WO2001007582A1

WO2001007582A1 - Milieux d'incubation de cellules tridimensionnelles et procede d'incubation des cellules faisant appel a ces milieux

Info

Publication number: WO2001007582A1
Application number: PCT/JP1999/006248
Authority: WO
Inventors: Mitsuaki Goto; Toshihiro Akaike; Jun Yang
Original assignee: Bio Quest Research, Ltd.
Priority date: 1999-07-28
Filing date: 1999-11-10
Publication date: 2001-02-01
Also published as: EP1123975A1; CN1320162A; IL142064A0; EP1123975A4; KR20010075288A; US6642050B1; JP2001037472A

Description

明系田 » 三次元細胞培養基材及びそれを用いた細胞培養方法技術分野

本発明は、細胞の増殖性、形態および機能を、生体内の細胞と同様に発現させることができる、三次元形状に付形した三次元細胞培養基材、およびこの細胞培養基材を用いた細胞培養方法に関するものである。背景技術

近年の糖鎖工学の進歩には目ざましいものがある。例えば、植物細胞の細胞壁のプロテオダリカン、糖脂質、糖タンパク質などが糖鎖を有する生体高分子として挙げられるが、それぞれ ①細胞の安定化、 ②細胞の分化、増殖、接着、移動、 ③細胞間相互作用や細胞認識に関与していると考えられており、様々な報告がなされている。さらに、これらの高分子の糖鎖が、互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかなつている。

さらに、このような糖鎖は細胞を分化増殖させ、細胞の接着に関与し、免疫、及び細胞の癌化との関係が明確にされており、この糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学とを密接に関連させて新たな展開を計ることで様々な産業の展開が期待できる。その一例として、細胞表面の糖鎖や、糖鎖レセプター間の相互作用異常による疾病の発生、あるいはエイズなどのウィルス感染における糖鎖の役割等に関する研究が活発化してきている (川野武弘、 Bio Industry, 14， 22-30 ( 1997 ) ) 。また、細胞—細胞間の接着を媒介する分子としてのセレクチン、コンタクチン、コンタクトインヒビンなどの糖鎖認識タンパク質に関する研究も、生体反応を理解する上で重要になってきている（武内恒成、高橋直樹、細胞工学、 16,801-812(1997)) 。

本発明者らは、従来から糖鎖の細胞特異的な相互作用に着目し鋭意研究を行ってきており、例えば、ァシァ口糖タンパク質レセプタ一に対するリガンドのモデルとして、ガラクト一スを側鎖に有するポリスチレンであるポリ一（ N— p — ビニルベンジル一 [ 0 — /3 — D —ガラクトビラノシル一（ 1 — 4 ) - D - ダルコンアミド ] ) ( P V L A と略記）を設計、合成した。例えば、この P V L Aを細胞培養基材としてコートしたシャーレ上での肝細胞培養実験において、 P V L Aと肝実質細胞表面のァシァロ糖タンパク質レセプターとの特異的親和力を介して肝実質細胞が選択的に培養され、 P V L Aコートシャーレという二次元基材環境下でも、肝実質細胞自体がその形態を三次元化し、細胞集合体として特異的に存在することを見出した（A. Kobayashi, M. Goto, K. Kobayashi, T. Akaike, J. Biomater. Sci. Polvmer Edn, 6， 325-342 (1994)) 。しかしながら、この P V L Aは、合成高分子であるポリスチレンを主鎖として有する構造であるため、生体分解性がないこと、抗原性が発現する可能性があること、毒性を有する可能性があること、といった欠点をもっている。一方、天然物であるコラーゲン、フイブロネクチン、ラミニン等の接着夕ンパク質をコ一トしたシャーレを用いて細胞の培養を行うこともなされている。しかし、二次元的な培養であることにより、細胞の増殖、細胞機能の発現などが十分に発揮されない。

また最近では、天然または合成高分子のコラーゲン、アルギン酸、ヒアルロン酸、ポリイソプロピルアクリルアミド等を、紫外線、放射線、化学架橋剤を用いて架橋させて三次元形状の培養基材とし、これを用いて細胞を培養する試みもなされている。しかし、細胞の生着が良好でなく、細胞の増殖が抑制されることが多いこと、細胞機能が低下すること、細胞形態が生体内とは異なり伸展してしまうことなどの問題点があり、細胞を良好に培養する系は得られていない。発明の開示

