WO2000066715A1 - Verfahren zur reduzierung von spezifischen immunreaktionen - Google Patents

Verfahren zur reduzierung von spezifischen immunreaktionen Download PDF

Info

Publication number
WO2000066715A1
WO2000066715A1 PCT/EP2000/003984 EP0003984W WO0066715A1 WO 2000066715 A1 WO2000066715 A1 WO 2000066715A1 EP 0003984 W EP0003984 W EP 0003984W WO 0066715 A1 WO0066715 A1 WO 0066715A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antigen
presenting cell
monoantigenic
receptor
protein
Prior art date
Application number
PCT/EP2000/003984
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ahmed Sheriff
Frank Gebauer
Original Assignee
Genethor Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP99118518A external-priority patent/EP1085085A1/de
Priority claimed from DE19944858A external-priority patent/DE19944858A1/de
Application filed by Genethor Gmbh filed Critical Genethor Gmbh
Priority to AU52112/00A priority Critical patent/AU5211200A/en
Priority to JP2000615740A priority patent/JP2002542819A/ja
Priority to DE50013230T priority patent/DE50013230D1/de
Priority to CA002373016A priority patent/CA2373016A1/en
Priority to EP00936709A priority patent/EP1173550B1/de
Publication of WO2000066715A1 publication Critical patent/WO2000066715A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4614—Monocytes; Macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4648—Bacterial antigens
    • A61K39/46482—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/122—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells for inducing tolerance or supression of immune responses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • an allergen that gets into the blood in some way can trigger anaphylaxis: an allergic reaction far from its distant body regions. Severe anaphylactic shocks can upset all normal bodily functions and can be fatal.
  • the allergic reactions are expressed differently, they are always set in motion by the same mechanism: sensitization.
  • One-time contact with an allergen typically a protein, can suffice for this.
  • the allergenic substance meets so-called phagocytes or macrophages. These gobble up the foreign substance, dismember it and present the fragments on the cell surface with MHC II molecules.
  • some T-helper lymphocytes recognize the fragments presented and bind to them.
  • the T helper lymphocytes are activated by the macrophages and then in turn activate some B lymphocytes, which also recognize the allergen.
  • the B cells then mature into plasma cells that produce antibodies. First of all, these are antibodies of the so-called IgM type; from a certain point in time, however, the plasma cells switch to IgE antibodies.
  • IgE molecules With their Fc region, they attach themselves to IgE receptors of two different classes of immune system cells.
  • mast cells which are usually found in the body tissues near blood vessels and epithelial cells. There is contact with the outside world via the epithelium (this also includes the epithelium of the respiratory tract and gastrointestinal tract).
  • IgE antibodies also bind to basophilic granulocytes (basophils). However, these cells circulate in the bloodstream.
  • IgEs Once production of the IgEs begins, it apparently lasts for months, sometimes even years. As a result, they constantly occupy IgE receptors on mast cells and basophils - ready to take immediate action the next time they come into contact with allergens. Acute symptoms
  • the second group of mediators consists mainly of prostaglandins and leukotrienes. They are only generated after the allergen molecules have attached to the IgEs on the cells. Like histamine, they narrow the bronchi and dilate the blood vessels. However, their effects last longer. In addition, stimulated mast cells emit a variety of potentially toxic enzymes. They also appear to release cytokines that regulate the activities of other immune cells.
  • Antihistamines are usually effective and still serve as standard therapy. The latest variants can no longer easily cross the blood-brain barrier and no longer make the patient tired. If antihistamines are ineffective in severe inflammation, inhalable corticosteroids, which are usually prescribed to relieve chronic inflammation in asthma, often help.
  • Bronchodilators are the most widely used drugs for asthma. They relieve the symptoms caused by histamine and other bronchoconstrictors very quickly, but are unlikely to affect the underlying inflammation. In addition, their excessive use can cause a back reaction of the body, so that after their effects have subsided, the respiratory flow is more restricted than before. In addition, the methods listed under 1. are used.
  • the animal model is currently testing DNA-based immunization with an allergen (Der p 5) of the mite Dermatophagoides pteronyssinus.
  • This immunization results in the production of IgG, but not IgE, and results in a 90% reduction in the amounts of specific IgE, which were caused by classic sensitization with Der p 5 and alum as adjuvant or allergen-induced rhinitis.
  • Another new strategy is the use of humanized monoclonal anti-IgE antibodies against the Fc ⁇ RI binding region for IgE. This prevents the binding of IgE to the IgE receptor, so that no mediators of the allergic reaction from mast cells or basophils can be released. This strategy has shown in clinical studies in patients with allergic rhinitis and allergic asthma that these antibodies are well tolerated and reduce the allergic reactions.
  • Tissue transplantation to replace diseased organs is an important medical therapy today.
  • an adaptive immune system response to the graft poses the greatest threat to successful treatment.
  • Adaptive immune system reactions are induced by antigen-presenting cells by activation of T helper lymphocytes.
  • the ABO and Rh blood group antigens When transfusing blood, which is the first and most commonly used graft, the ABO and Rh blood group antigens must be matched to avoid the rapid destruction of inappropriate erythrocytes.
  • the very polymorphic main histocompatibility complexes (MHC) have to be compared with one another, since these almost always trigger the immune response. Unfortunately, perfect matching of the MHCs is almost impossible except for relatives.
  • Autoimmune diseases are chronic diseases. They include rheumatism in various clinical forms, diabetes, multiple sclerosis, certain forms of heart muscle inflammation and thyroid diseases. The range of autoimmune diseases could be Continue as you like, although approx. 90% only make up a small percentage epidemiologically.
  • autoimmune diseases are antibody-mediated.
  • immunology this means that the organism produces antibodies for mostly unknown reasons, which are directed against the body's own cellular structures (autoantigens). Once these antibodies have been formed, their interaction and binding to the respective organ or cell-specific structures trigger a cell and tissue-destroying reaction of the immune system. Ultimately, this leads to the clinical picture of the disease (Steinman 1994).
  • WO-A-96/18736 discloses a method and a reagent for the treatment of arthritic conditions, induction of tolerance in transplants and reversal of immune reactions.
  • the possibility of suppressing the expression of B7-1, B7-2 and B7-3 by ribozymes or antisense RNA is theoretically discussed.
  • the suppression of B7 levels by a B7 ribozyme and B7 antisense RNA are not verified by experiments, but a pure suppression of B7 would at best result in a general reduction in the overall responses of the adaptive immune system.
  • WO-A-95/32734 describes the prevention of co-stimulatory activities of antigen-presenting cells in that Fc ⁇ RII receptors are cross-linked by aggregated IgG molecules. Suppression of T cell-mediated diseases is to be achieved by cross-linking the Fc ⁇ RII receptors and administering specific antigens.
  • WO-A-98/29124 relates to injected antisense oligonucleotides with which the amounts of B7 are to be reduced. This means that the expression of B7 can be inhibited at most in a non-specific manner in all cells.
  • WO-A-99/50394 discloses dividable cells derived from monocytes. Monocytes that predominantly present predefined antigens are not described. No gene transfer is provided that ensures a reduced number of CD80, CD86, CD40 on the cell surface. Rather, their reduced presence through treatment with z. B. achieved physical methods such as UV light, which also causes the other characteristics described.
  • the problem on which the invention is based consists, inter alia, in making available genetic engineering, therapeutically usable products for the reduction of specific immune reactions in which targets (antigens, autoantigens) and antibodies, autoantibodies are known.
  • the antigen-presenting cell according to the invention which predominantly presents certain antigens beforehand (monoantigenic antigen-presenting cell) and is characterized in that the monoantigenic antigen-presenting cell is capable of division and one of the functions of co-stimulatory receptors of the cell, how a B7 and / or CD40 receptor is suppressed.
  • An advantage of the antigen-presenting cell according to the invention is that the cells are expanded and z. B. can differentiate macrophages and dendritic cells. By maintaining the ability to divide, these cells are basically only suitable for gene transfer by the common non-replication-capable retroviruses, since these are only incorporated into the genome when they are divided.
  • Figure 1 shows a diagram of the function of genetic engineering at the cellular level. a) Normal mechanism of T helper cell activation via monocytes
  • Figure 2 shows a "normal" immune response to antibody formation, antigen-presenting monocytes as inducers of antibody production.
  • Monocytes absorb molecules recognized as foreign and bring them to the cell surface (antigen presentation). Together with a surface molecule (B7), the antigen is presented to the T helper cells. The antigen presented is recognized by T helper lymphocytes, which in turn stimulate B cells to produce antibodies.
  • the scheme is very simplified.
  • FIG. 3 shows schematically the function of gene manipulation at the molecular level: the co-stimulating receptor B7 is inactivated.
  • the cDNA of a protein that causes the production of pathological autoantibodies as an autoantigen is integrated into the monocyte genome. This genetic information then serves to overproduce the autoantigen. Peptides of this autoantigen are then preferably presented on MHC II and / or MHC I (see also FIG. 4 (11)). MHC II presents the peptides to the T helper cells and tries to find those that specifically recognize the proteins presented. If the co-receptor B7 does not appear on the cell surface at the same time, the T helper cells are stopped and are subject to premature cell death.
  • All genetically manipulated monocytes present the autoantigen on most of their MHC II complexes, while in vivo only very few "normal” monocytes present the autoantigen and then only on a few MHC II complexes.
  • the aim of the treatment is to displace the "normal" monocytes which present the autoantigen and activate the T helper cells in vivo by the genetically manipulated monocytes which have been programmed to switch off the antibody products.
  • the monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention can in particular show an increased number of homing receptors, such as CD44. Overexpression of homing receptors will show the monoantigenic antigen-presenting cell the way into the lymph nodes, which means that the genetically manipulated APCs will accumulate in lymph nodes more quickly. The lymph nodes are where most of the responses of the adaptive immune system are triggered. There, the genetically manipulated APCs have a much greater effect than outside the lymph nodes.
  • a transformation brings about an increase in the number of homing receptors and / or a suppression of functions of the B7 and CD40 receptors.
  • the B7 and / or CD40 receptor expression in the monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention can be prevented or reduced.
  • the expression of the B7 and / or CD40 receptors can be suppressed by co-suppression in the monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention with nucleic acids.
  • the monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention can contain or be transformed with nucleic acids which bring about an expression of proteins or peptides which have structures affine with B7 and / or CD40 receptors. Proteins are formed that practically neutralize through complex formation with B7 and / or CD40 receptors.
  • CTLA4, CD28, antibodies, F (ab) 2 , scFv and / or F ab fragments can be considered as proteins.
  • the monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention contains nucleic acids which code for a signal sequence or expression products of a signal sequence which determine the location of the expression products in the endoplasmic reticulum, the Golgi apparatus, the Trans-Golgi network or intracellular vesicles causes.
