発材料となる可能性を低く押さえることにつながるのである。
またより多くの領域によって反応の進行が制御されているということは、 類似 した塩基配列の厳密な識別を可能とする検出系を自由に構成できる可能性をもた らす。 ヒト CYP2C19のように相互に類似する塩基配列を含む遺伝子の間で、 類 似する塩基配列の中に存在する SNPsの検出は重要な課題である。 しかし PCR法 等の公知の遺伝子増幅技術や、 あるいは Invader法のような公知のシグナル増 幅技術に基づいて、 類似する塩基配列中のわずかな変異を一回の増幅反応のみで 検出することは困難である。 本発明によれば、 複数の領域が、 予測した塩基配列 を備え、 しかも特定の位置関係にあるときに限り、 高度な増幅反応が起きるよう にプライマ一を設計することができる。
したがって本発明は、 たとえば HLAや血小板同種抗原、 あるいは病原微生物 のタイピングのような、 類似する塩基配列を含む複数の遺伝子間の微細な塩基配 列の相違の検出に有用である。 これらの形質を決定している遺伝子は、 その大部 分が共通であり、 いくつかの領域における変異のパターンに基づいて、 タイピン グが行われる。 複数の領域における塩基配列が予測されたとおりでなければ、 一 定レベルの増幅生成物を生じることができない本発明の方法は、 このような解析 に好適である。
更に、 本発明によれば特定の領域を構成する塩基配列が野生型の塩基配列であ るときに増幅が起きるプライマーと、 変異型であるときに増幅が起きるプライマ —を組みあわせて同一検体のゲノム DNAを解析することにより、 ヘテロとホモ を明瞭に判定することができる。 すなわちいずれか一方でのみ増幅が観察された 場合には、 被検体は野生型か変異型のいずれかをホモで有することを示している 他方、 両方のプライマ一で増幅が観察されるときには、 変異型と野生型をへテロ で有することを示している。
この他本発明は、 テーラーメード医療を支える薬剤代謝遺伝子の解析技術とし ても有用である。 薬剤代謝遺伝子は、 薬剤に対する感受性を左右する重要な遺伝 子である。 その活性の違いは、 その薬剤の代謝に関与する酵素をコードする遺伝 子に見出されるわずかな塩基配列の相違に起因していると考えられている。 ヒト ゲノムプロジェク卜の成果によって、 標準的なヒト遺伝子の姿が明らかにされよ うとしている。 この成果の実用的な応用として最も注目されているのが薬剤代謝 遺伝子の解析である。 したがって本発明は、 ポストゲノム時代において高い有用 性を持つ技術を提供するものである。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、 参照として本明細書 に組み入れられる。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の望ましい態様の反応原理の一部（1 )-(2 )を示す模式図である。 図 2は、 本発明の望ましい態様の反応原理の一部 (3 )-( 5 )を示す模式図である。 図 3は、 本発明の望ましい態様の反応原理の一部 ( 6 )- (8 )を示す模式図である。 図 4は、 本発明の望ましい態様の反応原理の一部（9 )-( 11 )を示す模式図であ る o
図 5は、 本発明による 1本鎖核酸が形成するループの構造を示す模式図である 図 6は、 ヒト CYP2C19フアミリーに見出される互いに類似した塩基配列を示 す図である。
図 7は、 実施例において SNPsの検出を行った標的塩基配列と、 標的塩基配列 におけるプライマーの位置関係を示す図である。 図 8は、 本発明による変異の検出方法の結果を示す写真である。 各レーンは、 標的テンプレート ：特定の領域が予測される塩基配列であった場合、 一塩基違い テンプレート ：予測される塩基配列と 1塩基相違していた場合、 そして対照とし てのプライマーのみの場合：テンプレート無しを示している。
図 9は、 本発明による変異の検出方法の結果を示すグラフである。 図中、 縦軸 は蛍光強度を、 横軸は反応時間 （時間） を示す。 ―國— ：夕ーゲットなし、 一〇 - ： m l , - · - ： W T
図 1 0は、 実施例 3において SNPsの検出を行った標的塩基配列と、 標的塩基 配列におけるプライマーの位置関係を示す図である。
図 1 1は、 本発明による変異検出方法の結果を示すグラフである。 a ) は野生 型（WT)用プライマーセットを そして b ) は変異型 (MUT)用プライマーセットを 各錡型 DNAと反応させた結果を示す。 図中、 縦軸は蛍光強度を、 横軸は反応時 間 （分） を示す。 —秦— ：野生型（WT)、 —〇— ：変異型 (MUT)、 一 A_ : DNAな し
図 1 2は、 本 明による変異検出方法の結果を示す写真である。 各レーンは、 野生型 (WT)用プライマ一セット、 および変異型 (MUT)用プライマ一セヅ トを各鍊 型 DNAと反応させた結果を示す。 DNAなし：銪型 DNA無し、 MUT DNA：変異型の CYP2C19遺伝子が錶型、 WT DNA：野生型の CYP2C19遺伝子が錶型
図 1 3は、 本発明による変異検出方法の特異性を検討した結果を示すグラフで ある。 a ) は野生型 (WT)用プライマ一セットを、 そして b ) は変異型 (MUT)用プ ライマーセットを各錶型 DNAと反応させた結果を示す。 図中、 縦軸は蛍光強度 を、 横軸は反応時間 （分） を示す。 一♦—： DNAなし、 一▲一： CYP2C9遺伝子、 一 X—： CYP2C18遺伝子、 ―秦— ： CYP2C19野生型 (WT)、 —〇— ： CYP2C19変異 型（MUT)、
図 1 4は、 実施例 5において SNPsの検出を行った標的塩基配列と、 標的塩基 配列におけるプライマーの位置関係を示す図である。 図 1 5は、 ループプライマ一を応用した本発明による変異検出方法の結果を示 すグラフである。 a ) は野生型 (WT )用プライマ一セットを、 そして b ) は変異 型 (MUT)用プライマ一セットを各銪型 DNAと反応させた結果を示す。 図中、 縦軸 は蛍光強度を、 横軸は反応時間 （分） を示す。 一 ·一：野生型 (WT )、 —〇— ： 変異型 (MUT )、 —A—： DNAなし
図 1 6は、 ループプライマーを応用した本発明による変異検出方法の特異性を 検討した結果を示すグラフである。 a ) は野生型（WT)用プライマーセットを、 そして b ) は変異型 (MUT )用プライマ一セットを各錡型 MAと反応させた結果を 示す。 図中、 縦軸は蛍光強度を、 横軸は反応時間 （分） を示す。 一♦一： DNAな し、 一▲一： CYP2C9遺伝子、 一X—： CYP2C18遺伝子、 —き— ： CYP2C19野生型 (WT)、 —〇— ： CYP2C19変異型 (MUT )、
図 1 7は、 ループプライマーを応用した本発明による変異検出方法によって血 液検体の変異を検出した結果を示すグラフである。 検体 No. 10は野生型ホモ（WT /WT)、 検体！^， は野生型/変異型へテロ^!1/^!1)、 そして検体 No.8は変異型 ホモ (MUT/MUT)である。 図中、 縦軸は蛍光強度を、 横軸は反応時間 （分） を示す。 一き—：野生型（WT)用プライマ一、 —〇— ：変異型 (MUT)用プライマ一、 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。
実施例 1 . ヒト CYP2C19遺伝子における変異の検出 （ 1 )
ヒト CYP2C19の遺伝子を PCRにより増幅し、 SNPs部分を認識する制限酵素 Sm alで消化し野生型 (WT)か 1塩基変異（ml )かのタイピングを行った。 さらに、 そ の結果に基づいて WTおよび mlと判定した PCR産物を、 pBluescript I Iの EcoR Vにクローニングし、 塩基配列を決定して SNPs部分の塩基配列を確認した。 野 生型の塩基配列は、 配列番号： 5に示した。 mlでは、 配列番号： 5の 1 1 1番 目が Gではなく Aとなっていた （図 7 ) 。 続いて、 本発明に基づいてヒト CYP2C19の WTと mlを識別するためのプライ マ一として、 次の塩基配列からなるプライマ一を設計した。 各プライマーと標的 塩基配列の関係は、 図 7に示したとおりである。 F Aの 5'末端が、 変異を検出 すべき部分を含んでいる。 したがって、 標的塩基配列のこの領域において予測さ れる塩基配列が存在しない場合、 相補鎖合成反応は阻害される。
R A dll+I^ ) "配列番号： 1