そこで本発明は、細胞の生着、増殖を促進させ、細胞機能を維持、向上させ、細胞形態を生体内に近い形態に保持できるような三次元形状に付形した三次元細胞培養基材を提供すること、さらにはこの三次元細胞培養基材を用いた細胞培養方法を提供することを目的としてなされたものである。

すなわち本発明は、少なくとも 1 種類の糖鎖をスぺーサ一分子を介して側鎖として結合させた糖鎖高分子からなる細胞培養基材を、三次元形状に付形したことを特徴とする三次元細胞培養基材である。

さらに本発明は、この三次元細胞培養基材を用いて細胞を培養することにより、細胞の増殖性、形態および機能を維持、向上させることを特徴とする細胞培養方法である。図面の簡単な説明

図 1 は、 L A _ A Gゲルビーズとアルギン酸のみのゲルビーズについて、アルブミン産生量と培養日数の関係を示すグラフである。

図 2 は、コラーゲンコートシャーレ上で培養した肝実質細胞の形態を示す顕微鏡写真である。

図 3 は、 L A— A Gゲルビーズで培養した肝実質細胞の形態を示す顕微鏡写真である。発明を実施するための最良の形態

本発明の三次元細胞培養基材は、糖鎖高分子を主鎖とし、この主鎖にスぺ一サー分子を介して糖鎖を側鎖として結合させてなるものである。スぺーサ一分子としてジアミンを用いた場合の一般的な構造式を下記式（ 1 ) に示す。

RNHR'NH

COOH CO

R"一 •R，二

( 1 ) 上記の式（ 1 ) 中、 [ ] 内は糖鎖高分子を表し、アルギン酸、ヒアルロン酸、ぺクチン酸、またはこれらの誘導体等の力ルポキシル基を有する糖鎖高分子が好ましく使用できる。なお、ぺクチン酸としては、ぺクチン酸を主成分とするぺクチンも使用できる。本発明においては、これら以外の糖鎖高分子であつても、側鎖として糖鎖を導入できるものであれば種々の糖鎖高分子を用いることができるが、上記で例示した糖鎖高分子は食品や化粧品等の材料として広く使用されており、細胞に対する親和性が良好なものであるため特に好ましい。糖鎖高分子の分子量は一般的には 3万〜 2 0万程度のものが好ましく使用できる。分子量が低く過ぎる場合にはゾル状態となるため、三次元形状に付形しにくくなる傾向がある。

上記式（ 1 ) 中の Rは、糖鎖高分子に側鎖として結合した糖鎖を表す。本発明における糖鎖は、糖鎖高分子に側鎖として結合した状態で細胞と相互作用する糖残基を保持できるものであれば、いかなるものでも使用でき、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、 N—ァセチルグルコサミン、 N —ァセチルガラクトサミン、ラクトース、マルトース、ラミナリビオース、キ卜ビオース、マルトビオース、ゥロン酸関連物質、硫酸糖等の単糖類、オリゴ糖類等が挙げられる。

糖鎖高分子と糖鎖との結合はスぺ一サ一分子を介してなされるが、スぺ一サ一としては、上記式（ 1 ) 中で示したように、分子内にァミノ基を 2個有するジァミンが好ましく使用できる。すなわち、ジァミン中の 1 つのアミノ基とラクトン化した糖鎖の末端カルボキシル基との間でアミド結合を形成させ、ジアミン中のもう 1 つのアミノ基と糖鎖高分子のカルボキシル基との間で別のアミド結合を形成させることによって、糖鎖を糖鎖高分子に効果的にかつ容易に導入することができる。式（ 1 ) におけるスぺーサ一分子中の R ' は、アルキル基あるはベンゼン環等を表し、ジァミンとしては、エチレンジァミン、へキサェチレンジァミン、ジアミノキシレン等が挙げられる。ジァミン以外にも、 2個の官能基を分子内に有する化合物、例えばアミノエタノール等もスぺーサ一分子として使用できる。アミノエタノールの場合には、分子内のァミノ基と水酸基がそれぞれァミド結合とエステル結合により糖鎖高分子と糖鎖とを結合させることができる。また、スぺーサ一分子を予め導入した糖鎮高分子を糖鎖と結合させてもよく、スぺ一サー分子を予め導入した糖鎖を糖鎖高分子と結合させてもよい。但し、糖鎖を直接糖鎖高分子のカルボキシル基に導入できる場合は、スぺーサ一分子は必ずしも必要ではない。

