WO2002012453A1 - Verfahren zur reduzierung von spezifischen immunreaktionen - Google Patents

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WO2002012453A1
WO2002012453A1 PCT/EP2001/009161 EP0109161W WO0212453A1 WO 2002012453 A1 WO2002012453 A1 WO 2002012453A1 EP 0109161 W EP0109161 W EP 0109161W WO 0212453 A1 WO0212453 A1 WO 0212453A1
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presenting cell
antigen
monoantigenic
ctla4
monoantigenic antigen
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PCT/EP2001/009161
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Ahmed Sheriff
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Genethor Gmbh
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to antigen-presenting cells (APC), processes for producing antigen-presenting cells, medicaments containing antigen-presenting cells and use of the antigen-presenting cells.
  • APC antigen-presenting cells
  • Different allergens cause different symptoms, among other things, because they come into contact with the immune system in different parts of the body.
  • the misguided immune response causes sneezing and a stuffy nose.
  • the bronchi in the lower airways can narrow and become mucous, so that typical asthmatic symptoms appear.
  • immune activities in the tissues of the gastrointestinal tract cause nausea, abdominal cramps, diarrhea or vomiting.
  • an allergen that gets into the blood in some way can trigger anaphylaxis: an allergic reaction in regions of the body that are far from its point of entry. Severe anaphylactic shocks can upset all normal bodily functions and can be fatal.
  • the allergic reactions are expressed differently, they are always set in motion by the same mechanism: sensitization.
  • One-time contact with an allergen typically a protein, can suffice for this.
  • the allergenic substance meets so-called phagocytes or macrophages. These gobble up the foreign substance, dismember it and present the fragments on the cell surface with MHC II molecules.
  • some T-helper lymphocytes recognize the fragments presented and bind to them.
  • the T helper lymphocytes are activated by the macrophages and then in turn activate some B lymphocytes, which also recognize the allergen.
  • the B cells then mature into plasma cells that produce antibodies. First, these are antibodies of the so-called IgM type; from a certain point in time, however, the plasma cells switch to IgE antibodies.
  • IgE antibodies With their Fc region, they attach themselves to IgE receptors of two different classes of immune system cells.
  • mast cells which are usually found in the body tissues near blood vessels and epithelial cells. There is contact with the outside world via the epithelium (this also includes the epithelium of the respiratory tract and gastrointestinal tract).
  • IgE antibodies also bind to basophilic granulocytes (basophils). However, these cells circulate in the bloodstream. Once production of the IgEs begins, it apparently lasts for months, sometimes even years. As a result, they constantly occupy IgE receptors on mast cells and basophils - ready to take immediate action the next time they come into contact with allergens.
  • the second exposure initiates a stage of the hypersensitivity reaction, which also appears externally.
  • the allergy-causing substance binds to the IgEs of the mast cells within seconds of contact with human tissue. If it attaches to two or more IgE molecules at the same time, it forms a bridge between them. Such cross-links bring the affected IgE receptors closer together, and this activates the cell so that it releases highly effective substances that directly produce allergic symptoms. (The release can also be caused in other ways; allergic reactions are only spoken if IgEs are involved). The most important of these substances is histamine.
  • the second group of mediators consists mainly of prostaglandins and leukotrienes. They are only released after the allergen molecules have attached to the IgEs on the cells. Like histamine, they narrow the bronchi and dilate the blood vessels. However, their effects last longer.
  • stimulated mast cells emit a variety of potentially toxic enzymes. They also appear to release cytokines that regulate the activities of other immune cells.
  • Antihistamines are usually effective and still serve as standard therapy. The latest variants can no longer easily cross the blood-brain barrier and no longer make the patient tired. If antihistamines are ineffective in severe inflammation, inhalable corticosteroids, which are usually prescribed to relieve chronic inflammation in asthma, often help.
  • Bronchodilators are the most widely used drugs for asthma. They relieve those caused by histamine and other bronchoconstrictors
  • Another new strategy is the use of humanized monoclonal anti-IgE antibodies against the Fc ⁇ RI binding region for IgE. This prevents the binding of IgE to the IgE receptor, so that no mediators of the allergic reaction from mast cells or basophils can be released.
  • This strategy has shown in clinical studies in patients with allergic rhinitis and allergic asthma that these antibodies are well tolerated and reduce the allergic reactions. (see also LM Lichtenstein: "Allergy and immune system”; in the spectrum of science special: The immune system; 1994; 74-83; SK Huang, KY Chua and KH Hsieh: allergen gene transfer. Current Opinion in Immunology 1997; 800-804; C. Heusser and P. Jardieu: Therapeutic potential of anti-IgE 5 antibodies. Current Opinion in Immunology 1997; 805-814).
  • Tissue transplantation to replace diseased organs is an important medical therapy today.
  • an adaptive immune system response to the graft poses the greatest threat to successful treatment.
  • Adaptive immune system reactions are induced by antigen-presenting cells by activation of T helper lymphocytes.
  • the ABO and Rh blood group antigens When transfusing 5 blood, which is the first and most commonly used graft, the ABO and Rh blood group antigens must be matched to avoid the rapid destruction of inappropriate erythrocytes.
  • the very polymorphic main histocompatibility complexes (MHC) have to be matched to one another, since these almost always trigger the immune reaction. Unfortunately, perfect matching of the MHCs is almost impossible except for relatives.
  • Autoimmune diseases are chronic diseases. They include rheumatism in various clinical forms, diabetes, multiple sclerosis, certain forms of heart muscle inflammation and thyroid diseases. The series of autoimmune diseases could be continued as desired, although approximately 90% epidemiologically only make up a small percentage.
  • autoimmune diseases are antibody-mediated.
  • immunology this means that the organism produces antibodies for mostly unknown reasons, which are directed against the body's own cellular structures (autoantigens). Once these antibodies have been formed, their interaction and binding to the respective organ or cell-specific structures trigger a cell and tissue-destroying reaction of the immune system. Ultimately, this leads to the clinical picture of the disease (Steinman 1994).
  • WO-A-9533770 discloses a method and reagent for inducing apoptosis in T cells, inducing tolerance in grafts and reversing immune responses. Thereby the possibility of apoptosis initiation of T cells by CTLA4 ligands.
  • the ligands are applied as proteins, such as antibodies.
  • Antigen-presenting cells are not used for this purpose or are genetically modified.
  • This patent application also describes that CTLA4 ligands induce apoptosis.
  • the problem on which the invention is based consists, inter alia, in making available genetic engineering, therapeutically usable products for the reduction of specific immune reactions in which targets (antigens, autoantigens) and antibodies, autoantibodies are known.
  • the antigen-presenting cell which predominantly presents certain antigens beforehand (monoantigenic antigen-presenting cell) and is characterized in that, in the monoantigenic antigen-presenting cell, CTLA4-binding molecules are preferably produced and possibly one of the functions co-stimulatory receptors, such as a B7 and / or CD40 receptor is suppressed.
  • FIG. 1 shows a scheme for the function of gene manipulation at the cellular level:
  • FIG. 2 shows a "normal" immune response to antibody formation, antigen-presenting monocytes as inducers of antibody production.
  • Monocytes take up molecules recognized as foreign, disassemble them and bring the fragments of MHC II molecules to the cell surface (antigen presentation).
  • B7 a surface molecule (B7) is expressed that can bind to both CD28 and CTLA4.
  • the antigen presented is recognized by T helper lymphocytes, which in turn stimulate B cells to produce antibodies.
  • CTLA4 (CD152) is an analogue of CD28, also binds B7, but induces apoptosis of the T cell.
  • CTLA4 occurs mainly in intracellular vesicles and is only released after activation of the cells.
  • FIG. 3 shows schematically the function of gene manipulation on the molecular level: activation of CTLA4 by a CTLA4-binding molecule on the plasma membrane of the monocyte.
  • CTLA4 is bound by a ligand (antibody against CTLA4), which is located on the plasma membrane of the monocyte (antigen-presenting cell), and inactivates the T cell.
  • the effect can be increased if B7 is additionally suppressed in the antigen-presenting cell, so that only CTLA4 is bound to the T cell.
  • Figure 4 (I) shows the function of gene manipulation at the molecular level: the autoantigen is synthesized by the CTLA4-gand-producing antigen-presenting cells.
  • Figure 4 (II) shows a comparison of the antigen presentation of "normal” (1) and genetically modified monocytes (2) (see also Figure 4 (I)). Autoantigen quantities are shown schematically, which are presented at the MHC II. Figure 4 (II) (1) shows that normal monocytes rarely present the autoantigen. If so, only a few MHC II will present it. Figure 4 (II) (2) shows that genetically manipulated monocytes almost exclusively present the autoantigen.
  • Figure 5 demonstrates the function of the genetically modified monocytes in the body.
  • the monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention is preferably a monocyte, a dendritic cell and / or a macrophage.
  • the APCs are the switching points of the adaptable immune system. Only they can trigger a T cell-mediated immune response. This is shown in the following figures using the example of monocytes and the antibody production triggered by T helper cells:
  • the antibodies normally play an important role as specific defense molecules ("humoral immune response"). They are produced by mature B lymphocytes. However, the induction and production of soluble antibodies is not independent of the remaining cells in the immune system; rather, this humoral immune response is controlled by other cells in the immune system.
  • the antigen is e.g. a bacterial protein
  • the immune response is useful for the organism.
  • the antigen is an endogenous structure, one speaks of a (pathological) autoimmune reaction.
  • the monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention has an increased expression of an antigen, preferably by transfection of an antigen-presenting cell with nucleic acid-containing material, the antigen-presenting cell essentially presenting only predefined antigens.
  • the gene therapy method according to the invention is based on parallel genetic engineering interventions on the patient's own blood monocytes.
  • the interventions are carried out by means of suitable probes and bring about the production of CTLA4-binding molecules, preferably antibodies, and possibly the reduction of B7 molecules by hindering or preventing the formation of the molecule on the surface of the monocytes (FIG. 3) and at the same time making a strong presentation of autoantigen (Figure 4).
  • pathological autoantibodies is specifically ended by the manipulation of monocytes and the resulting shutdown of antigen-specific T cells.
  • T cells produce two receptors that recognize B7 (1 or 2).
  • One receptor is CD28, the other is CTLA4.
  • CD28 has a stimulating effect, while CTLA4 does not.
  • the contact of CTLA4 with B7 switches off the respective T cell. This then either goes into apoptosis via programmed cell death, is switched off, or is converted into a tolerance-producing T cell. In this case, the tolerance is generated against the specific antigen recognized by this T cell.
  • CTLA4 For binding to CTLA4 instead of CD28, molecules such as antibodies are used which bind to CTLA4 but not to CD28. These can then induce the T cell response promoted by CTLA4.
  • CTLA4 binding molecules can preferably be antibodies.
  • the co-receptor B7 without which the antigen presentation or the induction cascade for antibody production does not start, can also be suppressed in order to suppress preferential binding of CD28.
  • the co-receptor is two different co-receptors called CD80 (B7-1) and CD86 (B7-2). Their structures are known.
  • the cells After the in vitro manipulation of the monocytes, the cells are returned to the patient's bloodstream.
  • the genetically modified monocytes now switch off the pathological T helper lymphocytes in the organism.