5' -GGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTGTGTTCTTTTACTTTCTCCAAAATATC-35
アウタープライマ一 R 3 /配列番号： 2
5' -AGGGTTGTTGATGTCCATC-3'
F A (F1+F2)Z配列番号： 3
5' -CGGGAAATAATCAATGATAGTGGGAAAATATGCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAG-3 アウタープライマー F 3 /配列番号： 4
5' -CCAGAGCTTGGCATATTGTATC-3'
上記塩基配列からなるプライマ一を用い、 WTあるいは mlを組み込んだ pBlue script I I(EcoRIで直鎖状にしたもの） l(T19 mol/ tube (約 6 0 0 0 0分子） を 銪型とし、 6 0 °Cで 2時間反応させた。 铸型は 2本鎖のまま反応させた。 反応液 の組成は次のとおりである。
-反応液組成 （25〃L中）
20 mM Tris-HCl pH 8.8
10 mM KC1
10 mM (NH4)2S04
4 mM MgS04
1 Betaine
0.1% Triton X-100
0.4 mM dNTP 8 U Bst DM ポリメラーゼ （NEW ENGLAND BioLabs)
プライマー：
1600 nM F A
1600 nM R A
200 nM F 3
200 nM R 3
上記反応液の に 5 Lの loading bufferを添加し、 2%ァガロースゲル (0.5% TBE)を使って、 0.5時間、 1 0 0 Vで電気泳動した。 泳動後のゲルをェ チジゥムプロマイ ド（EtBr)で染色して核酸を確認した。 結果は図 8に示すとお りである。 テンプレート無しと、 一塩基違いの mlをテンプレートとしたときは 増幅反応が起きなかったが、 WTをテンプレートとしたときは増幅生成物が確認 された。 本発明によって、 1塩基の相違を明瞭に識別できることが確認された。 実施例 2 . ヒ ト CYP2C19遺伝子における変異の検出 （2 )
実施例 1と同じプライマ一を用い、 本発明に基づく変異の検出方法を実施した ( 標的塩基配列として、 WT、 および mlを組み込んだ pBluescript I I (EcoRIで直 鎖状にしたもの） 10—21mol/ tube (約 6 0 0分子） を用いる他は実施例 1と同様 の反応液組成とし、 6 4 °Cで反応させた。 反応液中には最終濃度 0.25 g/mlに なるように EtBrを添加し、 反応は ABI Prism 7700 (パーキンエルマ社） を用い て 6時間追跡した。
結果は図 9に示した。 6時間の反応中、 テンプレート無しと一塩基違いの ml をテンプレートとしたときは増幅反応は起きなかった。 WTをテンプレートとし たときには、 増幅反応に伴う傾向強度の増強が観察された。 本発明に基づいて、 特定の領域における 1塩基の相違を正確に識別できることが確認できた。 また本 発明に基づく変異の検出方法は、 等温で実施することができ、 しかも汎用の蛍光 測定装置で反応追跡が可能であることが示された。 なお、 この実施例で用いた ABI Prism 7700は、 もともと PCR法のモニタリン グを目的とする装置である。 しかし本発明に基づく検出方法においては PCR法 のような温度サイクルは行っておらず、 等温 （6 4 °C) でインキュベーションし たのみである。 したがって、 本実施例に基づく変異の検出方法は、 インキュべ一 夕一を備えた蛍光測定装置でありさえすれば、 実施することができる。 実施例 3 . ヒト CYP2C19遺伝子における変異の検出 （3 )
本発明による塩基配列の変異検出方法の特異性を確認するために、 以下の実験 を行った。 すなわち、 特定の領域に予測される塩基配列を変異型とした場合と、 野生型とした場合のそれぞれについてプライマーを設定し、 本発明による変異の 検出方法を試みた。 用意したプライマーの塩基配列は次のとおりである。 実施例
1、 2と同様にヒト CYP2C19遺伝子を錡型とし、 検出すべき変異に対して、 変 異がある場合 (MUT)に増幅が起きるプライマ一セット （予測される塩基配列が変 異型） と、 野生型 (WT)の場合に増幅が起きるプライマ一セヅ ト （予測される塩 基配列が野生型） を用いた。 各プライマーと標的塩基配列の関係は、 図 1 0に示 したとおりである。 F Aおよび R Aの両者の 5，末端から 2番目の塩基が、 SNPs に相当する。
野生型検出用プライマーセッ 卜
FA(F1+F2 )/配列番号： 6
： 5'-CCGGGAAATAATCAATGTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAG-3'
RA(R1+R2 ) /配列番号： 7
： 5'-CGGGAACCCATAACTGTTCTTTTACTTTCTCC-3'
変異型検出用プライマ一セッ ト
FA(F1+F2) /配列番号： 8
： 5'-CAGGAACCCATAACAAATTACTTAGTGTTCTTTTACTTTCTC-3'
RA(R1+R2 ) /配列番号： 9 ： 5'-CAGGAACCCATAACAAATGTGTTCTTTTACTTTCTCC-3'
アウタープライマ一 R 3には配列番号： 2、 アウタープライマ一 F 3には配列 番号： 4に示す塩基配列からなるプライマ一を用いた （実施例 1と同じ） 。 上記塩基配列からなるプライマーを用い、 WTあるいは mlを組み込んだ pBlue script I I(EcoRIで直鎖状にしたもの） 6 0 0 0分子/ tubeを鍊型とし、 9 5 °C で 3分間処理後、 下記の反応液に添加し反応液量を 2 5 /Lとして 6 0 °Cで 3時 間反応させた。 反応液の組成は次のとおりである。
•反応液組成 （25 L中）
20mM Tris-HCl pH 8.8
lOmM (NH4)2S04
lOmM KC1
3.5mM MgS04
1M Betaine
0.1% Triton X-100
0.4mM dNTPs
8U Bst DNA ポリメラーゼ
1600nM FA
1600nM RA
200nM F3
200nM R3
反応液中には最終濃度 0.25〃g/mlになるように EtBrを添加し、 反応は ABI P rism 7700 (パーキンエルマ一社） を用いて 3時間追跡した。
結果は図 1 1に示した。 また、 反応後の上記反応液の 5 /Lを実施例 1と同じ 操作で電気泳動した結果を図 1 2に示した。 3時間の反応中、 野生型用プライマ —セットおよび変異型プライマーセットのいずれも、 錡型が予測された塩基配列 であった場合にのみ増幅反応が進行していることが確認できた。 またわずか 6 0 0 0分子の錶型を用いた実験であるにもかかわらず増幅反応は 1 0 0分程度でプ ラトーに達し、 本発明による検出方法の感度の高さが証明された。 6 0 0 0分子 の DNAは、 ちょうど血液 1〃Lに含まれる白血球に由来するゲノムの数に相当す る。 成人の白血球数の正常値が 4 0 0 0〜8 0 0 0と言われていることから、 中 間値 6 0 0 0がちょうど白血球の数に相当する。 血液に含まれる DNAの大部分 が白血球に由来するものであることから、 白血球の数は血液中に存在する DNA の数を意味する。 すなわち、 6 0 0 0分子の DNAを解析できる条件とは、 l AdL の血液を試料として遺伝子の解析ができることを意味している。
一方で、 錡型の塩基配列が予測された塩基配列でなかった場合には、 野生型用 プライマーセット、 変異型プライマ一セットのいずれにおいても、 3時間の反応 で増幅は観察されなかった。 本発明による変異検出方法が、 わずかな試料によつ て信頼性の高い塩基配列のチヱック機構を実現していることが示された。 実施例 4 . ヒト P450CYP2C19遺伝子における特異性の検討
本発明による変異検出方法の特異性を検討するために、 変異を検出すべき錶型 と類似する塩基配列からなる錄型を 1 0 0倍量で用いた実験を行った。 変異を検 出すべき錡型としては実施例 3と同じヒト P450CYP2C19遺伝子を用いた。 一方、 この遺伝子と塩基配列が類似する銪型としては、 ヒト P450CYP2C9遺伝子、 およ びヒト P450CYP2C18遺伝子を用いた。 これらの遺伝子についても実施例 1と同 様に pBluescript I Iにクローニングし塩基配列を確認した上で実験に用いた。 ヒト P450CYP2C19を 6 0 0 0分子に代えて、 6 0 0 0 0 0分子のヒト p450CYP 2C9遺伝子およびヒト P450CYP2C18遺伝子を錡型としてチューブに加えた他は実 施例 3と同じ条件で反応させた。
