WO2000065045A1

WO2000065045A1 - Gene 419 associe a la pollinose

Info

Publication number: WO2000065045A1
Application number: PCT/JP2000/002729
Authority: WO
Inventors: Takeshi Nagasu; Yuji Sugita; Tomoko Fujishima; Tadahiro Oshida; Masaya Obayashi; Shigemichi Gunji; Izumi Obayashi; Yukiho Imai; Nei Yoshida; Kaoru Ogawa; Keiko Matsui
Original assignee: Genox Research, Inc.
Priority date: 1999-04-27
Filing date: 2000-04-26
Publication date: 2000-11-02
Also published as: JP2003125776A

Description

明細書花粉症関連遺伝子、 4 1 9 技術分野

本発明は、アレルギー疾患、特に花粉症に関連する遺伝子、並びに該遺伝子の発現を指標としたァレルギ一疾患の検査方法およびァレルギ一疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。従来の技術

花粉症を含むアレルギー疾患は多因子性の病気 (mu l t i f ac tor i al d i seases)と考えられている。これらの病気は多くの異なる遺伝子の発現の相互作用によって起こり、これらの個々の遺伝子の発現は、複数の環境要因によつて影響を受ける。このため、特定の病気を起こす特定の遺伝子を解明することは、非常に困難である。

またアレルギー疾患は、変異や欠陥を有する遺伝子の発現や、特定の遺伝子の過剰発現や発現量の減少が関わっていると考えられている。病気に関して遺伝子発現が果たしている役割を解明するためには、遺伝子が発症にどのように関わり、薬剤などの外的な刺激が遺伝子発現をどのように変化させるのかを理解する必要がある。

近年の遺伝子発現の解析技術の発達により、多くの臨床試料で、遺伝子の発現を解析 ·比較することが可能となった。このような方法としては、ディファレンシャルディスプレイ（DD)法が有用である。ディファレンシャルディスプレイ法は、ライアンおよびパディ一（L i ang and Pardee)によって 1992 年に最初に開発された（Sc i ence, 1992， 257 : 967- 971)。この方法を用いることによって、 1回に数十種類以上のサンプルをスクリーニングすることができ、それらのサンプル中で発現が変化した遺伝子を検出することが可能である。このような方法を用いて、変異が生じた遺伝子や、時間や環境とともに発現が変わるような遺伝子を調べることによって、病因遺伝子の解明のために重要な情報がもたらされることが期待される。これらの遺伝子には、環境要因によって発現に影響を受けるような遺伝子も含まれる。

アレルギー疾患の中でも花粉症は、近年多くの人に見られる疾患の一つである。花粉症の病因には、環境要因の一つである花粉によって発現が影響を受ける複数の遺伝子が関わっていると考えられる。このような事情から、花粉症に関連する遺伝子を単離することが望まれていた。発明の開示

本発明は、アレルギー疾患、特に花粉症に関連する遺伝子を提供することを課題とする。さらに、本発明は該遺伝子の発現を指標とした、アレルギー疾患の検查方法およびアレルギー疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、既に確立された「蛍光 DD (F luorescen t DD)法」（T. I t oら， 199 4, FEBS Le t t . 351 : 231-236) の手順に基づき、複数のヒトの血液から調製した T細胞 RNAサンプルを解析できる DDシステムを新たに開発した。このシステムを用いて、本発明者らは花粉症患者を含む複数の被験者について、花粉飛散の前後の血液から T細胞を採取し、スギ花粉特異的 IgE値の異なる被験者間や花粉飛散前後で発現量が変化する遺伝子のスクリーニングを行い、新規遺伝子（「419」遺伝子）を単離した。

本発明者らは、被験者をスギ花粉に対する IgE値の高い群（スギ花粉症素因群）とそれ以外の群（健常者）に分け、単離した「419」遺伝子の発現量を両群において比較解析した結果、該遺伝子が健常者と比較してスギ花粉症素因群において有意に低値を示すことを見出した。このため、本発明者らは、該遺伝子の発現量を指標として、ァレルギ一疾患の検査およびァレルギ一疾患治療薬候補化合物のスクリーニングを行うことが可能であることを見出した。

すなわち、本発明は、アレルギー素因を有する者に高い発現を示す遺伝子、および該遺伝子の発現を指標としたァレルギ一疾患の検査方法およびァレルギー疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。より具体的には、以下の核酸分子とその用途に関する。

〔1〕次の（a ) 〜（d ) のいずれかに記載の核酸分子。

( a ) 配列番号： 1 9に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸分子、

( b ) 配列番号： 2 0に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸分子、

( c ) 配列番号： 1 9に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、配列番号： 2 0に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする核酸分子、

( d ) 配列番号： 2 0に記載のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、およびまたは付加したアミノ酸配列からなり、配列番号： 2 0に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする核酸分子、

〔2〕〔1〕に記載の核酸分子によってコードされるタンパク質。

〔3〕〔1〕に記載の核酸分子が挿入されたべクタ一。

〔4〕〔1〕に記載の核酸分子、または〔3〕に記載のベクターを発現可能に保持する形質転換体。

〔5〕〔4〕に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、〔2〕に記載のタンパク質を製造する方法。

〔6〕配列番号： 1 9に記載の塩基配列からなる核酸分子、またはその相補鎖とハイブリダィズするポリヌクレオチドであって、少なくとも 1 5ヌクレオチドの鎖長を有するポリヌクレオチド。〔7〕〔6〕に記載のポリヌクレオチドからなる〔1〕に記載の核酸分子合成用

〔8〕〔6〕に記載のポリヌクレオチドからなる〔1〕に記載の核酸分子検出用プローブ。

〔9〕〔2〕に記載のタンパク質に対する抗体。

〔1 0〕〔6〕に記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、〔1〕に記載の核酸分子の検出方法。

〔1 1〕生体試料中の配列番号： 1 9に記載の塩基配列からなる遺伝子の発現レベルを測定し、対照（健常者の場合）と比較する工程を含む、アレルギー疾患の検査方法。

〔1 2 ) 生体試料が T細胞であり、 T細胞における遺伝子の発現レベルを、 mRNAを铸型とする RT- PCRによって測定する〔1 1〕に記載の方法。

〔1 3〕 RT- PCRを PCR増幅モニター法により行う、〔1 2〕に記載の方法。

〔1 4〕 T細胞が被験者の末梢血から調製される、〔1 1〕から〔1 3〕のいずれかに記載の方法。

〔1 5〕生体試料が血液であり、血中の配列番号： 2 0に示すアミノ酸配列からなるタンパク質およびまたはその断片を測定することによって遺伝子の発現レベルを測定する〔1 1〕に記載の方法。

〔1 6〕アレルギ一疾患がスギ花粉症である、〔1 1〕から〔1 5〕のいずれかに記載の方法。

〔1 7〕アレルギー疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

( a ) 花粉症のモデル動物に被検化合物の投与および花粉抗原による刺激を行う工程、

( b ) 該モデル動物の T細胞における配列番号： 1 9に記載の塩基配列からなる遺伝子の発現レベルを測定する工程、 (c) 対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（b) において測定される遺伝子の発現レベルを増大させる化合物を選択する工程、を含む方法。

〔18〕アレルギー疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

(a) 被検化合物を花粉症のモデル動物に投与する工程、

( b ) 該モデル動物からリンパ球を調製する工程、

(c ) 該リンパ球を花粉抗原で刺激する工程、

( d ) 該抗原刺激を受けたリンパ球から T細胞を分離する工程、

(e) 該 T細胞における配列番号： 19に記載の塩基配列からなる遺伝子の発現レベルを測定する工程、

( f ) 対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（e) において測定される遺伝子の発現レベルを増大させる化合物を選択する工程、を含む方法。