  • the genetically modified cells compete directly with the autoantigen-presenting monocytes already present in the organism (preferably bloodstream and lymphatic system), which however carry B7 on the cell surface and normally activate the T helper lymphocytes and thus the antibody production (FIG. 5). ,
  • the cDNA of a protein that causes the production of pathological autoantibodies as an autoantigen is integrated into the monocyte genome. This Genetic information then serves to overproduce autoantigen. Peptides of this autoantigen are then preferably presented on MHC II and / or MHC I [see also FIG. 4 (11)]. MHC II presents the peptides to the T helper cells and tries to find those that specifically recognize these presented peptides. If a CTLA4-binding molecule simultaneously activates CTLA4 instead of CD28 and the co-receptor B7 may not appear on the cell surface at the same time, the T helper cells are shut down and may suffer premature cell death.
  • All genetically modified monocytes present the autoantigen on most of their MHC II complexes, while in vivo only very few "normal” monocytes present the autoantigen and then only on a few MHC II complexes.
  • the aim of the treatment is to displace the "normal" monocytes which present the autoantigen and activate the T helper cells in vivo by the genetically modified monocytes which have been programmed to switch off the antibody production or T cell response.
  • the monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention can in particular show an increased number of homing receptors, such as CD44. Overexpression of homing receptors will show the monoantigenic antigen-presenting cell the way to the lymph nodes, which means that the genetically modified APCs will accumulate more quickly in lymph nodes.
  • the lymph nodes are where most of the responses of the adaptive immune system are triggered. There, the genetically modified APCs have a much greater effect than outside the lymph nodes.
  • transfection causes an increase in the number of homing receptors and / or a suppression of functions of the B7, CD40 receptors and an increase in the number of CTLA4-binding molecules.
  • the CTLA4 binding molecules can preferably be antibodies, monoclonal antibodies. These can be such that they remain in the plasma membrane of the cell.
  • the B7 and / or CD40 receptor expression in the monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention can be prevented or reduced.
  • the expression of the B7 and / or CD40 receptors can be suppressed by nucleic acids by co-suppression in the monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention.
  • the monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention can contain or be transfected with nucleic acids which bring about an expression of proteins or peptides which have structures affine with B7 and / or CD40 receptors. This forms proteins that practically neutralize these receptors by forming complexes with B7 and / or CD40 receptors.
  • CTLA4, CD28, antibodies, F (ab) 2 / scFv and / or F ab fragments can be considered as proteins.
  • the monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention contains nucleic acids which code for a signal sequence or expression products of a signal sequence which causes the expression products to remain in the endoplasmic reticulum, the Golgi apparatus, the Trans-Golgi network or intracellular vesicles.
  • the monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention is transfected with nucleic acids for the expression of antigens, which enable the transport of the expressed antigens into MHC II compartments of the cells.
  • All genetically modified monocytes present the autoantigen on most of their MHC complexes, while very few "normal” monocytes present the autoantigen at all and then only on a few MHC complexes.
  • the aim of the treatment is to displace the "normal" monocytes that present the autoantigen and activate the T helper cells by means of the genetically manipulated monocytes programmed to switch off the antibody products. It is very important to also administer the antigen (s) in a form that allows them to be transported into the MHC II endosomes.
  • the corresponding nucleic acids can be DNA, RNA, oligonucleotides, polynucleotides, ribozymes, peptide nucleic acids (PNA).
  • PNA peptide nucleic acids
  • the DNA preferably has regulatory elements such as enhancers, promoters, polyA-coding 3 "ends for transcribing the DNA into RNA, the RNA regulatory elements for translating the RNA into protein.
  • the regulatory elements ensure efficient expression of the genes.
  • the monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention is produced, for example, by ex vivo or in vivo methods.
  • An antigen-presenting cell is preferably ex vivo or in vivo by treatment with viruses, viral vectors, bacterial vectors, plasmids by electroporation techniques, iontophoresis, ballistic methods and / or other techniques for introducing molecules into a monoantigenic antigen-presenting cell transfected.
  • an antigen-presenting cell or a monoantigenic antigen-presenting cell can be treated by treatment with viruses, viral vectors, bacterial vectors, plasmids, by electroporation techniques, iontophoresis, ballistic methods and / or other techniques for introducing molecules into a cell transformed with increased amount of CTLA4 binding molecules and possibly suppressed function of co-stimulatory receptors or the expression of co-stimulatory receptors by preventing their expression or the co-stimulatory receptors are reacted with affine structures to stimulate T cells which bound to the monoantigenic antigen presenting cell.
  • Re 1 In this case, antisense nucleic acids must come into contact with the mRNA of the co-stimulatory molecule. You will then likely bind the molecule and prevent translation. A wide range of molecules, such as RNAs, DNAs, PNAs, ribozymes, are suitable as nucleic acids. Here, too, a genetic engineering intervention would ensure the longest half-life of the effect.
  • Re 2. It has now been found that the production of a gene product can also be achieved by integrating a homologous sense gene sequence. The mechanism is still completely unknown.
  • Re 3 The binding of the co-stimulatory molecule e.g. by specific antibodies prevents this molecule from contacting the intended receptor on a T cell and thus prevents activation of the T cell.
  • the external addition of such binding molecules has the disadvantage that they act on all antigen-presenting cells and thus prevent any immune reaction.
  • Nucleic acids (mostly complementary to the target sequence), which are e.g. B. oligonucleotides, polynucleotides, ribozymes, peptide nucleic acids
  • PNAs can act Antibodies or other molecules that bind the co-stimulatory molecules.
  • Proteins, peptides, peptidomimetics Proteins, peptides, peptidomimetics.
  • molecules such as antibodies, proteins, peptides, peptidomimetics, CTLA4, CD28, CD40L and / or constituents and / or combinations of these molecules, which e.g. B7-1, B7-2, CD40 bind, which prevents co-stimulation of the T cell taking place in the presence of an antigen presentation, brought into contact with the monoantigenic antigen presenting cell or the antigen presenting cell.
  • molecules such as liposomes, hydrogels, cyclodextrins, nanocapsules, nanoparticles, in particular biodegradable nanocapsules or particles, bio-adhesive microspheres and / or electroporation techniques, iontophoresis, ballistic methods and / or other techniques to introduce the molecules of molecules to transfer into the monoantigenic antigen-presenting cell or the antigen-presenting cell.
  • Nucleic acids can be transferred in particular by viruses, viral vectors, bacterial vectors, plasmids, which are transferred into the monoantigenic antigen-presenting cell or the antigen-presenting cell by electroporation techniques, iontophoresis, ballistic methods and / or other techniques for the introduction of molecules.
  • a medicament containing at least one monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention is further claimed.
  • the medicament according to the invention is preferably in the form of an infusion solution formulated for intravenous or intraperitoneal application.
  • the formulation is chosen such that when the medicament is administered, there is no significant impairment of the effectiveness of the monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention.
  • physiological saline is preferred as the infusion solution.
  • other solutions with a pH of 5.5 to 8.5 are also suitable.
  • Serum for example human serum, autologous serum or serum of other species, solutions with plasma substitutes, such as polyvinylpyrrolidone, are also suitable.
  • plasma substitutes such as polyvinylpyrrolidone
  • 0.5 ml to 500 ml should be applied.
  • the monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention can be used in particular for the production of a medicament for the treatment of unwanted immune reactions, such as autoimmune diseases and allergies or deliberately induced immune reactions, such as in immunizations.
  • the monoantigenic antigen-presenting cell according to the invention can be used to produce a medicament for the treatment of immune reactions against allologic and / or xenologic tissue characteristics.
  • immune reactions to be treated are related to antigens or their gene sequences and / or parts thereof and are selected from the group consisting of
  • Enzymes their gene sequences and / or partial sequences, in particular glutamic acid decarboxylase (GAD), receptor type protein tyro- sin phosphatase IA-2Beta, antigen: H + K + ATPase, U1RNP, transglutaminase, argininosuccinate lyase (ASL), tyrosinase-related protein-2, thyroid peroxidase, factor VIII, factor IX;
  • GAD glutamic acid decarboxylase
  • IA-2Beta receptor type protein tyro- sin phosphatase IA-2Beta
  • antigen H + K + ATPase
  • U1RNP transglutaminase
  • ASL argininosuccinate lyase
  • tyrosinase-related protein-2 thyroid peroxidase
  • factor VIII factor IX
  • Receptors their gene sequences and / or partial sequences, in particular acetylcholine receptor of the nicotine type, ⁇ 1-adrenergic receptor, ⁇ l-adrenergic receptor, angiotensin-2-ATl receptor, glutamate receptor, thyrotropin-stimulating hormone (TSH) receptor, LFA receptor 1, HLA-B27, Epididymal Protein DE, Zona Pellucida (ZP) -3 Glycoprotein, Zona Pellucida (ZP) -4 Glycoprotein, Follicle-
  • FSH Stimulating Hormone
  • Hormones or messenger substances their gene sequences and / or partial sequences, in particular insulin, thyroglobulin, follicle-stimulating hormones (FSH), prostaglandin F2 alpha, gonadotropin-releasing hormones (GnRH), oestradiol-17beta, estrogen, luteinizing hormone (LH) receptor, inhibin , Testosterone, androgen, chorionic gonodrophin (CG), interieukins, interferons, cytokines, chemokines, bone morphogenetic factors, ß-interferon, estradiol;
  • Structural proteins their gene sequences and / or partial sequences, in particular myelin basic protein (MBP), proteolipid protein (PLP), myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), ⁇ -fodrin, non-erythroid ⁇ -spectrin, beta-amyloid precursor protein (beta-APP ), Type 2 collagen, sperm plasma membrane protein PH-20;
  • MBP myelin basic protein
  • PGP proteolipid protein
  • MOG myelin oligodendrocyte glycoprotein
  • ⁇ -fodrin non-erythroid ⁇ -spectrin
  • beta-amyloid precursor protein beta-amyloid precursor protein
  • Type 2 collagen sperm plasma membrane protein PH-20;
  • Antigens their gene sequences and / or partial sequences, in particular CENP-A autoantigen, Beta2GP-I, ribosomal P protein, Ro / SSA, La / SSB, Sm / RNP, Sm, Scl-70, Jo-1, BCOADC-E2, albumin , Glucagon, islet cell antigens, Retinal S Ag; Allergens that trigger an IgE response, their gene sequences and / or partial sequences, in particular Der f 1, Der f 2, Der f 3, Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 8, Eur m 1, Lep d 2, Fei d 1, Can f 1, Can f 2, Mus m 1, Rat n 1, Bla g 1, Bla g 2, Bla g 4, Bla g 5, Per a 1 , Bee venom phospholipase A 2 (PLA 2 ), Group V major allergen Phl p 5b by Timothy Grass Pollen, Hom
  • the invention claims a use in which the immune reactions to be treated are associated with allologic and / or xenologic tissue characteristics, their gene sequences and / or partial sequences, in particular MHC I, MHC II, rhesus factor.
  • the method presented here for reducing immune responses is based on the genetic manipulation of certain blood cells, preferably outside the body, which are then subsequently returned to the organism.
  • the aim of this treatment is, among other things, the specific switching off of a chronic, immune system-driven production of autoantibodies that trigger the disease.
  • DCM Dilated cardiomyopathy
  • the antibodies play an important role as defense molecules ("humoral immune response"). They are produced by mature B lymphocytes. However, the induction and production of the antibodies is not detached from the remaining cells of the immune system; rather, this humoral immune response is controlled by other cells in the immune system. The immune response cannot be maintained without the help and mediation of antigen presenting cells and T helper lymphocytes.
  • the molecular mechanisms of the interaction - the cell-cell contact - of antigen-presenting cells with the T-helper lymphocytes is known in detail at the receptor level.
  • antigen presentation In addition to the antigen to be presented, various receptors and auxiliary receptors are involved in cell-cell contact and cell activation on the cell surface.