  • the monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention is transformed for expression of antigens with nucleic acids, which enable the transport of the expressed antigens in MHC II compartments of the cells.
  • All genetically manipulated monocytes present the autoantigen on most of their MHC complexes, while very few "normal” monocytes present the autoantigen at all and then only on a few MHC complexes.
  • the aim of the treatment is to displace the "normal" monocytes that present the autoantigen and activate the T helper cells by means of the genetically manipulated monocytes programmed to switch off the antibody products. It is very important to also administer the antigen (s) in a form that allows them to be transported into the MHC II endosomes.
  • the corresponding nucleic acids can be DNA, RNA, oligonucleotides, polynucleotides, ribozymes, peptide nucleic acids (PNA).
  • PNA peptide nucleic acids
  • the DNA preferably has regulatory elements such as enhancers, promoters, polyA-coding 3 ⁇ ends for transcribing the DNA into RNA, and the RNA regulatory elements for translating the RNA into protein.
  • the regulatory elements ensure efficient expression of the genes.
  • the monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention is produced, for example, by ex vivo or in vivo methods.
  • An antigen-presenting cell is preferably transformed ex vivo or in vivo by treatment with viruses, viral vectors, bacterial vectors, plasmids, which by electroporation techniques, iontophoresis, ballistic methods and / or other techniques for introducing molecules into a monoantigenic antigen-presenting cell .
  • an antigen-presenting cell or a monoantigenic antigen-presenting cell can be treated by treatment with viruses, viral vectors, bacterial vectors, plasmids by electroporation techniques, iontophoresis, ballistic methods and / or other techniques for introducing molecules into a cell with suppressed function of co-stimulatory receptors can be transformed or the expression of co-stimulatory receptors by preventing their expression or the co-stimulatory receptors are activated by reaction with affine structures on stimulation of T cells that are attached to the monoantigenic antigen-presenting Cell bound, hindered.
  • Nucleic acids (mostly complementary to the target sequence) which are e.g. can be oligonucleotides, polynucleotides, ribozymes, peptide nucleic acids (PNAs),
  • PNAs peptide nucleic acids
  • Antibodies or other molecules that bind the co-stimulatory molecules are included in the immunoglobulin analogs.
  • Nucleic acids can be transferred in particular by viruses, viral vectors, bacterial vectors, plasmids, which are transferred into the monoantigenic antigen-presenting cell or the antigen-presenting cell by electroporation techniques, iontophoresis, ballistic methods and / or other techniques for the introduction of molecules.
  • immune reactions to be treated are related to antigens or their gene sequences and / or parts thereof and are selected from the group consisting of
  • acetylcholine receptor of the nicotine type ⁇ 1-adrenergic receptor, ⁇ l-adrenergic receptor, angiotensin-2-ATl receptor, glutamate receptor, thyrotropin-stimulating hormone (TSH) LFA receptor -1, HLA-B27, Epididymal Protein DE, Zona Pellucida (ZP) -3 Glycoprotein, Zona Pelluci- da (ZP) -4 glycoprotein, follicle-stimulating hormones (FSH) receptor, sperm immunogen SP-10 or sperm protein SP-10;
  • TSH thyrotropin-stimulating hormone
  • Hormones or messenger substances their gene sequences and / or partial sequences, in particular insulin, thyroglobulin, follicle-stimulating hormones (FSH), prostaglandin F2 alpha, gonadotropin-releasing hormones (GnRH), oestradiol-17beta, estrogen, luteinizing hormone (LH) receptor, Inhibin, testosterone, androgen, chorionic gonadotrophin (CG), interleukins, interferons, cytokines, chemokines, bone morphogenetic factors, ß-interferon, estradiol;
  • FSH follicle-stimulating hormones
  • GnRH gonadotropin-releasing hormones
  • LH oestradiol-17beta
  • Inhibin testosterone
  • testosterone androgen
  • CG chorionic gonadotrophin
  • interleukins interferons
  • cytokines cytokines
  • chemokines bone morphogenetic factors
  • myelin basic protein MBP
  • proteolipid protein PBP
  • myelin oligodendrocyte glycoprotein MOG
  • ⁇ -fodrin non-erythroid ⁇ -spectrin
  • beta-APP beta-amyloid precursor protein
  • type 2 collagen sperm plasma membrane protein PH-20;
  • the invention claims use in which the immune reactions to be treated are associated with allologic and / or xenological tissue characteristics, their gene sequences and / or partial sequences, in particular MHC I, MHC II, rhesus factor. Development of a gene therapy
  • the method presented here for reducing immune responses e.g. for the treatment of autoimmune diseases with a clearly defined autoantibody profile is based on the genetic engineering manipulation of certain blood cells, preferably outside the body, which are then subsequently returned to the organism.
  • the aim of this treatment is, among other things, the specific switching off of a chronic, immune system-driven production of autoantibodies that trigger the disease.
  • diseases with autoantibody-mediated autoimmune reactions i.e. diseases in which the "binding structures" of these autoantibodies (autoantigens, targets) are known and have pathogenetic significance.
  • antigen presentation In addition to the antigen to be presented, various receptors and auxiliary receptors are involved in cell-cell contact and cell activation on the cell surface.
  • An essential molecule of the intercellular interaction in antigen presentation contact of antigen presenting cells with the T helper lymphocytes
  • costimulatory receptors with the designations B7-1 and B7-2.
  • CD40 also plays a role in this signal transduction.
  • autoimmune diseases and allergies do not exist. With a few exceptions (extracorporeal elimination of antibodies from the patient's blood or plasmapheresis), autoimmune diseases and allergies are treated with medication by inhibiting immune system reactions.
  • SSV Monkey Sarcoma Virus
  • Rous-associated virus (RAV 1-
  • Electron microscopic images show that retroviruses are coated particles with a size of about 100 nm.
  • the capsid is surrounded by a membrane in which outward-facing envelope proteins (env) are embedded.
  • the inside of the membrane is provided with a layer of matrix proteins (MA).
  • MA matrix proteins
  • the nudeocapsid which consists of capsid proteins (CA) is constructed.
  • Matrix protein and capsid protein belong to the so-called group-specific antigens (gag).
  • group-specific antigens gag
  • the RNA begins with the m ⁇ GPPP cap structure, which is important for the translation of the structural proteins, and ends with the approximately 200 base long poly (A) sequence. Between the cap structure and the poly (A) sequence there are regulatory sequences, including the splice donor, followed by the sequences coding for the gag, pro- and pol proteins, the splice acceptor and the coding sequence for the env gene.
  • the 5 'capping region Following the 5 'capping region is the 5' R region, followed by the U5 region, the primer binding site (PBS), the leader, the sequences for the viral proteins, the polypurine extract, the U3 region, the 3 'R Region and the poly A sequence.
  • PBS primer binding site
  • the U5 region adjoining the 5 'end is the first transcribed region for reverse transcription and contains important sequences for the initiation the transcription. It is approximately 75 bases long and becomes the 3 'end of the 5' long terminal repeats (LTR) of the Provirus.
  • LTR long terminal repeats
  • the leader sequence is approximately 475 bases long and contains the splice donor sequences.
  • the packaging signal is also located here. It assembles the genomic RNA into the virions when the virions are assembled, while other RNA is not packaged.
  • the protease is responsible for the breakdown of the gag and pol polyprotein precursors into the mature proteins.
  • the reverse transcriptase contains the DNA polymerase activity and an RNase H activity, but it has no "proof reading” activity.
  • Reverse transcriptase is one of the most conserved areas of the retrovirus genome. Not only is there agreement within the retrovirus family, but certain areas are also found in genetically distant viruses, e.g. the Hepadnaviruses (double-stranded DNA viruses) and the Cauliflower Mosaic Virus.
  • the env genes have their own reading frame and are transcribed via a splice acceptor. They are also transcribed as a polyprotein precursor (Pr80 env ), but cleaved by a cellular protease: transmembrane region (pl5E) and external glycoprotein (gp70).
  • the env protein consists of two polypeptide chains that are linked by disulfide bridges. These chains are synthesized as a common precursor; the amino terminal part gives the external polypeptide chain (SU), the carboxy terminal part the transmembrane region (TM).
  • the SU protein is glycosylated and responsible for the interaction with the receptor; the TM protein is not glycosylated and ensures that the proteins are anchored in the membrane. He is probably also responsible for the dimerization of the env molecules. Since the bond between the SU and the TM protein is not particularly tight, the SU protein is often "lost". Among other things, this results in the poor stability of infectious viruses during ultracentrifugation and the large number of infection-defective particles.
  • the replication cycle of murine leukemia virus corresponds to the general scheme of retroviruses and is divided into the following steps:
  • a cell is infected by the specific attachment of the virus to its receptor on the cell surface and the subsequent uptake of the virus into the cell. Only cells that express this receptor can be infected.
  • cellular receptor The interaction between the cellular receptor and the external viral coat protein (SU) causes a change in the conformation of the latter and enables fusion with the cell membrane through the transmembrane domain of the virus.
  • Virions are taken up either by pH-dependent fusion (ecotropic virus) or by endocytosis (amphotropic virus).
  • the minus DNA strand is first synthesized. It the 5 'located U5 and R region is transcribed (strong stop DNA), the RNA matrix being simultaneously degraded by the RNAse H activity of the reverse transcriptase. The DNA released in this way "jumps" to the 3 'end of the viral RNA and the newly synthesized R region is attached to the R region present there. Starting from this matrix, the remaining viral RNA is transcribed into DNA and broken down to the RNAse H-resistant polypurin area in front of the U3 region.
  • This area on the already synthesized minus DNA strand serves as a template for the synthesis of the plus DNA strand, the 3 'end of which is first transcribed. Then the remaining RNA residues are broken down and the primer binding site of the plus strand can bind to the primer binding site of the minus strand and the synthesis of the plus strand can proceed completely. The final step is to complete both strands of DNA.
  • the newly synthesized DNA contains the Long Terminal Repeats (LTR) on both sides.
  • Retroviruses are non-lytic viruses, have a simple genome, are well characterized, integrate stably into the genome of the infected cell and can permanently express the inserted gene there - all reasons to make them attractive for gene therapy approaches.
  • Vectors with amphotropic env or pseudotype vectors with the env of other viruses are used for the transduction of human cells. Work is being carried out on the development of cell-type-specific vectors, either by choosing a suitable LTR (Hunt 1987), a special coat protein or by introducing antibodies or receptors into the virus envelope.
  • Retroviral vectors are made on the basis of retroviruses. In order to prevent the formation of replication-competent viruses, the viral genes are deleted. Instead of this, the gene to be expressed is cloned with the necessary regulatory sequences between the LTRs and provided with the packaging signal. The vectors are packaged in special packaging cell lines that provide all the proteins required for packaging. The DNA to be transferred is limited by the packaging capacity of the virions. Retroviral vectors can transmit up to 9 kb of foreign DNA. By choosing a suitable LTR or an additional promoter, an attempt is made to obtain the highest possible expression of the transferred gene in the desired target cell. Different genes can be encoded from one vector using different strategies.
  • the Buffy Coats were tested in advance for their reactivity to tetanus toxin.
  • the experimental approach contains tests with monocytes and T lymphocytes. The monocytes were