〔19〕アレルギー疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

( a ) 花粉症のモデル動物または花粉症を有するヒトからリンパ球を調製する工程、

(b) 被検化合物の存在下、該リンパ球を花粉抗原で刺激する工程、

(c) 該抗原刺激を受けたリンパ球から T細胞を分離する工程、

(d) 該 T細胞における配列番号： 19に記載の塩基配列からなる遺伝子の発現レベルを測定する工程、

(e) 対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（d) において測定される遺伝子の発現レベルを増大させる化合物を選択する工程、を含む方法。

〔20〕アレルギー疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

(a) 被検化合物の存在下、株化 T細胞をリンパ球刺激物質で刺激するェ程、

(b) 株化 T細胞における配列番号： 19に記載の塩基配列からなる遺伝子の発現レベルを測定する工程、

(c) 対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（b) において測定される遺伝子の発現レベルを増大させる化合物を選択する工程、を含む方法。

〔21〕遺伝子の発現レベルを、 mRNAを铸型とする RT-PCRによって測定する〔17〕から〔20〕のいずれかに記載の方法。

〔22〕 T細胞が、花粉症のモデル動物の末梢血から調製される、〔17〕に記載の方法。

〔23〕リンパ球が末梢血から調製される、〔18〕または〔19〕に記載の方法。

〔24〕アレルギー疾患がスギ花粉症である、〔17〕から〔23〕のいずれかに記載の方法。

本発明において、アレルギー疾患（allergic desease)とはアレルギー反応の関与する疾患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定され、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義することができる。ここで、免疫学的な機序とは、アレルゲンの刺激によって T細胞が免疫応答を示すことを意味する。代表的なアレルギ一疾患には、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、花粉症、あるいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギー素因（allergic diathesi s)とは、アレルギー疾患を持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性に発症するアレルギー疾患はアトピー性疾患とも呼ばれ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。なお、本発明における「核酸分子」には、 DNAおよび RNAが含まれる。また、本発明における「アレルギー疾患の検査」には、アレルギー疾患を発症している患者に対する検査だけでなく、アレルギー疾患を発症していない被験者に対してアレルギー素因を有するか否かを判定するための検査も含まれる。

本発明は、個体のスギ花粉に対する IgE産生反応に相関する新規な遺伝子「41 9」に関する。本発明者らにより見出された「419」 cDNAの塩基配列を配列番号： 1 9に示す。

「419」 cDNAの塩基配列は、 DD法によって単離された断片の配列をもとに、それと相同性を有する EST配列の重ね合わせを行い、さらに RACE法（Frohman, M. A. et al.： Pro Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8992, 1988) によって約 3.2kbまで延長された（配列番号： 1、 3157bp)。次いでこの配列番号： 1との相同性検索により、より 5'側の配列を含む EST、 KIM0887が見出された。 KIM0887の配列をプローブとして T細胞由来 cDNAライブラリーをプラークハイブリダィゼーシヨンによってスクリーニングすることにより「419」 c DNAの全長塩基配列（配列番号： 1 9、 4503bp) が明らかにされた。更に本発明者らは、「419」によってコードされるアミノ酸配列（配列番号： 2 0) をも決定した。本発明における「419」の塩基配列（配列番号： 1 9) は、ホモロジ一サーチの結果、新規な遺伝子であることが確認された。本発明出願後に公開された ESTである KIAA0887は、配列番号： 1を含み更にその 5'側の領域をも含む塩基配列からなっていたが、その 0RFは明らかにされていなかった。また、 KI 0887は単なる ESTであり、アレルギー疾患との関連性も示唆されていなかった。一方「419」によってコードされるァミノ酸配列については、比較的相同性の高いアミノ酸配列としてヒト FAF-l(Fas Associated factor 1)が見出された。しかし FAF-1もアレルギ一疾患との関連性を明らかにした報告は無く、本発明者らが得た知見は新規なものである。

更に本発明者らは、各種免疫関連組織における「419」の遺伝子発現を比較した結果、この遺伝子がほとんどの免疫組織で発現していることを確認した（実施例 9、あるいは実施例 1 2 )。このことは、「41 9」が免疫機能に深く関与している可能性を裏付けるものである。また、「419」によってコードされるアミノ酸配列は、公知のタンパク質との相同性検索の結果、ヒト FAF-1との相同性を有することが見出された（ホモロジ一約 26 % )。 FAF-1は Fasの細胞内ドメインと結合することが知られているが、 Fas- Fas 1 i gandシステムはアポ！ ^一シスによる免疫反応の抑制的調節や、末梢の自己反応性 Tリンパ球の除去において重要な役割を果たしており、 FAF-1も Fasのシグナル伝達経路において、免疫反応の調節に一定の役割を果たしているものと考えられている。本発明の遺伝子「41 9」はアレルギ一疾患患者の T細胞において発現の低下が認められており、「41 9」によってコードされるタンパク質も、 FAF- 1と同様に，例えばアレルギー疾患における感作された T細胞のアポトーシスを通して免疫反応の調節に関連していることが期待でさる。

本発明の核酸分子は、配列番号： 1 9に示す塩基配列を含む核酸分子のみならず、この核酸分子とストリンジェントな条件下でハイプリダイズすることができ、配列番号： 2 0と機能的に同等なタンパク質をコードする核酸分子を含む。本発明においてストリンジェントな条件とは、たとえば次のような条件を示すことができる。ハイブリダィズの条件は、核酸分子の鎖長や構成塩基に応じて、調整することができる。

ハイブリダィズ条件：

5 X SSC

7 SDS

5 0〜6 0で

洗浄条件：

0 . 1 X SSC

0 . 1 % SDS

6 0〜7 0でまた本発明において、「419」と機能的に同等とは、アトピー素因群（スギ花粉に対する IgE値が 3.5 AU/ml以上）において、アトピー非素因群よりも有意に低い発現を示すことを意味する。ストリンジェントな条件下でハイブリダィズすることができる核酸分子は、構造的に相同性の高いタンパク質をコードしている可能性が高いので、このような条件下でスクリーニングすることにより、本発明における「419」と機能的に同等なタンパク質をコードする核酸分子を得ることがでさる。

更に本発明の核酸分子は、配列番号： 20に示すアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列からなり、配列番号： 20に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする核酸分子を含む。

本発明の核酸分子は、配列番号： 1 9に記載した塩基配列情報を基に、公知の方法によって得ることができる。たとえば、ヒト T細胞の cDNAライブラリーを、配列番号： 1 9の塩基配列に基づいて設定したプローブでスクリーニングすることにより目的とする cDNAを選択することができる。あるいは配列番号： 1 9に示す塩基配列に基づいて設定したプライマーによって PCRを行って、目的とする遺伝子を増幅することもできる。スクリ一ニング用のライブラリーや PCRのためのテンプレートとして、ヒト以外の動物のリンパ球に由来する cDNAを用いれば，「4 19」の他の種におけるホモログを得ることができる。更に，配列番号： 1 9に示した塩基配列を化学的に合成することもできる。このような分子遺伝学的な手法には、公知の方法（Sambrook 〗.， Fritsch, E. F. , and Maniatis T. Molecular cloning ： A Laboratory Manual (2nd edi tion). Cold Spring Harbor Laborat ory Press, Cold Spring Harbor.) を利用することができる。