結果は図 1 3に示したとおりである。 野生型用プライマーセットでは、 CYP2C 19WT DNA 6 0 0 0分子で増幅が見られたのに対して、 CYP2C9、 CYP2C18遺伝子 では 6 0 0 0 0 0分子でも増幅は観察されなかった。 同様に変異型用プライマー セッ 卜においても、 CYP2C19MUT DNA 6 0 0 0分子で増幅が見られたのに対して、 CYP2C9、 CYP2C18 遺伝子では 6 0 0 0 0 0分子でも増幅は観察されなかった。 以上の結果より、 本発明による変異検出方法は、 相互に類似する塩基配列からな る遺伝子群の中でも、 目的とする塩基配列を類似する塩基配列から識別すること ができ、 しかも目的とする変異は正確に検出できることが示された。
図 6にも示すように、 p450CYP2C19, p450CYP2C9、 および p450CYP2C18の塩基 配列は極めて類似性が高い。 公知の塩基配列の検出法では、 これほど類似性の高 い塩基配列を識別し、 同時に変異を検出することは不可能と言って良い。 実施例 5 . ループプライマ一を用いた検討 1
—ヒト p450CYP2C19遺伝子における SNPs検出—
本出願人によって見出されたループプライマー （2000年 9月 19日出願、 特願 2000-283862) による LAMP法の反応効率の改善効果が、 本発明による変異検出 方法においても有効であることを確認するために、 以下の実験を行った。
まず以下の塩基配列からなるプライマ一、 およびループプライマ一を設計した c ループプライマーとは、 F Aの伸長生成物上の F 2と F 1の間において相補鎖合 成の起点を与えることができるプライマ一である。 R Aについても同様に、 前記 R Aの伸長生成物における R 2と R 1の間において相補鎖合成の起点を与えるこ とができるプライマーをループプライマーとして用いる。 具体的には、 以下の塩 基配列からなるループプライマ一を設定した。 野生型 (WT )用、 変異型 (MUT )用の 各プライマーセヅトに対してループプライマ一は共通である。 反応に用いた各プ ライマーと標的塩基配列の関係を図 1 4に示した。 実施例 3と同様に、 F Aおよ び R Aの両者の 5'末端から 2番目の塩基が、 SNPsに相当する。
野生型検出用プライマーセット
FA(F 1+F2 )/配列番号： 1 0
： 5'- CCGGGAAATAATCTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAG-3' RA(R1+R2) /配列番号： 1 1
： 5'-CGGGAACCCTGTTCTTTTACTTTCTCC-3'
変異型検出用プライマ一セット
FA(F1+F2 ) /配列番号： 1 2
： 5'-CTGGGAAATAATCATAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAG-3'
RA(R1+R2) /配列番号： 1 3
： 5 '-CAGGAACCCATATGTTCTTTTACTTTCTCC-3 '
ループプライマー FL/配列番号： 1 4
： 5' -GATAGTGGGAAAATTATTGC-3'
ループプライマ一 RL/配列番号： 1 5
： 5' -CAAATTACTTAAAAACCTTGCTT-3'
アウタープライマ一 R 3には配列番号： 2、 アウタープライマー F 3には配列 番号： 4に示す塩基配列からなるプライマーを用いた （実施例 1と同じ） 。 上記プライマーセヅ卜に、 ループプライマ一を組み合わせ、 WTあるいは mlを 組み込んだ pBluescript I I (EcoRIで直鎖状にしたもの） 6 0 0 0分子/ tubeを 銪型とし、 9 5 °Cで 3分間処理後、 下記の反応液に添加し反応液量を 2 5 Lと して 6 0 °Cで 3時間反応させた。 反応液の組成は次のとおりである。
反応組成 （2 5 /L中）
20mM Tris-HCl pH 8.8
lOmM (NH4)2S04
lOmM KC1
4.0mM MgS04
1M Betaine
0. 1% Triton X-100
0.5mM dNTPs
8U Bst DNA ポリメラーゼ 1600nM FA
1600nM RA
200nM F3
200nM R3
800nM FL
800nM RL
錡型 DNA 6 0 0 0分子/ tube
反応液中には最終濃度 0.25 g/mlになるように EtBrを添加し、 反応は AB I P rism 7700 (パーキンエルマ一社） を用いて 1時間追跡した。 結果は図 1 5に示 した。
ループプライマーを用いない反応では、 WT用プライマーで反応開始後約 7 0 分から MUT用プライマーで約 8 0分から増幅生成物による蛍光シグナルの増加 が観察された （図 1 1 ) た。 一方、 ループプライマーを用いた反応では野生型用、 変異型用の両方のプライマーで、 反応開始後約 2 0分から増幅生成物による蛍光 シグナルの増加が観察されている （図 1 5 ) 。 ループプライマ一の応用によって、 反応速度が速くなることが確認された。
一方、 SNPsの識別においては、 ループプライマーを用いてもループプライマ —を用いない時と同様に、 1塩基の違いを識別しながら増幅反応が起こっている ことが確認された。 ループプライマーの添加によって、 特異性を犠牲にすること なく反応速度を大幅に向上させることが確認できた。 実施例 6 . ループプライマ一を用いた検討 2
—ヒト P450CYP2C19遺伝子における特異性の検討—
錶型として類似する塩基配列からなる DNAを 1 0 0倍量用いて、 ループブラ イマ一を応用した場合の本発明による変異検出方法の特異性を検討した。 ヒト p 450CYP2C19を 6 0 0 0分子に代えて、 6 0 0 0 0 0分子のヒト p450CYP2C9遺伝 子およびヒト P450CYP2C18遺伝子を錡型としてチューブに加えた他は実施例 5 と同じ条件で反応させた。
結果は図 1 6に示したとおりである。 野生型用プライマーセットでは、 CYP2C 19WT DNA 6 0 0 0分子で増幅が見られたのに対して、 CYP2C9、 CYP2C18遺伝子 では 6 0 0 0 0 0分子でも増幅は観察されなかった。 同様に変異型用プライマ一 セヅトにおいても、 CYP2C19MUT DNA 6 0 0 0分子で増幅が見られたのに対して、 CYP2C9、 CYP2C18 遺伝子では 6 0 0 0 0 0分子でも増幅は観察されなかった。 以上の結果より、 ループプライマーを応用した場合であっても、 本発明による変 異検出方法は、 相互に類似する塩基配列からなる遺伝子群の中でも、 目的とする 塩基配列を類似する塩基配列から識別することができ、 しかも目的とする変異は 正確に検出できることが示された。 実施例 7 . 血液検体を用いた検討
ボランティアより提供された血液 （3 5検体） から、 QIAamp DNA Blood Kit (キアゲン ）を用いて DMを抽出した。 抽出した DNAは、 特開平 10- 14585に記 載されているプライマー配列を用いてヒト P450CYP2C19遺伝子の ml領域を PCR により増幅した。 増幅は、 Z-Taq ポリメラ一ゼ（宝酒造） を用いて Z- Taq用のプ 口トコールに準じて行った。
得られた PCR産物を PCR- RFLPにより解析した。 操作は以下のとおりである。 まず PCR産物 3〃Lを制限酵素 Msp Iで 3 7 °C 3時間消化し、 4 %ァガ口一スゲ ル （Ampl isize Agarose, BIO- RAD )で電気泳動した。 泳動後、 ゲルを SYBR- Green I (FMC )で染色し、 DNAのバンドのパターンを検出することにより ml領域の夕 ィビングを行った。
このうち、 ml領域について野生型ホモ（WT/WT)、 野生型/変異型へテロ （WT/MU T) 、 および変異型ホモ（MUT/MUT)を各 3検体、 合計 9検体について本発明に基 づく変異の検出方法によって解析した。 用いた 9検体については、 PCR産物の塩 基配列を決定し、 PCR-RFLPによるタイピング結果が正しい事を確認した。 実施 例 5に記載のプロトコルにしたがって、 本発明による変異の検出方法を実施した ( ただし、 検体 DNAは計算上血液 分より抽出された量を用いた。 すなわち、 7 mlの血液から抽出した DNAの 1 / 7 0 0 0を検体 DNAとして加えた。