Abstract

Antigen präsentierende Zelle, die überwiegend vorher bestimmte Antigene präsentiert (monoantigene antigen-präsentierende Zelle), dadurch gekennzeichnet, dass die monoantigene antigen-präsentierende Zelle teilungsfähig ist und eine der Funktionen co-stimulatorischer Rezeptoren, wie ein B7 - und/oder CD40-Rezeptor supprimiert ist.

Description

Verfahren zur Reduzierung von spezifischen Immunreaktionen
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Antigen präsentierende Zeilen, Verfahren zur Herstellung Antigen präsentierender Zellen, Arzneimittel enthaltend Antigen präsentierende Zellen sowie Verwendung der Antigen präsentierenden Zellen .
Beschreibung
Seit knapp 10 Jahren werden für verschiedene Krankheiten und in Tiermodellen gentherapeutische Verfahren entwickelt und angewendet. Bisher sind sie noch nicht in die Routine überführt. Meist handelt es sich dabei um die Behandlung von genetisch bedingten, schweren Erkrankungen, für die andere Therapien nicht zur Verfügung stehen. Weiterhin werden Gentherapien zur Behandlung von schweren und ebenfalls nicht therapierbaren Krebserkrankungen eingesetzt.
Wenig Aufmerksamkeit hat die experimentelle Medizin bisher der Behandlung von Allergien und Autoimmunerkrankungen mittels gentechnischer Methoden geschenkt.
Allgemeines zu Allergien
Allergien verursachen beträchtliche Kosten im Gesundheitswesen der Industrieländer. Immerhin sind schätzungsweise mindestens 20% der Bevölkerung gegen irgendeine Substanz allergisch. Die meisten Betroffenen leiden an allergischer Rhinitis, zu der insbesondere der Heuschnupfen zählt, oder an Bronchialasthma: Sie niesen oder ringen nach Luft, nachdem sie bestimmte Pollen oder andere im allgemeinen harmlose Substanzen eingeatmet haben. Viele Kinder und einige Erwachsene reagieren auch allergisch auf Nahrungsmittel. Andere erleiden Hautausschläge oder sogar einen allergischen Schock, nachdem sie Medikamente wie Penizillin erhalten haben. Bei wieder anderen rufen Bienenstiche starke lokale Schwellungen oder schwere systemische - den gesamten Organismus erfassende - Störungen hervor. Im Extremfall können allergische Anfälle sogar zum Tod führen. Allein die unmittelbare medizinische Versorgung von Asthmapatienten hat in den USA 1990 schätzungsweise 3,6 Milliarden Dollar verschlungen und damit rund ein Prozent aller Kosten im Gesundheitswesen ausgemacht.
Mittlerweile ist bekannt, dass einige der zellulären und molekularen Wechselwirkungen bei allergischen Reaktionen oft ähnlich ablaufen, unabhängig davon, auf welche Substanzen der einzelne anspricht und welche Symptome er entwickelt. Gewisse Begleiterscheinungen der Allergien treten normalerweise ausschließlich auf, wenn das Immunsystem Parasiten bekämpft. So reagiert der Körper auf Schmarotzer ebenso wie auf Allergene mit der massiven Produktion von Molekülen, die als Immunglobulin-E-Antikörper (IgE) bezeichnet werden. Die Produktion dieser Antikörper wird durch T-Helfer-Zellen induziert, die wiederum von antigen-präsentierenden Zellen aktiviert werden.
Sensibilisierunq
Unterschiedliche Allergene rufen unter anderem deswegen verschiedenartige Symptome hervor, weil sie mit dem Immunsystem in verschiedenen Körperregionen in Berührung kommen. In den oberen Luftwegen erzeugt die fehlgeleitete Immunreaktion Niesen und eine verstopfte Nase. In den unteren Luftwegen können dagegen die Bronchien sich verengen und verschleimen, so dass typische asthmatische Symptome auftreten. Entsprechend rufen Immunaktivitäten in den Geweben des Magen-Darm-Traktes Übelkeit, Bauchkrämpfe, Durchfall oder Erbrechen hervor.
Schließlich vermag ein Allergen, dass auf irgendeinem Weg ins Blut gelangt, eine Anaphylaxe auszulösen: eine allergische Reaktion in weit von seiner Ein- trittsstelle entfernten Körperregionen. Schwere anaphylaktische Schocks können alle normalen Körperfunktionen durcheinanderbringen und tödlich enden.
Auch wenn sich die allergischen Reaktionen unterschiedlich äußern, werden sie doch stets durch den gleichen Mechanismus in Gang gesetzt: die Sensibilisie- rung. Dazu kann bereits der einmalige Kontakt mit einem Allergen, typischerweise einem Eiweißstoff, genügen. In den Luftwegen oder anderen Geweben trifft die allergieauslösende Substanz auf sogenannte Fresszellen oder Makrophagen. Diese verschlingen den Fremdstoff, zerstückeln ihn und präsentieren die Fragmente auf der Zelloberfläche mit MHC II-Molekülen. Im weiteren Verlauf erkennen einige T-Helfer-Lymphozyten die dargebotenen Bruchstücke und binden daran. Die T-Helfer-Lymphozyten werden von den Makrophagen aktiviert und aktivieren dann ihrerseits einige B-Lymphozyten, die gleichfalls das Allergen erkennen. Die B-Zellen reifen dann zu Antikörper produzierenden Plasmazellen aus. Zunächst sind dies Antikörper vom sogenannten IgM-Typ; ab einem bestimmten Zeitpunkt schalten die Plasmazellen jedoch auf IgE- Antikörper um.
Bis die Antikörper hergestellt sind, können Tage oder Wochen vergehen, und das Aliergen, welches ihre Produktion in Gang gesetzt hat, ist dann womöglich schon lange verschwunden. Nicht so die IgE-Moleküle. Mit ihrer Fc-Region heften sie sich an IgE-Rezeptoren zweier unterschiedlicher Klassen von Immunsystemzellen. Bei der einen handelt es sich um Mastzellen, die sich im Körpergewebe für gewöhnlich in der Nähe von Blutgefäßen und Epithelzellen ansiedeln. Über das Epithel besteht Kontakt mit der Außenwelt (darunter fällt auch das Epithel der Atemwege und des Magen-Darm-Traktes). IgE-Antikörper binden außerdem an basophile Granulozyten (Basophile). Diese Zellen zirkulieren allerdings im Blutstrom.
Hat die Produktion der IgEs einmal begonnen, hält sie offenbar Monate, ja manchmal sogar Jahre an. Folglich besetzen sie unablässig IgE-Rezeptoren auf Mastzellen und Basophilen - bereit beim nächsten Allergenkontakt augenblicklich in Aktion zu treten. Akute Symptome
Während also die erste Begegnung mit einem Allergen selbst bei Personen, die sich später als Allergiker entpuppen, keine Symptome hervorruft, leitet die Zweitexposition ein Stadium der Überempfindlichkeitsreaktion ein, welches auch äußerlich in Erscheinung tritt. Innerhalb von Sekunden nach dem Kontakt mit menschlichem Gewebe bindet der allergieauslösende Stoff an die IgEs der Mastzellen. Heftet er sich dabei an zwei oder mehr IgE-Moleküle zugleich, bildet er eine Brücke zwischen ihnen. Solche Quervernetzungen lassen die betroffenen IgE-Rezeptoren dichter zusammenrücken, und dies aktiviert die Zelle, so dass sie hochwirksame Substanzen ausschüttet, die auf direktem Wege allergische Symptome erzeugen. (Die Freisetzung kann auch auf andere Arten hervorgerufen werden; von allergischen Reaktionen spricht man nur, wenn IgEs beteiligt sind). Die wichtigste dieser Substanzen ist Histamin. Es kann sowohl die Schleimbildung in den Epithelien anregen und so zur Verstopfung der Luftwege beitragen als auch die glatte Muskulatur, die wie ein elastisches Band Bronchien und Därme umschlingt, kontrahieren lassen. Ferner vermag es die feinen Blutgefäße zu weiten und durchlässiger zu machen, so dass Flüssigkeit ins Gewebe sickern kann. Rötungen und Schwellungen sind die Folge. Betreffen diese Gefäßveränderungen große Teile des Körpers, können sie ein tödliches Kreislaufversagen auslösen: Bei einem solchen Schock fällt der Blutdruck jäh so stark ab, dass die Sauerstoffversorgung von Herz und Gehirn nicht mehr gewährleistet ist.
Die zweite Gruppe von Mediatoren besteht hauptsächlich aus Prostaglandinen und Leukotrienen. Sie werden erst erzeugt, nachdem die Allergenrπoleküle sich an die IgEs auf den Zellen angelagert haben. Wie Histamin verengen sie die Bronchien und erweitern die Blutgefäße. Ihre Wirkung hält allerdings länger an. Zusätzlich stoßen stimulierte Mastzellen eine Vielzahl potentiell toxischer Enzyme aus. Offenbar setzen sie ferner Cytokine frei, die die Aktivitäten anderer Immunzellen regulieren.
Behandlung: 1. Die allergische Rhinitis
Antihistaminika erweisen sich in der Regel als wirksam und dienen immer noch als Standardtherapie. Die neuesten Varianten können die Blut-Hirn-Schranke nicht mehr ohne weiteres passieren und machen die Patienten nicht mehr müde. Wenn bei einer schweren Entzündung Antihistaminika wirkungslos bleiben, helfen oft inhalierbare Corticosteroide, die gewöhnlich zur Linderung der chronischen Entzündung bei Asthma verschrieben werden.
In schweren Fällen kann die schon im Jahre 1911 eingeführte Immuntherapie oder Hyposensibilisierung (auch als Allergiespritzen oder Desensibilisierung bekannt) auf lange Sicht Erleichterung verschaffen. Bei dieser Behandlung injizieren Ärzte den Patienten steigende Dosen des Allergens, auf das diese empfindlich reagieren. In allen Fällen ist die Dosis ausschlaggebend : Zu wenig Allergen verleiht keine Toleranz. Außerdem ist der Schutz selten vollständig.
2. Asthma
Bronchodilatatoren sind die meistverwendeten Arzneimittel bei Asthma. Sie lindern die durch Histamin und andere Bronchokonstriktoren hervorgerufenen Symptome sehr schnell, beeinflussen die zugrundeliegende Entzündung jedoch wahrscheinlich nicht. Außerdem kann ihr übermäßiger Gebrauch eine Gegenreaktion des Körpers hervorrufen, so dass nach Abklingen ihrer Wirkung der Atemstrom stärker behindert ist als zuvor. Zusätzlich kommen die unter 1. aufgezählten Methoden zur Anwendung.
3. Anaphylaktische Reaktionen Insektenstiche rufen bei manchen Menschen Anaphylaxien aus. In schweren Fällen führen diese zum Tod durch z.B. Kreislaufversagen oder Ersticken. Jede schwere Anaphylaxie - gleich ob sie zum ersten oder fünfzehnten Mal auftritt - ist ein Notfall, bei dem zunächst versucht werden muss, die bedrohlichsten Symptome zu beherrschen. Meist geschieht das durch Injektion von Adrenalin, welches die Freisetzung der Mediatoren hemmt, die Luftwege öffnet und der Erweiterung der Blutgefäße entgegenwirkt. Man kann vorbeugend durch eine Immunisierung mit dem Gift des gesundheitsbedrohenden Insekts agieren.
Neue Ansätze
In der Erprobung im Tiermodell befindet sich die auf DNA basierende Immunisierung mit einem Allergen (Der p 5) der Milbe Dermatophagoides pteronyssi- nus. Diese Immunisierung resultiert in einer Produktion von IgG, aber nicht IgE, und resultiert in einer 90%tigen Reduktion der Mengen an spezifischem IgE, welche durch klassische Sensibilisierung mit Der p 5 und Alaun als Adju- vant oder allergen-induzierte Rhinitis hervorgerufen wurden.
Eine weitere neue Strategie ist die Verwendung von humanisierten monoklo- nalen Anti-IgE-Antikörpern gegen die FcεRI-Binderegion für IgE. Dadurch wird die Bindung von IgE an den IgE-Rezeptor verhindert, so dass keine Mediatoren der allergischen Reaktion von Mastzellen oder Basophilen ausgeschüttet werden können. Diese Strategie hat in klinischen Studien bei Patienten mit allergischer Rhinitis und allergischem Asthma gezeigt, dass diese Antikörper gut toleriert werden und die allergischen Reaktionen reduzieren.
(siehe auch L.M. Lichtenstein: "Allergie und Immunsystem"; in Spektrum der Wissenschaft Spezial: Das Immunsystem; 1994; 74-83; S-K Huang, K-Y Chua und K-H Hsieh: Allergen gene transfer. Current Opinion in Immunology 1997; 800-804; C. Heusser und P. Jardieu: Therapeutic potential of anti-IgE antibo- dies. Current Opinion in Immunology 1997; 805-814). Allgemeines zu Transplantationen
Die Transplantation von Geweben, um kranke Organe zu ersetzen, ist heute eine wichtige medizinische Therapie. In den meisten Fällen stellt eine Reaktion des anpassungsfähigen Immunsystems gegen das Transplantat die größte Bedrohung für eine erfolgreiche Behandlung dar. Reaktionen des anpassungsfähigen Immunsystems werden von Antigen-präsentierenden Zellen durch Aktivierung von T-Helfer-Lymphozyten induziert. Bei der Transfusionen von Blut, welches das erste und am häufigsten verwendete Transplantat ist, müssen die ABO und Rh Blutgruppenantigene abgeglichen werden, damit die schnelle Zerstörung unpassender Erythrozyten vermieden wird. Bei anderen Geweben müssen die sehr polymorphen Haupthistokompatibilätskomplexe (MHC) aufeinander abgeglichen werden, da diese fast immer die Immunreaktion auslösen. Leider ist der perfekte Abgleich der MHCs außer bei Verwandten fast unmöglich.
Obwohl die Immunreaktion Organtransplantationen schwierig macht, gibt es wenige Alternativen bei Organausfällen. Die Verwendung von potenten im- munsuppressiven Drogen, besonders Cyclosporin A und FK-506, die die Aktivierung von T-Zellen verhindern, macht Organtransplantationen erfolgreich. Trotzdem laufen hier einige Probleme auf, da das Leiden, welches das eigene Organ zerstört hat, auch das fremde Organ zerstört. Außerdem steigt durch die Unterdrückung des Immunsystems, das Risiko an Krebs oder Infektionen zu erkranken. Zudem ist die Prozedur sehr kostspielig (Janeway and Travers 1997).
Allgemeines zu Autoimmunerkrankungen
Autoimmunerkrankungen gehören zu den chronischen Erkrankungen. Zu ihnen zählen Rheuma in verschiedensten klinischen Ausprägungen, Diabetes, Multiple Sklerose, bestimmte Formen von Herzmuskelentzündungen und von Schilddrüsenerkrankungen. Die Reihe von Autoimmunerkrankungen ließe sich beliebig fortsetzen, wobei ca. 90% allerdings epidemiologisch nur einen kleinen Prozentsatz ausmachen.
Die klinischen Verläufe von Autoimmunerkrankungen selbst bei ein- und derselben Diagnose können sehr unterschiedlich sein. Z. T. werden schubartige Krankheitsverläufe beobachtet. Entsprechend werden die Behandlungen vom Arzt individuell gestaltet.
Einige der Autoimmunerkrankungen sind antikörpervermittelt. Darunter wird in der Immunologie verstanden, dass der Organismus aus meist nicht bekannten Ursachen Antikörper produziert, welche sich gegen körpereigene zelluläre Strukturen (Autoantigene) richten. Sind diese Antikörper einmal gebildet, lösen sie durch ihre Interaktion und Bindung an die jeweiligen organ- oder zellspezifischen Strukturen eine zell- und gewebszerstörende Reaktion des Immunsystems aus. Letztendlich führt diese dann zu dem klinischen Bild der Erkrankung (Steinman 1994).
Beispiel hierfür ist die Schilddrüsenerkrankung Morbus Basedow, aber auch eine Form der Herzmuskelentzündung, die zur Dilatativen Cardiomyopathie führt. In einigen Fällen sind sowohl die Targets, gegen die sich die Autoantikörper richten, als auch die Autoantikörper selbst, genau charakterisiert.