  • An essential molecule of the intercellular interaction in antigen presentation contact of antigen presenting cells with the T helper lymphocytes
  • costimulatory receptors with the designations B7-1 and B7-2.
  • CD40 also plays a role in this signal transduction.
  • CTLA4, B7 and CD40 are the subject of numerous publications (Daikh et al., 1997; Greenfield et al., 1998; Johnson-Leger et al., 1998; McAdam et al., 1998; Vyth-Dreese et al., 1995) and are also dealt with extensively in textbooks (eg (Janeway and Travers, 1997)).
  • the designed method is based on at least two parallel interventions on the patient's own antigen-presenting cells.
  • the interventions are carried out using suitable probes and have an effect •
  • the cells are returned to the donor's bloodstream.
  • the genetically manipulated monocytes now switch off the corresponding T helper lymphocytes in the organism.
  • the genetically manipulated cells compete directly with the autoantigen-presenting monocytes already present in the organism (preferably bloodstream and lymphatic system), which however carry B7 and no additional CTLA4-binding molecule on the cell surface and normally the T helper lymphocytes and thus, among others activate antibody production.
  • autoimmune diseases and allergies are treated with medication by inhibiting immune system reactions.
  • immunosuppressive drugs such as cortisone and its derivatives, as well as cyclosporin, beta-interferon or cytostatics (methothrexate).
  • antibodies, antagonists and oligonucleotides against various signal components of the immune system are tested with the purpose of activating
  • Immunosuppressants therefore have a negative effect on important, necessary and useful parts of the immune system; for this reason and their side effects, their use is limited.
  • the methodology shown is intended as a generally applicable concept for reducing immune responses. With this basic concept it should be possible to stop any immune reaction of the adaptable immune system. In addition, such immune reactions can be triggered at will and then switched off again.
  • T cells were then counted and stained with carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE).
  • CFSE carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
  • T cell: antigen-presenting cell 1: 1 in a final volume of 500 ⁇ l (2 ⁇ 10 5 C3H T cells and the same number of T cells deposed BALB / c splenic lymphocytes) the corresponding antibody concentrations (0.01 ⁇ g / ml for the primary antibody and 0.01-1 ⁇ g / ml for the cross-linking secondary antibody) taken in culture for 7 days. After this culture phase, the cells were removed quantitatively from the culture vessels and stained against CD4 and CD8 simultaneously with two different fluorescent dyes.
  • FIG. 7 shows the effect of crosslinked anti-mouse CTLA-4 antibodies on the proliferation of CD4 + T cells.
  • FIG. 8 shows the effect of cross-linked isotype Kohtroll antibodies on the proliferation of CD8 + T cells.
  • FIG. 9 shows the effect of crosslinked anti-mouse CTLA-4 antibodies on the proliferation of CD8 + T cells.
  • the anti-mouse CTLA-4 antibody shows a clear reduction in the proliferation of the CD4 positive and CD8 positive T cells by about 75% in each case.
  • CTLA4 Cytotoxic T lymphocyte antigen 4
  • CTLA-4 ligation suppresses CD28-induced NF-kappaB and AP-1 activity in mouse T cell blasts [published erratum appears in J Biol Chem 1999 Jul 23; 274 (30): 21490]. J Biol Chem. 274: 14400-14405.
  • Complementarity determining region 1 (CDR1) - and CDR3- analogous regions in CTLA-4 and CD28 determine the binding to B7-1. J Exp Med. 180: 2049-2058.

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Abstract

Die Erfindung beruht auf einer Reduktion von spezifischen Immunreaktionen. Bei dem Verfahren werden Antigen-produzierende Zellen zur Präsentation von definierten Antigenen veranlasst unter gleichzeitiger Produktion eines CTLA4 bindenden Moleküls.

Description

VERFAHREN ZUR REDUZIERUNG VOJSPEZIFISCHEN IMMUNREAKTIONEN
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Antigen-präsentierende Zellen (APC), Verfahren zur Herstellung Antigen präsentierender Zellen, Arzneimittel enthaltend Antigen-präsentierende Zellen sowie Verwendung der Antigen präsentierenden Zellen.
Beschreibung
Seit knapp 10 Jahren werden für verschiedene Krankheiten und in Tiermodellen gentherapeutische Verfahren entwickelt und angewendet. Bisher sind sie noch nicht in die Routine überführt. Meist handelt es sich dabei um die Behandlung von genetisch bedingten, schweren Erkrankungen, für die andere Therapien nicht zur Verfügung stehen. Weiterhin werden Gentherapien zur Behandlung von schweren und ebenfalls nicht therapierbaren Krebserkrankungen eingesetzt.
Wenig Aufmerksamkeit hat die experimentelle Medizin bisher der Behandlung von Allergien und Autoimmunerkrankungen mittels gentechnischer Methoden geschenkt.
Allgemeines zu Allergien
Allergien verursachen beträchtliche Kosten im Gesundheitswesen der Industrieländer. Immerhin sind schätzungsweise mindestens 20% der Bevölkerung gegen irgendeine Substanz allergisch. Die meisten Betroffenen leiden an allergischer Rhinitis, zu der insbesondere der Heuschnupfen zählt, oder an Bronchialasthma: Sie niesen oder ringen nach Luft, nachdem sie bestimmte Pollen oder andere im allgemeinen harmlose Substanzen eingeatmet haben. Viele Kinder und einige Erwachsene reagieien auch allergisch auf Nahrungsmittel. Andere erleiden Hautausschläge oder sogar einen allergischen Schock, nachdem sie Medikamente wie Penizillin erhalten haben. Bei wieder anderen rufen Bienenstiche starke lokale Schwellungen oder schwere systemische - den gesamten Organismus erfassende - Störungen hervor. Im Extremfall können allergische Anfälle sogar zum Tod führen. Allein die unmittelbare medizinische Versorgung von Asthmapatienten hat in den USA 1990 schätzungsweise 3,6 Milliarden Dollar verschlungen und damit rund ein Prozent aller Kosten im Gesundheitswesen ausgemacht.
Mittlerweile ist bekannt, dass einige der zellulären und molekularen Wechselwirkungen bei allergischen Reaktionen oft ähnlich ablaufen, unabhängig davon, auf welche Substanzen der einzelne anspricht und welche Symptome er entwickelt. Gewisse Begleiterscheinungen der Allergien treten normalerweise ausschließlich auf, wenn das Immunsystem Parasiten bekämpft. So reagiert der Körper auf Schmarotzer ebenso wie auf Allergene mit der massiven Produktion von Molekülen, die als Immunglobulin-E- Antikörper (IgE) bezeichnet werden. Die Produktion dieser Antikörper wird durch T-Helfer-Zellen induziert, die wiederum von antigen-präsentierenden Zellen aktiviert werden.
Sensibilisierunq
Unterschiedliche Allergene rufen unter anderem deswegen verschiedenartige Symptome hervor, weil sie mit dem Immunsystem in verschiedenen Körperregionen in Berührung kommen. In den oberen Luftwegen erzeugt die fehlgeleitete Immunreaktion Niesen und eine verstopfte Nase. In den unteren Luftwegen können dagegen die Bronchien sich verengen und verschleimen, so dass typische asthmatische Symptome auftreten. Entsprechend rufen Immunaktivitäten in den Geweben des Magen-Darm-Traktes Übelkeit, Bauchkrämpfe, Durchfall oder Erbrechen hervor. Schließlich vermag ein Allergen, das auf irgendeinem Weg ins Blut gelangt, eine Anaphylaxe auszulösen: eine allergische Reaktion in weit von seiner Eintrittsstelle entfernten Körperregionen. Schwere anaphylaktische Schocks können alle normalen Körperfunktionen durcheinanderbringen und tödlich enden.
Auch wenn sich die allergischen Reaktionen unterschiedlich Äußern, werden sie doch stets durch den gleichen Mechanismus in Gang gesetzt: die Sensibilisie- rung. Dazu kann bereits der einmalige Kontakt mit einem Allergen, typischerweise einem Eiweißstoff, genügen. In den Luftwegen oder anderen Geweben trifft die allergieauslösende Substanz auf sogenannte Fresszellen oder Makrophagen. Diese verschlingen den Fremdstoff, zerstückeln ihn und präsentieren die Fragmente auf der Zelloberfläche mit MHC II-Molekülen. Im weiteren Verlauf erkennen einige T-Helfer-Lymphozyten die dargebotenen Bruchstücke und binden daran. Die T-Helfer-Lymphozyten werden von den Makrophagen aktiviert und aktivieren dann ihrerseits einige B-Lymphozyten, die gleichfalls das Allergen erkennen. Die B-Zellen reifen dann zu Antikörper produzierenden Plasmazellen aus. Zunächst sind dies Antikörper vom sogenannten IgM-Typ; ab einem bestimmten Zeitpunkt schalten die Plasmazellen jedoch auf IgE-Antikörper um.
Bis die Antikörper hergestellt sind, können Tage oder Wochen vergehen, und das Allergen, welches ihre Produktion in Gang gesetzt hat, ist dann womöglich schon lange verschwunden. Nicht so die IgE-Moleküle. Mit ihrer Fc-Region heften sie sich an IgE-Rezeptoren zweier unterschiedlicher Klassen von Immunsystemzellen. Bei der einen handelt es sich um Mastzellen, die sich im Körpergewebe für gewöhnlich in der Nähe von Blutgefäßen und Epithelzellen ansiedeln. Über das Epithel besteht Kontakt mit der Außenwelt (darunter fällt auch das Epithel der Atemwege und des Magen-Darm-Traktes). IgE-Antikörper binden außerdem an basophile Granulozyten (Basophile). Diese Zellen zirkulieren allerdings im Blutstrom. Hat die Produktion der IgEs einmal begonnen, hält sie offenbar Monate, ja manchmal sogar Jahre an. Folglich besetzen sie unablässig IgE-Rezeptoren auf Mastzellen und Basophilen - bereit, beim nächsten Allergenkontakt augenblicklich in Aktion zu treten.
Akute Symptome
Während also die erste Begegnung mit einem Allergen selbst bei Personen, die sich später als Allergiker entpuppen, keine Symptome hervorruft, leitet die Zweitexposition ein Stadium der Überempfindlichkeitsreaktion ein, welches auch äußerlich in Erscheinung tritt. Innerhalb von Sekunden nach dem Kontakt mit menschlichem Gewebe bindet der allergieauslösende Stoff an die IgEs der Mastzellen. Heftet er sich dabei an zwei oder mehr IgE-Moleküle zugleich, bildet er eine Brücke zwischen ihnen. Solche Quervernetzungen lassen die betroffenen IgE-Rezeptoren dichter zusammenrücken, und dies aktiviert die Zelle, so dass sie hochwirksame Substanzen ausschüttet, die auf direktem Wege allergische Symptome erzeugen. (Die Freisetzung kann auch auf andere Arten hervorgerufen werden; von allergischen Reaktionen spricht man nur, wenn IgEs beteiligt sind). Die wichtigste dieser Substanzen ist Histamin. Es kann sowohl die Schleimbildung in den Epithelien anregen und so zur Verstopfung der Luftwege beitragen als auch die glatte Muskulatur, die wie ein elastisches Band Bronchien und Därme umschlingt, kontrahieren lassen. Ferner vermag es die feinen Blutgefäße zu weiten und durchlässiger zu machen, so dass Flüssigkeit ins Gewebe sickern kann. Rötungen und Schwellungen sind die Folge. Betreffen diese Gefäßveränderungen große Teile des Körpers, können sie ein tödliches Kreislaufversagen auslösen: Bei einem solchen Schock fällt der Blutdruck jäh so stark ab, dass die Sauerstoffversor- gung von Herz und Gehirn nicht mehr gewährleistet ist. Die zweite Gruppe von Mediatoren besteht hauptsächlich aus Prostaglandinen und Leukotrienen. Sie werden erst ausgeschüttet, nachdem die Allergenmole- küle sich an die IgEs auf den Zellen angelagert haben. Wie Histamin verengen sie die Bronchien und erweitern die Blutgefäße. Ihre Wirkung hält allerdings länger an.