その結果、 本発明による変異の検出方法の結果は、 9検体全てで PCR-RFLPの 結果と一致した。 このうち、 検体 No. lO(PCR-RFLPの結果 WT/WT) 、 検体 No. 11 (PCR-RFLPの結果 WT/MUT)、 検体 No.8(PCR- RFLPの結果 MUT/MUT)についての反 応を図 1 7に示した。
野生型ホモ（WT/WT)検体では野生型（WT)用プライマ一セットでのみ増幅反応が 起こり、 変異型（ UT)用のプライマ一では増幅反応が起きなかった。 ヘテロ（WT/ MUT)検体では野生型 (WT)用、 変異型（MUT)用の両方のプライマ一セッ卜で同じ様 に遺伝子が増幅された。 変異型ホモ（MUT/ UT)検体では変異型 (MUT)用のプライ マーでのみ増幅反応が起き、 野生型（WT)用プライマ一では増幅反応は起こらな かった。 このことは、 野生型用と変異型用のプライマーセットを組み合わせて反 応させることによって、 次のようなマトリクスに基づいて、 ホモとヘテロを容易 に判定できることを示している。
野生型 変異型
野生型ホモ + —
変異型ホモ 一 +
ヘテロ + +
さらに増幅された核酸については、 塩基配列を決定し、 CYP2C19遺伝子である ことを確認した。 血液に由来する検体 MA中では、 CYP2C19遺伝子の他に CYP2C 9、 CYP2C18等の類似配列が多数混在するが、 そのような類似配列存在下でも、 目的とする CYP2C19遺伝子のみを特異的に増幅し、 かつ、 1塩基の違いを識別 するという反応が一回の増幅反応でおこなえた。 従って類似配列が多数存在する 遺伝子の SNPタイビングが一回の増幅反応の有無のみで判定できる事が確認さ れた。 産業上の利用の可能性
本発明によって、 標的塩基配列が予測する塩基配列と異なっているかどうかを、 正確に識別することができる。 本発明の方法は、 核酸の変異や多型の解析に有用 である。 この方法は、 簡単な酵素的な反応に基づいている。 したがって、 特殊な 機器や、 反応成分を必要とせず、 安価に、 しかも容易に実施することができる。 また本発明による変異や多型の検出方法は、 標的塩基配列の増幅を伴う反応を 伴っているので、 塩基配列の識別結果を核酸の増幅反応生成物の量を指標として 検出できる。 その結果、 感度と再現性の高い塩基配列の解析が可能となる。 しか も本発明で用いる反応原理は、 相補鎖合成の開始が繰り返し標的塩基配列のチェ ックを経て進行している。 そのため、 たとえ誤った相補鎖合成が起きたとしても、 その反応が最終的な解析結果に影響を与えることがない。 公知の遺伝子増幅反応 である PCR法では、 いったん誤った相補鎖合成が起きてしまうと、 正確な判定 を行えなくなってしまうため、 このような解析には現実には応用することができ ない。 プライマーのハイブリダィズに基づく塩基配列のチヱック機構には、 常に 一定の誤りを伴うことは、 いわば宿命的な特性である。 本発明では、 核酸の相補 鎖合成における誤りの影響を常に最小限にすると同時に、 正確な反応に基づく生 成物のみが多量に蓄積するという、 高い S /N比を現実のものとした。 したがつ て、 本発明は、 核酸の増幅反応による塩基配列の識別方法をはじめて現実的なも のとした先駆的な発明と言うことできる。
更に、 複数の領域によって反応の進行が制御されるという本発明の特徴は、 類 似する塩基配列を含む複数の遺伝子が存在する条件の基での、 わずかな塩基配列 の相違の検出において有用である。 この特徴に基づいて、 本発明は、 HLAや血小 板同種抗原、 あるいは病原微生物のタイピングを正確に、 そして簡便に行うこと ができる。 また、 薬剤代謝酵素の活性に関連する SNPsの検出も、 本発明によつ て容易に行うことができる。

Claims

請求の範囲 次の要素を、 第 2および第 1のプライマーを起点とする相補鎖合成が可能な 条件下でィンキュベートし、 標的塩基配列を銪型とする相補鎖合成反応生成 物の量と特定の領域の変異および/または多型の存在と関連付ける工程を含 む、 標的塩基配列における特定の領域の変異および/または多型の検出方法 であって、 第 2および第 1のプライマーの少なくとも一方の 5，末端に配置 された塩基配列が、 前記特定の領域、 またはその相補鎖の予測される塩基配 列に相補的な塩基配列を含み、 この 5'末端に配置された塩基配列を銪型と して合成された相補鎖は、 特定の領域、 またはその相補鎖にァニールして相 補鎖合成の起点となるとき、 特定の領域を構成する塩基配列が予測していた ものでなかった場合に、 相補鎖合成が阻害されることを特徴とする方法。
( a )標的塩基配列を含む核酸試料、
(b )鎖置換を伴う相補鎖合成を触媒することができる DNAポリメラ一ゼ ( c )第 2のプライマー； ここで第 2のプライマ一はその 3，末端において前記 標的塩基配列を構成する一方の鎖の 3'側を規定する領域に対してァニール することができ、 かつ第 2のプライマーの 5，側には、 このプライマーを起 点とする相補鎖合成反応生成物上の領域を構成する予測される塩基配列に相 補的な塩基配列を備える、
( d)第 1のプライマー； ここで第 1のプライマ一はその 3'末端において前記 標的塩基配列を構成する他方の鎖の 3'側を規定する領域に対してァニール することができ、 かつ第 1のプライマーの 5，側には、 このプライマーを起 点とする相補鎖合成反応生成物上の領域を構成する予測される塩基配列に相 補的な塩基配列を備える、
( e )ヌクレオチド基質
2 .第 2のプライマー、 および第 1のプライマーが、 いずれもその 5，末端に配 置された塩基配列が、 前記特定の領域、 またはその相補鎖の予測される塩基 配列に相補的な塩基配列を含み、 この 5'末端に配置された塩基配列を錶型 として合成された相補鎖は、 特定の領域、 またはその相補鎖にァニールして 相補鎖合成の起点となるとき、 特定の領域を構成する塩基配列が予測してい たものでなかつた場合に、 相補鎖合成が阻害されることを特徴とする請求項 1に記載の方法。
3 .更に付加的に次の要素を存在させる請求項 1に記載の方法。
'第 3のプライマ一； ここで第 3のプライマーは、 錡型における第 1のブラ イマ一がァニールすべき領域の 3'側を起点とする相補鎖合成反応の起点とな る、 および
'第 4のプライマー； ここで第 4のプライマ一は、 鍊型における第 2のブラ イマ一がァニールすべき領域の 3'側を起点とする相補鎖合成反応の起点とな る、
4 .標的塩基配列の塩基配列と類似する塩基配列を含む遺伝子が同じ試料中に存 在する可能性があるものである、 請求項 1に記載の方法。
5 .標的塩基配列の塩基配列と類似する塩基配列を含む遺伝子が、 ファミリー遺 伝子および/または擬似遺伝子である請求項 4に記載の方法。
6 . フアミリー遺伝子および/または擬似遺伝子が、 チトクロム P 4 5 0フアミ リー、 ヒト白血球組織適合型抗原、 および血小板同種抗原からなる群から選 択されるいずれかの遺伝子である請求項 5に記載の方法。
7 .多型が 1塩基多型である、 請求項 1に記載の方法。
8 .標的塩基配列が、 C型肝炎ウィルス、 インフルエンザウイルス、 マラリア、 およびへリコパクター · ピロリからなる群から選択されるいずれかの病原性 ウィルスまたは病原性微生物の遺伝子の塩基配列から選択される請求項 1に 記載の方法。
9 .融解温度調整剤の存在下でィンキュペートする請求項 1に記載の方法。
1 0 . 融解温度調整剤が、 ベ夕イン、 プロリン、 およびジメチルスルホキシドか ら選択される少なくとも 1つの化合物である請求項 9に記載の方法。
1 1 . 核酸試料が 2本鎖の形態である請求項 1に記載の方法。
1 2 . 核酸の検出剤存在下で請求項 1に記載の方法を行い、 検出剤のシグナル変 化に基づいて変異および/または多型の存在を検出することを特徴とする請 求項 1に記載の方法。
1 3 . 変異および/または多型を検出すべき生物と同一の生物に由来し、 変異お よび/または多型を伴わないことが明らかな塩基配列を内部標準として利用 し、 両者を鎵型とする合成生成物の量の比較によって、 変異および/または 多型の存在を検出することを特徴とする請求項 1に記載の方法。
1 4 . 更に次の要素（f )および Zまたは（g)を存在させる請求項 1に記載の方法。
(f )第 1のループプライマ一；ここで第 1のループプライマーは、 第 1のプ ライマーの伸長生成物における第 1のプライマ一に由来する領域と、 第 1の プライマーに対する前記任意の領域の間において相補鎖合成の起点を与える ことができるものである