WO-A-96/18736 offenbart ein Verfahren und ein Reagenz zur Behandlung von arthritischen Bedingungen, Induktion von Toleranz bei Verpflanzungen und Umkehrung von Immunreaktionen. Dabei wird die Möglichkeit, die Expression von B7-1, B7-2 und B7-3 durch Ribozyme oder Antisense-RNA zu unterdrücken, theoretisch erörtert. Die Unterdrückung der B7-Mengen durch ein B7- Ribozym und B7-Antisense-RNA werden zwar nicht durch Experimente verifiziert, aber eine reine Unterdrückung von B7 würde im besten Falle eine allgemeine Reduzierung der gesamten Reaktionen des anpassungsfähigen Immunsystems bewirken. Die WO-A-95/32734 beschreibt die Verhinderung co-stimulatorischer Aktivitäten von antigen-präsentierenden Zellen, indem FcγRII-Rezeptoren durch ag- gregierte IgG-Moleküle vernetzt werden. Eine Unterdrückung von T-Zell- vermittelten Krankheiten soll erreicht werden, indem gleichzeitig die FcγRII- Rezeptoren vernetzt und spezifische Antigene verabreicht werden.
Die WO-A-98/29124 betrifft injizierte Antisense-Oligonukleotide, mit denen die B7-Mengen reduziert werden sollen. Damit kann die Expression von B7 höchstens unspezifisch in allen Zellen behindert werden.
WO-A-97/44450 offenbart die Erhöhung oder Unterdrückung von Prozessen, die auf sequenzspezifischen Interaktionen von Nukleinsäuren mit der Zellmaschinerie beruhen. Insbesondere können Genpromotor-unterdrückende Nukleinsäuren eingesetzt werden, die mit Genpromotormotiven für die Erhöhung oder Unterdrückung der Transkription eines Zielgens interagieren. Im Detail werden mit einer Utron-Nukleinsäure, dem TSU, die Expression von MHCs der Klassen I und II, sowie von ICAM-1, B7-1, B7-2 und FcγR behindert. Ein solcher Eingriff könnte insbesondere für Organtransplantate von Nutzen sein, bei denen die Expression von MHC-Molekülen die entscheidenden Abstoßungsreaktionen hervorruft. Utron-Nukleinsäuren stammen aus den 3 '- untranslatierten Regionen von mRNAs. Diese 3 ' -untranslatierten Regionen werden so genannt, wenn sie in vivo Aktivitäten entfalten, die zelluläre Prozesse durch sequenzspezifische Interaktionen mit einem Teil der zellulären Maschinerie stimulieren oder inhibieren. Bei der zellulären Maschinerie handelt es sich gemäß WO -A-97/44450 um Promotoren. Es wird dort zwar über die Möglichkeit der Unterdrückung der B7-Expression (1 und 2) mit gentechnischen Methoden spekuliert, aber eine solche Inhibition kann mit dem aufgezeigten Mittel nur in Zusammenhang mit der Inhibition weiterer Gene (MHCs der Klassen I und II, sowie von ICAM-1 und FcγR) geschehen. Eine solch weitreichende Inhibition ist kontraproduktiv, da man auf eine hohe MHC-Expression angewie- - lo sen ist. Außerdem ist eine Regulation auf der Promotorebene nachteilig, da keine Möglichkeit besteht, um hinreichend spezifisch zu wirken.
WO-A-99/50394 offenbart teilungsfähige aus Monozyten gewonnene Zellen. Es werden keine Monozyten beschrieben, die vorwiegend vordefinierte Antigene präsentieren. Es wird kein Gentransfer vorgesehen, der für eine verminderte Anzahl von CD80, CD86, CD40 an der Zelloberfläche sorgt. Vielmehr wird deren verminderte Präsenz durch die Behandlung mit z. B. physikalischen Methoden wie UV-Licht erreicht, wodurch auch die beschriebenen anderen Charakte- ristika hervorgerufen werden.
Das der Erfindung zu Grunde liegende Problem besteht unter anderem darin, gentechnologische, therapeutisch nutzbare Produkte für die Reduktion von spezifischen Immunreaktionen zur Verfügung zustellen, bei denen Targets (Antigene, Autoantigene) und Antikörper, Autoantikörper bekannt sind.
Gelöst wird das Problem durch die erfindungsgemäße antigen-präsentierende Zelle, die überwiegend vorher bestimmte Antigene präsentiert (monoantigene antigen-präsentierende Zelle) und dadurch gekennzeichnet ist, dass die monoantigene antigen-präsentierende Zelle teilungsfähig ist und eine der Funktionen co-stimulatorischer Rezeptoren der Zelle, wie ein B7- und/oder CD40- Rezeptor supprimiert ist.
Vorteilhaft an der antigen-präsentierenden Zelle gemäß der Erfindung ist, dass man die Zellen vermehren und z. B. Makrophagen und dendritischen Zellen differenzieren kann. Durch Erhalt der Teilungsfähigkeit werden diese Zellen im Grunde erst für den Gentransfer durch die gängigen nicht replikationsfähigen Retroviren geeignet, da diese erst bei der Teilung ins Genom eingebaut werden.
Figur 1 zeigt ein Schema zur Funktion der Genmanipulation auf zellulärer Ebene. a) normaler Mechanismus der T-Helfer-Zell-Aktivierung über Monozyten
b) Mechanismus der Monozyten nach Genmanipulation. Ausbleiben der T- Helfer-Zell-Aktivierung nach Genmanipulation der Monozyten.
Figur 2 zeigt eine "Normale" Immunreaktion zur Antikörperbildung, Antigen- präsentierende Monozyten als Induktoren der Antikörperproduktion. Monozyten nehmen als fremd erkannte Moleküle auf und bringen sie auf die Zelloberfläche (Antigenpräsentation). Gemeinsam mit einem Oberflächenmolekül (B7) wird das Antigen den T-Helferzellen präsentiert. Das präsentierte Antigen wird von T-Helfer-Lymphozyten erkannt, die ihrerseits B-Zellen zur Antikörperproduktion anregen. Das Schema ist stark vereinfacht.
Figur 3 zeigt schematisch die Funktion der Genmanipulation auf molekularer Ebene: der Co-stimulierende Rezeptor B7 wird inaktiviert.
Figur 4 (I) zeigt die Funktion der Genmanipulation auf molekularer Ebene: das Autoantigen wird von den B7-inhibierten antigenpräsentierenden Zellen synthetisiert
Figur 4 (II) zeigt einen Vergleich der Antigenpräsentation von "normalen" und gentechnisch veränderten Monozyten.
Figur 5 demonstriert die Funktion der genetisch veränderten Monozyten im Körper.
Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße monoantigene antigen-präsentierende Zelle ein Monozyt, eine dendritische Zelle und/oder ein Makrophage. Die APCs sind die Schaltstellen des anpassungsfähigen Immunsystems. Nur sie können eine solche Immunantwort auslösen. Dies sei in folgenden Abbildungen am Beispiel von Monozyten und der durch T-Helfer-Zellen ausgelösten Antikörperproduktion gezeigt:
Innerhalb des Immunsystems spielen die Antikörper normalerweise als Abwehrmoleküle ("humorale Immunreaktion") eine wichtige Rolle. Sie werden von ausgereiften B-Lymphozyten produziert. Die Induktion und Produktion der Antikörper erfolgt allerdings nicht unabhängig von den restlichen Zellen des Immunsystems; vielmehr wird diese humorale Immunreaktion von anderen Zellen des Immunsystems gesteuert.
Die Antikörperproduktion - und so auch die Produktion der pathologischen Autoantikörper - lässt sich nicht aufrechterhalten ohne die Hilfe und Vermittlung von Monozyten und T-Helfer-Lymphozyten, die ihrerseits antigenspezi- fisch die B-Lymphozyten aktivieren (Fig.l).
Die molekularen Mechanismen der Interaktion - des Zell-Zell-Kontakts - von Monozyten mit den T-Helfer-Lymphozyten ist auf Rezeptorebene bis ins Detail bekannt (Figur 2).
Handelt es sich bei dem Antigen z.B. um ein Bakterienprotein, ist die Immunreaktion für den Organismus nützlich. Ist das Antigen allerdings eine körpereigene Struktur, spricht man von einer (pathologischen) Autoimmunreaktion.
Neben dem zu präsentierenden Antigen (gegen welches sich die zu produzierenden Antikörper richten) sind auf der Zelloberfläche verschiedene Rezeptoren und Hilfsrezeptoren am Zell-Zell-Kontakt und der Zellaktivierung beteiligt. Ein essentielles Molekül der interzellulären Wechselwirkung bei der Antigenpräsentation (Kontakt von Monozyt mit den T-Helfer-Lymphozyten) ist ein costi- mulierender Rezeptor mit der Bezeichnung B7 (Figur 2) Die erfindungsgemäße monoantigene antigen-präsentierende Zelle weist vorzugsweise durch eine Transformation einer antigen-präsentierenden Zelle mit nukleinsäurehaltigem Material eine erhöhte Expression eines Antigens auf, wobei die antigen-präsentierende Zelle im wesentlichen nur eine Sorte eines Antigens präsentiert.
Das konzipierte gentherapeutische Verfahren beruht auf zwei parallelen gentechnologischen Eingriffen an patienteneigenen Blutmonozyten. Die Eingriffe erfolgen mittels geeigneter Sonden und bewirken die Verminderung von B7- Molekülen durch die Behinderung und damit der Verhinderung der Ausbildung des Moleküls auf der Oberfläche der Monozyten (Figur 3) und gleichzeitig eine starke Präsentation des Autoantigens (Figur 4).
Verminderung der spezifischen Antikörperproduktion durch Gentherapie
Die Produktion pathologischer Autoantikörper wird durch die Manipulation von Monozyten spezifisch abgeschaltet. Der Co-Rezeptor B7, ohne den die Antigenpräsentation bzw. die Induktionskaskade zur Antikörperproduktion nicht anläuft, wird unterdrückt. Hinter dem Begriff B7 verbergen sich zwei unterschiedliche Co-Rezeptoren, die als CD80 (B7-1) und CD86 (B7-2) bezeichnet werden. Ihre Strukturen sind bekannt.
Nach dem Abschalten der Antikörperproduktion verschwinden die im Blut zirkulierenden Autoantikörper aufgrund des natürlichen Abbaus und des fehlenden Nachschubs.
Nach der in vitro Manipulation der Monozyten werden die Zellen in die Blutbahn des Patienten zurückgegeben. Die genmanipulierten Monozyten schalten nunmehr die im Organismus befindlichen entsprechenden T-Helfer- Lymphozyten ab. Die genmanipulierten Zellen treten dabei unmittelbar in Konkurrenz zu den bereits im Organismus (vorzugsweise Blutbahn und Lymphsystem) vorhandenen Autoantigen-präsentierenden Monozyten, die allerdings B7 auf der Zelloberfläche tragen und normalerweise die T-Helfer-Lymphozyten und damit die Antikörperproduktion aktivieren (Figur 5).
Antigenpräsentation bei gentechnisch veränderten Monozyten
Die cDNA eines Proteins, das als Autoantigen die Produktion pathologischer Autoantikörper hervoruft, wird in das Monozytengenom integriert. Diese Erbinformation dient dann zur Überproduktion des Autoantigens. Peptide dieses Autoantigens werden daraufhin bevorzugt an MHC II und/oder MHC I präsentiert (siehe auch Figur 4(11)). MHC II präsentiert die Peptide den T-Helferzellen und versucht solche zu finden, die spezifisch die präsentierten Proteine erkennen. Wenn der Co-Rezeptor B7 nicht gleichzeitig an der Zelloberfläche erscheint, werden die T-Helferzellen stillgestellt und unterliegen einem vorzeitigen Zelltod.
Alle genmanipulierten Monozyten präsentieren an den meisten ihrer MHC II- Komplexe das Autoantigen, während in vivo nur sehr wenige "normale" Monozyten das Autoantigen präsentieren und dann auch nur an wenigen MHC II- Komplexen. Es ist Ziel der Behandlung, in vivo die "normalen" Monozyten, die das Autoantigen präsentieren und die T-Helfer-Zellen aktivieren, zu verdrängen durch die auf Abschaltung der Antikörperprodukte programmierten, genmanipulierten Monozyten.
Die erfindungsgemäße monoantigene antigen-präsentierende Zelle kann insbesondere eine erhöhte Anzahl von Homing-Rezeptoren, wie CD44, aufzeigen. Eine Überexpression von Homing-Rezeptoren wird der monoantigenen Antigen-präsentierenden Zelle den Weg in die Lymphknoten weisen, wodurch die genmanipulierten APCs sich vermehrt und schneller in Lymphknoten ansammeln. Die Lymphknoten sind der Ort, an dem die allermeisten Reaktionen des anpassungsfähigen Immunsystems hervorgerufen werden. Dort entfalten die genmanipulierten APCs daher eine um ein vielfaches höhere Wirkung als außerhalb der Lymphknoten. In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen monoantige- nen antigen-präsentierenden Zelle bewirkt eine Transformation eine Erhöhung der Anzahl von Homing-Rezeptoren und/oder eine Suppression von Funktionen der B7-, CD40-Rezeptoren.
Insbesondere mit Antisense-Nukleinsäuren kann die B7- und/oder CD40- Rezeptor Expression in der erfindungsgemäßen monoantigenen antigen- präsentierenden Zelle verhindert oder reduziert werden..
Alternativ kann mit Nukleinsäuen eine Unterdrückung der Expression der B7- und/oder CD40-Rezeptoren durch Co-Suppression in der erfindungsgemäßen monoantigene antigen-präsentierende Zelle bewirkt werden.
Die erfindungsgemäße monoantigene antigen-präsentierende Zelle kann Nukleinsäuren enthalten oder transformiert sein, die eine Expression von mit B7- und/oder CD40-Rezeptoren affinen Strukturen aufweisenden Proteinen oder Peptiden bewirken. Damit werden Proteine gebildet, die durch Komplexbildung mit B7 - und/oder CD40-Rezeptoren praktisch neutralisieren. Insbesondere kommen dazu CTLA4, CD28, Antikörper, F(ab)2, scFv und/oder Fab-Fragmente als Proteine in Betracht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße monoantigene antigen-präsentierende Zelle Nukleinsäuren, die für eine Signalsequenz kodieren oder Expressionsprodukte einer Signalsequenz, die den Verbleib der Expressionsprodukte im endoplasmatischen Retikulum, dem Gol- gi-Apparat, dem Trans-Golgi-Netzwerk oder intrazellulären Vesikeln bewirkt.
Die erfindungsgemäße monoantigene antigen-präsentierende Zelle wird zur Expression von Antigenen mit Nukleinsäuren transformiert, die den Transport der exprimierten Antigene in MHC II-Kompartimente der Zellen ermöglichen. Alle genmanipulierten Monozyten präsentieren an den meisten ihrer MHC- Komplexe das Autoantigen, während nur sehr wenige "normale" Monozyten überhaupt das Autoantigen präsentieren und dann auch nur an wenigen MHC- Komplexen. Es ist Ziel der Behandlung, die "normalen" Monozyten, die das Autoantigen präsentieren und die T-Helfer-Zellen aktivieren, zu verdrängen durch die auf Abschaltung der Antikörperprodukte programmierten, genmanipulierten Monozyten. Es ist sehr wichtig, das Antigen (die Antigene) auch in einer Form zu verabreichen, die den Transport in die MHC II-Endosomen ermöglicht. Nur so kann zuverlässig eine Präsentation an MHC II erreicht werden. Bei einem gentechnischen Eingriff erfolgt dies in der Regel durch Manipulation des offenen Leserasters, so daß dem Leseraster eine Signalsequenz für dieses Kompartiment vorgeschaltet wird. Eine genetische Manipulation hat den zusätzlichen Vorteil, daß sie eine viel längere Halbwertzeit hat, als z.B. Oligo- nukleotide oder Peptide. Eine stabile Integration von Genen führt sogar zu einer permanenten Veränderung der Eigenschaft der Zielzellen.
Die entsprechenden Nukleinsäuren können dabei DNA, RNA, Oligonukleotide, Polynukleotide, Ribozyme, Peptidnukleinsäuren (PNA) sein.