このようにして得られる本発明の核酸分子は、本発明のタンパク質「419」を組み換え体として産生させるために有用である。組み変え体として得られた本発明のタンパク質は，「419」に対する抗体を得るための免疫原として用いることがでさる。

あるいは本発明は、配列番号： 1 9に記載の塩基配列からなる核酸分子、またはその相補鎖とハイブリダィズするポリヌクレオチドであって、少なくとも 1 5 ヌクレオチドの鎖長を有するポリヌクレオチドに関する。当業者は、与えられた塩基配列に対してハイプリダイズすることができるポリヌクレオチドを設計することができる。更に、配列番号： 1 9の塩基配列に特異的にハイブリダィズするもののみならず、構造的に類似した未知の塩基配列に対してハイブリダィズすることができるプローブやプライマーを設計する方法も公知である。設計された塩基配列を持つポリヌクレオチドは、ジデォキシ法等の手法によって化学的に合成することができる。あるいは、 cDNAクローンを適当な制限酵素で切断することによって、必要な塩基配列からなるポリヌクレオチドを得ることもできる。これらのポリヌクレオチドは、本発明の核酸分子の検出や合成のためのプローブやブライマ一として有用である。

「419」は、アトピー素因群（スギ花粉に対する 6値が3. 5 AU/ml以上）の方がアトピー非素因群よりも有意に低い発現を示した。従って、「419」の遺伝子の発現（mRNAへの転写およびタンパク質への翻訳を含む）を指標に、アレルギー疾患の検査およびアレルギー疾患治療薬候補化合物のスクリーニングを行うことが可能であると考えられる。本発明において検査 ·治療の対照となるアレルギー疾患としては、特にスギ花粉症が好ましい。

本発明におけるアレルギー疾患の検査における「419」の遺伝子の発現の検出は、「419」遺伝子にハイブリダィズする核酸をプローブとしたハイブリダィゼーション技術、または本発明の遺伝子にハイブリダィズする DNAをプライマーとした遺伝子増幅技術を利用して行うことが可能である。

本発明の検査に用いられるプローブまたはプライマ一としては、「419」遺伝子に特異的にハイブリダイズし、少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有する核酸分子が用いられる。ここで「特異的にハイブリダィズする」とは、通常のハイプリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダィゼーション条件下で、他の遺伝子をコードする DNAおよび Zまたは RNAとクロスハイブリダィゼーシヨンが有意に生じないことを指す。たとえば、 Express Hybridization Solution (CL0NTECH社製）中でプローブと転写膜を 681：でハイブリダィゼーションし、最終的に 0.1 X SSC, 0.05% SDS溶液にて、 50でで洗浄することにより、ストリンジェントな条件とすることができる。

本発明の検査に用いるこれら核酸分子は合成されたものでも天然のものでもよレ^ また、ハイブリダィゼーシヨンに用いるプローブ DNAは、通常、標識したものが用いられる。標識としては、例えば、 DNAポリメラーゼ 1を用いるニックトランスレーシヨンによる標識、ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識、クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識（Berger SL， Ki腿 el AR. (1987) Guide to Molecular Cloning Techniques, Method in Enzymology, Academic P ress； Hames BD, Higgins SJ (1985) Genes Probes： A Practical Approach. IR L Press； Sambrook J, Fri tsch EF, Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press),腿ポリメラーゼを用いる転写による標識 (Melton DA, Krieg, PA, Rebagkiati MR, Ma niatis T, Zinn K, Green MR. (1984) Nucleic Acid Res., 12, 7035- 7056)、放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドを DNAに取り込ませる方法 (Kricka LJ. (1 992) Nonisotopic DNA Probing Techniques. Academic Press)等が挙げられる。ハイブリダィゼ一シヨン技術を利用したアレルギー疾患の検査は、例えば、ノ —ザンハイブリダィゼーシヨン法、ドットブロット法、 DNAマイクロアレイを用いた方法などを使用して行うことができる。 - 一方、遺伝子増幅技術を利用した方法としては、例えば、 RT-PCR法を用いることができる。 RT-PCR法においては、遺伝子の増幅過程において実施例 8に示すように PCR増幅モニター法を用いれば、「419」遺伝子の発現レベルをより正確に定量することができる。 PCR遺伝子増幅モニタ一法においては、両端に互いの蛍光を打ち消し合う異なつた蛍光色素で標識したプローブを用い、検出対象（DNAもしくは RNAの逆転写産物）にハイブリダィズさせる。 PCR反応が進んで Taqポリメラーゼの 5' -3' ェクソヌクレア一ゼ（exonuclease)活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の明らかな標準試料について同時に測定することにより、 PCR増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Holland, P.M. et al. , 1991, Pro atl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280; Livak, K. J. et al. , 1995, PCR Methods and Applications 4(6)： 357-362; Heid, C. A. et al. , Genome Research 6:986-994; Gibson, E. M. U. et al., 1996, Genome Research 6:995-1001)。 PCR増幅モニター法においては、例えば、 ABI PRISM7700 (パーキンエルマ一社）を用いることができる。

また、本発明のアレルギー疾患の検査は、「419」によりコードされるタンパク質を検出することにより行うことも考えられる。このような検査方法としては、例えば、「419」によりコードされるタンパク質に結合する抗体を利用したウェス夕ンブロッテイング法、免疫沈降法、 ELISA法などを利用することができる。夕ンパク質の検出を行うための試料には、 T細胞のライセートや血清や血漿などの血液試料を用いることができる。あるいは T細胞を含む全血試料を溶血させて試料とすることもできる。

本発明の「419」によりコードされるタンパク質の抗体は、当業者に周知の技法を用いて、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる (Milstein C， et al. , 1983, Nature 305 (5934)： 537-40)。抗原に用いるタンパク質もしくはその部分ペプチドは、例えば「419」遺伝子もしくはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換えタンパク質を発現させ、発現させた組み換え夕ンパク質を培養体または培養上清から精製することにより得ることができる。本発明によるアレルギー疾患の検査の結果、本発明の遺伝子の発現が有意に低ければ、被験者は例えばスギ花粉抗原のようなアレルゲンに対する IgE値が高く、ァレルギ一素因を有すると判定することができる。ァレルゲン特異的抗体価や、症状などと併せて、本発明の遺伝子の発現レベルの測定を、アレルギー疾患の検査に用いることが可能である。

T細胞に発現する「419」遺伝子は花粉抗原に対する特異的 IgEの高い、花粉症患者群において発現が低下している。スギ花粉以外の抗原に対する応答性を示すアレルギー患者においても、当該抗原に対する T細胞の応答性の亢進している状態で「419」遺伝子の発現が低下する可能性がある。このようなケースでは「419」遺伝子の発現低下が T細胞の応答性の亢進に対応しており、従って「419」遺伝子の発現をモニタ一することによってアレルギー疾患治療薬のスクリーニングを行うことができる。

本発明のアレルギー疾患治療候補化合物のスクリーニング方法は、 in vivo で行なうことも in vi t ro で行なうこともできる。 in vivo でのスクリーニングにおいては、例えば、マウス等のモデル動物に、候補薬剤の投与および花粉抗原での刺激を行った後、末梢血より T細胞を分離し、「419」の転写産物を測定する。あるいは、マウス等のモデル動物に候補薬剤を投与した後、末梢血よりリンパ球を分離し、該リンパ球をスギ花粉抗原等で in vi t ro で刺激する。該刺激後のリンパ球から T細胞を分離し、その「419」遺伝子の転写産物を測定する。これら測定の結果、「419」遺伝子の転写量を増大させる化合物を選択する。ここで花粉抗原による刺激は、 T細胞において抗原特異的なアレルギー反応を惹起し、それに対する候補化合物の治療効果を判定することを目的として行うものである。