(g)第 2のループプライマ一； ここで第 2のループプライマーは、 第 2のプ ライマーの伸長生成物における第 2のプライマーに由来する領域と、 第 2の ブラィマーに対する前記任意の領域の間において相補鎖合成の起点を与える ことができるものである、
1 5 . 前記特定の領域を構成する塩基配列が予測された塩基配列でなかった場合 に、 第 1のプライマ一および/または第 2のプライマーの 5，末端に配置さ れた塩基配列を錡型として合成された相補鎖が、 特定の領域、 またはその相 補鎖にァニールするとき、 当該相補鎖の 3'末端から 2〜4番目の塩基にお いてミスマッチを生じることを特徴とする請求項 1に記載の方法。
. 次の要素を含む、 標的塩基配列における特定の領域の変異および/または 多型の検出用キッ 卜であって、 第 2および第 1のプライマーの少なくとも一 方の 5'末端に配置された塩基配列が、 前記特定の領域、 またはその相補鎖 の予測される塩基配列に相補的な塩基配列を含み、 この 5'末端に配置され た塩基配列を錶型として合成された相補鎖は、 特定の領域、 またはその相補 鎖にァニールして相補鎖合成の起点となるとき、 特定の領域を構成する塩基 配列が予測していたものでなかった場合に、 相補鎖合成が阻害されることを 特徴とするキット。
i )第 2のプライマ一； ここで第 2のプライマ一はその 3，末端において前記 標的塩基配列を構成する一方の鎖の 3'側を規定する領域に対してァニール することができ、 かつ第 2のプライマ一の 5，側には、 このプライマ一を起 点とする相補鎖合成反応生成物上の領域を構成する予測される塩基配列に相 補的な塩基配列を備えるものであり、
ii )第 1のプライマー； ここで第 1のプライマーはその 3，末端において前記 標的塩基配列を構成する他方の鎖の 3'側を規定する領域に対してァニール することができ、 かつ第 1のプライマーの 5'側には、 このプライマーを起 点とする相補鎖合成反応生成物上の領域を構成する予測される塩基配列に相 補的な塩基配列を備えるものである、
iii) 鎖置換を伴う相補鎖合成を触媒することができる DNAポリメラーゼ iv)ヌクレオチド基質
. 更に次の要素を含む請求項 1 6に記載のキット。
V )鎵型における第 1のプライマーがァニールすべき領域の 3，側にァニールし て相補鎖合成の起点となることができる第 3のプライマー、 および vi )錶型における第 2のプライマーがァニールすべき領域の 3，側にァニール して相補鎖合成の起点となることができる第 4のプライマー
. 更に次の要素を含む請求項 1 6に記載のキット。
vii )内部標準を増幅することができる第 5のプライマ一；ここで第 5のブラ イマ一は、 その 3'末端において内部標準の標的塩基配列を構成する一方の 鎖の 3'側を規定する領域に対してァニールすることができ、 かつ第 5のプ ライマーの 5'側には、 このプライマーを起点とする相補鎖合成反応生成物 の任意の領域を構成する塩基配列に相補的な塩基配列を備えるものであり、 そして
iix)内部標準を増幅することができる第 6のプライマ一；ここで第 6のブラ イマ一はその 3'末端において内部標準の標的塩基配列を構成する一方の鎖 の 3'側を規定する領域に対してァニールすることができ、 かつ第 6のブラ イマ一の 5'側には、 このプライマーを起点とする相補鎖合成反応生成物の 領域を構成する塩基配列に相補的な塩基配列を備えるものである、
. 更に次の要素を含む請求項 1 8に記載のキット。
ix )錶型における第 5のプライマ一がァニールすべき領域の 3，側にァニール して相補鎖合成の起点となることができる第 7のプライマ一、 および
X )銪型における第 6のプライマーがァニールすべき領域の 3，側にァニールし て相補鎖合成の起点となることができる第 8のプライマー
. 以下の工程を含む標的塩基配列の特定の領域における変異および/または 多型の検出方法であって、 第 2および第 1のプライマーの少なくとも一方の 5'末端に配置された塩基配列が、 前記特定の領域、 またはその相補鎖の予測 される塩基配列に相補的な塩基配列を含み、 この 5'末端に配置された塩基 配列を錶型として合成された相補鎖は、 特定の領域、 またはその相補鎖にァ ニールして相補鎖合成の起点となるとき、 特定の領域を構成する塩基配列が 予測していたものでなかった場合に、 相補鎖合成が阻害されることを特徴と する方法。
a ) 標的塩基配列に第 1のプライマ一をァニールさせ、 これを起点とする相 補鎖合成反応を行う工程； ここで第 1のプライマ一はその 3'末端において 前記標的塩基配列を構成する一方の鎖の 3'側を規定する領域に対してァニ ールすることができ、 かつ第 1のプライマーの 5，側には、 このプライマー を起点とする相補鎖合成反応生成物上の領域を構成する予測される塩基配列 に相補的な塩基配列を備える、
b ) 工程 a ) で合成された第 1のプライマーの伸長産物における第 2のブラ イマ一がァニールすべき領域を塩基対結合が可能な状態とし、 両者をァニー ルさせて第 1のプライマーの伸長産物を錶型とする相補鎖合成を行う工程； ここで第 2のプライマ一はその 3'末端において前記標的塩基配列を構成す る他方の鎖の 3'側を規定する領域に対してァニールすることができ、 かつ 第 2のプライマーの 5，側には、 このプライマ一を起点とする相補鎖合成反 応生成物上の領域を構成する予測される塩基配列に相補的な塩基配列を備え る、
c ) 第 2のプライマーの伸長生成物の 3'末端と、 該伸長生成物における第 1 のプライ.マ一に対する前記予測される塩基配列をァニールさせて自身を錶型 とする相補鎖合成を行う工程、
d ) 工程 c ) で合成された相補鎖における 3'末端と、 該伸長生成物におけ る第 2のプライマ一に対する前記予測される塩基配列をァニールさせて自身 を铸型とする相補鎖合成を行う工程、
e ) 第 2のプライマーを起点とする合成生成物の量を特定の領域における変 異および/または多型の存在と関連付ける工程、
. 工程 b ) が、 銪型における錶型における第 1のブライマ一がァニールすベ き領域の 3'側をを起点とする第 3のプライマ一の相補鎖合成反応による置換 によって第 1のプライマーの伸長生成物を 1本鎖とする工程を含む請求項 2 0に記載の方法。
2 2 . 工程 c ) が、 錡型における第 2のプライマーがァニールすべき領域の 3， 側を起点とする第 4のプライマ一の相補鎖合成反応による置換によって第 2 のプライマーの伸長生成物を 1本鎖とする工程を含む請求項 2 0に記載の方 法。
2 3 . 更に以下の工程を含む請求項 2 0に記載の方法であって、 第 2および第 1 のプライマーの少なくとも一方の 5'末端に配置された塩基配列が、 前記特 定の領域、 またはその相補鎖の予測される塩基配列に相補的な塩基配列を含 み、 この 5'末端に配置された塩基配列を錶型として合成された相補鎖は、 特定の領域、 またはその相補鎖にァニールして相補鎖合成の起点となるとき、 特定の領域を構成する塩基配列が予測していたものでなかった場合に、 相補 鎖合成が阻害されることを特徴とする方法。
1 ) 請求項 2 0に記載の方法において、 工程 c ) の 3'末端と自身の前記予 測される塩基配列とのァニールによって、 第 1のプライマーの 3'末端に相 補的な塩基配列を含む塩基対結合が可能なループ形成領域を形成するととも に、 自身の 3'末端を相補鎖合成の起点とし、 自身を錶型とする相補鎖合成 反応を行う工程、
2 ) ループ形成領域に第 1のブライマーをァニールさせて、 鎖置換を伴う相 補鎖合成を触媒することができる DNAポリメラ一ゼによりそれを起点とする 相補鎖合成を行う工程、
3 ) ループ形成領域にァニールするプライマーを起点とする相補鎖合成反応 によって、 自身の 3'末端からの伸長生成物を置換し、 その 3'末端と前記予 測される塩基配列を再び塩基対結合が可能な状態とする工程、
4 ) 工程 3 ) によって塩基対結合が可能となった 3'末端を前記予測される 塩基配列にァニールさせて相補鎖合成の起点とし、 自身を錄型とする相補鎖 合成反応を行うことによって、 ループ形成領域を起点として合成された相補 鎖を置換して 1本鎖の核酸を生成する工程 5 ) 3'末端の第 2のプライマ一に対する前記予測される塩基配列に対するァ ニールと相補鎖合成によって、 第 2のプライマ一の 3'末端に相補的な塩基 配列を含む塩基対結合が可能なループ形成領域を形成する工程、