糖鎖高分子に対する糖鎖の導入量は特に限定されるものではないが、糖鎖高分子中のカルボキシル基の数の 1 0 〜 5 0 %程度に糖鎖を導入することが好ましい。また、糖鎖高分子に導入する糖鎖は、 1 種類でもよく、あるいは 2種類以上の糖鎖を導入させてもよい。細胞の種類によって特異な糖鎖認識性を有しているため、細胞による認識性の異なる糖鎖を 2種類以上導入させた糖鎖高分子を培養基材として用いる場合には、組み合わせる糖鎖の種類や、それらの導入割合をコントロールすることによって、細胞の増殖性、形態および機能を任意にコントロールすることが可能となる。

2種類以上の糖鎖を糖鎖高分子に結合させる場合には、種類の異なる糖鎖を同時に糖鎖高分子に結合させることもでき、あるいは、 1 種類の糖鎖を糖鎖高分子に結合させた後、別種の糖鎖を引き続き糖鎖高分子に結合させることもできる。

糖鎖を側鎖として導入した糖鎖高分子の具体例を構造式を示して以下に説明する。なお、糖鎖高分子に対する糖鎖の結合は、高分子と低分子との反応であるためランダムに起こり、必ずしも図示の結合位置に限られるものではない。

アルギン酸

上記式（ 2 ) で表される 1 — N— [ 0 — ;3 — D —ガラクトビラノシルー（ 1 — 4 ) 一 D — グルコンアミド ] メチノレー 2 — N ' 一メチルアミドーアルギン酸（以下 L A — A G と略記する）は、ラクトビオン酸をエチレンジァミンの 1 つのアミノ基と結合させ、もう一方のアミノ基とアルギン酸のカルボキシル基を結合させた化合物である。 OH HNCOCH3

ヒアルロン酸

上記式（ 3 ) で表される 1 — N— [ 0— S — D —ガラクトビラノシノレ一（ 1 → 4 ) — D—グルコンアミド ] メチノレ一 2 — N ' 一メチルアミドーヒアルロン酸（以下 L A— H Aと略記する）は、ラクトビオン酸をエチレンジァミンの 1 つのアミノ基と結合させ、もう一方のァミノ基とヒアルロン酸のカルボキシル基を結合させた化合物である。

上記式（ 4 ) で表される 1 一 N— [ 0 _ — D —ガラクトビラノシルー（ 1 → 4 ) — D —ダルコンアミド ] メチル一 2 — N ' — メチルアミドーぺクチン（以下 L A— P Aと略記する）は、ラクトビオン酸をエチレンジアミンの 1 つのアミノ基と結合させ、もう一方のァミノ基とぺクチン酸のカルボキシル基を結合させた化合物である。

…… (5)

上記式（ 5 ) で表される化合物は、任意の糖鎖 Rを任意のスぺ一サ一化合物の 1 つのアミノ基と結合させ、もう一方のアミノ基とアルギン酸のカルボキシル基を結合させた化合物である _c

(6)

上記式（ 6 ) で表される化合物は、任意の糖鎖 Rを任意のスぺーサ一化合物の 1 つのアミノ基と結合させ、もう一方のアミノ基とヒアルロン酸のカルボキシル基を結合させた化合物である。

(7)

上記式（ 7 ) で表される化合物は、任意の糖鎖 Rを任意のスぺ一サ一化合物の 1 つのアミノ基と結合させ、もう一方のアミノ基とぺクチン酸のカルボキシル基を結合させた化合物である c 本発明においては、上述したような糖鎖を側鎖として結合させた糖鎖高分子からなる細胞培養基材を、三次元形状に付形することによって、三次元細胞培養基材とする。三次元形状の付形方法は、一般の糖鎖高分子（糖鎖を側鎖として結合させていない糖鎖高分子）の付形方法として種々の文献に記載されている既知方法を採用することができる。