また、 in vi t roでのスクリーニングにおいては、例えば、花粉症のヒトまたはマウス等から末梢血リンパ球を採取し、スギ花粉抗原などで、該末梢血リンパ球を in vi t ro で刺激する。 in vi t ro 刺激の際に候補化合物を添加する。その後、刺激された末梢血リンパ球から T細胞を分離し、「419」の転写産物を測定する。この測定の結果、「419」遺伝子の転写量を増大させる化合物を選択する。

また、本発明のアレルギー疾患治療候補化合物のスクリーニングは、株化 T細胞を用いて行なうこともできる。例えば、 Mol t4細胞、 Jurkat細胞などの株化 T 細胞をリンパ球刺激物質で i n vi t ro で刺激する。リンパ球刺激物質としては、例えば、カルシウムィオノフォア（A23187)、 PMA、フイトへマグルチニン（PHA) などが挙げられる。 in vi tro 刺激の際に候補薬剤を添加する。その後、該株化 T 細胞における「419」遺伝子の転写量を測定する。この測定の結果、「419」遺伝子の転写を増大させる化合物を選択する。

アレルギー疾患治療候補化合物のスクリーニングにおける「419」の遺伝子の発現の検出は、本発明のアレルギー疾患の検査と同様、「419」遺伝子にハイブリダィズする核酸をプローブとしたハイブリダィゼーション技術、または本発明の遺伝子にハイブリダィズする DNAをプライマ一とした遺伝子増幅技術を利用して行うことが可能である。

ハイブリダィゼーシヨン技術を利用した方法としては、例えば、ノーザンハイブリダィゼーシヨン法、ドットブロット法、 DNAマイクロアレイを用いた方法などを使用して行うことができる。一方、遺伝子増幅技術を利用した方法としては、 RT - PCR法を用いることができる。 RT-PCR法においては、遺伝子の増幅過程において実施例 8に示すような PCR増幅モニター法を用いれば、「419」遺伝子の発現レベルをより正確に定量することができる。リンパ球や T細胞の分離、 T細胞からの RNAの抽出、あるいは cDNAの合成などの操作は、実施例に示すような公知の手法にしたがって実施することができる。

これらスクリーニングに用いる被検化合物としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物標品、コンビナトリァルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動 ·植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。本発明のアレルギー疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法により単離される化合物は、花粉抗原等のアレルゲンに対するアレルギー素因を改善する薬剤の候補になる。

本発明のスクリーニング方法により単離される化合物を、医薬品として用いる場合には、公知の製剤学的製造法により製剤化して用いることが可能である。例えば、薬理学上許容される担体または媒体（生理食塩水、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤など）とともに患者に投与される。投与は、化合物の性質に応じて、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、静脈内、または経口的に行われる。投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択することが可能である。図面の簡単な説明

図 1は、血液を採取した被験者 10人、計 18の血液試料におけるスギ花粉特異的 IgE抗体の抗体価を表す図である。被験者 A〜〗（試料番号 1〜18) の各血液試料のスギ花粉特異的 IgE抗体の値を AUZml で表した。花粉飛散前を左（白い力ラム）、飛散後を右（黒いカラム）に対で表した。被験者 Aおよび Bは、花粉飛散後の血液のみ採取した。

図 2は、スギ花粉特異的 IgE値によって群分けした場合の高 IgE群および正常 IgE群における「419」の発現変化を示す図である。エラーバーは標準偏差を表す。図 3は、各種免疫関連組織から調製した mRNAを用いて「419」のノーザンハイブリダィゼ一ションを行った結果を示す写真である。

図 4は、各種癌細胞株から調製した mRNAを用いて「419」のノーザンハイプリダイゼ一シヨンを行った結果を示す写真である。

図 5は、「419」と FAF-1との構造的な特徴を比較した結果を示す図である。図中 hFAFl sで示したのは、 FAF-1の al ternat ive spl i c ing formとして報告されたタンパク質の構造を示したものである。

図 6は、ヒトの各種組織から調製した mRNAを用いて「419」のノーザンハイブリダィゼーションを行った結果を示す写真である。

図 7は、「419」と FAF-1の花粉症患者における発現パターンを比較した結果をまとめた図である。上段のグラフは、各患者における花粉飛散前後の各遺伝子のコピー数を示している。下段のグラフは、 IgE測定値の高い群と低い群における各遺伝子のコピー数の平均を比較した結果である。エラーバーは標準偏差を表す。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

[実施例 1] 10人の成人ポランティアからの血液採取

花粉飛散前後の T細胞を採取するため、成人ポランティア 10名 (A〜； I)から 10 mlの血液サンプルを、花粉飛散前および花粉飛散後に採取した。最初の血液サンプルは、日本のスギ花粉飛散の季節の前（1997年 1月および 2月）に採取し、 2回目は日本のスギ花粉飛散後（1997年 3、 4および 5月）に採取した。ポランティアのうち 8人については、 2つの時期のサンプルを得た。残る 2名のポランティアに関しては、花粉飛散後のサンプルのみ入手できた。これらの血液サンプルの一部を用いて、スギ花粉特異的 IgEの量を測定した。特異的 IgEの測定はペーパーディスクを固相とする RAST法（radio allergo sorbent test, Wide, L. et， al.： Lancet 2: 1105-1107, 1967) を改良した CAP RAST法（Pharmacia社）により行つた。 Pharmacia社製の標準の抗体価を含む血清を用いて、それを基準にしてそれぞれの検体の IgE抗体価（単位は Pharmacia RAST Unit, PRU、あるいは AU (a rbitrary unit) とも表示する）を決定した。

測定された各被験者における花粉飛散前後でのスギ花粉特異的 IgE値を図 1に示す。図に示されるように、 10人の被験者の大半で、花粉被曝後にスギ花粉特異的 IgEの血清中の濃度が増加した。アトピー素因を有するかどうかは、スギ花粉特異的 IgEの CAP RAST試験の値が 2より大きいかどうかで判断した。すなわち、被験者 A〜Gおよび Iの 8人の被験者をアトピー素因群（以後「患者」とも記す）、被験者 H、】の 2人を健常者（以後「正常群」とも記す）とした。 8人のアトピー素因を有する被験者のうち 7人が、花粉飛散後にアレルギー性鼻炎の症状を示した。

[実施例 2 ] 血液試料からのリンパ球画分の調製

血液 10 mlから T細胞を調製する場合は、以下のようにした。まずノボ社製等のへパリン 1 mlで注射筒壁を万遍なく処理し、最終濃度 50 unitZmlのへパリンを含む 10 ml注射筒に採血した。このとき一人の採血に 22G針を 2本準備した。注射針をはずし、 50 mlの遠心チューブ（ポリプロピレン製）に移した。 1500 rp m、室温で 5分間遠心し、できるだけ表面近くから 1.1 ml を採取し、 15000 rpm で 5分間、 4でで遠心して上清 1 mlを血漿（plasma)として回収した。血漿を回収した残りに 3%のデキストラン（ナカライ社製）を含む 0.9% NaClを等量（9 m 1) 加え、静かに数回転倒させて混和した。その後 30分間室温で静置した。 PRP( Platelet rich plasma，血小板に富む血漿）を別の 15 ml遠心チューブに移し、 12 00 rpm (トミー社製の遠心機で 150Xgに相当する）で 5分間、室温で遠心した。遠心後、血小板は上清にあった。沈殿した細胞をギブコ社等から入手した Ca、 Mg 不含の HBSS 5 mlに懸濁した。これを、パスツールピペットを用いて Ficol Paqu e (フアルマシア社製）が 5 mlが入ったチューブ（ファルコンチューブ： 2006または 2059；ポリプロピレン製） 1本に上層した。 1200 ι·ριηで 5分間遠心後、 1500 rpm (Tomy社製の遠心機で 400Xgに相当する）で 30分間室温で遠心した。その結果、顆粒細胞（granulocyte；)、赤血球（erythrocyte)が沈殿し、フイコール層を挟んで中間層にリンパ球（ ly即 hocy t e)、単球 (monocy t e)、血小板 (platelet)が含まれた。