6 ) ループ形成領域に第 2のプライマーをァニールさせて、 鎖置換を伴う相 補鎖合成を触媒することができる DNAポリメラ一ゼによりそれを起点とする 相補鎖合成を行う工程、
7 ) 工程 3 ) - 6 ) を繰り返す工程、 および
8 ) 工程 7 ) の後に、 および/または工程 7 ) と並行して標的塩基配列とそ の相補鎖とが繰り返し連結された 1本鎖核酸の生成を観察し、 その生成量を 変異および/または多型と関連付ける工程
. 更に次の工程を含む、 請求項 2 3に記載の方法。
9 ) 工程 4 ) で生成する 1本鎖の核酸の 3，末端を第 2のプライマーに対す る前記予測される塩基配列にァニールさせて、 第 2のプライマーの 3'末端 に相補的な塩基配列を含む塩基対結合が可能なループ形成領域を形成すると ともに、 自身の 3'末端を相補鎖合成の起点とし、 自身を錶型とする相補鎖 合成反応を行う工程、 予測される塩基配列
1 0 ) 3'末端と自身の前記特定の領域とのァニールによって形成された、 ル ープ形成領域に第 2のプライマーをァニールさせて、 鎖置換を伴う相補鎖合 成を触媒することができる DNAポリメラーゼによりそれを起点とする相補鎖 合成を行う工程、
1 1 ) ループ形成領域にァニールするプライマーを起点とする相補鎖合成反 応によって、 自身の 3'末端からの伸長生成物を置換し、 その 3'末端と前記 予測される塩基配列を再び塩基対結合が可能な状態とする工程、
1 2 ) 工程 1 1 ) によって塩基対結合が可能となった 3'末端を前記予測さ れる塩基配列にァニールさせて相補鎖合成の起点とし、 自身を鎵型とする相 補鎖合成反応を行うことによって、 ループ形成領域を起点として合成された 相補鎖を置換して 1本鎖の核酸を生成する工程、
1 3 ) 3'末端の前記予測される塩基配列に対するァニールと相補鎖合成によ つて、 第 1のプライマーの 3'末端に相補的な塩基配列を含む塩基対結合が 可能なループ形成領域を形成する工程、
1 4 ) ループ形成領域に第 1のプライマーをァニールさせて、 鎖置換を伴う 相補鎖合成を触媒することができる DNAポリメラーゼによりそれを起点とす る相補鎖合成を行う工程、
1 5 ) 工程 1 1 ) — 1 4 ) を繰り返す工程、 および
1 6 ) 工程 1 5 ) の後に、 および/または工程 1 5 ) と並行して標的塩基配 列とその相補鎖とが繰り返し連結された 1本鎖核酸の生成を観察し、 その生 成量を変異および/または多型と関連付ける工程
. 更に次の工程を含む、 請求項 2 4に記載の方法。
1 7 ) 工程 1 2 ) において生成する 1本鎖の核酸の 3'末端を自身の前記予 測される塩基配列にァニールさせて、 第 1のプライマーの 3'末端に相補的 な塩基配列を含む塩基対結合が可能なループ形成領域を形成するとともに、 自身の 3'末端を相補鎖合成の起点とし、 自身を錶型とする相補鎖合成反応 を行う工程、
. 第 2のプライマ一、 および第 1のプライマーが、 いずれもその 5'末端に 配置された塩基配列が、 前記特定の領域、 またはその相補鎖の予測される塩 基配列に相補的な塩基配列を含み、 この 5'末端に配置された塩基配列を鎵 型として合成された相補鎖は、 特定の領域、 またはその相補鎖にァニールし て相補鎖合成の起点となるとき、 特定の領域を構成する塩基配列が予測して いたものでなかつた場合に、 相補鎖合成が 害されることを特徴とする請求 項 2 0に記載の方法。
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Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001077317A1 (en) * 2000-04-07 2001-10-18 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Method of amplifying nucleic acid by using double-stranded nucleic acid as template
WO2002024902A1 (fr) * 2000-09-19 2002-03-28 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Procede permettant de synthetiser un polynucleotide
JP2002345499A (ja) * 2001-05-29 2002-12-03 Eiken Chem Co Ltd 核酸配列を検出する方法及びその方法に使用するキット
WO2004013354A1 (en) * 2002-08-06 2004-02-12 Tepnel Medical Limited Amplification of nucleic acids
JP3897805B2 (ja) * 2003-12-25 2007-03-28 独立行政法人理化学研究所 核酸の増幅法およびこれを利用した変異核酸の検出法
EP1970453A2 (en) 2007-03-09 2008-09-17 Riken Primer, primer set, and nucleic acid amplification method and mutation detection method using the same
WO2009054510A1 (ja) 2007-10-25 2009-04-30 Riken 等温増幅方法およびそれに用いるｄｎａポリメラーゼ
US7713691B2 (en) 1998-06-24 2010-05-11 Enzo Life Sciences, Inc. Modified nucleic acid polymers and methods for their production
WO2010061922A1 (ja) 2008-11-27 2010-06-03 独立行政法人理化学研究所 新規ＭｕｔＳタンパク質およびそれを用いた変異の判定方法
US8445664B2 (en) 1998-06-24 2013-05-21 Enzo Diagnostics, Inc. Kits for amplifying and detecting nucleic acid sequences
US8530165B2 (en) 2008-02-05 2013-09-10 Olympus Corporation Nucleic acid detection method for determining if one or more analyte nucleotides are present in a nucleic acid

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2390309C (en) * 1999-11-08 2012-09-25 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Method for synthesizing the nucleic acid
EP1564301A4 (en) * 2002-10-29 2007-07-11 Riken METHOD FOR AMPLIFYING NUCLEIC ACID
JP5019431B2 (ja) * 2004-10-19 2012-09-05 学校法人日本大学 インフルエンザ菌の検出方法、インフルエンザ菌検出用プライマーセット及びインフルエンザ菌検出用キット
JP2008029333A (ja) * 2006-07-03 2008-02-14 Fujifilm Corp 新規遺伝子増幅法に用いられるプライマー
US20080182312A1 (en) 2007-01-17 2008-07-31 Todd Denison Pack Stable reagents and kits useful in loop-mediated isothermal amplification (LAMP)
JP4410268B2 (ja) * 2007-03-28 2010-02-03 株式会社東芝 メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ｍｔｈｆｒ）の遺伝子型を検出するための核酸プライマーセット及び核酸プローブ
WO2009049630A1 (en) * 2007-10-16 2009-04-23 Aarhus Universitet Isothermal amplification method for detection of nucleic acid mutation