Vorzugsweise besitzt die DNA Regulationselemente wie Enhancer, Promotoren, polyA-kodierende 3λ-Enden zur Transkription der DNA in RNA, die RNA Regulationselemente zur Translation der RNA in Protein. Die Regulationselemente sorgen für eine effiziente Expression der Gene.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen monoantigenen antigen- präsentierenden Zelle erfolgt zum Beispiel durch ex vivo oder in vivo Verfahren. Dabei wird vorzugsweise eine antigen-präsentierende Zelle ex vivo oder in vivo durch Behandlung mit Viren viralen Vektoren, bakteriellen Vektoren, Plasmiden, die durch Elektroporationstechniken, Iontophorese, ballistischen Methoden und/oder anderen Techniken zur Einschleusung von Molekülen in eine monoantigene antigen-präsentierende Zelle transformiert. In einer weiteren Ausführungsform kann eine antigen-präsentierende Zelle oder eine monoantigene antigen-präsentierende Zelle durch Behandlung mit Viren, viralen Vektoren, bakteriellen Vektoren, Plasmiden, die durch Elektro- porationstechniken, Iontophorese, ballistischen Methoden und/oder anderen Techniken zur Einschleusung von Molekülen in eine Zelle mit supprimierter Funktion co-stimulatorischer Rezeptoren transformiert werden oder die Expression co-stimulatorischer Rezeptoren durch Verhinderung von deren Expression oder die co-stimulatorischen Rezeptoren werden durch Reaktion mit affinen Strukturen an einer Stimulation von T-Zellen, die an die monoantigene antigen-präsentierende Zelle gebunden sind, gehindert.
Für die Unterdrückung der Co-Stimulation, die letztendlich ein Unterdrücken der Produktion eines oder mehrerer Proteine oder die Behinderung des Proteins oder der Proteine bedeutet, kommen verschiedene Strategien in Frage:
1. Antisense-Ansatz
2. Co-Suppression
3. Bindung des co-stimulatorischen Moleküls.
Zu 1. : In diesem Fall müssen Antisense-Nukleinsäuren in Kontakt mit der mRNA des co-stimulatorischen Moleküls kommen. Sie binden dann wahrscheinlich das Molekül und verhindern die Translation. Als Nukleinsäuren kommen eine große Bandbreite von Molekülen, wie RNAs, DNAs, PNAs, Ribozyme, in Frage. Auch hier würde ein gentechnischer Eingriff für die größte Halbwertszeit des Effekts sorgen.
Zu 2.: Es hat sich inzwischen herausgestellt, dass man die Produktion eines Genproduktes auch durch Integration einer möglichst homologen Sense- Gensequenz erreichen kann. Der Mechanismus ist noch völlig unbekannt. Zu 3. : Die Bindung des co-stimulatorischen Moleküls z.B. durch spezifische Antikörper verhindert, daß dieses Molekül Kontakt mit dem avisierten Rezeptor auf einer T-Zelle aufnimmt und verhindert so die Aktivierung der T-Zelle. Die externe Zugabe solcher Bindemoleküle hat den Nachteil, dass sie auf alle Antigen-präsentierenden Zellen wirken und damit jede Immunreaktion verhindern. Um Immunreaktionen spezifisch zu behindern, haben wir ein Modell entworfen, bei dem die co-stimulatorischen Moleküle bereits in der Zelle, in einem intrazellulären Kompartiment gebunden werden. In einer Erweiterung dieses Modells soll dafür gesorgt werden, dass das Bindemolekül im intrazellulären Kompartiment zurückgehalten wird, so dass der co-stimulatorische Rezeptor erst gar nicht zur Plasmamembran gelangt. Hierfür sind Signalsequenzen bekannt, die dem offenen Leseraster des Bindemoleküls zugefügt werden müssen. Dieser intrazelluläre Ansatz lässt sich gut an isolierten Zellen durchführen. Auch hier ist ein gentechnischer Eingriff zu bevorzugen.
Die gewünschten Effekte können auch erreicht werden, wenn nur eines der beiden Ziele mit einem gentechnischen Eingriff vorgenommen wird. In diesem Fall können statt der Gene z.B. folgende anderen Moleküle eingesetzt werden:
1. Behinderung der Co-Stimulation durch
Nukleinsäuren (zumeist komplementär zur Zielsequenz) bei denen es sich z.B. um Oligonukleotide, Polynukleotide, Ribozyme, Peptidnukleinsäuren (PNAs) handeln kann,
Antikörper oder andere Moleküle, die die co-stimulatorischen Moleküle binden.
2. Antigen Kontaktierung durch
Proteine, Peptide, Peptidomimetica. Es werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren insbesondere Moleküle wie Antikörper, Proteine, Peptide, Peptidomimetica, CTLA4, CD28, CD40L und/oder Bestandteile und/oder Kombinationen dieser Moleküle, die z.B. B7-1, B7-2, CD40 binden, welche eine in Gegenwart einer Antigenpräsentation stattfindende Co-Stimulation der T-Zelle behindert, mit der monoantigenen antigen- präsentierenden Zelle oder der antigen-präsentierenden Zelle in Kontakt gebracht.
Es kann vorteilhaft sein, die Moleküle mittels Vehikeln, wie Liposomen, Hydro- gele, Zyklodextrine, biologisch abbaubare Nanokapseln, bio-adhäsive Mikroku- geln und/oder durch Elektroporationstechniken, Iontophorese, ballistische Methoden und/oder andere Techniken zur Einschleusung von Molekülen in die monoantigene antigen-präsentierende Zelle oder die antigen-präsentierende Zelle zu transferieren.
Nukleinsäuren können insbesondere durch Viren, virale Vektoren, bakterielle Vektoren, Plasmide, die durch Elektroporationstechniken, Iontophorese, ballistische Methoden und/oder andere Techniken zur Einschleusung von Molekülen in die monoantigene antigen-präsentierende Zelle oder die antigen- präsentierende Zelle transferiert werden.
Erfindungsgemäß beansprucht wird ein Arzneimittel, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße monoantigene antigen-präsentierende Zelle. Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Arzneimittel als Infusionslösung zur intravenösen oder intraperitonealen Applikation formuliert. Die Formulierung ist so gewählt, dass bei Verabreichung des Arzneimittels keine wesentliche Beeinträchtigung der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen monoantigenen antigen- präsentierenden Zelle erfolgt.
So kommt als Infusionslösung vorzugsweise physiologische Kochsalzlösung in Betracht. Grundsätzlich sind auch andere Lösungen, die einen pH-Wert von 5,5 bis 8,5 aufweisen, geeignet. Auch Serum, beispielsweise humanes Serum, authologes Serum oder Serum anderer Species, Lösungen mit Plasmaersatzstoffen, wie Polyvinylpyrolidon, kommen in Betracht. Typischerweise sollen 0,5 ml bis 500 ml appliziert werden. Diese Mengen sind selbstverständlich nicht absolut, sondern können vom Fachmann, je nach Bedingungen und Anforderungen, variiert und an die spezifischen Bedürfnisse eines Patienten an- gepasst werden.
Die erfindungsgemäße monoantigene antigen-präsentierende Zelle kann insbesondere zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ungewollten Immunreaktionen, wie Autoimmunerkrankungen und Allergien oder gewollt hervorgerufenen Immunreaktionen, wie bei Immunisierungen verwendet werden.
Weiterhin kann die erfindungsgemäße monoantigene antigen-präsentierende Zelle zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Immunreaktionen gegen allologe und/oder xenologe Gewebsmerkmale verwendet werden.
Erfindungsgemäß beansprucht werden insbesondere Verwendungen, bei denen die zu behandelnden Immunreaktionen in Verbindung mit Antigenen oder deren Gensequenzen und/oder Teilen davon stehen und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
- Enzymen, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Glutamic acid decarboxylase (GAD), Rezeptor-Typ Protein Tyrosin
Phosphatase IA-2Beta, Antigen: H+K+ATPase, U1RNP, Transglutamina- se, Argininosuccinatlyase (ASL), Tyrosinase-related protein-2, Thyroid Peroxidase, Faktor VIII, Faktor IX;
- Rezeptoren, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Acetylcholinrezeptor vom Nicotintyp, ßl-adrenerger-Rezeptor, αl- adrenerger-Rezeptor, Angiotensin-2-ATl-Rezeptor, Glutamat-Rezeptor, Thyrotropin-stimulierendes Hormon (TSH)-Rezeptor, LFA-1, HLA-B27, Epididymal Protein DE, Zona Pellucida (ZP)-3 Glycoprotein, Zona Pelluci- da (ZP)-4 Glycoprotein, Follicle-Stimulating Hormone (FSH) Rezeptor, Sperm Immunogen SP-10 oder Sperm Protein SP-10;
- Hormone oder Botenstoffe, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Insulin, Thyroglobulin, Follicle-Stimulating Hormone (FSH), Prostaglandin F2 alpha, Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH), Oestradiol-17beta, Oestrogen, Luteinizing Hormon (LH) Rezeptor, Inhibin, Testosteron, Androgen, Chorionic Gonadotrophin (CG), Interleukine, Interferone, Cytokine, Chemokine, Bone Morphogenetic Factors, ß-Interferon, Estradiol;
- Strukturproteine, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Myelin Basic Protein (MBP), Proteolipid protein (PLP), Myelin oli- godendrocyte glycoprotein (MOG), α-Fodrin, Nicht-erythroides α- Spectrin, Beta-Amyloid Precursor Protein (beta-APP), Typ 2 Kollagen, Sperm Plasma Membran Protein PH-20;
- Antigene, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere CENP-A Autoantigen, Beta2GP-I, ribosomales P Protein, Ro/SSA, La/SSB, Sm/RNP, Sm, Scl-70, Jo-1, BCOADC-E2, Albumin, Glucagon, Inselzellantigene, Retinal S Ag;
- Allergene, die eine IgE-Antwort auslösen, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Der f 1, Der f 2, Der f 3, Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 8, Eur m 1, Lep d 2, Fei d 1, Can f 1, Can f 2, Mus m 1, Rat n 1, Bla g 1, Bla g 2, Bla g 4, Bla g 5, Per a 1, Bienengift Phospholipase A2 (PLA2), Group V major allergen Phl p 5b von Timothy Grass Pollen, Hom s 1.
Weiterhin wird erfindungsgemäß beansprucht eine Verwendung bei der die zu behandelnden Immunreaktionen in Verbindung mit allologen und/oder xenolo- gen Gewebsmerkmalen, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere MHC I, MHC II, Rhesus Faktor stehen. Entwicklung einer Gentherapie
Das hier vorgestellte Verfahren zur Reduzierung von Immunantworten z.B. zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen mit klar definiertem Autoantikörperprofil basiert auf der gentechnischen Manipulation von bestimmten Blutzellen vorzugsweise außerhalb des Körpers, die dann anschließend wieder in den Organismus zurückgeführt werden. Ziel dieser Behandlung ist unter anderem das spezifische Abschalten einer chronischen, durch das Immunsystem getriebenen Produktion von Autoantikörpern, welche die Krankheit auslösen.
Anwendungsgebiete der Gentherapie
Das Verfahren zur spezifischen Abschaltung von Immunreaktionen ist immer dort sinnvoll, wo ein oder mehrere molekular definierte Targets (Antigene, Autoantigene) bekannt sind. Diese können beispielsweise mit einer Autoimmunerkrankung oder Allergie assoziiert seien.
Z.B. handelt es sich dabei um Krankheiten mit Autoantikörper-vermittelten Autoimmunreaktionen, d.h. um Krankheiten, bei denen die "Bindungsstrukturen" dieser Autoantikörper (Autoantigene, Targets) bekannt sind und pathogenetische Bedeutung haben.
Beispiele für Krankheiten mit bekannten, die Autoantikörper-bindenden molekularen Strukturen (Epitope) sind:
• Myasthenia gravis (Autoantikörper gegen den Acetylcholinrezeptor)
• Morbus Basedow (Autoantikörper gegen den TSH-Rezeptor der Schilddrüse)
• Dilatative Cardiomyopathie (DCM, Autoantikörper gegen den ßl- adrenergen Rezeptor der Herzmuskelzellen) • bestimmte Formen des insulinabhängigen Diabetes (Autoantikörper gegen Insulin)
• bestimmte Formen des malignen Bluthochdrucks (Autoantikörper gegen den Angiotensin- und/oder αl-adrenerger-Rezeptor.
Behandlung mit genmanipulierten patienteneigenen Blutzellen: Prinzip der vorgeschlagenen Gentherapie
Innerhalb des Immunsystems spielen die Antikörper als Abwehrmoleküle ("humorale Immunreaktion") eine wichtige Rolle. Sie werden von ausgereiften B-Lymphozyten produziert. Die Induktion und Produktion der Antikörper erfolgt allerdings nicht losgelöst von den restlichen Zellen des Immunsystems; vielmehr wird diese humorale Immunreaktion von anderen Zellen des Immunsystems gesteuert. Die Immunreaktion lässt sich nicht aufrechterhalten ohne die Hilfe und Vermittlung von Antigen-präsentierenden Zellen und T-Helfer- Lymphozyten. Die molekularen Mechanismen der Interaktion - des Zell-Zell- Kontakts - von Antigen-präsentierenden Zellen mit den T-Helfer-Lymphozyten ist auf Rezeptorebene bis ins Detail bekannt.
Neben dem zu präsentierenden Antigen sind auf der Zelloberfläche verschiedene Rezeptoren und Hilfsrezeptoren am Zell-Zell-Kontakt und der Zellaktivierung beteiligt. Ein essentielles Molekül der interzellulären Wechselwirkung bei der Antigenpräsentation (Kontakt von Antigen-präsentierenden Zellen mit den T-Helfer-Lymphozyten) sind costimulierende Rezeptoren mit den Bezeichnungen B7-1 und B7-2. Auch CD40 spielt bei dieser Signaltransduktion eine Rolle.
Die Funktionen von B7 und CD40 sind Inhalt zahlreicher Publikationen (Daikh et al. 1997; Greenfield et al. 1998; Johnson-Leger et al. 1998; McAdam er al. 1998; Vyth-Dreese et al. 1995) und werden auch umfangreich in Lehrbüchern abgehandelt (s. z.B. Janeway and Travers 1997). Das konzipierte Verfahren beruht auf zwei parallelen Eingriffen an patienteneigenen Antigen-präsentierenden Zellen. Die Eingriffe erfolgen mittels geeigneter Sonden und bewirken
• die Abschaltung von B7 und damit die Verhinderung der Ausbildung des Moleküls auf der Oberfläche der Antigen-präsentierenden Zellen und/oder die Abschaltung von CD40 und
• gleichzeitig eine starke Präsentation des Autoantigens auf den Antigen- präsentierenden Zellen.
Sollte die Manipulation der Zellen, die z.B. Monozyten sind, in vitro erfolgen, werden die Zellen in die Blutbahn des Spenders zurückgegeben. Die genmanipulierten Monozyten schalten nunmehr die im Organismus befindlichen entsprechenden T-Helfer-Lymphozyten ab. Die genmanipulierten Zellen treten dabei unmittelbar in Konkurrenz zu den bereits im Organismus (vorzugsweise Blutbahn und Lymphsystem) vorhandenen Autoantigen-präsentierenden Monozyten, die allerdings B7 auf der Zelloberfläche tragen und normalerweise die T-Helfer-Lymphozyten und damit unter anderem die Antikörperproduktion aktivieren.
Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Allergien und Transplantationen: Stand der Technik
Kausaltherapien zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Allergien existieren nicht. Von wenigen Ausnahmen abgesehen (extrakorporale Elimination der Antikörper aus dem Blut der Patienten bzw. Plasmapherese), erfolgt die Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Allergien medikamentös durch eine Hemmung von Reaktionen des Immunsystems.
Nach wie vor am gebräuchlichsten ist die medikamentöse Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Allergien und Transplantationen mit immunsuppres- siven Präparaten wie Cortison und dessen Abkömmlingen, Cyclosporin, Beta- Interferon oder Zytostatika (Methothrexat). Desweiteren werden Antikörper, Antagonisten und Oligonukleotide gegen verschiedene Signalkomponenten des Immunsystems mit dem Zweck erprobt, die Aktivierung von T-Zellen zu verhindern. Solche Arzneimittel sind bestenfalls selektiv, nie aber spezifisch gegen die falsch programmierten Autoimmunreaktionen gerichtet. Immunsuppressiva haben daher auf wichtige, notwendige und nützliche Teile des Immunsystems eine negative Wirkung; aus diesem Grund und ihrer Nebenwirkungen wegen ist ihr Einsatz begrenzt.
Von den immunsuppressiven Therapien unterscheidet sich das vorgelegte Konzept einer Gentherapie zur Reduktion von spezifischen Immunreaktionen grundlegend. Es wird eine spezifische Abschaltung fehlgeleiteter immunologischer Reaktionen durch gentechnisch umprogrammierte patienteneigene Blutzellen durchgeführt.