例えば、アルギン酸を糖鎖高分子とする培養基材の場合、この培養基材溶液にカルシウムを添加することにより、培養基材とカルシウムのコンプレックスによるゲル状のビーズを作成することができる。また、ヒアルロン酸を糖鎖高分子とする培養基材の場合、培養基材の濃厚溶液を紫外線、放射線、化学架橋剤等で処理してヒアルロン酸を架橋させたのち凍結乾燥するか、あるいは凍結乾燥したのち架橋させることにより、培養基材のスポンジを作成することができる。また、アルギン酸を糖鎖高分子とする培養基材の溶液とカルシウム溶液とを混合してホモジナイズしたのち凍結乾燥することによりスポンジとすることができる。

あるいはまた、ポリスチレンなどの担体に、培養基材を吸着等の物理化学的方法あるいは共有結合等の化学的方法等により担持させることにより、三次元形状に付形することもできる。

細胞培養基材を三次元形状に付形するに際しては、糖鎖を側鎖として結合させた糖鎖高分子と、一般の糖鎖高分子（糖鎖を側鎖として結合させていない糖鎖高分子）との混合物からなる細胞培養基材を付形することもできる。

上述した本発明による三次元細胞培養基材を用いて細胞培養を行うには、従来から慣用されている細胞培養方法をそのまま採用すればよい。例えばゲル状のビーズからなる三次元細胞培養基材を用いる場合には、細胞培養基材の溶液中に細胞懸濁液を混合しておき、これにカルシウムを添加してビーズに付形することにより、細胞を内包したゲルビーズを作成することができ、このビーズを液体培地中で培養すればよい。

また、予め作成したスポンジ状の三次元細胞培養基材上に、細胞懸濁液を播種して、スポンジ内に細胞を導入、内包せしめ、これを常法により培養すればよい。

このようにして細胞を培養することにより、細胞のもつ特異な糖鎖認識性に起因して、細胞の生着、増殖を促進させ、細胞機能を維持、向上させ、細胞形態を生体内に近い形態に保持させることが可能となる。

なお、上述の細胞培養に際しては、本発明による三次元細胞培養基材の 1 種類のみを使用してもよいが、 2種類以上を混合して使用することもできる。さらには、本発明による三次元細胞培養基材だけでなく、必要に応じて例えば糖鎖高分子、コラ一ゲンなどの接着タンパク質、各種の天然高分子等と本発明の三次元細胞培養基材とを組み合わせて細胞培養に供することもできる。実施例 1 ： L A - A G (式（ 1 ) ) の合成

( a ) 1 — N— [ 0 — ^ 一 D—ガラクトビラノシルー（ 1 →

4 ) — D —グルコンアミド ] メチル— 2 — N ' —メチルァミン（以下 L A— E D と略記する）の合成下記の反応式に従って、 L A — E Dを合成した。反 ί& 式

ΝΗつ CH₂CHつ ΝΗ₂

先ず、 M. Goto, et al.， J. Controlled Release, 28, 223-233 ( 1994 )に記載の方法により、ラクトースのラクトン化を行った。概略は以下の通りである。ラクト一スを蒸留水に分散させてメタノールで希釈する。その希釈した分散液を加温したヨウ素のメタノール溶液に加え、撹拌した後、水酸化カリウム/メタノール溶液をョゥ素の色が消失するまで徐々に添加する。引き続き、反応液を氷冷し、析出した沈殿を濾取する。沈殿を洗浄し、再結晶することにより酸カリウム塩を得る。得られたカリウム塩を、ィォン交換樹脂に通すことにより酸型とし、その酸型の分画にメタノールを加えて減圧濃縮して結晶を得る。その結晶を少量のメタノ一ルに溶かして、さらにエーテルを加えて沈殿させるという操作を数回繰り返したのち、沈殿を凍結乾燥してラクトースラクトンを得た。

上記で得られたラクトースラクトン 5 gを D M S 0 5 0 m L

( ミリリットル）に溶解し、これにエチレンジアミン 2 0 gを加えて、環流下 4時間反応させた。放冷し、沈殿を濾別した後、反応液をクロ口ホルムの 3 0 O m Lに添加して、沈殿した白色結晶を濾取した。これをエーテル、少量の冷メタノールで洗浄し、 5 gの L A— E Dを得た。

( b ) L A— A Gの合成

アルギン酸を T E M E D緩衝液（ p H 4 . 7 ) 5 O m L に溶解し、縮合剤として水溶性カルポジイミド（ W S C ) の 0 . 9 7 gを加えて、 1 時間、室温で撹拌反応させた。この溶液に、上記で得られた L A— E Dの 2 gを加えて、 3 日間、室温で撹拌反応させた。この溶液を純水 2 0 L ( リットル）に対して透析を行い、透析終了後、凍結乾燥して目的物を得た。この目的物の ¹ H— N M Rスペクトルから、 2 . 6 9 p p mエチレンジァミン C H ₂ C H ₂、 3 . 2 5 p p mアミド N H、 3 . 5 — 4 .