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
EP2272980A1 (en) * 2009-07-09 2011-01-12 Bioesplora SRL Molecular probes for target nucleic acid detection and quantification
ES2386514T3 (es) 2009-07-10 2012-08-22 Biotrin International Limited Método isotérmico rápido, altamente sensible, para la detección de mutaciones puntuales y SNP
US20120014956A1 (en) 2010-02-02 2012-01-19 Hartmut Kupper Methods and compositions for predicting responsiveness to treatment with tnf-alpha inhibitor
AU2011317073B2 (en) 2010-10-22 2016-04-07 T2 Biosystems, Inc. NMR systems and methods for the rapid detection of analytes
US8563298B2 (en) 2010-10-22 2013-10-22 T2 Biosystems, Inc. NMR systems and methods for the rapid detection of analytes
TWI600766B (zh) 2012-08-09 2017-10-01 財團法人工業技術研究院 用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及／或多形性的套組
US20170335382A1 (en) * 2014-11-10 2017-11-23 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Isothermal Amplification Assay for the Detection of Short Nucleic Acid Sequences
CN104573409B (zh) * 2015-01-04 2017-07-25 杭州和壹基因科技有限公司 基因定位的多重检验方法
US20190032104A1 (en) 2016-01-21 2019-01-31 T2 Biosystems, Inc. Rapid antimicrobial susceptibility testing using high-sensitivity direct detection methods
AU2017250205A1 (en) 2016-04-14 2018-11-22 T2 Biosystems, Inc. Methods and systems for amplification in complex samples
JP7176682B2 (ja) 2018-02-22 2022-11-22 佐藤製薬株式会社 白癬菌の遺伝子をｌａｍｐ法により検出するためのプライマーセット及びそれを含むキット並びにそれらを用いて白癬菌を検出する方法
US11149320B1 (en) 2020-03-31 2021-10-19 Diasorin S.P.A. Assays for the detection of SARS-CoV-2

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0549107A1 (en) * 1991-10-11 1993-06-30 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification and phosphorothioate-containing oligonucleotides as primers in nucleic acid amplification
WO1996001327A1 (fr) * 1994-07-04 1996-01-18 Labimap S.A. Methode d'amplification de sequences d'acides nucleiques
US5874260A (en) * 1994-10-28 1999-02-23 Bio Merieux Oligonucleotide which can be used as primer in a method of amplification based on a replication accompanied by strand displacement

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
GB9001181D0 (en) * 1990-01-18 1990-03-21 Imp Cancer Res Tech Genetic assay
US5595891A (en) 1990-07-19 1997-01-21 Behringwerke Ag Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification
US5525462A (en) 1991-05-02 1996-06-11 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Nucleic acid sequence amplification method, detection method, and reagent kit therefor
US5612199A (en) 1991-10-11 1997-03-18 Behringwerke Ag Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification
US5270184A (en) 1991-11-19 1993-12-14 Becton, Dickinson And Company Nucleic acid target generation
AT402203B (de) 1995-06-13 1997-03-25 Himmler Gottfried Dipl Ing Dr Verfahren zur transkriptionsfreien amplifizierung von nucleinsäuren
US5888731A (en) 1995-08-30 1999-03-30 Visible Genetics Inc. Method for identification of mutations using ligation of multiple oligonucleotide probes
GB9812768D0 (en) 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
US6743605B1 (en) 1998-06-24 2004-06-01 Enzo Life Sciences, Inc. Linear amplification of specific nucleic acid sequences
ES2369818T3 (es) * 1998-11-09 2011-12-07 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Procedimiento de síntesis de ácido nucleico.
US6277607B1 (en) * 1999-05-24 2001-08-21 Sanjay Tyagi High specificity primers, amplification methods and kits
US20020025519A1 (en) * 1999-06-17 2002-02-28 David J. Wright Methods and oligonucleotides for detecting nucleic acid sequence variations

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0549107A1 (en) * 1991-10-11 1993-06-30 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification and phosphorothioate-containing oligonucleotides as primers in nucleic acid amplification