Die aufgezeigte Methodik ist als allgemein gültiges Konzept zur Reduzierung von Immunantworten gedacht. Es sollte mit diesem Grundkonzept möglich sein jede Immunreaktion des anpassungsfähigen Immunsystems wieder abzustellen. Außerdem können nach belieben solche Immunreaktionen hervorgerufen und dann wieder abgestellt werden.
Somatische Gentherapie Grundlagen
Als Hilfsmittel für den Gentransfer werden hauptsächlich retrovirale (Hunt 1987; Porter 1996) oder adenovirus-assoziierte Vektoren eingesetzt (Bertran 1996), liposomen-vermittelter Gentransfer spielt nur eine untergeordnete Rolle.
Einteilung der Retroviren
Retroviren sind einzelsträngige, umhüllte RNA Viren. Die Familie der Retroviri- diae wird in drei Unterfamilien eingeteilt: Onkoviren, Lentiviren und Spumavi- ren (Fields 1996). Zu den Lentiviren gehören HIV-1 und HIV-2, zu den Spu- maviren das Simian Foamy Virus. Die Gruppe der Onkoviren wird in 5 Genera unterteilt (Tabelle 1).
Tab. 1: Einteilung der Onkoviren und ihre wichtigsten Vertreter bei Menschen und Tieren
Genus Mensch Tier B-Typ Viren HervK Familie Maus Mamma Tumor Virus
(MMTV)
C-Typ Viren Erv-3 Moloney Maus Leukämie Virus (Säuger) S71 Familie (MoMuLV)
Harvey Maus Sarkom Virus
(HaMSV) felines Leukämie Virus (FeLV)
Gibbon Ape Leukämie Virus
(GALV)
Affen Sarkom Virus (SSV)
ALV-related aviäres Leukose Virus (ALV) (C-Typ Viren) Rous Sarkom Virus (RSV)
Rous assoziertes Virus (RAV 1-
50)
D-Typ Viren Mason Pfitzer Affen Virus
HTLV/BLV humane T- Zeil LeukäRinder Leukämie Virus (BLV)
Gruppe mie Viren (HTLV1/HTLV2)
Genereller Aufbau der Retroviren
Elektronenmikroskopische Bilder zeigen, daß Retroviren umhüllte Partikel mit einer Grosse von etwa 100 nm sind. Das Capsid ist von einer Membran umgeben, in die nach außen weisende Hüllproteine (env) eingelagert sind. Innen ist die Membran mit einer Schicht von Matrixproteinen (MA) versehen. Im Innern des Partikels befindet sich das Nudeocapsid, welches aus Capsidproteinen (CA) aufgebaut ist. Matrixprotein und Capsidprotein gehören zu den sogenannten gruppenspezifischen Antigenen (gag). Innerhalb des Capsids befinden sich zwei Moleküle einzelsträngige RNA sowie die Enzyme Reverse
Transkriptase (RT), Integrase (IN) (durch die als pol bezeichneten Sequenzen kodiert) und
Protease (PR) (durch die als pro bezeichneten Sequenzen kodiert) (Fields
1996).
Das Genom der Retroviren besteht aus zwei identischen Einzelstrang-RNAs von 7 - 10 kb Länge.
Die RNA beginnt mit der m^GPPP Cap Struktur, die wichtig für die Translation der Strukturproteine ist, und endet mit der ca. 200 Basen langen Poly(A) Sequenz. Zwischen Cap Struktur und Poly(A) Sequenz findet man regulatorische Sequenzen, unter anderem den Spleißdonor, dann folgen die für die gag-, pro- und pol-Proteine kodierenden Sequenzen, der Spleißakzeptor und die kodierende Sequenz für das env Gen.
Die einfachen Retroviren, wie z.B. die C-Typ Viren, benötigen nur diese Proteine für ihren Lebenszyklus. Komplexere Viren,wie z.B. die Lentiviren, enthalten noch weitere Gene, entweder durch Verschiebung der Leserahmen oder durch weitere Sequenzen zwischen der env-Region und den 3 ' regulatorischen Sequenzen.
Maus Leukämie Viren
Das für den Gentransfer am häufigsten benutzte Virus, das amphotrope Maus Leukämie Virus (MuLV), gehört zur Klasse der C-Typ Viren. Murine Leukämie Viren werden anhand ihrer Rezeptornutzung und damit ihres Wirtsbereiches weiter unterteilt (Tab. 2). Tab.2 : Einteilung der murinen Leukämie Viren Klasse Wirtsbereich Rezeptor Funktion amphotrop alle Mammalia Pit-2 (ram- -i) PO43- Transporter ecotrop Maus mCat AS Transporter polytrop alle Mammalia ? ? xenotrop alle Mammalia au•? ? ßer Maus
MCF Maus 10A1 alle Mammalia Pit-1 (Glvr-1) und Pit-2 (ram-1)
Zellen, die mit den Viren einer Gruppe infiziert sind, können nicht von Viren derselben Klasse überinfiziert werden, da die zellulären Rezeptoren bereits von den env Proteinen dieses Virus besetzt sind. Dieses Phänomen wird Interferenz genannt. Die Zellen können jedoch mit Viren einer anderen Klasse infiziert werden.
Aufbau des MuLV -Genoms
Anschließend an die 5' Capping Region befindet sich die 5' R Region, gefolgt von der U5 Region, der Primer Binding Site (PBS), dem Leader, den Sequenzen für die viralen Proteine, dem Polypurintrakt, der U3 Region, der 3' R Region und der Poly A Sequenz.
Direkt an die Capping Struktur anschließend und vor dem Poly A Strang befinden sich jeweils die beiden identischen R Regionen. Sie sind ca. 60 Basenpaare lang und wichtig für die reverse Transkription.
Die am 5' Ende anschließende U5 Region ist die erste transkribierte Region bei der reversen Transkription und enthält wichtige Sequenzen für die Initiation der Transkription. Sie ist ca. 75 Basen lang und wird zum 3' Ende der 5' Long Terminal Repeats (LTR) des Provirus.
Die Primerbinding Site ist 18 Nucleotide lang. Hier wird ein Molekül tRNA als Primer gebunden.
Die Leader Sequenz ist ca. 475 Basen lang und enthält die Splice Donor Sequenzen. Außerdem ist das Verpackungssignal hier lokalisiert. Es bewirkt beim Zusammenbau der Virionen die Verpackung der genomischen RNA in die Virionen, während andere RNA nicht verpackt wird.
Daran schließen sich die Sequenzen für die gag, pro und pol Gene an, gefolgt vom Splice Akzeptor und den Sequenzen für die env Gene. An die env Sequenz schließt sich direkt vor der U3 Region der Polypurin Bereich an. Hier ist die Initiationsstelle für die Plus Strang Synthese lokalisiert. Die U3 Region ist ca. 500 Basen lang und wird der 51 Bereich der LTR im Provirus. Sie enthält alle für die Transkription der viralen Proteine erforderlichen Sequenzen, wie z. B. Bindungsstellen für verschiedene Transkriptionsfaktoren oder die TATA Box. Zellinien spezifische Regulation der Expression z. B. wird von der U3 Region codiert.
Die U3 Region wird von der 3' R Region gefolgt, sowie dem Polyadenylierungs Signal und der 200 Nucleotid langen Poly A Sequenz.
Aufbau der MuLVs
Die Matrix-, Capsid- und Nucleoproteine werden von zwei gemeinsamen Poly- protein-Vorlä ufern synthetisiert. Das Prl8θ9a9-po' enthäl neben den gag Proteinen auch die pol Domäne, das Pr65939 enthält nur die gag Proteine. Diese Vorläuferproteine werden von der viralen Protease (PR) sequentiell in die reifen Proteine gespalten: Matrixprotein (pl5), Capsidprotein (p30) und Nucle- oprotein (plO); Protease (pl4), Reverse Transcriptase (p80) und Integrase (p46).
Das Matrixprotein ist über aminoterminal angefügte Myristinsäurereste mit der Lipidmembran am engsten assoziert. Das Capsid oder Core ist aus dem hydrophoben Capsidprotein aufgebaut. Das kleine basische Nucleoprotein liegt innerhalb des Cores. Werden diese Proteine in eukaryontischen Zellen expri- miert, lagern sie sich dort in die Zytoplasmamembran und generieren nach Ausknospung fast normal aussehende Virionen. Die gag Proteine liegen im ersten Leserahmen des Virusgenom und werden in der Zelle in großen Mengen synthetisiert, da sie sowohl vom Prl809a9-Po1 als auch vom Pr659a9 generiert werden (Fields 1996).
Die folgenden pro und pol Gene, die für die enzymatischen Aktivitäten verantwortlich sind, liegen im nächsten Leserahmen und werden in geringeren Mengen hergestellt (nur vom Prl809ag-pol).
Die Protease ist verantwortlich für die Aufspaltung der gag und pol Polyprote- in-Vorläufer in die reifen Proteine.
Die reverse Transkriptase enthält die DNA Polymerase-Aktivität und eine RNa- se H-Aktivität, sie besitzt jedoch keine "proof reading" Aktivität. Reverse Transkriptase gehört zu den am stärksten konservierten Bereichen des Retro- virusgenoms. Man findet nicht nur Übereinstimmung innerhalb der Retrovirus Familie, sondern bestimmte Bereiche sind auch bei genetisch weit entfernten Viren, wie z.B. den Hepadnaviren (doppelsträngige DNA-Viren) und dem Blu- menkohl-Mosaic Virus zu finden.
Die Integrase ist das Enzym, das die provirale DNA in das Genom der Wirtszelle einfügt.
Die env Gene haben einen eigenen Leserahmen und werden über einen Spleißakzeptor transkribiert. Sie werden ebenfalls als Polyprotein-Vorläufer transkribiert (Pr80env), aber durch eine zelluläre Protease gespalten: Transmembran Region (pl5E) und externes Glykoprotein (gp70).
Das env Protein besteht aus zwei Polypeptidketten, die durch Disulfid -Brücken miteinander verbunden sind. Diese Ketten werden als gemeinsamer Vorläufer synthetisiert; der aminoterminale Teil ergibt die externe Polypeptidkette (SU), der carboxyterminale Teil die Transmembranregion (TM). Das SU Protein ist glykosyliert und für die Interaktion mit dem Rezeptor zuständig; das TM Protein ist nicht glykosyliert und sorgt für die Verankerung der Proteine in der Membran. Wahrscheinlich ist er auch für die Dimerisierung der env Moleküle verantwortlich. Da die Bindung zwischen dem SU und dem TM Protein nicht besonders fest ist, geht das SU Protein häufig "verloren". Dies bedingt unter anderem die mangelnde Stabilität infektiöser Viren während der Ultrazentrifugation und die große Anzahl an infektionsdefekten Partikeln.
Der retrovirale Lebenszyklus der MuLVs
Der Replikationszyklus des murinen Leukämie Virus entspricht dem allgemeinen Schema der Retroviren und unterteilt sich in folgende Schritte:
- Anheftung an den Rezeptor und Zelleintritt
- Reverse Transkription
- Kerntransport und Integration
- Synthese viraler RNA und Proteine
- Ausknospung und Reifung der Virionen
Anheftung an den Rezeptor und Zelleintritt
Die Infektion einer Zelle erfolgt durch die spezifische Anlagerung des Virus an seinen Rezeptor auf der Zelloberfläche und die anschließende Aufnahme des Virus in die Zelle. Nur Zellen, die diesen Rezeptor exprimieren, können infiziert werden.
Die Interaktion zwischen dem zellulären Rezeptor und dem externen viralen Hüllprotein (SU) bewirkt eine Konformationsänderung bei letzterem und ermöglicht die Fusion mit der Zellmembran durch die Transmembrandomäne des Virus. Die Aufnahme der Virionen erfolgt entweder durch pH abhängige Fusion (ecotropes Virus) oder durch Endozytose (amphotropes Virus).
Reverse Transkription
Im Cytoplasma der Zelle erfolgt das Uncoating der Viren; dadurch wird die virale RNA freigesetzt und die Reverse Transkriptase aktiviert. Das Capsid verbleibt jedoch in enger Assoziation mit der viralen RNA und ist notwendig für die korrekte Transkription der viralen RNA in DNA.
Ausgehend von dem tRNA Primer, der nahe dem 5'Ende an der Primerbin- dungssteile (PB) sitzt, wird zunächst der Minus-DNA-Strang synthetisiert. Es wird die 5' gelegene U5 und R-Region transkribiert (strong stop DNA), wobei gleichzeitig durch die RNAse H Aktivität der Reversen Transcriptase die RNA Matritze abgebaut wird. Die so freigewordene DNA "springt" an das 3' Ende der viralen RNA und es erfolgt eine Anlagerung der neu synthetisierten R- Region an die dort vorhandene R-Region. Ausgehend von dieser Matritze wird die restliche virale RNA in DNA transkribiert und bis auf den RNAse H resis- tenten Polypurin Bereich vor der U3 Region abgebaut. Dieser Bereich dient am bereits synthetisierten Minus-DNA-Strang als Matritze für die Synthese des Plus-DNA-Stranges, dessen 3' Ende als erstes transkribiert wird. Dann werden die verbleibenden RNA Reste abgebaut und die Primerbindungsstelle des Plus- Stranges kann an die Primerbindungsstelle des Minus-Stranges binden und die Synthese des Plus-Stranges kann vollständig ablaufen. Als letzter Schritt werden beide DNA Stränge vervollständigt. Die neu synthetisierte DNA enthält an beiden Seiten die Long Terminal Repeats (LTR).
Kerntransport und Integration
Die im Cytoplasma neu synthetisierte virale DNA wandert als Präintegrationskomplex in den Kern und lagert sich dort an die zelluläre DNA an. MuLV können nur sich teilende Zellen infizieren, da diese eine aufgelöste Zellmembran haben. Sie besitzen kein Kerntransportsignal oder Protein (wie z.B. HIV), daß den Kerntransport bewirken könnte. Der Präintegrationskomplex ist auch zu groß, um durch Kernporen zu diffundieren. Die virale DNA liegt in linearer Form vor. Die viruseigene Integrase spaltet die zelluläre DNA an einer beliebigen Stelle und erzeugt überhängende Enden von 6 Basenpaaren. Die 3' Enden der viralen DNA werden mit einem Strang der zellulären DNA ligiert; vorher werden jeweils 2 Basen an den 3' Enden der viralen DNA entfernt. Die fehlenden Sequenzen im zweiten Strang werden durch das zelleigene Reparatursystem aufgefüllt, wobei auch die beiden überzähligen Basen am 5' Ende der viralen DNA entfernt werden. Retrovirale Vektoren
Retroviren gehören zu den nicht lytischen Viren, haben ein einfaches Genom, sind gut charakterisiert, integrieren stabil in das Genom der infizierten Zelle und können dort dauerhaft das inserierte Gen exprimieren- alles Gründe, um sie für gentherapeutische Ansätze attraktiv zu machen.
Für die Transduktion von humanen Zellen werden Vektoren mit amphotropem env eingesetzt oder Pseudotypvektoren mit dem env anderer Viren. Es wird an der Entwicklung zelltypspezifischer Vektoren gearbeitet, entweder durch Wahl einer geeigneten LTR (Hunt 1987), eines besonderen Hüllproteins oder durch Einbringen von Antikörpern oder Rezeptoren in die Virushülle.
Aufbau
Retrovirale Vektoren werden auf der Basis von Retroviren hergestellt. Um die Bildung von replikationskompetenten Viren zu verhindern, werden die viralen Gene deletiert. Anstelle dieser wird zwischen die LTRs das zu exprimierende Gen mit den nötigen Regulationssequenzen kloniert und mit dem Verpackungssignal versehen. Die Verpackung der Vektoren erfolgt in speziellen Verpackungszellinien, die alle zur Verpackung nötigen Proteine bereitstellen. Die zu transferierende DNA wird durch die Verpackungskapazität der Virionen begrenzt. Retrovirale Vektoren können bis 9 kb Fremd DNA übertragen. Durch Wahl eines geeigneten LTR oder eines zusätzlichen Promotors wird versucht, eine möglichst hohe Expression des transferierten Gens in der gewünschten Zielzelle zu erhalten. Durch verschiedene Strategien können mehrere Gene von einem Vektor aus kodiert werden.
Verpackungszellen für retrovirale Vektoren
Da bei retroviralen Vektoren alle viralen Gene deletiert wurden, müssen die für die Replikation benötigten Proteine von geeigneten Verpackungszellen bereit gestellt werden.