Zusätzlich stoßen stimulierte Mastzellen eine Vielzahl potentiell toxischer Enzyme aus. Offenbar setzen sie ferner Cytokine frei, die die Aktivitäten anderer Immunzellen regulieren.
Behandlung: 1. Die allergische Rhinitis
Antihistaminika erweisen sich in der Regel als wirksam und dienen immer noch als Standardtherapie. Die neuesten Varianten können die Blut-Hirn-Schranke nicht mehr ohne weiteres passieren und machen die Patienten nicht mehr müde. Wenn bei einer schweren Entzündung Antihistaminika wirkungslos bleiben, helfen oft inhalierbare Corticosteroide, die gewöhnlich zur Linderung der chronischen Entzündung bei Asthma verschrieben werden.
In schweren Fällen kann die schon im Jahre 1911 eingeführte Immuntherapie oder Hyposensibilisierung (auch als Allergiespritzen oder Desensibilisierung bekannt) auf lange Sicht Erleichterung verschaffen. Bei dieser Behandlung injizieren Ärzte den Patienten steigende Dosen des Allergens, auf das diese empfindlich reagieren. In allen Fällen ist die Dosis ausschlaggebend: Zu wenig Allergen verleiht keine Toleranz. Außerdem ist der Schutz selten vollständig.
2. Asthma
Bronchodilatatoren sind die meistverwendeten Arzneimittel bei Asthma. Sie lindern die durch Histamin und andere Bronchokonstriktoren hervorgerufenen
Symptome sehr schnell, beeinflussen die zugrundeliegende Entzündung jedoch wahrscheinlich nicht. Außerdem kann ihr übermäßiger Gebrauch eine Gegenreaktion des Körpers hervorrufen, so dass nach Abklingen ihrer Wirkung der Atemstrom stärker behindert ist als zuvor. Zusätzlich kommen die unter 1. aufgezählten Methoden zur Anwendung.
3. Anaphylaktische Reaktionen
Insektenstiche rufen bei manchen Menschen Anaphylaxien aus. In schweren Fällen führen diese zum Tod durch z.B. Kreislaufversagen oder Ersticken. Jede schwere Anaphylaxie - gleich ob sie zum ersten oder fünfzehnten Mal auftritt - ist ein Notfall, bei dem zunächst versucht werden muss, die bedrohlichsten Symptome zu beherrschen. Meist geschieht das durch Injektion von Adrenalin, welches die Freisetzung der Mediatoren hemmt, die Luftwege öffnet und der Erweiterung der Blutgefäße entgegenwirkt. Man kann vorbeugend durch eine Immunisierung mit dem Gift des gesundheitsbedrohenden Insekts agieren.
Neue Ansätze
In der Erprobung im Tiermodell befindet sich die auf DNA basierende Immunisierung mit einem Allergen (Der p 5) der Milbe Dermatophagoides pteronyssinus. Diese Immunisierung resultiert in einer Produktion von IgG, aber nicht IgE, und resultiert in einer 90%igen Reduktion der Mengen an spezifischem IgE, welche durch klassische Sensibilisierung mit Der p 5 und Alaun als Adjuvant oder allergen-induzierte Rhinitis hervorgerufen wurden.
Eine weitere neue Strategie ist die Verwendung von humanisierten monoklonalen Anti-IgE-Aηtikörpern gegen die FcεRI-Binderegion für IgE. Dadurch wird die Bindung von IgE an den IgE-Rezeptor verhindert, so dass keine Mediatoren der allergischen Reaktion von Mastzellen oder Basophilen ausgeschüttet werden können. Diese Strategie hat in klinischen Studien bei Patienten mit allergischer Rhinitis und allergischem Asthma gezeigt, dass diese Antikörper gut toleriert werden und die allergischen Reaktionen reduzieren. (siehe auch L.M. Lichtenstein: "Allergie und Immunsystem"; in Spektrum der Wissenschaft Spezial: Das Immunsystem; 1994; 74-83; S-K Huang, K-Y Chua und K-H Hsieh : Allergen gene transfer. Current Opinion in Immunology 1997; 800-804; C. Heusser und P. Jardieu: Therapeutic potential of anti-IgE 5 antibodies. Current Opinion in Immunology 1997; 805-814).
Allgemeines zu Transplantationen
Die Transplantation von Geweben, um kranke Organe zu ersetzen, ist heute o eine wichtige medizinische Therapie. In den meisten Fällen stellt eine Reaktion des anpassungsfähigen Immunsystems gegen das Transplantat die größte Bedrohung für eine erfolgreiche Behandlung dar. Reaktionen des anpassungsfähigen Immunsystems werden von Antigen-präsentierenden Zellen durch Aktivierung von T-Helfer-Lymphozyten induziert. Bei der Transfusionen von 5 Blut, welches das erste und am häufigsten verwendete Transplantat ist, müssen die ABO und Rh Blutgruppenantigene abgeglichen werden, damit die schnelle Zerstörung unpassender Erythrozyten vermieden wird. Bei anderen Geweben müssen die sehr polymorphen Haupthistokompatibilätskomplexe (MHC) aufeinander abgeglichen werden, da diese fast immer die Immunreakti- o on auslösen. Leider ist der perfekte Abgleich der MHCs außer bei Verwandten fast unmöglich.
Obwohl die Immunreaktion Organtransplantationen schwierig macht, gibt es wenige Alternativen bei Organausfällen. Die Verwendung von potenten
5 immunsuppressiven Drogen, besonders Cyclosporin A und FK-506, die die Aktivierung von T-Zellen verhindern, macht Organtransplantationen erfolgreich. Trotzdem laufen hier einige Probleme auf, da das Leiden, welches das eigene Organ zerstört hat, auch das fremde Organ zerstört. Außerdem steigt durch die Unterdrückung des Immunsystems, das Risiko an Krebs oder o Infektionen zu erkranken. Zudem ist die Prozedur sehr kostspielig (Janeway and Travers 1997). Allgemeines zu Autoimmunerkrankungen
Autoimmunerkrankungen gehören zu den chronischen Erkrankungen. Zu ihnen zählen Rheuma in verschiedensten klinischen Ausprägungen, Diabetes, Multiple Sklerose, bestimmte Formen von Herzmuskelentzündungen und von Schilddrüsenerkrankungen. Die Reihe von Autoimmunerkrankungen ließe sich beliebig fortsetzen, wobei ca. 90% allerdings epidemiologisch nur einen kleinen Prozentsatz ausmachen.
Die klinischen Verläufe von Autoimmunerkrankungen selbst bei ein- und derselben Diagnose können sehr unterschiedlich sein. Z. T. werden schubartige Krankheitsverläufe beobachtet. Entsprechend werden die Behandlungen vom Arzt individuell gestaltet.
Einige der Autoimmunerkrankungen sind antikörpervermittelt. Darunter wird in der Immunologie verstanden, dass der Organismus aus meist nicht bekannten Ursachen Antikörper produziert, welche sich gegen körpereigene zelluläre Strukturen (Autoantigene) richten. Sind diese Antikörper einmal gebildet, lösen sie durch ihre Interaktion und Bindung an die jeweiligen organ- oder zellspezifischen Strukturen eine zell- und gewebszerstörende Reaktion des Immunsystems aus. Letztendlich führt diese dann zu dem klinischen Bild der Erkrankung (Steinman 1994).
Beispiel hierfür ist die Schilddrüsenerkrankung Morbus Basedow, aber auch eine Form der Herzmuskelentzündung, die zur Dilatativen Cardiomyopathie führt. In einigen Fällen sind sowohl die Targets, gegen die sich die Autoantikörper richten, als auch die Autoantikörper selbst, genau charakterisiert.
WO-A-9533770 offenbart ein Verfahren und ein Reagenz zur Einleitung von Apoptose bei T-Zellen, Induktion von Toleranz bei Verpflanzungen und Umkehrung von Immunreaktionen. Dabei wird die Möglichkeit, die Apoptose von T-Zellen durch CTLA4-Liganden einzuleiten, beschrieben. Die Liganden werden dabei als Proteine, wie z.B. Antikörper, appliziert. Zur Eliminierung Autoantigen-spezifischer T-Zellen wird die gleichzeitige Verabreichung des Autoantigens erörtert. Antigen-präsentierende Zellen werden zu diesem Zweck nicht eingesetzt oder genetisch verändert. Diese Patentanmeldung beschreibt auch, dass CTLA4-Liganden Apoptose einleiten.
Das der Erfindung zu Grunde liegende Problem besteht unter anderem darin, gentechnologische, therapeutisch nutzbare Produkte für die Reduktion von spezifischen Immunreaktionen zur Verfügung zustellen, bei denen Targets (Antigene, Autoantigene) und Antikörper, Autoantikörper bekannt sind.
Gelöst wird das Problem durch die erfindungsgemäße Antigen-präsentierende Zelle, die überwiegend vorher bestimmte Antigene präsentiert (monoantigene Antigen-präsentierende Zelle) und dadurch gekennzeichnet ist, dass in der monoantigenen antigen-präsentierenden Zelle CTLA4 bindende Moleküle vorzugsweise Antikörper produziert werden und gegebenenfalls eine der Funktionen co-stimulatorischer Rezeptoren, wie ein B7- und/oder CD40- Rezeptor supprimiert ist.
Figur 1 zeigt ein Schema zur Funktion der Genmanipulation auf zellulärer Ebene:
a) normaler Mechanismus der T-Helfer-Zell-Aktivierung über Monozyten
b) Mechanismus der Monozyten nach Genmanipulation. Ausbleiben der T-Helfer-Zell-Aktivierung nach Genmanipulation der Monozyten.
Figur 2 zeigt eine "Normale" Immunreaktion zur Antikörperbildung, Antigen- präsentierende Monozyten als Induktoren der Antikörperproduktion. Das Ziel dies gentherapeutischen Eingriffs ist eingezeichnet. Monozyten nehmen als fremd erkannte Moleküle auf, zerlegen sie und bringen die Bruchstücke an MHC II-Molekülen auf die Zelloberfläche (Antigenpräsentation). Gleichzeitig wird ein Oberflächenmolekül (B7) exprimiert, das sowohl an CD28 als auch an CTLA4 binden kann. Das präsentierte Antigen wird von T-Helfer-Lymphozyten erkannt, die ihrerseits B-Zellen zur Antikörperproduktion anregen. Das Schema ist stark vereinfacht. CTLA4 (CD152) ist ein Analogon zu CD28, bindet auch B7, induziert aber die Apoptose der T-Zelle. CTLA4 kommt hauptsächlich in intrazellulären Vesikeln vor und wird erst nach Aktivierung der Zellen freigesetzt.
Figur 3 zeigt schematisch die Funktion der Genmanipulation auf molekularer Ebene: Aktivierung von CTLA4 durch ein CTLA4 bindendes Molekül an der Plasmamembran des Monozyten. CTLA4 wird durch einen Liganden (Antikörper gegen CTLA4), der sich auf der Plasmamembran des Monozyten (Antigen- präsentierende Zelle) befindet, gebunden und die T-Zelle so inaktiviert.
Der Effekt kann verstärkt werden, wenn zusätzlich B7 in der Antigen- präsentierenden Zelle unterdrückt wird, so dass auf der T-Zelle ausschließlich CTLA4 gebunden wird.