WO1996001327A1 (fr) * 1994-07-04 1996-01-18 Labimap S.A. Methode d'amplification de sequences d'acides nucleiques
US5874260A (en) * 1994-10-28 1999-02-23 Bio Merieux Oligonucleotide which can be used as primer in a method of amplification based on a replication accompanied by strand displacement

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
G. TERRANCE WALKER ET AL.: "Strand displacement amplification-an isothermal, in vitro DNA amplification technique", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 20, no. 7, 1992, pages 1691 - 1696, XP002936766 *
NOTOMI T. ET AL.: "Loop-mediated isothermal amplification of DNA", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 28, no. 12, 2000, pages E63, XP002936765 *

Cited By (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7713691B2 (en) 1998-06-24 2010-05-11 Enzo Life Sciences, Inc. Modified nucleic acid polymers and methods for their production
US8445664B2 (en) 1998-06-24 2013-05-21 Enzo Diagnostics, Inc. Kits for amplifying and detecting nucleic acid sequences
US8288092B2 (en) 1998-06-24 2012-10-16 Enzo Life Sciences, Inc. Modified nucleic acid polymers and methods for their production
US8133989B2 (en) 1998-06-24 2012-03-13 Enzo Diagnostics, Inc. Nucleic acid primer/construct compositions
US8017357B2 (en) 2000-04-07 2011-09-13 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Method of amplifying nucleic acid by using double-stranded nucleic acid as template
WO2001077317A1 (en) * 2000-04-07 2001-10-18 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Method of amplifying nucleic acid by using double-stranded nucleic acid as template
JP4726381B2 (ja) * 2000-04-07 2011-07-20 栄研化学株式会社 ２本鎖核酸を鋳型とする核酸の増幅方法
EP2253717A1 (en) * 2000-04-07 2010-11-24 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Method of amplifying nucleic acid by using double-stranded nucleic acid as template
US7374913B2 (en) 2000-09-19 2008-05-20 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Method for synthesizing polynucleotides
WO2002024902A1 (fr) * 2000-09-19 2002-03-28 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Procede permettant de synthetiser un polynucleotide
EP2031058A1 (en) 2000-09-19 2009-03-04 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Method of synthesizing polynucleotide
US7846695B2 (en) 2000-09-19 2010-12-07 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Method for synthesizing polynucleotides
US7851186B2 (en) 2000-09-19 2010-12-14 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Kit for synthesizing polynucleotides
JP2002345499A (ja) * 2001-05-29 2002-12-03 Eiken Chem Co Ltd 核酸配列を検出する方法及びその方法に使用するキット
WO2004013354A1 (en) * 2002-08-06 2004-02-12 Tepnel Medical Limited Amplification of nucleic acids
JP3897805B2 (ja) * 2003-12-25 2007-03-28 独立行政法人理化学研究所 核酸の増幅法およびこれを利用した変異核酸の検出法
EP2415878A1 (en) 2003-12-25 2012-02-08 Riken Method of amplifying nucleic acid and method of detecting mutated nucleic acid using the same
US8206902B2 (en) 2003-12-25 2012-06-26 Riken Method of amplifying nucleic acid and method of detecting mutated nucleic acid using the same
EP1970453A2 (en) 2007-03-09 2008-09-17 Riken Primer, primer set, and nucleic acid amplification method and mutation detection method using the same
WO2009054510A1 (ja) 2007-10-25 2009-04-30 Riken 等温増幅方法およびそれに用いるｄｎａポリメラーゼ
US8530165B2 (en) 2008-02-05 2013-09-10 Olympus Corporation Nucleic acid detection method for determining if one or more analyte nucleotides are present in a nucleic acid
JP5530185B2 (ja) * 2008-02-05 2014-06-25 オリンパス株式会社 核酸検出方法及び核酸検出用キット
WO2010061922A1 (ja) 2008-11-27 2010-06-03 独立行政法人理化学研究所 新規ＭｕｔＳタンパク質およびそれを用いた変異の判定方法

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EP1231281A4 (en) 2003-05-14
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