5 p p mラクト一ス、及びアルギン酸糖鎖が観測され、この目的物が L A— A Gであることを確認した。糖鎖の導入量は、約

1 5 %と計算された。実施例 2 ： L A— A G ビーズを用いた肝実質細胞の培養

( a ) 肝実質細胞の採取

肝実質細胞は、文献（ A. Kobayashi, M. Goto, K. Kobayashi, T. Akaike, J. Biomater. Sci. Polymer Edn， 6, 325-342 ( 1994) ) 記載の方法に従つてマウス肝臓より採取、単離した。単離した肝実質細胞は、 5 %ゥシ胎児血清を含むウイリアムの培地 Eで希釈して用いた。

( b ) 細胞含有 L A— A G ビーズの作成

アルギン酸（ 1 %、 w/ v ) と L A— A G ( 1 %、 w / V ) の混合生理食塩水溶液に、ゥシ血清（ F C S ： 5 % , V X V ) 、上皮細胞増殖因子（ E G F ： 2 0 n g / m L ) 、インスリン ( I n s . ： 1 0 -⁸M) をそれぞれ括弧内に示した量となるように添加し、細胞濃度が 8 0万 c e 1 1 s Z m L となるように肝実質細胞を混合した。この細胞溶液を注射器に入れ 2 6 ( G X 1/2" )の針を用いて 1 0 0 m Mの塩化カルシウム水溶液中に滴下して、ゲルビーズを形成させた。これにより平均直径約 3 m mのゲルビーズが作成される。このビーズは、 5分間以上ィンキュベ一トしてゲル化させている。

次に、 C H E S緩衝液（ p H 5. 0 ) で数回洗浄した後、生理食塩水でさらに数回洗浄した。次に、，ゲルビーズ表面を 0. 0 5 %のポリ一 L — リシン生理食塩水溶液で 5分間処理した後、生理食塩水で数回洗浄した。次いで、ゲルビーズ表面を 0 . 1 5 %のアルギン酸水溶液で 5分間コートした後、生理食塩水で数回洗浄した。さらに、このビーズを 5 O mMのクェン酸ナトリウム水溶液で 5分間処理した後、生理食塩水で 3 回洗浄し、細胞含有 L A— A G ビーズを作成した。

L A— A Gに導入する糖鎖の含有量によっては、 L A— A G とアルギン酸とを混合せずに、 L A— A G単独でビーズに付形することも可能である。

なお、比較のために、上記したアルギン酸と L A— A Gの混合生理食塩水溶液に代えて、アルギン酸のみの生理食塩水溶液 ( 2 %、 w / v ) を用いて、上記と全く同様に処理し、細胞含有アルギン酸ビーズを作成した。

( c ) 細胞含有 L A— A Gビーズの培養

上記で得られた細胞含有 L A— A G ビーズを、 F C S ( 5 %、 v / v ) 、 E G F ( 2 0 n g /m L ) 、 I n s . ( 1 0 - ⁸ M ) を添加した L 1 5培地で培養し、ビーズに内包された肝実質細胞の機能を評価した。比較のために、細胞含有アルギン酸ビーズについても同様に培養し、ビーズに内包された肝実質細胞の機能を評価した。

( e ) 肝実質細胞機能の評価

ゲルビーズ中の肝実質細胞の機能は、肝実質細胞から産生されるアルブミンの量から評価した。アルブミンの測定は、アルブミン測定キッ卜（米国、バイオラド社製）を用いて定法に従てた o

アルブミンの産生量を測定した結果を図 1 に示す。 L A— A Gゲルビーズで培養した肝実質細胞は、培養 8 日目で 0. 0 1 5 8 β g Z m Lのアルブミン産生量であったのに対し、アルギン酸のみのゲルビーズで培養したものは、 0. 0 0 7 6 5 〃 g Zm L となった。このことから、 L A— A Gゲルビーズで培養したものの方が、肝実質細胞の機能が維持、向上されていることがわかる。