Figur 4 (I) zeigt die Funktion der Genmanipulation auf molekularer Ebene: das Autoantigen wird von den CTLA4-üganden produzierenden Antigen- präsentierenden Zellen synthetisiert.
Figur 4 (II) zeigt einen Vergleich der Antigenpräsentation von "normalen" (1) und gentechnisch veränderten Monozyten (2) (siehe auch Figur 4 (I)). Gezeigt sind schematisch Autoantigenmengen, die an den MHC II präsentiert werden. Figur 4 (II) (1) zeigt, dass normale Monozyten selten das Autoantigen präsentieren. Wenn, dann wird es nur von wenigen MHC II präsentiert. Figur 4 (II)(2) zeigt, dass genmanipulierte Monozyten fast ausschließlich das Autoantigen präsentieren.
Figur 5 demonstriert die Funktion der genetisch veränderten Monozyten im Körper. Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße monoantigene Antigen-präsentierende Zelle ein Monozyt, eine dendritische Zelle und/oder ein Makrophage.
Die APCs sind die Schaltstellen des anpassungsfähigen Immunsystems. Nur sie können eine T-Zell-vermittelte Immunantwort auslösen. Dies sei in folgenden Abbildungen am Beispiel von Monozyten und der durch T-Helfer-Zellen ausgelösten Antikörperproduktion gezeigt:
Innerhalb des Immunsystems spielen die Antikörper normalerweise als spezifische Abwehrmoleküle ("humorale Immunreaktion") eine wichtige Rolle. Sie werden von ausgereiften B-Lymphozyten produziert. Die Induktion und Produktion der löslichen Antikörper erfolgt allerdings nicht unabhängig von den restlichen Zellen des Immunsystems; vielmehr wird diese humorale Immunreaktion von anderen Zellen des Immunsystems gesteuert.
Die Antikörperproduktion - und so auch die Produktion der pathologischen Autoantikörper - lässt sich nicht aufrechterhalten ohne die Hilfe und Vermittlung von Monozyten und T-Helfer-Lymphozyten, die ihrerseits antigenspezifisch die B-Lymphozyten aktivieren (Fig.l).
Die molekularen Mechanismen der Interaktion - des Zell-Zell-Kontakts - von Monozyten mit den T-Helfer-Lymphozyten ist auf Rezeptorebene bis ins Detail bekannt (Figur 2).
Handelt es sich bei dem Antigen z.B. um ein Bakterienprotein, ist die Immunreaktion für den Organismus nützlich. Ist das Antigen allerdings eine körpereigene Struktur, spricht man von einer (pathologischen) Autoimmunreaktion.
Neben dem zu präsentierenden Antigen (gegen welches sich die zu produzierenden Antikörper richten) sind auf der Zelloberfläche verschiedene Rezeptoren und Hilfsrezeptoren am Zell-Zell-Kontakt und der Zellaktivierung beteiligt. Ein essentielles Molekül der interzellulären Wechselwirkung bei der Antigenpräsentation (Kontakt von Monozyt mit den T-Helfer-Lymphozyten) ist ein costimulierender Rezeptor mit der Bezeichnung B7 (Figur 2).
Die erfindungsgemäße monoantigene Antigen-präsentierende Zelle weist, vorzugsweise durch eine Transfektion einer antigen-präsentierenden Zelle mit nukleinsäurehaltigem Material, eine erhöhte Expression eines Antigens auf, wobei die Antigen-präsentierende Zelle im wesentlichen nur vordefinierte Antigene präsentiert.
Das erfindungsgemäße gentherapeutische Verfahren beruht auf parallelen gentechnologischen Eingriffen an patienteneigenen Blutmonozyten. Die Eingriffe erfolgen mittels geeigneter Sonden und bewirken die Produktion von CTLA4 bindenden Molekülen, vorzugsweise Antikörper, und gegebenenfalls die Verminderung von B7-Molekülen durch die Behinderung bzw. Verhinderung der Ausbildung des Moleküls auf der Oberfläche der Monozyten (Figur 3) und gleichzeitig eine starke Präsentation des Autoantigens (Figur 4).
Verminderung der spezifischen Antikörperproduktion durch Gentherapie
Die Produktion pathologischer Autoantikörper wird durch die Manipulation von Monozyten und die daraus resultierende Abschaltung Antigen-spezifischer T-Zellen spezifisch beendet. Hierbei wird ausgenutzt, dass T-Zellen zwei Rezeptoren produzieren, die B7 (1 oder 2) erkennen. Der eine Rezeptor ist CD28, der andere ist CTLA4. CD28 entfaltet eine stimulierende Wirkung, während CTLA4 eine solche Wirkung nicht entfaltet. Der Kontakt von CTLA4 mit B7 sorgt für das Abschalten der jeweiligen T-Zelle. Diese geht dann entweder in die Apoptose über programmierten Zelltod, wird abgeschaltet, oder wird in eine toleranzerzeugende T-Zelle umgewandelt. Die Toleranz wird in diesem Fall gegen das spezielle von dieser T-Zelle erkannte Antigen erzeugt. (Gribben et al., 1994; Judge et al., 1999; Lee et al., 1998; Lin et al., 1998; Metzler et al., 1997; Olsson et al., 1999; Oosterwegel et al., 1999a; Oosterwegel et al., 1999b; Peach et al., 1994; Walunas et al., 1996; Wu et al., 1997; Wulfing and Davis, 1998).
Zur Bindung an CTLA4 anstatt von CD28 werden Moleküle, wie Antikörper, eingesetzt, die an CTLA4, nicht aber an CD28 binden. Diese können dann die von CTLA4 beförderte Reaktion der T-Zellen induzieren. Diese CTLA4 bindenden Moleküle können vorzugsweise Antikörper sein.
Der Co-Rezeptor B7, ohne den die Antigenpräsentation bzw. die Induktions- kaskade zur Antikörperproduktion nicht anläuft, kann zusätzlich unterdrückt werden, um eine präferentielle Bindung von CD28 zu unterdrücken. Der Co- Rezeptor stellt zwei unterschiedliche Co-Rezeptoren, die als CD80 (B7-1) und CD86 (B7-2) bezeichnet werden, dar. Ihre Strukturen sind bekannt.
Nach dem Abschalten der Antikörperproduktion verschwinden die im Blut zirkulierenden Autoantikörper aufgrund des natürlichen Abbaus und des fehlenden Nachschubs.
Nach der in vitro Manipulation der Monozyten werden die Zellen in die Blutbahn des Patienten zurückgegeben. Die gentechnisch veränderten Monozyten schalten nunmehr die im Organismus befindlichen pathologischen T-Helfer-Lymphozyten ab. Die gentechnisch veränderten Zellen treten dabei unmittelbar in Konkurrenz zu den bereits im Organismus (vorzugsweise Blutbahn und Lymphsystem) vorhandenen Autoantigen-präsentierenden Monozyten, die allerdings B7 auf der Zelloberfläche tragen und normalerweise die T-Helfer-Lymphozyten und damit die Antikörperproduktion aktivieren (Figur 5).
Antigenpräsentation bei gentechnisch veränderten Monozyten
Die cDNA eines Proteins, das als Autoantigen die Produktion pathologischer Autoantikörper hervoruft, wird in das Monozytengenom integriert. Diese Erbinformation dient dann zur Überproduktion des Autoantigens. Peptide dieses Autoantigens werden daraufhin bevorzugt an MHC II und/oder MHC I präsentiert [siehe auch Figur 4(11)]. MHC II präsentiert die Peptide den T- Helferzellen und versucht solche zu finden, die spezifisch diese präsentierten Peptide erkennen. Wenn gleichzeitig durch ein CTLA4 bindendes Molekül CTLA4 anstelle von CD28 aktiviert wird und eventuell zusätzlich der Co- Rezeptor B7 nicht gleichzeitig an der Zelloberfläche erscheint, werden die T- Helferzellen stillgelegt und können eventuell einen vorzeitigen Zelltod erleiden.
Alle gentechnisch veränderten Monozyten präsentieren an den meisten ihrer MHC II-Komplexe das Autoantigen, während in vivo nur sehr wenige "normale" Monozyten das Autoantigen präsentieren und dann auch nur an wenigen MHC II-Komplexen. Es ist Ziel der Behandlung, in vivo die "normalen" Monozyten, die das Autoantigen präsentieren und die T-Helfer-Zellen aktivieren, zu verdrängen durch die auf Abschaltung der Antikörperproduktion bzw. T-Zellantwort programmierten, gentechnisch veränderten Monozyten.
Die erfindungsgemäße monoantigene Antigen-präsentierende Zelle kann insbesondere eine erhöhte Anzahl von Homing-Rezeptoren, wie CD44, aufzeigen. Eine Überexpression von Homing-Rezeptoren wird der monoantigenen Antigen-präsentierenden Zelle den Weg in die Lymphknoten weisen, wodurch die gentechnisch veränderten APCs sich vermehrt und schneller in Lymphknoten ansammeln. Die Lymphknoten sind der Ort, an dem die allermeisten Reaktionen des anpassungsfähigen Immunsystems hervorgerufen werden. Dort entfalten die gentechnisch veränderten APCs daher eine um ein vielfaches höhere Wirkung als außerhalb der Lymphknoten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen monoantigenen antigen-präsentierenden Zelle bewirkt eine Transfektion eine Erhöhung der Anzahl von Homing-Rezeptoren und/oder eine Suppression von Funktionen der B7-, CD40-Rezeptoren und eine Erhöhung der Anzahl von CTLA4 bindenden Molekülen. Die CTLA4 bindenden Moleküle können vorzugsweise Antikörper, monoklonale Antikörper sein. Diese können so geartet sein, dass sie in der Plasmamembran der Zelle verbleiben.
Insbesondere mit Antisense-Nukleinsäuren kann die B7- und/oder CD40- Rezeptorexpression in der erfindungsgemäßen monoantigenen antigen- präsentierenden Zelle verhindert oder reduziert werden.
Alternativ kann mit Nukleinsäuren eine Unterdrückung der Expression der B7- und/oder CD40-Rezeptoren durch Co-Suppression in der erfindungsgemäßen monoantigenen antigen-präsentierenden Zelle bewirkt werden.
Die erfindungsgemäße monoantigene Antigen-präsentierende Zelle kann Nukleinsäuren enthalten oder damit transfiziert sein, die eine Expression von mit B7- und/oder CD40- Rezeptoren affinen Strukturen aufweisenden Proteinen oder Peptiden bewirken. Damit werden Proteine gebildet, die durch Komplexbildung mit B7 - und/oder CD40-Rezeptoren diese Rezeptoren praktisch neutralisieren. Insbesondere kommen dazu CTLA4, CD28, Antikörper, F(ab)2/ scFv und/oder Fab-Fragmente als Proteine in Betracht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße monoantigene Antigen-präsentierende Zelle Nukleinsäuren, die für eine Signalsequenz kodieren oder Expressionsprodukte einer Signalsequenz, die den Verbleib der Expressionsprodukte im endoplasmatischen Retikulum, dem Golgi-Apparat, dem Trans-Golgi-Netzwerk oder intrazellulären Vesikeln bewirkt.