Die zur Zeit benutzten Verpackungszellen enthalten ein Konstrukt, das für die gag pol Gene kodiert, und ein weiteres, das für die Hüllproteine kodiert (Danos 1988). Sie sind stabil in das Genom der Zellen integriert. Die Konstrukte ent- halten kein Verpackungssignal, so daß nur leere Virionen gebildet werden. Erst wenn Vektor DNA in den Zellen vorliegt, entstehen RNA haltige Viren. Die Benutzung von zwei verschiedenen Konstrukten zur Expression von gag, pol und env soll die Gefahr der Bildung von replikationskompetenten Viren vermindern. Es sind mindestens drei Rekombinationsereignisse erforderlich, bevor ein replikationskompetentes Virus (RCR) entstehen kann. Trotzdem müssen Verpackungszellen für klinische Anwendungen ständig auf RCRs überprüft werden.
Ausführunqsbeispiel
Methoden
Die grundsätzlichen Methoden der Molekularbiologie sind in "Current Protocols" (Fred M. Ausubel 1999; John E. Coligan 1999; Juan S. Bonifacino 1999) offenbart. Hierauf wird ausdrücklich Bezug genommen.
Zellkultur
Alle Zellinien wurden in Brutschränken bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert.
Isolation von Monozyten
Folgende Methoden wurden verwandt, um humane Blutmonozyten oder solche aus Mäusen aufzureinigen. Dem Fachmann sind noch weitere Methoden an sich bekannt.
Isolierung und Kultur peripherer Blutmonozyten
Medium 1: Dulbecco's PBS ohne (Ca und Mg)
Medium 2: RPMI 1640
10% fetales Kälberserum
Medium 3: RPMI 1640, serumfrei Periphere Blutmonozyten wurden aus buffy coats oder Mäuseblut vorzugsweise durch Dichtezentrifugation über ein Lymphozytentrennmedium und anschließende selektive Adhäsion isoliert.
Buffy coats, präpariert aus ca. 400 ml Zitratblut von gesunden Spendern, wurden von einer lokalen Blutspende erhalten. Frisch präparierte buffy coats wurden jeweils mit Medium 1 auf ca. 120 ml aufgefüllt. 30 bis 35 ml der Zellsuspension wurden in sterilen 50ml-Polypropylenröhrchen mit 15 ml Ficoll-Paque (d = 1,077 mg/ml) vorsichtig mit einer Spritze unterschichtet und bei 400 x g, 30 min, 24°C zentrifugiert. Die in der Interphase enthaltenen Lymphozyten/ Monozyten wurden zweimal bei 200 x g, 15 min, 20°C gewaschen. Dann wurden die Zellen mit einer Dichte von 5x lO^/ml bis 2 x 10^/ml in sterile, gelatinebeschichtete Zellkulturschalen in Medium 2 ausgesät. Nach zweistündiger Inkubation bei 37°C konnten nicht adhärente Zellen durch dreimaliges, gleichmäßiges Waschen mit Medium 3 entfernt werden. Die Monozyten wurden dann in Medium 2 bei 37°C, 5% CO2 kultiviert. Das Mäuseblut wurde in gleicher Weise behandelt.
Der Buffy coat bzw. das Mäuseblut wurde 1 :4 mit PBS ohne (Ca und Mg) verdünnt, 15 Minuten bei 100 g zentrifugiert. Der obere gelbliche Teil (Plasma) enthält hauptsächlich Thrombozyten. Er wird vorsichtig abgenommen und verworfen. Der Rest wird mit PBS ohne Ca & Mg auf ca. 120 ml verdünnt, die Lösung wird auf vier Falcontubes mit jeweils 15 ml Ficoll (d = 1,077 mg/ml) überschichtet. Dann wird 20 Minuten bei 700 g ohne Bremse zentrifugiert. Die Interphase (milchiger Ring) wird abgesaugt (Lymphozyten, Monozyten, Thrombozyten) und zweimal gewaschen. Das Pellet (Erythrozyten, Granulozy- ten) wird verworfen.
Die Monozyten werden dann durch Adherenz an gelatinierte Plastikgefäße isoliert, da die anderen Zelltypen beim waschen entfernt werden. Hierzu wurde die Interphase zwei Stunden in den gelatinierten Plastikgefäßen inkubiert. Virusproduktion
Für transiente Virusproduktion wurden die Zellen unter Verwendung der Ca- Pθ4~Methode transfiziert und die Überstände an drei aufeinanderfolgenden
Tagen abgesammelt.
Bei stabilen Producer Linien wurden die Zellen konfluent ausgesät und das Medium nach 6 h gewechselt. Nach 16 h wurden die Überstände abgesammelt und durch einen 0,8 μm Filter filtriert. Der Virusüberstand von amphotropoen Verpackungslinien wurde direkt eingesetzt.
Virusanreicherung
Zur Virusanreicherung wurden die Überstände der virusproduzierenden Zellen abgesammelt und durch einen 0,8 μm Filter filtriert. Anschließend wurden sie in ein Zentrifugationsröhrchen überführt und bei 100.000 g und 5°C 2 h ab- zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das pelletierte Virus in wenig DMEM-Medium mit 2 % BSA aufgenommen. Die konzentrierten Viren wurden entweder direkt in Teste eingesetzt oder bei -80°C eingefroren. Zur Optimierung wurde in Zentrifugationsröhrchen 5 ml einer 15% Sucroselö- sung vorgelegt und diese mit dem Zellkulturüberstand überschichtet. Dann wurde wie oben beschrieben zentrifugiert.
Für Westernblot-Analysen wurde der Überstand auf zwei Röhrchen aufgeteilt und zentrifugiert. Eines der Virus-Pellets wurde in Medium aufgenommen zur Titerbestimmung, das andere wurde in der gleichen Menge Virus-Lysepuffer aufgenommen und bis zur Verwendung bei -80°C eingefroren.
Virustiterbestimmung a.) GTU
Je 5x10*3 sc-1 Fibroblasten wurden in 1 ml Medium in die Well einer 24 Well Platte ausplattiert. Nach 4 Stunden Inkubation wurde das Medium entfernt, durch 1 ml einer Virusverdünnung (1:5 Verdünnungsschritte, dreifach Ansatz) ersetzt und weitere 16 h inkubiert. Die Expression der zusätzlichen genetischen Informationen wurde im FACS oder per RT-PCR quantifiziert. Es wurden die Klone der Verdünnungsstufe ausgezählt, die 1 - 6 Klone pro Well enthielt. b.)Verdünnung der infizierten Zellen
Je lxlO6 SC-1 Fibroblasten wurden in 3 ml in die Wells einer 6-Well Platte ausplattiert. Nach 4 Stunden Inkubation wurde das Medium entfernt, durch 2 ml einer Virusverdünnung ersetzt und weitere 16 h inkubiert. Die Zellen wurden trypsiniert und in Verdünnungen von 102, 3xl02 bis lxlO5 Zellen/Well in 4 ml Medium ausplattiert. Es wurden je zwei Well pro Verdünnung angesetzt. Die Expression der zusätzlichen genetischen Informationen wurde im FACS oder per RT-PCR quantifiziert. Es wurden die Klone der Verdünnungsstufe ausgezählt, die 1 - 6 Klone pro Well enthielt.
Die Klonierungseffizienz berechnete sich aus den Klonen der Klonie- rungskontrolle:
Der Virustiter berechnete sich aus den Klonen der einzelnen Virusverdünnung, der Verdünnungsstufe und der Klonierungseffizienz.
Zur Titerbestimmung wurden nur Verdünnungen verwendet, in denen die Anzahl der Klone linear mit den Verdünnungen anstieg.
Verwendete therapeutische Gene
Als Genfähre diente ein amphotropes, murines Leukämievirus. Die in den Versuchen verwendeten Gene bezwecken einerseits die Reduktion der an der Zelloberfläche erscheinenden B7- und/oder CD40-Moleküle und sollen zusätzlich für die Expression eines Antigens sorgen. Dazu werden zu Beginn CTLA4Ig zur Unterdrückung von B7 und/oder CD40-Antisense-cDNA und ein Antigen verwendet. Bei dem Antigen handelt es sich bei humanen Monozyten um das C-Fragment des Tetanustoxins. Bei den Mäusemonozyten um Ovalbumin. CTLA4Ig ist ein Fusionsprotein aus dem Fc-Teil eines Antikörpers und dem Teil von CTLA4, der an B7 bindet. Es ist gezeigt worden, daß dieses Molekül sehr effektiv beide B7 (1 und 2)- Moleküle bindet und auch neutralisieren kann (Linsley, et al.; Patent; 1993).
Da Menschen gegen Tetanus geimpft werden, kann in humanem Blut eine starke Reaktion gegen Fragmente des Tetanustoxins (z.B. das C-Fragment) auch ex vivo beobachtet werden. Dies wurde genutzt, um die ex vivo T- Zellproliferation zu beobachten.
Die Mäuse wiederum können gegen Ovalbumin geimpft werden. Danach kann die Reduktion der Immunantwort gegen Ovalbumin beobachtet werden. Als Promotor wurde der CMV-Promotor (Boshart er al. 1985; Nelson et al. 1987) verwendet. Die Gene waren durch IRES-Sequenzen transkriptional gekoppelt (Hildinger et al. 1999).
Transfektion der Monozyten
Hierfür wurde der Überstand der Verpackungszellinie verwendet. Mit diesem wurden die Monozyten inkubiert.
Ergebnisse mit humanen Monozyten, in vitro
Die Buffy Coats wurden vorweg auf ihre Reaktivität gegen Tetanustoxin getestet. Der Versuchsansatz enthält Tests, mit Monozyten und T-Lymphozyten. Die Monozyten wurden
1. nicht genetisch verändert;
2. mit einem Retrovirus behandelt, der keine therapeutischen Gene enthält;
3. mit einem Retrovirus behandelt, der mit der C-Fragment-Tetanustoxin- cDNA versehen ist;
4. mit einem Retrovirus behandelt, der mit der C-Fragment-Tetanustoxin- cDNA und der CTLA4Ig-cDNA versehen ist;
5. mit einem Retrovirus behandelt, der mit der C-Fragment-Tetanustoxin- cDNA und der CD40-Antisense-cDNA versehen ist;
6. mit einem Retrovirus behandelt, der mit der C-Fragment-Tetanustoxin- cDNA, der CD40-Antisense-cDNA und der CTLA4Ig-cDNA versehen ist.
Die Messungen wurden sieben Tage nach Beginn der Behandlungen durchgeführt. Der T-Zell-Proliferation-Assay wurde mit dem EZ4U-Kit (BIOMEDICA, Wien, Österreich) durchgeführt. Reaktion der T-Zellen in relativen Einheiten : zu 1. : 0 zu 2. : 0 zu 3. : -+-+ + zu 4. + zu 5. : ++ zu 6. : +
Diskussion
Der Versuch zeigt, daß die Gesamtheit der T-Zell-vermittelten Immunreaktionen gegen in diesem Falle Tetanustoxin vermindert werden kann, wenn die Monozyten nicht nur spezifisch antigene Determinaten des Tetanustoxins präsentieren, sondern zusätzlich die Bindung von B7- und/oder CD40-Molekülen an die entsprechenden Liganden verhindert wird. Hier sind sowohl Thl als auch Th2 T-Zell-Aktivierungen vermindert worden. Die Blockade von B7 ist dabei effizienter als die von CD40.
Ergebnisse an Tieren, in vivo
Der Versuchsansatz enthält Tests, mit Monozyten und T-Lymphozyten. Die Monozyten wurden
1. nicht genetisch verändert;
2. mit einem Retrovirus behandelt, der keine therapeutischen Gene enthält;
3. mit einem Retrovirus behandelt, der mit der Ovalbuminli-cDNA versehen ist;
4. mit einem Retrovirus behandelt, der mit der Ovalbuminli-cDNA und der CTLA4Ig-cDNA versehen ist;
5. mit einem Retrovirus behandelt, der mit der Ovalbuminli-cDNA und der CD40-Antisense-cDNA versehen ist;
6. mit einem Retrovirus behandelt, der mit der Ovalbuminli-cDNA, der CD40- Antisense-cDNA und der CTLA4Ig-cDNA versehen ist. Ovalbuminli bedeutet, daß das Ovalbumin mit einer Signalsequenz für das MHC II-Kompartiment versehen wurde, um seine Fragmente mit größerer Effizienz an MHC II präsentieren zu lassen.
Antikörperspiegel der gegen Ovalbumin geimpften Mäuse in relativen Einhei- ten :
Zeit in 0 1 4 8
Wochen zu 1. : +++++ + + +++ + + + + ■+ +++ + zu 2. : +++++ + + + + + + + + + + + + + + zu 3. + + +++ +++++ +++++++ ++ + + ++*+ + zu 4. : ++ + *+ + + + + + + + + + +*+ zu 5. : + + +++ + + + + + + + + + +++ zu 6. : ++ +++ ++*+*+*+ + + + ++
Diskussion
Der Versuch zeigt, dass die humorale Immunantwort gegen in diesem Falle Ovalbumin vermindert werden kann, wenn die Monozyten nicht nur spezifisch antigene Determinaten des Ovalbumins präsentieren, sondern zusätzlich die Bindung von B7- und/oder CD40-Molekülen an die entsprechenden Liganden verhindert wird. Wir haben hier vor allem Th2 T-Zell-Aktivierungen beobachtet. Die Blockade von B7 ist dabei effizienter als die von CD40. Es hat sich auch gezeigt, das die Verwendung der Signalsequenz der Invarianten Kette gut geeignet ist, um den gewünschten Effekt zu erhalten. In den beiden gezeigten Beispielen wurde das System an Menschen- und Mäuseblut getestet. Es zeigte sich, dass sowohl in vitro, als auch in vivo eine Unterdrückung spezifischer Immunantworten möglich ist.
Neben der erfindungsgemäß beschriebenen Transduktion von Antigen- präsentierenden Zellen sind dem Fachmann auch andere Möglichkeiten zur Transduktion, wie die Verwendung anderer Viren oder der nicht-virale Gentransfer an sich bekannt. Literatur
Daikh D., Wofsy D. and Imboden J. (1997) The CD28-B7 constimulatory pathway and its role in autoimmune disease. J Leukoc Biol 62, 165-62.
Greenfield E., Nguyen K. and Kuchroo V. (1998) CD28/B7 costimulation: a review. Crit Rev Immunol 18, 389-418
Janeway J.C.A. and Travers P. (1997) Immunobiology - The immune System in health and disease. Current Biology Ltd./Garland Publishing Inc., London, San Francisco and New York
Johnson-Leger C, Christensen J. and Klaus G. (1998) CD28 costimulation stabilizes the expression of the CD40 lingand on T cells. Int Immunol 10, 1083-91
McAdam A., Schweitzer A. and Sharpe A. (1998) The role of B7 costimulation in activation and differentiation of CD4+ and CD8+ T cells. Immunol Rev 165, 231-47
Steinman L. (1994) Autoimmunerkrankungen. Spektrum der Wissenschaften (Spezial: Das Immunsystem) 64-73.
Vyth-Dreese F., Deilemijn T., Majoor D. and de Jong D. (1995) Localizati- on in situ of the co-stimulatory molecules B7.1, B7.2, DC40 and their ligands in normal human lymphoid tissue. Eur J Immunol 25, 3023-9
Linsley Peter S; Ledbetter Jeffrey A; Damle Nitin K; Brady William
(Publication date: 1993-01-07 ) CTL4A RECEPTOR, FUSION PROTEINS CONTAINING IT AND USES THEREOF. Patent Number: WO9300431
Bertran J. Miller, J., Yang, Y., et al., . (1996) Recombinant adeno- associated virus-mediated high-efflciency, transient expression of the murine cationic amino acid transporter (ecotropic retroviral receptor) permits stable transduction of human HeLa cells by ecotroplc retroviral vectors. J-Virol. 70, 6759-66.
Boshart M., Weber F., Jahn G., Dorsch-Hasler K., Fleckenstein B. and Schaffner W. (1985) A very strong enhancer is located upstream of an im- mediate early gene of human cytomegalovirus. Cell 41, 521-30.
Danos O.a.M. R.C. (1988) Safe and efficient generation of recombinant retroviruses with amphotroplc and ecotroplc host ranges. Genetics 85, 6460- 6464.
Fields B.N. (1996) Fields Virology. Lippincot-Raven, Philadelphia
Fred M. Ausubel R.B. Robert E. Kingston, David D. Moore, J.G. Seid- man, John A. Smith, Kevin Struhl (1999) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York
Hildinger M., Schilz A., Eckert H.G., Bohn W., Fehse B., Zander A., Os- tertag W. and Baum C. (1999) Bicistronic retroviral vectors for combining myeloprotection with cell-surface marking. Gene Ther β, 1222-30.
Hunt N. Laker, C, Stocking, C, et al. (1987) Retroviral vectors for gene transfer into and gene expression in hematopoietic cells. In Advanced Research Workshop " Molecular and Cellular Aspects of Erythropoiesis", (Rieh I.N., eds) Berlin: Springer-Verlag, pp. 103-121.
John E. Coligan A.M.K. David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (1999) Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons, New York
Juan S. Bonifacino M.D. Jennifer Lippincott-Schwartz, Joe B. Harford, and Kenneth M. Yamada (1999) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley & Sons, New York Nelson J.A., Reynolds-Kohler C. and Smith B.A. (1987) Negative and positive regulation by a Short segment in the 5'-flanking region of the human cytomegalovirus major immediate-early gene. Mol Cell Biol 7, 4125-9.
Porter CD. Collins, M., Tailor, C, et al. (1996) Comparison of effldency of Infectlon of human gene therapy target cells via four different retroviral re- ceptors. Hum Gene Ther 7(), 913-9.