また、 L A— A Gゲルビーズ内で肝実質細胞を培養した場合には、培養 3 日目から細胞数個からなる細胞集合体が観察され、細胞の移動増殖が促進されていることがわかる。

さらに肝実質細胞の顕微鏡観察から、肝実質細胞を二次元形状のコラーゲンコートシャーレ上で培養した際にみられる伸展した形態（図 2の顕微鏡写真参照）とは異なり、三次元形状の L A— A Gゲルビーズで培養した場合には球状の形態（図 3の顕微鏡写真参照）を取っていることが明らかとなった。このことから、 L A— A Gゲルビーズ内で肝実質細胞を培養した場合には、生体内での肝実質細胞の形態が維持されていることがわ力、る。実施例 3 ： L A— A Gスポンジを用いた肝実質細胞の培養

( a ) L A— A Gスポンジの作成

文献 ( L. Shapiro, S. Cohen, Biomaterials, 18, 583-590 ( 1997 ) ) 記載の方法に従って行った。即ち、 L A— A G ( 1 %、 V V ) とァノレギン酸（ 1 %、 w / V ) 混合水溶液を 2 4穴マルチプレートに l m l 添加し、同量の 0. 0 1 % ( w / V ) 塩化カルシウム水溶液をゆっくり添加した。これをホモジナイザー（ 6 G、 3 1 8 0 0 r p m ) にて 3分間ミキシングした後、一 1 8 °Cのフリ —ザ一で凍結させ、次いで凍結乾燥することにより、 L A— A Gスポンジを作成した。

比較のために、 L A— A Gとアルギン酸の混合水溶液に代えて、アルギン酸のみの水溶液（ 2 %、 w / V ) を用いて上記と全く同様に処理して、アルギン酸スポンジを作成した。

( b ) スポンジ上での肝実質細胞培養

実施例 2 に記載の方法によりマウス肝実質細胞を採取、単離し、この細胞を、 F C S ( 5 %、 v / v ) 、 E G F ( 2 0 n g Zm L ) 、 I n s . ( 1 0—⁸M) をそれぞれ括弧内の量となるように含んだウイリアム培地 Eに添加し、細胞濃度が 8 0万 c e 1 1 s / m L となるようにスポンジ上に播種した。これを所定時間インキュベートして、スポンジ上で培養された肝実質細胞の機能をアルブミン産生量の測定により評価した。

L A _ A Gスポンジで培養した肝実質細胞は、培養 8 日目で 0 . 0 1 4 4 u g Z m Lのアルブミン産生量であったのに対し、アルギン酸のみのスポンジでは 0 . 0 0 5 4 4 u g Z m L となつた。実施例 4 ： L A — H Aスポンジを用いた肝実質細胞の培養

( a ) L A — H Aの合成

実施例 1 の L A — A G合成方法に準じて行った。即ち、ヒアルロン酸を T E M E D緩衝液（ p H 4 . 7 ) 5 0 m L に溶解し、縮合剤として W S Cの 0 . 9 7 gを加えて、 1 時間、室温で撹拌反応させた。この溶液に、実施例 1 で得られた L A — E Dの

2 gを加えて、 3 日間、室温で撹拌反応させた。この溶液を純水 2 0 Lに対して透析を行い、透析終了後、凍結乾燥して目的物を得た。この目的物の ¹ H — N M Rスぺクトルから、 2 . 0 p p m ヒアルロン酸の C H ₃、 3 . 3 0 p p mアミド N H、 3 .

3 — 4 . 6 p p mラクトース、及びアルギン酸糖鎖が観測され、この目的物が L A — H Aであることを確認した。糖鎖の導入量は、約 1 3 %と計算された。

( b ) L A — H Aスポンジの作成

文献（ J. R. Glass, at el., Biomaterial, 17, 1101-1108 ( 1997) ) 記載の方法に従って行った。即ち、 L A — H A ( 1 %、 w / V ) 及びヒアルロン酸（ 1 %、 w/ v ) を混合し、 0. 5 %水酸化ナトリウム水溶液に分散させた。この分散液に 1， 4 — ブタンジェタノ一ルジグリシジルェ一テル（架橋剤） 0. 5 Lを加え、 1 6 時間反応させた。反応液を透析した後、一 2 0 °Cのフリーザ一で凍結させ、次いで凍結乾燥することにより、 L A— H Aスポンジを作成した。