Die erfindungsgemäße monoantigene Antigen-präsentierende Zelle wird zur Expression von Antigenen mit Nukleinsäuren transfiziert, die den Transport der exprimierten Antigene in MHC II-Kompartimente der Zellen ermöglichen. Alle gentechnisch veränderten Monozyten präsentieren an den meisten ihrer MHC -Komplexe das Autoantigen, während nur sehr wenige "normale" Monozyten überhaupt das Autoantigen präsentieren und dann auch nur an wenigen MHC -Komplexen. Es ist Ziel der Behandlung, die "normalen" Monozyten, die das Autoantigen präsentieren und die T-Helfer-Zellen aktivieren, zu verdrängen durch die auf Abschaltung der Antikörperprodukte programmierten, genmanipulierten Monozyten. Es ist sehr wichtig, das Antigen (die Antigene) auch in einer Form zu verabreichen, die den Transport in die MHC II-Endosomen ermöglicht. Nur so kann zuverlässig eine Präsentation an MHC II erreicht werden. Bei einem gentechnischen Eingriff erfolgt dies in der Regel durch Manipulation des offenen Leserasters, so dass dem Leseraster eine Signalsequenz für dieses Kompartiment vorgeschaltet wird. Die genetische Manipulation hat den zusätzlichen Vorteil, dass sie eine viel längere Halbwertzeit hat, als z.B. Oligonukleotide oder Peptide. Eine stabile Integration von Genen führt sogar zu einer permanenten Veränderung der Eigenschaft der Zielzellen.
Die entsprechenden Nukleinsäuren können dabei DNA, RNA, Oligonukleotide, Polynukleotide, Ribozyme, Peptidnukleinsäuren (PNA) sein.
Vorzugsweise besitzt die DNA Regulationselemente wie Enhancer, Promotoren, polyA-kodierende 3" -Enden zur Transkription der DNA in RNA, die RNA Regulationselemente zur Translation der RNA in Protein. Die Regulationselemente sorgen für eine effiziente Expression der Gene.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen monoantigenen antigen- präsentierenden Zelle erfolgt zum Beispiel durch ex vivo oder in vivo Verfahren. Dabei wird vorzugsweise eine Antigen-präsentierende Zelle ex vivo oder in vivo durch Behandlung mit Viren, viralen Vektoren, bakteriellen Vektoren, Plasmiden, die durch Elektroporationstechniken, lontophorese, ballistischen Methoden und/oder anderen Techniken zur Einschleusung von Molekülen in eine monoantigene Antigen-präsentierende Zelle transfiziert. In einer weiteren Ausführungsform kann eine Antigen-präsentierende Zelle oder eine monoantigene Antigen-präsentierende Zelle durch Behandlung mit Viren, viralen Vektoren, bakteriellen Vektoren, Plasmiden, die durch Elektroporationstechniken, lontophorese, ballistischen Methoden und/oder anderen Techniken zur Einschleusung von Molekülen in eine Zelle mit erhöhter Menge von CTLA4 bindenden Molekülen und gegebenenfalls supprimierter Funktion co-stimulatorischer Rezeptoren transformiert werden oder die Expression co-stimulatorischer Rezeptoren durch Verhinderung von deren Expression oder die co-stimulatorischen Rezeptoren werden durch Reaktion mit affinen Strukturen an einer Stimulation von T-Zellen, die an die monoantigene Antigen-präsentierende Zelle gebunden sind, gehindert.
Für die Unterdrückung der Co-Stimulation, die letztendlich ein Unterdrücken der Produktion eines oder mehrerer Proteine oder die Behinderung des Proteins oder der Proteine bedeutet, kommen verschiedene Strategien in Frage:
1. Antisense-Ansatz
2. Co-Suppression
3. Bindung αes co-stimulatorischen Moleküls.
Zu 1. : In diesem Fall müssen Antisense-Nukleinsäuren in Kontakt mit der mRNA des co-stimulatorischen Moleküls kommen. Sie binden dann wahrscheinlich das Molekül und verhindern die Translation. Als Nukleinsäuren kommen eine große Bandbreite von Molekülen, wie RNAs, DNAs, PNAs, Ribozyme, in Frage. Auch hier würde ein gentechnischer Eingriff für die größte Halbwertszeit des Effekts sorgen. Zu 2. : Es hat sich inzwischen herausgestellt, dass man die Produktion eines Genproduktes auch durch Integration einer möglichst homologen Sense-Gensequenz erreichen kann. Der Mechanismus ist noch völlig unbekannt.
Zu 3. : Die Bindung des co-stimulatorischen Moleküls z.B. durch spezifische Antikörper verhindert, dass dieses Molekül Kontakt mit dem avisierten Rezeptor auf einer T-Zelle aufnimmt und verhindert so die Aktivierung der T-Zelle. Die externe Zugabe solcher Bindemoleküle hat den Nach- teil, dass sie auf alle Antigen-präsentierenden Zellen wirken und damit jede Immunreaktion verhindern. Um Immunreaktionen spezifisch zu behindern, haben wir ein Modell entworfen, bei dem die co- stimulatorischen Moleküle bereits in der Zelle, in einem intrazellulären Kompartiment gebunden werden. In einer Erweiterung dieses Modells soll dafür gesorgt werden, dass das Bindemolekül im intrazellulären
Kompartiment zurückgehalten wird, so dass der co-stimulatorische Rezeptor erst gar nicht zur Plasmamembran gelangt. Hierfür sind Signalsequenzen bekannt, die dem offenen Leseraster des Bindemoleküls zugefügt werden müssen. Dieser intrazelluläre Ansatz lässt sich gut an isolierten Zellen durchführen. Auch hier ist ein gentechnischer Eingriff zu bevorzugen.
Die gewünschten Effekte können auch erreicht werden, wenn nur eines der beiden Ziele mit einem gentechnischen Eingriff vorgenommen wird. In diesem Fall können statt der Gene z. B. folgende andere Moleküle eingesetzt werden :
1. Behinderung der Co-Stimulation durch
Nukleinsäuren (zumeist komplementär zur Zielsequenz), bei denen es sich z. B. um Oligonukleotide, Polynukleotide, Ribozyme, Peptidnukleinsäuren
(PNAs) handeln kann, Antikörper oder andere Moleküle, die die co-stimulatorischen Moleküle binden.
2. Antigen Kontaktierung durch
Proteine, Peptide, Peptidomimetica.
Es werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren insbesondere Moleküle wie Antikörper, Proteine, Peptide, Peptidomimetica, CTLA4, CD28, CD40L und/oder Bestandteile und/oder Kombinationen dieser Moleküle, die z.B. B7-1, B7-2, CD40 binden, welche eine in Gegenwart einer Antigenpräsentation stattfindende Co-Stimulation der T-Zelle behindert, mit der monoantigenen antigen-präsentierenden Zelle oder der antigen-präsentierenden Zelle in Kontakt gebracht.
Es kann vorteilhaft sein, die Moleküle mittels Vehikeln, wie Liposomen, Hydrogelen, Zyklodextrinen, Nanokapseln, Nanopartikel, insbesondere biologisch abbaubaren Nanokapseln oder -partikel, bio-adhäsiven Mikrokugeln und/oder durch Elektroporationstechniken, lontophorese, ballistische Methoden und/oder andere Techniken zur Einschleusung von Molekülen in die monoantigene Antigen-präsentierende Zelle oder die Antigen-präsentierende Zelle zu transferieren.
Nukleinsäuren können insbesondere durch Viren, virale Vektoren, bakterielle Vektoren, Plasmide, die durch Elektroporationstechniken, lontophorese, ballistische Methoden und/oder andere Techniken zur Einschleusung von Molekülen in die monoantigene Antigen-präsentierende Zelle oder die Antigen- präsentierende Zelle transferiert werden.
Erfindungsgemäß beansprucht wird weiterhin ein Arzneimittel, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße monoantigene Antigen-präsentierende Zelle. Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Arzneimittel als Infusionslösung zur intravenösen oder intraperitonealen Applikation formuliert. Die Formulierung ist so gewählt, dass bei Verabreichung des Arzneimittels keine wesentliche Beeinträchtigung der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen monoantigenen antigen-präsentierenden Zelle erfolgt.
So kommt als Infusionslösung vorzugsweise physiologische Kochsalzlösung in Betracht. Grundsätzlich sind auch andere Lösungen, die einen pH-Wert von 5,5 bis 8,5 aufweisen, geeignet. Auch Serum, beispielsweise humanes Serum, autologes Serum oder Serum anderer Spezies, Lösungen mit Plasmaer- satzstoffen, wie Polyvinylpyrrolidon, kommen in Betracht. Typischerweise sollen 0,5 ml bis 500 ml appliziert werden. Diese Mengen sind selbstverständlich nicht absolut, sondern können vom Fachmann, je nach Bedingungen und Anforderungen, variiert und an die spezifischen Bedürfnisse eines Patienten angepasst werden.
Die erfindungsgemäße monoantigene Antigen-präsentierende Zelle kann insbesondere zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ungewollten Immunreaktionen, wie Autoimmunerkrankungen und Allergien oder gewollt hervorgerufenen Immunreaktionen, wie bei Immunisierungen verwendet werden.
Weiterhin kann die erfindungsgemäße monoantigene Antigen-präsentierende Zelle zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Immunreaktionen gegen allologe und/oder xenologe Gewebsmerkmale verwendet werden.
Erfindungsgemäß beansprucht werden insbesondere Verwendungen, bei denen die zu behandelnden Immunreaktionen in Verbindung mit Antigenen oder deren Gensequenzen und/oder Teilen davon stehen und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
Enzymen, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Glutamic acid decarboxylase (GAD), Rezeptor-Typ Protein Tyro- sin Phosphatase IA-2Beta, Antigen: H+K+ATPase, U1RNP, Transglu- taminase, Argininosuccinatlyase (ASL), Tyrosinase-related protein-2, Thyroid Peroxidase, Faktor VIII, Faktor IX;
Rezeptoren, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Acetylcholinrezeptor vom Nicotintyp, ßl-adrenerger- Rezeptor, αl-adrenerger-Rezeptor, Angiotensin-2-ATl-Rezeptor, Glutamat-Rezeptor, Thyrotropin-stimulierendes Hormon (TSH)- Rezeptor, LFA-1, HLA-B27, Epididymal Protein DE, Zona Pellucida (ZP)-3 Glycoprotein, Zona Pellucida (ZP)-4 Glycoprotein, Follicle-
Stimulating Hormone (FSH) Rezeptor, Sperm Immunogen SP-10 oder Sperm Protein SP-10;
Hormone oder Botenstoffe, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Insulin, Thyroglobulin, Follicle-Stimulating Hormone (FSH), Prostaglandin F2 alpha, Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH), Oestradiol-17beta, Oestrogen, Luteinizing Hormon (LH) Rezeptor, Inhibin, Testosteron, Androgen, Chorionic Gona- dotrophin (CG), Interieukine, Interferone, Cytokine, Chemokine, Bone Morphogenetic Factors, ß-Interferon, Estradiol;
Strukturproteine, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Myelin Basic Protein (MBP), Proteolipid protein (PLP), Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), α-Fodrin, Nicht- erythroides α-Spectrin, Beta-Amyloid Precursor Protein (beta-APP), Typ 2 Kollagen, Sperm Plasma Membran Protein PH-20;
Antigene, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere CENP-A Autoantigen, Beta2GP-I, ribosomales P Protein, Ro/SSA, La/SSB, Sm/RNP, Sm, Scl-70, Jo-1, BCOADC-E2, Albumin, Glucagon, Inselzellantigene, Retinal S Ag; Allergene, die eine IgE-Antwort auslösen, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Der f 1, Der f 2, Der f 3, Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 8, Eur m 1, Lep d 2, Fei d 1, Can f 1, Can f 2, Mus m 1, Rat n 1, Bla g 1, Bla g 2, Bla g 4, Bla g 5, Per a 1, Bienengift Phospholipase A2 (PLA2), Group V major aller- gen Phl p 5b von Timothy Grass Pollen, Hom s 1.