Claims

Patentansprüche
1. Antigen präsentierende Zelle, die überwiegend vorher bestimmte Antigene präsentiert (monoantigene antigen-präsentierende Zelle) dadurch gekennzeichnet, dass die monoantigene antigen-präsentierende Zelle teilungsfähig ist und eine der Funktionen co-stimulatorischer Rezeptoren der Zelle, wie ein B7- und/oder CD40-Rezeptor supprimiert ist.
2. Monoantigene antigen-präsentierende Zelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die monoantigene antigen-präsentierende Zelle ein Monozyt, eine dendritische Zelle und/oder ein Makrophage ist.
3. Monoantigene antigen-präsentierende Zelle nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass durch Transformation einer antigen- präsentierenden Zelle mit nukleinsäurehaltigem Material eine erhöhte Expression eines Antigens erfolgt und die antigen-präsentierende Zelle im wesentlichen nur eine Sorte eines Antigens präsentiert.
4. Monoantigene antigen-präsentierende Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die monoantigene antigen-präsentierende Zelle eine erhöhte Anzahl von Homing-Rezeptoren, wie CD44, aufweist.
5. Monoantigene antigen-präsentierende Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Transformation eine Suppression von Funktionen der B7-, CD40-Rezeptoren und/oder eine Erhöhung der Anzahl von Homing-Rezeptoren bewirkt.
6. Monoantigene antigen-präsentierende Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 enthaltend Antisense-Nukleinsäuren zur Verhinderung der B7- und/oder CD40-Rezeptor Expression.
7. Monoantigene antigen-präsentierende Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 enthaltend Nukleinsäuren, die eine Unterdrückung der Expression der B7- und/oder CD40-Rezeptoren durch Co-Suppression bewirken.
8. Monoantigene antigen-präsentierende Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 enthaltend Nukleinsäuren, die eine Expression von mit B7- und/oder CD40-Rezeptoren affinen Strukturen aufweisenden Proteinen oder Peptiden bewirken.
9. Monoantigene antigen-präsentierende Zelle nach Anspruch 8, wobei die Proteine, die affine Strukturen zu B7-Rezeptoren aufweisen CTLA4, CD28, Antikörper, F(ab)2/ scFv und/oder Fab-Fragmente sind.
10. Monoantigene antigen-präsentierende Zelle nach Anspruch 8 und/oder 9, wobei die Nukleinsäuren für eine Signalsequenz kodieren oder die Expressionsprodukte eine Signalsequenz besitzen, die den Verbleib der Expressionsprodukte im endoplasmatischen Retikulum, dem Golgi-Apparat, dem Trans-Golgi-Netzwerk oder intrazellulären Vesikeln bewirkt.
11. Monoantigene antigen-präsentierende Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die monoantigene antigen-präsentierende Zelle zur Expression von Antigenen mit Nukleinsäuren transformiert ist, die den Transport der exprimierten Antigene in MHC II-Kompartimente der Zellen ermöglicht.
12. Monoantigene antigen-präsentierende Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren DNA, RNA, Oligonukleotide, Polynukleotide, Ribozyme, Peptidnuklein- säuren (PNA) sind.
13. Monoantigene antigen-präsentierende Zelle nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA Regulationselemente wie Enhancer, Promotoren, polyA-kodierende 3λ-Enden zur Transkription der DNA in RNA enthält, die RNA Regulationselemente zur Translation der RNA in Protein enthält.
14. Verfahren zur Herstellung der monoantigenen antigen-präsentierenden Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13 durch ex vivo oder in vivo Verfahren.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei eine antigen-präsentierende Zelle ex vivo oder in vivo durch Behandlung mit Viren, viralen Vektoren, bakteriellen Vektoren, Plasmiden, die durch viralen Gentransfer, Elektroporationstechniken, Iontophorese, ballistischen Methoden und/oder anderen Techniken zur Einschleusung von Molekülen in eine monoantigene antigen-präsentierende Zelle transformiert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14 und/oder 15, wobei eine antigen- präsentierende Zelle oder eine monoantigene antigen-präsentierende Zelle durch Behandlung mit Viren, viralen Vektoren, bakteriellen Vektoren, Plasmiden die durch viralen Gentransfer, Elektroporationstechniken, Iontophorese, ballistischen Methoden und/oder anderen Techniken zur Einschleusung von Molekülen in eine Zelle mit supprimierter Funktion co- stimulatorischer Rezeptoren transformiert, die Expression co- stimulatorischer Rezeptoren durch Verhinderung deren Expression oder die co-stimulatorischen Rezeptoren durch Reaktion mit affinen Strukturen an einer Stimulation von T-Zellen, die an die monoantigene antigen- präsentierende Zelle gebunden sind, verhindert wird.
17. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei Moleküle wie Antikörper, Proteine, Peptide, Peptidomimetica, CTLA4, CD28, CD40L und/oder Bestandteile und/oder Kombinationen dieser Moleküle, die z.B. B7-1, B7-2, CD40 binden, welche eine in Gegenwart einer Antigenpräsentation stattfindende Co-Stimulation der T-Zelle behindert, mit der monoantigenen antigen-präsentierenden Zelle oder der antigen- präsentierenden Zelle in Kontakt gebracht werden.
18. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die Moleküle gemäß Anspruch 17 durch Vehikel, wie Liposomen, Hydrogele, Zyklodextrine, biologisch abbaubare Nanokapseln, bio-adhäsive Mikro- kugeln und/oder durch Elektroporationstechniken, Iontophorese, ballistische Methoden und/oder andere Techniken zur Einschleusung von Molekülen in die monoantigene antigen-präsentierende Zelle oder die antigen-präsentierende Zelle transferiert werden.
19. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei Nukleinsäuren durch Viren, virale Vektoren, bakterielle Vektoren, Plasmide die durch viralen Gentransfer, Elektroporationstechniken, Iontophorese, ballistische Methoden und/oder andere Techniken zur Einschleusung von Molekülen in die antigen-präsentierende Zelle oder die antigen- präsentierende Zelle transferiert werden.
20. Arzneimittel enthaltend mindestens eine monoantigene antigen- präsentierende Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bisl3.
21. Arzneimittel nach Anspruch 20, wobei mindestens eine monoantigene antigen-präsentierende Zelle als Infusionslösung zur intravenösen oder intraperitonealen Applikation formuliert ist.
22. Verwendung mindestens einer monoantigenen antigen-präsentierenden Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ungewollten Immunreaktionen, wie Autoimmunerkrankungen und Allergien oder gewollt hervorgerufenen Immunreaktionen, wie bei Immunisierungen.
23. Verwendung mindestens einer monoantigenen antigen-präsentierenden Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Immunreaktionen gegen allologe und/oder xenologe Gewebsmerkmale.
24. Verwendung nach Anspruch 22, wobei die zu behandelnden Immunreaktionen in Verbindung mit Antigenen oder deren Gensequenzen und/oder Teilen davon stehen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
- Enzymen, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Glutamic acid decarboxylase (GAD), Rezeptor-Typ Protein Tyrosin
Phosphatase IA-2Beta, H + K+ATPase, U1RNP, Transglutaminase, Argini- nosuccinatelyase (ASL), Tyrosinase-related protein-2, Thyroid Peroxida- se, Faktor VIII, Faktor IX;
- Rezeptoren, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Acetylcholinrezeptor vom Nicotintyp, Myasthenia gravis, ßl-adrenerger Rezeptor, αl-adrenerger-Rezeptor, Angiotensin-2-ATl-Rezeptor, Gluta- mat-Rezeptor, Thyrotropin-stimulierendes Hormon (TSH)-Rezeptor, LFA- 1, HLA-B27, Epididymal Protein DE, Zona Pellucida (ZP)-3 Glycoprotein, Zona Pellucida (ZP)-4 Glycoprotein, Follicle-Stimulating Hormone (FSH) Rezeptor, Sperm Immunogen SP-10 oder Sperm Protein SP-10;
- Hormone oder Botenstoffe, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Insulin, Thyroglobulin, Follicle-Stimulating Hormone (FSH), Prostaglandin F2 alpha, Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH), Oestradiol-17beta, Oestrogen, Luteinizing Hormon (LH) Rezeptor, Inhibin, Testosteron, Androgen, Chorionic Gonadotrophin (CG), In- terleukine, Interferone, Cytokine, Chemokine, Bone Morphogenetic Fac- tors, ß-Interferon, Estradiol; - Strukturproteine, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Myelin Basic Protein (MBP), Proteolipid protein (PLP), Myelin oli- godendrocyte glycoprotein (MOG), α-Fodrin, Nicht-erythroides α- Spectrin, Beta-Amyloid Precursor Protein (beta-APP), Typ 2 Kollagen, Sperm Plasma Membran Protein PH-20;
- Antigene, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere CENP- A Autoantigen, Beta2GP-I, ribosomales P Protein, Ro/SSA, La/SSB, Sm/RNP, Sm, Scl-70, Jo-1, BCOADC-E2, Albumin, Glucagon, In- selzellantigene, Retinal S Ag;
- Allergene, die eine IgE-Antwort auslösen, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Der f 1, Der f 2, Der f 3, Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 8, Eur m 1, Lep d 2, Fei d 1, Can f 1, Can f 2, Mus m 1, Rat n 1, Bla g 1, Bla g 2, Bla g 4, Bla g 5, Per a 1, Bienengift Phospholipase A2 (PLA2), Group V major allergen Phl p 5b von Timothy Grass Pollen, Hom s 1.
25. Verwendung nach Anspruch 23, wobei die zu behandelnden Immunreaktionen in Verbindung mit allologen und/oder xenologen Gewebsmerkmalen, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere MHC I, MHC II, Rhesus Faktor steht.
PCT/EP2000/003984 1999-05-04 2000-05-04 Verfahren zur reduzierung von spezifischen immunreaktionen WO2000066715A1 (de)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU52112/00A AU5211200A (en) 1999-05-04 2000-05-04 Method for diminishing specific immune reactions
JP2000615740A JP2002542819A (ja) 1999-05-04 2000-05-04 特異的免疫反応の低減方法
DE50013230T DE50013230D1 (de) 1999-05-04 2000-05-04 Verfahren zur reduzierung von spezifischen immunreaktionen
CA002373016A CA2373016A1 (en) 1999-05-04 2000-05-04 Method for diminishing specific immune reactions
EP00936709A EP1173550B1 (de) 1999-05-04 2000-05-04 Verfahren zur reduzierung von spezifischen immunreaktionen

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19920412 1999-05-04
DE19920412.8 1999-05-04
DE19944858.2 1999-09-18
EP99118518.2 1999-09-18
EP99118518A EP1085085A1 (de) 1999-09-18 1999-09-18 Verfahren zur Reduzierung von spezifischen Immunreaktionen
DE19944858A DE19944858A1 (de) 1999-09-18 1999-09-18 Verfahren zur Reduzierung von spezifischen Immunreaktionen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2000066715A1 true WO2000066715A1 (de) 2000-11-09

Family

ID=27219128

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2000/003984 WO2000066715A1 (de) 1999-05-04 2000-05-04 Verfahren zur reduzierung von spezifischen immunreaktionen

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP1173550B1 (de)
JP (1) JP2002542819A (de)
AT (1) ATE334193T1 (de)
AU (1) AU5211200A (de)
CA (1) CA2373016A1 (de)
DE (1) DE50013230D1 (de)
WO (1) WO2000066715A1 (de)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002012453A1 (de) * 2000-08-09 2002-02-14 Genethor Gmbh Verfahren zur reduzierung von spezifischen immunreaktionen
WO2002077208A1 (de) * 2001-03-27 2002-10-03 Genethor Gmbh Antigen-abhängige reduktion von spezifischen immunreaktionen durch beeinflussung der co-stimulation
WO2002092795A2 (de) * 2001-05-16 2002-11-21 Genethor Gmbh Intrazelluläre bindung costimulatorischer moleküle
WO2003006636A1 (de) * 2001-07-12 2003-01-23 Genethor Gmbh Reduktion der stimulationsfähigkeit von antigen präsentierenden zellen
US6858210B1 (en) 1998-06-09 2005-02-22 La Jolla Pharmaceutical Co. Therapeutic and diagnostic domain 1 β2GPI polypeptides and methods of using same
EP2000531A1 (de) * 2007-06-06 2008-12-10 Biomay AG Antigenpräsentierende Zellen

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005244851B2 (en) 2004-05-12 2010-08-26 Baxter Healthcare S.A. Oligonucleotide-containing microspheres, their use for the manufacture of a medicament for treating diabetes type 1
ES2313350T3 (es) 2004-05-12 2009-03-01 Baxter International Inc. Microesferas de acido nucleico, produccion y suministro de las mismas.
AU2007281737B2 (en) 2006-08-04 2013-09-19 Baxter Healthcare S.A. Microsphere-based composition for preventing and/or reversing new-onset autoimmune diabetes
EP2146691A2 (de) 2007-04-17 2010-01-27 Baxter International Inc. Nukleinsäure-mikroteilchen zur abgabe in den lungen

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998029124A1 (en) * 1996-12-31 1998-07-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of b7 protein
WO1999025812A1 (en) * 1997-11-14 1999-05-27 Hemosol Inc. Method for the production and use of dendritic cells
WO1999050394A1 (en) * 1998-03-30 1999-10-07 I.D.M. Immuno-Designed Molecules Suppressive monocyte derived cells, process for their preparation and their uses in pharmaceutical compositions

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998029124A1 (en) * 1996-12-31 1998-07-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of b7 protein
WO1999025812A1 (en) * 1997-11-14 1999-05-27 Hemosol Inc. Method for the production and use of dendritic cells
WO1999050394A1 (en) * 1998-03-30 1999-10-07 I.D.M. Immuno-Designed Molecules Suppressive monocyte derived cells, process for their preparation and their uses in pharmaceutical compositions

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BONE MARROW TRANSPLANTATION, vol. 9, no. 2, 1992, pages 123 - 127, ISSN: 0268-3369 *
DATABASE BIOSIS [online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; 1992, SHIOTA Y ET AL: "INDUCTION OF UP-MODULATION OF HOMING RECEPTORS IN CLONED HEMOPOIETIC PROGENITORS BY GROWTH FACTORS", XP002142748, Database accession no. PREV199293119387 *
F. FU ET AL.: "COSTIMULATORY MOLECULE-DEFICIENT DENDRITIC CELL PROGENITORS (MHC CLASS II+, CD80dim, CD86-) PROLONG CARDIAC ALLOGRAFT SURVIVAL IN NONIMMUNOSUPPRESSED RECIPIENTS.", TRANSPLANTATION, vol. 62, no. 5, 15 September 1996 (1996-09-15), BALTIMORE, US, pages 659 - 665, XP000929113 *
L. LU ET AL.: "TRANSDUCTION OF DENDRITIC CELLS WITH ADENOVIRAL VECTORS ENCODING CTLA4-Ig MARKEDLY REDUCES THEIR ALLOSTIMULATORY ACTIVITY.", TRANSPLANTATION PROCEEDINGS, vol. 31, no. 1/2, March 1999 (1999-03-01), NEW YORK, N.Y., US, pages 797, XP000915484 *
R.W. O'ROURKE ET AL.: "A DENDRITIC CELL LINE GENETICALLY MODIFIED TO EXPRESS CTLA4-Ig AS A MEANS TO PROLONG ISLET ALLOGRAFT SURVIVAL.", TRANSPLANTATION, vol. 69, no. 7, 15 April 2000 (2000-04-15), BALTIMORE, US, pages 1440 - 1446, XP000915486 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6858210B1 (en) 1998-06-09 2005-02-22 La Jolla Pharmaceutical Co. Therapeutic and diagnostic domain 1 β2GPI polypeptides and methods of using same
WO2002012453A1 (de) * 2000-08-09 2002-02-14 Genethor Gmbh Verfahren zur reduzierung von spezifischen immunreaktionen
WO2002077208A1 (de) * 2001-03-27 2002-10-03 Genethor Gmbh Antigen-abhängige reduktion von spezifischen immunreaktionen durch beeinflussung der co-stimulation
WO2002092795A2 (de) * 2001-05-16 2002-11-21 Genethor Gmbh Intrazelluläre bindung costimulatorischer moleküle
WO2002092795A3 (de) * 2001-05-16 2003-01-09 Genethor Gmbh Intrazelluläre bindung costimulatorischer moleküle
WO2003006636A1 (de) * 2001-07-12 2003-01-23 Genethor Gmbh Reduktion der stimulationsfähigkeit von antigen präsentierenden zellen
EP2000531A1 (de) * 2007-06-06 2008-12-10 Biomay AG Antigenpräsentierende Zellen
WO2008148831A2 (en) * 2007-06-06 2008-12-11 Biomay Ag Antigen presenting cells
WO2008148831A3 (en) * 2007-06-06 2009-03-05 Biomay Ag Antigen presenting cells
JP2010528639A (ja) * 2007-06-06 2010-08-26 ビオマイ アクチエンゲゼルシャフト 抗原提示細胞

Also Published As

Publication number Publication date
DE50013230D1 (de) 2006-09-07
ATE334193T1 (de) 2006-08-15
JP2002542819A (ja) 2002-12-17
AU5211200A (en) 2000-11-17
CA2373016A1 (en) 2000-11-09
EP1173550A1 (de) 2002-01-23
EP1173550B1 (de) 2006-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69910362T2 (de) Anwendung der mesenchymalen stammzellen als immunsuppressiva
DE69836643T2 (de) Zusammensetzungen für die zufuhr von genen an antigen-präsentierende zellen der haut
EP0881906B1 (de) Pharmazeutische zusammensetzung für die immunmodulation beruhend auf peptiden und adjuvantien
DE60011761T2 (de) Arpe-19 als plattform zellinie zur verabreichung eingekapselter zellen
EP2370101B1 (de) Verwendung von flt3-ligand zur verstärkung von immunreaktionen bei rna-immunisierung
DE69923840T2 (de) Transfer von mRNAs unter Verwendung von polykationischen Verbindungen
DE69332921T2 (de) Hemmung des Tumorzellwachstums durch Verabreichung von B7-transfizierten Zellen
AT506041A1 (de) Verfahren zur erhöhung der immunreaktivität
EP1173550B1 (de) Verfahren zur reduzierung von spezifischen immunreaktionen
EP0777499B1 (de) Lebendvakzine zur behandlung von tumorerkrankungen
EP0859628B9 (de) Medikament, insbesondere zur modulation der immunantwort bei der bekämpfung von viren, tumoren, bakterien und parasiten
DE102020111571A1 (de) Wpre-mutantenkonstrukte, zusammensetzungen und zugehörige verfahren
DE69610295T3 (de) Von einem retroviralen regulationsprotein abstammende, detoxifierte immunogene, dagegen gerichtete antikörper, verfahren zur deren herstellung und diese immunogene oder antikörper enthaltende, pharmazeutische zusammensetzungen.
US8309070B2 (en) Use of umbilical cord blood stem cells to treat ischemic event
DE60038555T2 (de) Verpackungszelle
EP1308167A1 (de) Antigenpräsentierende Vesikel
DE69627644T2 (de) Vektoren, die therapeutische gene fuer antimikrobielle peptide enthalten, zur verwendung in der gentherapie
DE69633919T2 (de) Mehrzweckvakzine gegen umhüllte viren
Rother et al. Complement in inflammation: induction of nephritides and progress to chronicity
DE10038722C2 (de) Verfahren zur Reduzierung von spezifischen Immunreaktionen
WO2003006636A1 (de) Reduktion der stimulationsfähigkeit von antigen präsentierenden zellen
WO2002077208A1 (de) Antigen-abhängige reduktion von spezifischen immunreaktionen durch beeinflussung der co-stimulation
EP1179587A1 (de) Verfahren zur Reduzierung von spezifischen Immunreaktionen
WO2002092792A2 (de) Antigen-abhängige reduktion von spezifischen immunreaktionen durch beeinflussung der co-stimulation
DE102020106710A1 (de) Wpre-mutantenkonstrukte, zusammensetzungen und zugehörige verfahren

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2000936709

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2373016

Country of ref document: CA

Ref country code: CA

Ref document number: 2373016

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 2000 615740

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2000936709

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09959750

Country of ref document: US

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 2000936709

Country of ref document: EP