比較のために、 L A— H Aとヒアルロン酸に代えて、ヒアノレロン酸のみを用いて上記と全く同様に処理して、ヒアルロン酸スポンジを作成した。

( c ) スポンジ上での肝実質細胞培養

実施例 2に記載の方法によりマウス肝実質細胞を採取、単離し、この細胞を、 F C S ( 5 %、 v / v ) 、 E G F ( 2 0 n g ノ m L ) 、 I n s . ( 1 0— ⁸M) をそれぞれ括弧内の量となるように含んだウイリアム培地 Eに添加し、細胞濃度が 8 0万 c e 1 1 s Zm Lとなるようにスポンジ上に播種した。これを所定時間インキュベートして、スポンジ上で培養された肝実質細胞の機能をアルブミン産生量の測定により評価した。

L A— H Aスポンジで培養した肝実質細胞は、培養 8 日目で

0. 0 1 6 6 g Zm Lのアルブミン産生量であったのに対し、ヒアルロン酸のみのスポンジでは、 0. 0 0 4 8 3 〃 g Zm L となった。産業上の利用性

本発明の三次元細胞培養基材は、細胞により特異な認識性を有する糖鎖を側鎖として結合した糖鎖高分子からなるものであるため、かような細胞培養基材を用いて細胞を培養することにより、細胞と糖鎖との特異的相互作用に起因して、細胞の生着、増殖を促進させ、細胞機能を維持、向上させ、細胞形態を生体内に近い形態に保持することができる。従って、生体内と同様な増殖性および機能を維持した任意の形態の細胞を得ることが可能となり、例えばハイブリツド型人工肝臓等に応用することも可能となる。

さらに本発明の細胞培養基材は、糖鎖を結合していないアルギン酸やヒアルロン酸等の糖鎖高分子と同様に、容易に三次元形状を付与することができる。特に、アルギン酸、ヒアルロン酸、ぺクチン及びそれらの誘導体からなる糖鎖高分子を用いれば、糖鎖を容易に側鎖として導入することができ、製造コストも比較的安価であるためディスポ一ザブルな製品とすることもできる。

Claims

言青求の範囲

1 . 少なくとも 1 種類の糖鎖をスぺーサ一分子を介して側鎖として結合させた糖鎖高分子からなる細胞培養基材を、三次元形状に付形したことを特徴とする三次元細胞培養基材。

2 . 少なくとも 1 種類の糖鎖をスぺーサ一分子を介して側鎖として結合させた糖鎖高分子と、糖鎖を側鎖として結合させていない糖鎖高分子との混合物からなる細胞培養基材を三次元形状に付形したことを特徴とする三次元細胞培養基材。

3 . 前記糖鎖高分子がカルボキシル基を有する糖鎖高分子及びその誘導体であることを特徴とする請求の範囲第 1 または 2 項記載の三次元細胞培養基材。

4 . 前記糖鎖高分子がアルギン酸及びその誘導体であることを特徴とする請求の範囲第 3項記載の三次元細胞培養基材。

5 . 前記糖鎖高分子がヒアルロン酸及びその誘導体であることを特徴とする請求の範囲第 3項記載の三次元細胞培養用基材。

6 . 前記糖鎖高分子がぺクチン酸及びその誘導体であることを特徴とする請求の範囲第 3項記載の三次元細胞培養基材。

7 . 前記糖鎖高分子が、 2種類以上の糖鎖を側鎖として結合させた糖鎖高分子であることを特徴とする請求の範囲第 1 〜 6 項のいずれか 1項記載の三次元細胞培養基材。

8 . 前記スぺーサ一分子がジァミンである請求の範囲第 1 〜 7項のいずれか 1項記載の三次元細胞培養基材。

9 . 請求の範囲第 1 〜 8項のいずれか 1項に記載した三次元細胞培養基材を用いて細胞を培養することにより、細胞の増殖性、形態および機能を維持、向上させることを特徴とする細胞培養方法。

1 0 . 請求の範囲第 1 〜 8項のいずれか 1 項に記載の三次元細胞培養基材の 2種類以上を混合した細胞培養基材を用いて細胞を培養することにより、細胞の増殖性、形態および機能を維持、向上させることを特徴とする細胞培養方法。