Weiterhin wird erfindungsgemäß beansprucht eine Verwendung, bei der die zu behandelnden Immunreaktionen in Verbindung mit allologen und/oder xenologen Gewebsmerkmalen, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere MHC I, MHC II, Rhesus Faktor stehen.
Entwicklung einer Gentherapie
Das hier vorgestellte Verfahren zur Reduzierung von Immunantworten, z. B. zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen mit klar definiertem Autoantikörperprofil, basiert auf der gentechnischen Manipulation von bestimmten Blutzellen vorzugsweise außerhalb des Körpers, die dann anschließend ieder in den Organismus zurückgeführt werden. Ziel dieser Behandlung ist unter anderem das spezifische Abschalten einer chronischen, durch das Immunsystem getriebenen Produktion von Autoantikörpern, welche die Krankheit auslösen.
Anwendungsgebiete der Gentherapie
Das Verfahren zur spezifischen Abschaltung von Immunreaktionen ist immer dort sinnvoll, wo ein oder mehrere molekular definierte Targets (Antigene, Autoantigene) bekannt sind. Diese können beispielsweise mit einer Autoimmunerkrankung oder Allergie assoziiert sein.
Z. B. handelt es sich dabei um Krankheiten mit Autoantikörper-vermittelten Autoimmunreaktionen, d.h. um Krankheiten, bei denen die "Bindungsstrukturen" dieser Autoantikörper (Autoantigene, Targets) bekannt sind und pathogenetische Bedeutung haben.
Beispiele für Krankheiten mit bekannten, die Autoantikörper-bindenden molekularen Strukturen (Epitope) sind:
• Myasthenia gravis (Autoantikörper gegen den Acetylcholinrezeptor)
• Morbus Basedow (Autoantikörper gegen den TSH-Rezeptor der Schilddrüse)
• Dilatative Cardiomyopathie (DCM, Autoantikörper gegen den ßl-adrenergen Rezeptor der Herzmuskelzellen)
• bestimmte Formen des insulinabhängigen Diabetes (Autoantikörper gegen Insulin)
• bestimmte Formen des malignen Bluthochdrucks (Autoantikörper gegen den Angiotensin- und/oder αl-adrenergen-Rezeptor).
Behandlung mit genmanipulierten patienteneigenen Blutzellen: Prinzip der vorgeschlagenen Gentherapie
Innerhalb des Immunsystems spielen die Antikörper als Abwehrmoleküle ("humorale Immunreaktion") eine wichtige Rolle. Sie werden von ausgereiften B-Lymphozyten produziert. Die Induktion und Produktion der Antikörper erfolgt allerdings nicht losgelöst von den restlichen Zellen des Immunsystems; vielmehr wird diese humorale Immunreaktion von anderen Zellen des Immunsystems gesteuert. Die Immunreaktion lässt sich nicht aufrechterhalten ohne die Hilfe und Vermittlung von Antigen-präsentierenden Zellen und T- Helfer-Lymphozyten. Die molekularen Mechanismen der Interaktion - des Zeil- Zeil-Kontakts - von Antigen-präsentierenden Zellen mit den T-Helfer- Lymphozyten ist auf Rezeptorebene bis ins Detail bekannt.
Neben dem zu präsentierenden Antigen sind auf der Zelloberfläche verschiedene Rezeptoren und Hilfsrezeptoren am Zell-Zell-Kontakt und der Zellaktivierung beteiligt. Ein essentielles Molekül der interzellulären Wechselwirkung bei der Antigenpräsentation (Kontakt von Antigen- präsentierenden Zellen mit den T-Helfer-Lymphozyten) sind costimulierende Rezeptoren mit den Bezeichnungen B7-1 und B7-2. Auch CD40 spielt bei dieser Signaltransduktion eine Rolle.
Die Funktionen von CTLA4, B7 und CD40 sind Inhalt zahlreicher Publikationen (Daikh et al., 1997; Greenfield et al., 1998; Johnson-Leger et al., 1998; McAdam et al., 1998; Vyth-Dreese et al., 1995) und werden auch umfangreich in Lehrbüchern abgehandelt (s. z.B. (Janeway and Travers, 1997)).
Das konzipierte Verfahren beruht auf mindestens zwei parallelen Eingriffen an patienteneigenen Antigen-präsentierenden Zellen. Die Eingriffe erfolgen mittels geeigneter Sonden und bewirken • die Produktion eines CTLA4 bindenden Moleküls, wie z.B. Antikörpern, die Über die Wirkung von CTLA4, welches in T-Zellen vorkommt, die T-Zellen an der Aktivierung hindert
• gleichzeitig eine starke Präsentation des Autoantigens auf den Antigen- präsentierenden Zellen
• und gegebenenfalls die Abschaltung von B7 und damit die Verhinderung der Ausbildung des Moleküls auf der Oberfläche der Antigen-präsentierenden Zellen und/oder die Abschaltung von CD40.
Sollte die Manipulation der Zellen, die z. B. Monozyten sind, ex vivo erfolgen, werden die Zellen in die Blutbahn des Spenders zurückgegeben. Die genmanipulierten Monozyten schalten nunmehr die im Organismus befindlichen entsprechenden T-Helfer-Lymphozyten ab. Die genmanipulierten Zellen treten dabei unmittelbar in Konkurrenz zu den bereits im Organismus (vorzugsweise Blutbahn und Lymphsystem) vorhandenen Autoantigen- präsentierenden Monozyten, die allerdings B7 und kein zusätzliches CTLA4 bindendes Molekül auf der Zelloberfläche tragen und normalerweise die T- Helfer-Lymphozyten und damit unter anderem die Antikörperproduktion aktivieren.
Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Allergien und Transplantationen: Stand der Technik
Kausaltherapien zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Allergien existieren nicht. Von wenigen Ausnahmen abgesehen (extrakorporale Elimination der Antikörper aus dem Blut der Patienten bzw. Plasmapherese), erfolgt die Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Allergien medikamentös durch eine Hemmung von Reaktionen des Immunsystems. Nach wie vor am gebräuchlichsten ist die medikamentöse Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Allergien und Transplantationen mit immunsuppressiven Präparaten wie Cortison und dessen Abkömmlingen, sowie Cyclosporin, Beta-Interferon oder Zytostatika (Methothrexat). Desweiteren werden Antikörper, Antagonisten und Oligonukleotide gegen verschiedene Signalkomponenten des Immunsystems mit dem Zweck erprobt, die Aktivierung von
T-Zellen zu verhindern. Solche Arzneimittel sind bestenfalls selektiv, nie aber spezifisch gegen die falsch programmierten Autoimmunreaktionen gerichtet. Immunsuppressiva haben daher auf wichtige, notwendige und nützliche Teile des Immunsystems eine negative Wirkung; aus diesem Grund und ihrer Nebenwirkungen wegen ist ihr Einsatz begrenzt.
Von den immunsuppressiven Therapien unterscheidet sich das vorgelegte Konzept einer Gentherapie zur Reduktion von spezifischen Immunreaktionen grundlegend. Es wird eine spezifische Abschaltung fehlgeleiteter immunologischer Reaktionen durch gentechnisch umprogrammierte patienteneigene Blutzellen durchgeführt.
Die aufgezeigte Methodik ist als allgemein gültiges Konzept zur Reduzierung von Immunantworten gedacht. Es sollte mit diesem Grundkonzept möglich sein, jede Immunreaktion des anpassungsfähigen Immunsystems wieder abzustellen. Außerdem können nach Belieben solche Immunreaktionen hervorgerufen und dann wieder abgestellt werden.
Ausführungsbeispiel :
Effekte eines Anti-Maus-CTLA-4 Antikörpers UC10-4F10-11 (Walunas et al, Immunity, vol 1, 405-413, 1994), der in Hamstern generiert wurde, auf die Proliferation von T Zellen in einer MLR (Mixed lymphocyte reaction). Die AntiMaus-Antikörper wurden zusätzlich mit einem Anti-Hamster-Antikörper kreuzvernetzt. Die optimale Konzentration der Anti-Hamster-Antikörper für die Kreuzvernetzung kann gemäß Abbildung 6-9 abgeschätzt werden. Es wurden T Zellen aus den Milzen von fünf C3H-Mäusen (H-2k) durch indirektes MACS-Sorting isoliert. Die Reinheit dieser Zellen lag dann über 95%. Parallel wurden aus den Milzen von 5 BALB/c-Mäusen (H-d) die Antigen- präsentierenden Zellen durch eine magnetische T-Zell-Depletion angereichert (weniger als 2 % kontaminierende T Zellen).
Die T Zellen wurden dann gezählt und mit Carboxyfluoresceindiacetatsuccini- midylester (CFSE) gefärbt. Dieser fluoreszierende Farbstoff bindet fest an zytosolische Proteine und wird während einer Teilung gleichmässig auf die Tochterzellen verteilt, die dann nur noch halb so intensiv gefärbt sind. Durch Antikörper-Färbungen gegen T-Zellmarker wie CD4 und CD8 und abschlies- sende Analyse im Durchflusszytometer lassen sich exakte Aussagen über die Art der proliferierten Zellen machen.
Die Zellen wurden dann auf 6 Ansätze verteilt und im Verhältnis T- Zelle: Antigen-präsentierende Zelle = 1: 1 in einem Endvolumen von 500μl (2 x 105 C3H T Zellen und die gleiche Anzahl an T Zeil deputierten BALB/c Milzlymphozyten) mit den entsprechenden Antikörperkonzentrationen (0,01μg/ml für die Primärantikörper und 0,01 - 1 μg/ml für den vernetzenden Sekundärantikörper) für 7 Tage in Kultur genommen. Nach dieser Kulturphase wurden die Zellen quantitativ aus den Kulturgefäßen abgenommen, und gleichzeitig gegen CD4 und CD8 mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt. Außerdem wurde noch eine bekannte Anzahl von TrueCount Beads (Becton-Dickinson) in jede Probe gegeben, um die Absolutzahl der proliferierten CD4+ und CD8+ zu bestimmen. Tote, nekrotische Zellen wurden durch Zugabe von Propidiumiodid unmittelbar vor der Messung von der späteren Analyse ausgeschlossen.
Ergebnis und Diskussion: Figur 7 zeigt den Effekt von quervernetzten Anti-Maus CTLA-4 Antikörpern auf die Proliferation von CD4+ T-Zellen.
Figur 8 zeigt den Effekt von quervernetzten Isotyp-Kohtroll-Antikörpern auf die Proliferation von CD8+ T-Zellen. Figur 9 zeigt den Effekt von quervernetzten Anti-Maus CTLA-4 Antikörpern auf die Proliferation von CD8+ T-Zellen.
Wenn der Sekundärantikörper in der optimalen Konzentration von 1 μg/ml eingesetzt wird, sieht man bei dem Anti-Maus CTLA-4 Antikörper eine klare Reduktion der Proliferation der CD4 positiven als auch CD8 positiven T Zellen um jeweils ungefähr 75%.
Bei Einsatz einer Isotyp-Kontrolle anstelle des Anti-Maus CTLA-4 Antikörpers, sieht man diese Reduktion nicht. Als Antigene fungierten in diesem Versuch die Haupt- und Nebenantigene der allologen C3H-Zellen. Hieraus kann geschlußfolgert werden, dass die beschriebene Methodik zur Unterdrückung von Immunantworten des adaptiven Immunsystems funktioniert. Man kann auch erkennen, dass eine Quervernetzung der Anti-CTLA4-Antikörper hilfreich ist, da sich in weiteren, hier nicht dargestellten Versuchen zeigte, dass der Effekt ohne die Quervernetzung geringer ist. Eine Quervernetzung entspricht einer in vivo Situation, bei der Bindemoleküle in der Zellmembran verankert werden, was z.B. durch Gentransfer in die erfindungsgemäßen Zellen erreicht werden kann.