パスツールピペットで中間層を回収し、 2〜3倍の容量の BSAZPBS(0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS, pH7.2；使用直前に脱気した）を添加し、 1200 rpm, 4でで 5 分間遠心した。沈殿を回収し、 BSAZPBSで 2回洗浄した。 2回目の洗浄後、細胞を 5 mlに懸濁し、その一部をトリパンブルーで 2倍に希釈して細胞数を測定した全細胞数は約 1X10⁷であった。これをリンパ球画分とした。

[実施例 3] リンパ球画分からの T細胞の分離

実施例 2で得たリンパ球画分を 1200 rpmで 4で、 5分間遠心し、 IOO Iあたり 10⁸になるように BSA/PBSに懸濁した。容量は約 20 1になった。これをエツべンドルフチューブ（1.5 ml) に移し、 CD3マイクロビーズ液を添加した。その後、 30分間 4〜10でに放置した（このとき氷上には置かなかった）。この試料をマグネチックセルソ一ター（MACS) (Miltenyi Biotech In 製）で以下のように処理した。

MS+ZRS+カラムを Mini MACSまたは Vario MACSセパレーシヨンユニットに装着した（針は付けなかった）。 500 1の BSAZPBSをカラムに静かにアプライし、バッファーは流し出した。次に CD3マイクロビーズ標識した細胞をカラムにァプラィした。カラムを 500/zlで 3回洗浄した（B細胞画分）。カラムをセパレーションユニットからはずし、溶出液を集めるチューブ上に置いた。 1 ml の BSAZPBS をカラムにアプライし、カラム添付のプランジャーを用いポジティブ細胞を急速に流し出した。これを T細胞画分とした。

得られた T細胞画分について、 1200 rpm, 5分間 4でで遠心した。沈殿を BSAZ PBSで 2回洗浄した。 2回目の洗浄後、細胞を 1 mlに懸濁し、その一部をトリパンブルーで 2倍に希釈して細胞数を測定した。全細胞数は約 4X10⁶であった。

[実施例 4 ] T細胞からの全 RNAの調製

T細胞からの全 RNAの調製は RNeasy Mini (Qiagen製）を用い、原則として添付のマニュアルに従い行った。操作はすべて手袋を着用して、室温で行った。またゥォッシュバッファ一 RPEに 4倍量のエタノールを加えた。リシスバッファー R LTには 10 1/mlの 2-メルカプトエタノールを加えた。細胞浮遊液を 1000〜120 0 rpmで 5分間遠心し、上清をァスピレーシヨンで除いた。沈殿に 350 1のリシスバッファー RLT(2-メルカプトエタノールを含む）溶液を加えた。この段階で、 R LT バッファ一中の細胞のライセートは、 -701：で保存可能であった。細胞のライセートを冷凍保存していた場合は、 37 で 10〜15分間ィンキュベートして、不溶物が見えるようなら最大速度で 3分間遠心し、上清のみを回収した。このライセートを 20Gの力テラン針を付けた注射筒でホモゲナイズ後、キアシュレッダ一（Q IAshredder)で処理した。（即ち、通常 350 1の細胞のライセ一トをキアシュレツダ一ュニッ卜にピぺットマンを用いてアプライした。これを 1500 卬 mで 2分間遠心し、流出液を回収した。） 350 1の 70%エタノールを加え、ピペッティングしてよく混ぜた。 RNeasyスピンカラムを添付の 2 mlチューブに装着し、細胞のライセ一ト混合物をアプライし、 8000Xg(11500 rpm)で 1分間遠心し、流出液は捨てた。ゥォッシュバッファー RW1 700 1をカラムにアプライし、 5分間フタをした形で立てた。 11500 rpmで 15秒間遠心し、流出液は捨てた。カラムを新しい 2 ml チューブに装着し、ゥォッシュバッファ一 RPE (エタノールを含む） 500 1 をカラムにアプライした後、 11500 rpmで 15秒間遠心し、流出液は捨てた。ゥォッシュバッファ一 RPE 500 1をカラムにアプライし、最大速度で 2分間遠心した。カラムを新しい 1.5 mlチューブに装着し、 DEPC処理した水 1をアプライし、フタをして 10分間立てた。 11500 i"pmで 10分間遠心し、全 RNAを得た。濃度を測定し、量が少ないようなら、再度カラムを新しい 1.5 mlチューブに装着し、 D EPC処理した水 30 1 をアプライし、フタをして 10分間立て、 11500 rpmで 10 分間遠心した。

[実施例 5] 全 RNAの DNase処理

T細胞から調製した全 RNAから DNAを除くため、 DNase処理を行った。反応は 2 ユニットの DNase (二ツボンジーン社）および 50ユニットの RNaseインヒビター

(フアルマシア社）を含む 100//1の lXDNaseバッファ一（二ツボンジーン社）中で行った。これを 37 15分間インキュベートした後、等量の PCI (フエノール：クロ口ホルム：イソアミルアルコール = 25:24:1)を加え、ポルテックスした。 12 000 卬 mで室温、 10分間遠心し、上層（水層）を新しい 1.5 mlチューブに移した。

1Z10量の 3M酢酸ナトリゥム（pH 5.2)を加え、 2.5倍量の 100%エタノールおよびエタ沈メイト 1 ^ 1を加えて、転倒混和させた。 -20でで 15分間静置させた後、 12000 i"pmで 4で、 15分間遠心し、上清を除去し、 70%エタノールを加えた。沈殿がはがれる程度にタッピングした後、上清をきれいに除去した。 3 分間乾燥させ、 10〜20 1 の DDW(DNaseおよび RNase不含）に溶解させた。濃度を測定し、使用まで - 80でに保存した。

[実施例 6] T細胞から調製した全 RNAを用いたディファレンシャルディスプレイ（DD) 解析

T細胞から調製した全 RNAを用いた蛍光ディファレンシャルディスプレイ（F1 uorescent Differential Display, 「DD」と略記する）解析は文献（T. Itoら， 19 94， FEBS Lett. 351: 231-236)に記載の方法に準じて行った。 T細胞から調製した全 RNAを逆転写し、 cDNAを得た。第一次 DD- PCR反応用には 3種のアンカープライマ一の各々について全 RNAの各 0.2 gを用いて cDNAを調製した。第二次 DD -PCR反応用には、 3種のアンカ一プライマ一の各々について RNA OAugを用いて cDNAを調製した。いずれの cDNAも、 0.4ngZ _il RNA相当の最終濃度に希釈し、実験に用いた。 1反応あたり 1 ng RNA相当の cDNAを用いて DD-PCR反応を行った。反応液の組成は表 1の通りである。

cDNA(0.4ng/ 1 RNA相当） 2.5 1

任意プライマ一（2//M) 2.5/zl

lOXAmpliTaq PCRバッファ一 1.0 /1

2.5mM dNTP 0.8 1

50 M アンカープライマ一 O. l zl

(GT15A, GT15C, GT15G)