Literatur
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Gribben, J., G. Freeman, L. Nadler, P. Rennert, C. Jellis, E. Greenfield, and G. Gray. 1994. Ligands for induction of antigen specific apoptosis in T cells. In Patent. Repligen Corp. (US); Dana Faber Cancer Inst. Inc. (US). Janeway J.C.A. and Travers P. (1997) Immunobiology - The immune System in health and disease. Current Biology Ltd./Garland Publishing Inc., London, San Francisco and New York Johnson-Leger, C, J. Christensen, and G. Klaus. 1998. CD28 co-stimulation stabilizes the expression of the CD40 ligand on T cells. Int Immunol. 10: 1083- 1091.
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Claims

Patentansprüche
1. Antigen-präsentierende Zelle, die überwiegend vorher bestimmte Antigene präsentiert (monoantigene Antigen-präsentierende Zelle), dadurch gekennzeichnet, dass in der monoantigenen antigen- präsentierenden Zelle ein CTLA4 bindendes Molekül produziert wird und gegebenenfalls eine der Funktionen co-stimulatorischer Rezeptoren, wie B7- und/oder CD40-Rezeptoren supprimiert sind.
2. Monoantigene Antigen-präsentierende Zelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die monoantigene Antigen-präsentierende Zelle ein Monozyt, eine dendritische Zelle und/oder ein Makrophage ist.
3. Monoantigene Antigen-präsentierende Zelle nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass durch Transfektion einer antigen- präsentierenden Zelle mit nukleinsäurehaltigem Material eine erhöhte Expression der so vordefinierten Antigene erfolgt und die Antigen- präsentierende Zelle im wesentlichen nur diese Antigene präsentiert.
4. Monoantigene Antigen-präsentierende Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die monoantigene Antigen-präsentierende Zelle eine erhöhte Anzahl von Homing- Rezeptoren, wie CD44, aufweist.
5. Monoantigene Antigen-präsentierende Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Transfektion eine Expression von CTLA4 bindenden Molekülen und gegebenenfalls eine Suppression von Funktionen der B7-, CD40-Rezeptoren und gegebenenfalls eine Erhöhung der Anzahl von Homing-Rezeptoren bewirkt.
Monoantigene Antigen-präsentierende Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 enthaltend Nukleinsäuren, die CTLA4 bindende Mole- küle kodieren und gegebenenfalls Antisense-Nukleinsäuren zur Verhinderung der B7- und/oder CD40-Rezeptor Expression.
7. Monoantigene Antigen-präsentierende Zelle nach mindestens einem der 5 Ansprüche 1 bis 6 enthaltend Nukleinsäuren, die für CTLA4 bindende
Moleküle kodieren, die in der Plasmamembran der Zelle verbleiben.
8. Monoantigene Antigen-präsentierende Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 bei denen die CTLA4 bindenden Moleküle vorzugswei-
LO se Antikörper, monoklonale Antikörper sind.
9. Monoantigene Antigen-präsentierende Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 enthaltend Nukleinsäuren, die eine Unterdrückung der Expression der B7- und/oder CD40-Rezeptoren durch Co-Suppression
L5 bewirken.
10. Monoantigene Antigen-präsentierende Zelle nach mindestens einem der
/
Ansprüche 1 bis 9 enthaltend Nukleinsäuren, die eine Expression von mit B7- und/oder CD40-Rezeptoren affinen Strukturen aufweisenden 20 Proteinen oder Peptiden bewirken.
11. Monoantigene Antigen-präsentierende Zelle nach Anspruch 10, wobei die Proteine, die affine Strukturen zu B7-Rezeptoren aufweisen CTLA4, CD28, Antikörper, F(ab)2/ scFv und/oder Fab-Fragmente sind.
25
12. Monoantigene Antigen-präsentierende Zelle nach Anspruch 10 und/oder 11, wobei die Nukleinsäuren für eine Signalsequenz kodieren oder die Expressionsprodukte eine Signalsequenz besitzen, die den Verbleib der Expressionsprodukte im endoplasmatischen Retikulum, dem Golgi-
50 Apparat, dem Trans-Golgi-Netzwerk oder intrazellulären Vesikeln bewirkt.
13. Monoantigene Antigen-präsentierende Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die monoantigene Antigen-präsentierende Zelle zur Expression von Antigenen mit Nukleinsäuren transfiziert ist, die den Transport der exprimierten Antigene in MHC II-Kompartimente der Zellen ermöglicht.
14. Monoantigene Antigen-präsentierende Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren DNA, RNA, Oligonukleotide, Polynukleotide, Ribozyme, Peptidnuklein- säuren (PNA) sind.
15. Monoantigene Antigen-präsentierende Zelle nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA Regulationselemente wie Enhancer, Promotoren, polyA-kodierende 3 '-Enden zur Transkription der DNA in RNA enthält, die RNA Regulationselemente zur Translation der RNA in
Protein enthält.
16. Verfahren zur Herstellung der monoantigenen antigen-präsentierenden Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 durch ex vivo oder in vivo Verfahren.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei eine Antigen-präsentierende Zelle ex vivo oder in vivo durch Behandlung mit Viren, viralen Vektoren, bakteriellen Vektoren, Plasmiden, die durch viralen Gentransfer, E- lektroporationstechniken, lontophorese, ballistischen Methoden und/oder anderen Techniken zur Einschleusung von Molekülen in eine monoantigene Antigen-präsentierende Zelle transfiziert wird.
18. Verfahren nach Anspruch 16 und/oder 17, wobei eine Antigen- präsentierende Zelle oder eine monoantigene Antigen-präsentierende
Zelle durch Behandlung mit Viren, viralen Vektoren, bakteriellen Vektoren, Plasmiden die durch viralen Gentransfer, Elektroporationstechniken, lontophorese, ballistischen Methoden und/oder anderen Techniken zur Einschleusung von Molekülen in eine Zelle mit erhöhter Produktion von CTLA4 bindenden Molekülen und gegebenenfalls mit supprimierter Funktion co-stimulatorischer Rezeptoren transfiziert wird, die Expression co-stimulatorischer Rezeptoren durch Verhinderung deren Expression oder die co-stimulatorischen Rezeptoren durch Reaktion mit affinen Strukturen an einer Stimulation von T-Zellen, die an die monoantigene Antigen-präsentierende Zelle gebunden sind, verhindert wird.
19. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei Moleküle wie Antikörper, Proteine, Peptide, Peptidomimetica, CTLA4 bindende Moleküle, CTLA4, CD28, CD40L und/oder Bestandteile und/oder Kombinationen dieser Moleküle, die z.B. CTLA4, B7-1, B7-2, CD40 binden, welche eine in Gegenwart einer Antigenpräsentation stattfindende Co-Stimulation der T-Zelle behindert, mit der monoantigenen antigen-präsentierenden Zelle oder der antigen-präsentierenden Zelle in Kontakt gebracht werden.
20. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei die Moleküle gemäß Anspruch 17 durch Vehikel, wie Liposomen, Hydrogele,
Zyklodextrine, Nanokapseln, Nanopartikel, bio-adhäsive Mikrokugeln und/oder durch Elektroporationstechniken, lontophorese, ballistische Methoden und/oder andere Techniken zur Einschleusung von Molekülen in die monoantigene Antigen-präsentierende Zelle oder die Antigen- präsentierende Zelle transferiert werden.
21. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei Nukleinsäuren durch Viren, virale Vektoren, bakterielle Vektoren, Plasmide die durch viralen Gentransfer, Elektroporationstechniken, Ion- tophorese, ballistische Methoden und/oder andere Techniken zur Einschleusung von Molekülen in die monoantigene Antigen-präsentierende Zelle oder die Antigen-präsentierende Zelle transferiert werden.
22. Arzneimittel enthaltend mindestens eine monoantigene Antigen- präsentierende Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bisl5.
23. Arzneimittel nach Anspruch 22, wobei mindestens eine monoantigene Antigen-präsentierende Zelle als Infusionslösung zur intravenösen oder intraperitonealen Applikation formuliert ist.
24. Verwendung mindestens einer monoantigenen antigen-präsentierenden Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ungewollten Immunreaktionen, wie Autoimmunerkrankungen und Allergien oder gewollt hervorgerufenen Immunreaktionen, wie bei Immunisierungen.
25. Verwendung mindestens einer monoantigenen antigen-präsentierenden Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von' Immunreaktionen gegen allolo- ge und/oder xenologe Gewebsmerkmale.
26. Verwendung nach Anspruch 24, wobei die zu behandelnden Immunreaktionen in Verbindung mit Antigenen oder deren Gensequenzen und/oder Teilen davon stehen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Enzymen, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbe- sondere Glutamic acid decarboxylase (GAD), Rezeptor-Typ Protein
Tyrosin Phosphatase IA-2Beta, H+K+ATPase, U1RNP, Transglu- taminase, Argininosuccinatelyase (ASL), Tyrosinase-related pro- tein-2, Thyroid Peroxidase, Faktor VIII, Faktor IX;
- Rezeptoren, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Acetylcholinrezeptor vom Nicotintyp, Myasthenia gravis, ßl-adrenerger Rezeptor, αl-adreneger-Rezeptor, Angiotensin-2- ATI-Rezeptor, Glutamat-Rezeptor, Thyrotropin-stimulierendes Hormon (TSH)-Rezeptor, LFA-1, HLA-B27, Epididymal Protein DE, Zona Pellucida (ZP)-3 Glycoprotein, Zona Pellucida (ZP)-4 Glycoprotein, Follicle-Stimulating Hormone (FSH) Rezeptor, Sperm Immunogen SP-10 oder Sperm Protein SP-10;
Hormone oder Botenstoffe, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Insulin, Thyroglobulin, Follicle-Stimulating Hormone (FSH), Prostaglandin F2 alpha, Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH), Oestradiol-17beta, Oestrogen, Luteinizing
Hormon (LH) Rezeptor, Inhibin, Testosteron, Androgen, Chorionic Gonadotrophin (CG), Interieukine, Interferone, Cytokine, Chemokine, Bone Morphogenetic Factors, ß-Interferon, Estradiol;
Strukturproteine, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Myelin Basic Protein (MBP), Proteolipid protein (PLP), Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), α-Fodrin, Nicht-erythroides α-Spectrin, Beta-Amyloid Precursor Protein (beta-APP), Typ 2 Kollagen, Sperm Plasma Membran Protein PH- 20;
Antigene, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere CENP- A Autoantigen, Beta2GP-I, ribosomales P Protein, Ro/SSA, La/SSB, Sm/RNP, Sm, Scl-70, Jo-1, BCOADC-E2, Albu- min, Glucagon, Inselzellantigene, Retinal S Ag;
Allergene, die eine IgE-Antwort auslösen, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere Der f 1, Der f 2, Der f 3, Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 8, Eur m 1, Lep d 2, Fei d 1, Can f 1, Can f 2, Mus m 1, Rat n 1, Bla g 1, Bla g 2,
Bla g 4, Bla g 5, Per a 1, Bienengift Phospholipase A2 (PLA2), Group V major allergen Phl p 5b von Timothy Grass Pollen, Hom s 1.
27. Verwendung nach Anspruch 25, wobei die zu behandelnden Immunreaktionen in Verbindung mit allologen und/oder xenologen Gewebsmerkmalen, deren Gensequenzen und/oder Teilsequenzen, insbesondere MHC I, MHC II, Rhesus Faktor steht.
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