AmpliTaq (5U/ 1) 0.05 1 dH₂0 3. 0 /z 1 総量 10. 0 i l

PCRの反応条件は、「95^3分、 40で5分、 72で5分」を 1サイクル、続いて、「9 4で15秒、 40^2分、 72で1分」を 30サイクルの後、 72で5分、その後連続的に 4でにした。

使用したプライマー対はアンカ一プライマーである GT15A (配列番号： 2 )、 GT 15C (配列番号： 3 )、および GT15G (配列番号： 4 ) に対して任意プライマーをそれぞれ AG ！〜 110、 AG 111〜199、および AG 200〜287を組み合わせ、計 287組の反応をおこなった。なお、任意プライマ一としては GC含量 50%の 10ヌクレオチドからなるオリゴマーを設計し、合成して用いた。

ゲル電気泳動は、 6 %変性ポリアクリルアミドゲルを作製し、 2. 5 ^ 1 の試料をアプライし、 40Wで 210分間泳動した。その後、日立製蛍光イメージアナライザ -FMBI0 I Iを用いてゲル板をスキャンし、蛍光検出によって泳動画像を得た。

[実施例 7 ] D D解析で切り出したバンドの増幅と配列決定

多数の任意プライマーを用いて 2回の D D解析を行った。花粉飛散前後または患者と健常者のグループの間で差のあるバンドを選択し、 2回の実験で再現性のあるバンドをゲルから切り出した。

切り出したバンドの 1つ（「419」と称する）についてさらに解析を進めた。「4 19」のバンドはアンカープライマ一として GT15A (配列番号： 2 ) を、任意ブライマ一として AG33 (GCCGAATMCZ配列番号： 5 ) を用いた D D解析によって見出された。

「419」の塩基配列を決定するために、「419」のバンドを含むゲルを切り出し、 ΤΕ溶液に保存し 60°C、 10分加温して DNAをゲルから溶出させた。この TE溶液を铸型として DD-PCRと同条件で PCRを行い、約 230bpの DNA断片を増幅した。アンカープライマ一として、 GT15Aを、任意プライマ一として AG33を用いた。増幅した DNA断片をプラスミドベクター pCR2. l (Invi t rogen社）にてクローニングし、約 230b の DNA断片を保持するプラスミド p419- 17を得た。プラスミド DNAを用いて常法に従い DNA断片の塩基配列を決定した。

[実施例 8 ] ABI-7700による定量

ABI- PRI SM7700を用いた TaqMan法により、「419」の発現量の定量を行った。この方法は PCR増幅された DNA鎖を蛍光色素を用いてリアルタイムに定量検出するシステムである。

定量のために新たに 1998年春にスギ花粉飛散前 ·後の血液試料を 22名のボランティアから採取し、 T細胞を調製して全 RNAを抽出した。計 44種の全 RNA試料を用いて目的の遺伝子の発現量を定量した。

実施例 1と同様にしてスギ花粉、ヒノキ花粉、ャケヒヨウダニ、およびコナヒヨウダニの特異的 IgE値、並びに総 IgE値を測定した（表 2 )。

表 2 特異的 lgE (UA ml) 総血樣 BB ] ffl (UA/mi) 八飛

飛敗後散檯

c 飛前 15.2 1.5 68.7 66.1 450 飛敏後 20.3 1.32 .3 .7 330 飛散前

飛散後

飛散前

飛後

fttt航

飛散後

飛敵前

飛) 後

飛 tt抑

飛 tt後

飛 tt前

飛敢後

飛 tt前

飛散後

飛散前 .2

飛 tt後 2.72

L 飛 tt前 0.95 0.39 1.3 1.8 1 3 飛後 2.5 0.51 1.45 2.38 18

M 飛前 0.34 <0.34 0.34 <0.34 36 飛敝後 2.08 0.34 <0.34 <0.34 43

N 飛散前 0.42 0.34 <0.34 0,34 22 飛散後 1.67 <0.34 0.45 <0.34 73

0 飛 tt前 0.54 <0.34 28.1 27.2 180 飛敵後 1.42 0.34 27.2 26.3 160 p 飛敵前 0.38 <0.34 5.08 3.65 280 飛敷後 0.68 0.34 4.49 3.02 240

Q 飛 tt前 <0.34 <0.34 0.34 0.34 < 5.0 飛 tt後 <0.34 <0.34 <0.34 0,34 <5.0 飛 0.34 0.34 <0.34 0.34 53 飛 tt後 <0.34 0.34 <0.34 0.34 62

S 飛 Μίϊΰ <0.34 <0.34 <0.34 0.34 420

<0.34 <0,34 <0.34 0,34 370

T 飛敗前 <0.34 0,34 <0.34 <0.34 82 飛敢後 0.34 <0.34 <0.34 <0.34 62 u 飛敵前 <0.34 <0.34 <0.34 <0.34 18 飛散後 <0.34 <0.34 <0.34 <0.34 16

V 飛散舵 <0.34 0.34 0.79 0.81 180 飛敵後 0.34 <0.34 0.78 0.9 160 実施例 7において決定した DDバンドの塩基配列を基にしてプライマ一 419-5' (CCGAATAACCATGGGAAGTGA/配列番号： 6)、 419-3' (GGGCTCCACTGAGGGTACAA/配列番号： 7)、および TaqManプロ一ブ 419SEQS5 (AAGCAAAGACACTCGATTGGAGTCAGT TGAAZ配列番号： 8) を設計、合成し定量反応に用いた。 TaqManプローブ 419SE QS5 は 5，端を FAM (6-carboxyf luorescein)で、 3，端を TAMRA (6-carboxy-te tramethy卜 rhodamine)で蛍光標識して用いた。铸型には 44種の全 RNAからポリ T (12〜18マー）をプライマーとして逆転写した cDNAを用いた。コピー数を算出する標準曲線のために実施例 7で得たプラスミド P419-17の段階希釈液を铸型として反応を行った。 PCR増幅のモニタリングのための反応液の組成は表 3に示した。また、試料中の cDNA濃度の差を補正するため、 β-ァクチン ( - actin) 遺伝子について同様の定量解析を行い、それら遺伝子のコピー数を基に補正して、目的遺伝子（419) のコピー数を算出した。

表 3

ABI-PRISM 7700の反応組成（ 1ゥエルあたりの反応量）滅菌蒸留水 25.66 (til)

10x TaqMan ノッファー A 5

25mM MgCl₂ 7

dATP(lOmM) 1.2

dCTP(lOmM) 1.2

dGTP(lOmM) 1.2

dUTP(lOmM) 1.2

Forward Primer (IOO M) 0.15

Reverse Primer (100/ M) 0.15

419 TaqMan プローブ（6.7//M) 1.49

A即 liTaq Gold (5U/ D 0.25 AmpErase環 G (1U//ZL) 0.5

テンプレート溶液 5 総量 50

/3 -ァクチンのコピー数で補正した各試料中の「419」の存在数（コピー数）を表 4に示す。補正は全試料における /3 -ァクチンの平均コピーを求め、それを 1としたときの各試料中の )3 -ァクチンの相対値で各試料中の「419」のコピー数を除した。

表 4

ABI7700による定量信 (copy/ngRNA) beta actin補正 data 被 R者血液採取時期バン ID

419

A 飛敗前 123 飛後 1 8

B 飛敗前 212 飛敗後 110

C 飛敗前 124 飛敏後 88

D 飛散前 152

127

E 飛敗前 140 飛敗後 105

F 飛散前 116 飛 tt後 124

G 飛敗前 125 飛敗後 123

H 飛敗前 91 飛敗後 112

1 飛敗前 137 飛 tt後 108

J 飛敏前 131 飛數後 116

K 飛敏前 126

HtiX後 123 し飛散前 359 飛敏後 255

M 飛敏前 68

121

N 飛敗前 234 飛敗後 222

0 飛敏前 237 飛 219

P 飛 tt前 106 飛敏後 187

Q 飛前 115 飛敗後 191

R 飛敏前 186 飛敏後 57

S 飛前 147 飛散後 1 9

T 飛散前 280 飛數後 145 u 飛敗前 176 飛敏後 141

V 飛敏前 276 飛敗後 117 この値を用いて二元配置分散分析を行った。群分けは、スギ花粉飛散前と後、または血清中の各特異的 IgEについて 2回の測定のうち 1回でも 3.5 AU/ml以上を示した群（高 IgEグループ）とそれ以外の群（正常 IgEグループ）の 2つの要因にわけて検定した。各グループの人数は、たとえばスギ花粉の場合、高 IgEグループ 10人：正常 IgEグループ 12人であった。また、総 IgEについて 200 AU /mlを示した群とそれ以外の群に分けて検定した。二元配置分散分析の検定は St atViewソフトウェア（Abacuus Concepts, Inc. ) を用いて行った。

その結果、スギ花粉に対する IgE値で群分けすると、「419」の発現は高 IgEグループにおいて正常 IgEグループよりも有意に低いことが示された（表 5、図 2)。飛散前後のデータを合わせた場合の高 IgEグループおよび正常 IgEグループにおける 419の発現量はそれぞれ 125.5±26.1 および 176.6±72.8 コピー Zng RNA (平均土標準偏差）であった。スギ花粉以外に対する IgE値で群分けしてもこのような差は認められなかった。

表 5

419

[実施例 9] 「419」のノーザンハイブリダィゼ一シヨン

各種免疫関連組織および癌細胞株から調製した mRNAが転写されている膜である Human Immune System MTN Blot II および Human Cancer Cell Line MTN Bio t (CLONTECH社）を用いて、ノーザン解析を行った。

「419」内に特異的なプライマーセット 19-17.5 (AGGACTTTTGGGATTTTGATGAG /配列番号： 9) および AA088445U (TTCTGGGGGTTATCGTCCTTCZ配列番号： 10) を作製し、ヒト末梢血 cDNAライブラリーを铸型として PCRを行い、約 0.5kbの D NA断片を増幅した。増幅断片を Pandom Primer Labeling Kit (TAKARA)を用いて ³²P により標識し、プロ一ブとして用いた。 Express Hybridization Solution (C LONTECH)を用いて、添付使用書通りにノーザンハイブリダイゼーションおよび膜洗浄を行った。洗浄後の膜をイメージングプレートに暴露し、 Molecular Imager System (BI0-RAD)によって画像を取得した。その結果、ほとんどの免疫組織で、 4.6kbの mRNAの発現が認められた（図 3)。各種免疫関連組織のうちでは、脾臓、リンパ節、胎児肝臓に、相対的に強い発現が認められ、白血球および骨髄ではシグナルが弱かった。各種細胞株のうちでは、大腸腺癌（Colorectal Adenocarcin oma)、慢性骨髄性白血病細胞で特に強い発現が認められた（図 4)。

[実施例 10] 「419」のクローニングと塩基配列の解析

DD により単離された「419」の塩基配列について相同性検索をしたところ、この配列を持つ 64の ESTが見出だされた。これらの配列間の相同な領域を、 AutoA ssembler (ABI) を用いてつなぎ合わせ、約 2.5kbの配列を得た。この配列の存在を PCRによる増幅と塩基配列決定によって確認した。 PCRに用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。

419-17.1 AGTTATTCCAAAGTGTTCCGTAG (配列番号： 1 1)

N73633 AGTACAAGTTGGGGCACTGCATC (配列番号： 12)

419-17U AAGACACTCGATTGGAGTCAG (配列番号： 13)

419-17L ATCATGGTGGAGGCAAGCAAG (配列番号： 14)

419-17.5 AGGACTTTTGGGATTTTGATGAG (配列番号： 9)

N78474 CACACCTCTTTGGGGAAGTTACGA (配列番号： 15)

M0LT4 Marathon Ready cDNA を铸型に、 Marathon cDNA Amplification Kit (C LONTECH)を用いて、キット付属の APIプライマーと「419」特異的なプライマー 419-225R (CAGACCCCATAACCACCACCTG 配列番号： 16) を使用して PCRを行つた。増幅した断片をサブクローニングして塩基配列を決定したところ、「419」配列を含む約 0.8kbの新規な配列が得られ、合わせて 3.2kbの「419」配列が決定された。この「419」塩基配列を配列番号： 1に示す。

[実施例 1 1] 全長「419」遺伝子のクローニング

配列番号： 1 (3.2kb) に記載した「419」の断片について相同性検索を行い、 B 419より 5'側に 1335bp長い 4456bpの EST(KIAA0887)を確認した。この EST(KIAA 0887)は、配列番号： 1の塩基配列を含んでいた。実際に EST(KIM0887)内にいくつかの PCR primerを設定して増幅した断片の配列決定を行い、データベースに登録されている塩基配列が正しいことを確認した。 KIAA0887の配列は 5'側に 0RF と思われる配列を含んでいるが、 0RFの 5'末端はまだ決定されていなかった。また、言うまでも無くアレルギー疾患との関連性については何ら示唆されていない。次に Human Tcell Lamda cDNA Library (Jurkat cell line from ATCC) [STARATA GENE] を用いて、プラークハイブリダィゼ一シヨンによるクローニングを行った。プローブには K I AA0887の 5 '側の 0RF内に設定した B419- K3プライマー（GGATCAGTGT CGCCATACCTTG/配列番号： 1 7)、および B419-K4プライマー (GCCGTCCCACCACAGT CAT/配列番号： 18) を用いて、上記の Human Tcell Lamda cDNA Libraryを铸型に増幅後、精製した約 0.6kbの PCR産物を用いた。その結果、 EST(KIAA0887)の塩基を含み、さらに 5'側に llbp長いクローンを得た。これらの知見を総合し、最終的に「419」の塩基配列は 4503bpとなり、 5'側に開始コドンを含む 445アミノ酸のタンパク質をコードする OR Fを有する遺伝子であることが明らかとなった。「419」の塩基配列を配列番号： 1 9に、この塩基配列によってコードされるァミノ酸配列を配列番号： 20に示した。

本発明の遺伝子「419」によってコードされるアミノ酸配列についてホモロジ一サーチを試みたところ、ヒト FAF-l(Fas Associated factor 1)との相同性が見られた。 FAF-1は、 Fasとの結合活性を持ち、マウスにおける過剰発現はアポトーシスを誘導することが確認されているタンパク質である。両者の構造的な特徴を比較した結果を図 5に示した。本発明の「419」は、核移行シグナル (NLS)から C末端側では FAF- 1と比較的高い相同性（35%) を示す一方、 Fas death domainに結合する領域に相当する N末端側では相同性は低くなつている（26%)。

[実施例 12] 「419」のノーザンハイブリダィゼ一シヨン— 2

各種免疫関連組織および癌細胞株から調製した mRNAが転写されている市販のフィルターを用いて、各組織及び癌細胞株における「419」の発現を調べた。使用したフィルタ一は次の 7つ（いずれも CL0NTECH社製）である。

Human MTN Blot,

Human MTN Blot II、

Human MTN Blot III、

Human MTN Blot IV、

Human Brain II、

Human Brain IV、および

Human Cancer Cell Line MTN Blot

「419」 ORF配列の上流と下流に特異的なプライマー（419SacIおよび 419Hind ΠΙ)を作成し、 Human Tcell Lamda cDNA Library (Jurkat cell line from ATCC)

[STARATAGENE]を铸型として PCRを行い、約 1.6kbの DNA断片を増幅した。「419」特異的プライマ一配列

419SacI： GAGCTCAAAATGGCGGCGCCTGAGGA/配列番号： 2 1

419Hindffl： AAGCTTATGTCATTCGTCAGTTAGGTCCTG/配列番号： 22

増幅した断片を、 Random Primer Labeling Kit (TAKARA)を用いて³² Pにより標識してプローブとした。 Express Hybridization Solution (CL0NTECH) を用いて、添付使用書通りにノーザンハイブリダィゼ一シヨンおよび膜洗浄を行った。洗浄後の膜をイメージングプレートに暴露し、 Molecular Imager System (BIO- RAD) によって画像を取得した。結果は図 6に示した。ほとんどの免疫組織、癌細胞株で、 4.6kb の m- RNAを検出した。本発明による遺伝子「419」は、各組織に広く発現が見られ、なかでも心臓、脳とくに小脳、胎盤、筋肉、精巣では強い発現が見られた。各種細胞株のうちでは Colorectal Adenocarcinoma,あるいは Chronic Myelogenous leukemiaで特に強い発現が認められた。また、強い発現が見られた心臓および筋肉では 4.6k bのほかに 6.3kbの m- RNAを検出した。

[実施例 1 3] FAF-1との発現レベルの比較

先に述べたように、ホモロジ一サーチの結果、本発明によって提供された遺伝子「419」によってコードされるアミノ酸配列（配列番号： 20) は、公知のタンパク質であるヒト FAF-1との相同性が見られた。そこで、花粉飛散時期前後における、花粉症患者を対象として、これらの遺伝子の発現パターンの比較を試みた。実施例 8と同じ試料について、次の塩基配列からなるプライマー、およびプロ —ブを用い、 ABI7700によってヒト FAF-1 の発現レベルを測定した。プローブが異なる他は、実施例 8と同様の操作により FAF- 1のコピー数を決定した。

TaqMan probe (配列番号： 2 1) ： TCCACCATGATGAAAGTGTGTTAACCAACG

Primer 1 (配列番号： 22) ： CTTTTCAAGAGGCCTTCTATGTGAAAG

Primer 2 (配列番号： 23) ： GCACAAAGCATTTGTGAGCAGAA

結果は図 7にまとめた。図 7から明らかなように、 FAF-1は「419」と同様の発現パターンを示している。相関係数は 0. 87を示し、両者の発現パターンがよく似ていることを裏付けている。すなわち、花粉飛散の前後のいずれの時期においても、花粉特異 IgEが低い患者群で高値を示す。

この結果により、 FAF- 1は「419」と同様に、本発明による花粉症の診断や、花粉症の治療薬のスクリーニング方法に有用であると言える。産業上の利用の可能性

本発明により、スギ花粉特異的 IgE値と相関を示す新規遺伝子が提供された。本発明の遺伝子の発現を指標に、ァレルギ一素因を有するか否かの検査およびァレルギ一疾患治療薬候補化合物のスクリーニングを行うことが可能となった。

Claims

請求の範囲

1 . 次の（a ) 〜（d ) のいずれかに記載の核酸分子。

( c ) 配列番号： 1 9に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジエンドな条件下でハイブリダィズし、配列番号： 2 0に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする核酸分子、

( d ) 配列番号： 2 0に記載のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列からなり、配列番号： 2 0に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする核酸分子、

2 . 請求項 1に記載の核酸分子によってコードされるタンパク質。

3 .請求項 1に記載の核酸分子が挿入されたベクター。

4.請求項 1に記載の核酸分子、または請求項 3に記載のベクターを発現可能に保持する形質転換体。

5 .請求項 4に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、請求項 2に記載のタンパク質を製造する方法。

6 .配列番号： 1 9に記載の塩基配列からなる核酸分子、またはその相補鎖と八イブリダィズするポリヌクレオチドであって、少なくとも 1 5ヌクレオチドの鎖長を有するポリヌクレオチド。

7 .請求項 6に記載のポリヌクレオチドからなる請求項 1に記載の核酸分子合成用プライマ一。

8 .請求項 6に記載のポリヌクレオチドからなる請求項 1に記載の核酸分子検出用プローブ。

9 .請求項 2に記載のタンパク質に対する抗体。

1 0 . 請求項 6に記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求項 1 に記載の核酸分子の検出方法。

1 1 . 生体試料中の配列番号： 1 9に記載の塩基配列からなる遺伝子の発現レべルを測定し、対照（健常者の場合）と比較する工程を含む、アレルギー疾患の検査方法。

1 2 . 生体試料が T細胞であり、 T細胞における遺伝子の発現レベルを、 mRNA を铸型とする RT- PCRによって測定する請求項 1 1に記載の方法。

1 3 . RT-PCRを PCR増幅モニター法により行う、請求項 1 2に記載の方法。

1 4. T細胞が被験者の末梢血から調製される、請求項 1 1から 1 3のいずれかに記載の方法。

1 5 . 生体試料が血液であり、血中の配列番号： 2 0に示すアミノ酸配列からなるタンパク質および Zまたはその断片を測定することによって遺伝子の発現レベルを測定する請求項 1 1に記載の方法。

1 6 . アレルギー疾患がスギ花粉症である、請求項 1 1から 1 5のいずれかに記載の方法。

1 7 . アレルギー疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

( b ) 該モデル動物の T細胞における配列番号： 1 9に記載の塩基配列からなる遺伝子の発現レベルを測定する工程、

( c ) 対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（b ) において測定される遺伝子の発現レベルを増大させる化合物を選択する工程、を含む方法。

1 8 . アレルギー疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、 ( a ) 被検化合物を花粉症のモデル動物に投与する工程、 ( b ) 該モデル動物からリンパ球を調製する工程、

(c) 該リンパ球を花粉抗原で刺激する工程、

(f ) 対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（e) において測定される遺伝子の発現レベルを増大させる化合物を選択する工程、を含む方法。

19. アレルギー疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

(a) 花粉症のモデル動物または花粉症を有するヒトからリンパ球を調製する工程、

(b) 被検化合物の存在下、該リンパ球を花粉抗原で刺激する工程、 ( c ) 該抗原刺激を受けたリンパ球から T細胞を分離する工程、

20. アレルギー疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

. 遺伝子の発現レベルを、 mRNAを铸型とする RT-PCRによって測定する請求項 1 7から 2 0のいずれかに記載の方法。

. T細胞が、花粉症のモデル動物の末梢血から調製される、請求項 1 7に記載の方法。

. リンパ球が末梢血から調製される、請求項 1 8または 1 9に記載の方法。. アレルギー疾患がスギ花粉症である、請求項 1 7から 2 3のいずれかに記載の方法。