WO2000063363A1 - Peptid aus antigen muc-1 zur auslösung einer immunreaktion gegen tumorzellen - Google Patents

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Lothar Kanz
Hans Georg Rammensee
Wolfram Brugger
Stefan Stevanovic
Peter Brossart
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Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum
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Definitions

  • the present invention relates to a peptide derived from the MUC-1 gene, by means of which an HLA-A2-restricted immune reaction against tumor cells can be triggered.
  • Brossart et al. show in an abstract to a lecture given at the 40th Annual Meeting of the American Society of Hematology, 1998, the possibility of deriving such a peptide from the MUC-1 gene, but without the sequence of a peptide they have tested or the location the sequence of a peptide not derived from the tandem repeat region of MUC-1.
  • Peptides for triggering an immune reaction against tumor cells are, for example, also in the publication by Finn, OJ, et al., (1995) "MUC-1 Epithelial Tumor Mucin-Based Immunity and Cancer 00/63363
  • An immune reaction is understood to mean, for example, the destruction of cells by T cells which, because of their ability to kill other cells, are also referred to as cytotoxic T cells.
  • the T cells In order to trigger such an immune response by cytotoxic T cells, the T cells must have foreign proteins from an MHC molecule on the cell surface, e.g. presented as a result of a viral infection.
  • MHC molecules are peptide receptors that normally bind peptides within the cell to transport them to the cell surface where the complex of peptide and MHC molecule can be recognized by T cells.
  • the peptides bound by MHC molecules are derived from the usual cell proteins.
  • T cells become tolerant of complexes of their own peptides with their own MHC molecules. Thus any new peptide that appears later, e.g. one that is produced by infection by a virus from a cell can be recognized by T cells.
  • HLA-A HLA-A
  • B HLA-A2
  • HLA-A2 HLA-A2
  • an immune reaction depends on the presence of a certain MHC molecule, for example HLA-A2, one speaks of an MHC-restricted, for example an HLA-A2 restricted immune response. There are also isolated T-cell reactions that take place independently of MHC molecules. One then speaks of MHC-unrestricted immune reactions.
  • MUC-1 The protein encoded by the MUC-1 gene, which is also called MUC-1, is usually expressed in polarized form by normal epithelial cells in such a way that it is normally not accessible to the immune system, for example in the intestine, where it is on the apical side of the epithelial cells , ie is expressed protruding into the intestinal lumen.
  • MUC-1 is not expressed polarized on tumor cells, but covers the entire cell.
  • the level of expression is higher in tumor cells than in normal cells, but the molecules are incompletely glycosylated in tumor cells, ie the side chains of sugar molecules have a shortened structure compared to MUC-1, which is produced by healthy cells.
  • the incomplete glycosylation means that epitopes on the protein portion of MUC-1, which are normally masked by sugar side chains, are accessible to the immune system on tumor cells. The immune system can therefore distinguish this under-glycosylated MUC-1 from normal, not under-glycosylated MUC-1.
  • another essential structural feature of MUC-1 is the so-called tandem repeats. These are sequences of 20 amino acid residues each, which in an identical or similar manner are repeated approximately 20 to 125 times in the MUC-1 molecule.
  • co-stimulators are now required, which include, in particular, the so-called dendritic cells, which absorb proteins offered from outside and, after their processing into peptides, can present them in such a way that cytotoxic T cells are thereby activated can.
  • An adjuvant is a substance that, when injected together with a substance against which an immune response is to be triggered, non-specifically enhances the immune system's response to this substance.
  • Such an inoculation is intended to obtain an MHC-unrestricted T cell reaction against the tandem repeats. It is even proposed to replace amino acids in the synthetic peptides that could mediate an MHC class I bond with others, so that no MHC-restricted T cells result from a presentation of the peptides by MHC class I molecules can.
  • the prevention of an MHC-restricted immune response can reduce the problem of a possible autoimmunity
  • the inventors of the present application have therefore proposed, on the basis of the lecture mentioned at the outset, to trigger an MHC-restricted immune response against MUC-1-expressing cells. They report that the known MUC-1 amino acid sequence was searched for by computer analysis for HLA-A2-binding motifs. Peptides with a high probability of binding were identified, synthesized and examined to determine whether they could induce cytotoxic T cells in vitro using dendritic cells. The cytotoxic T cells generated in this way developed an antigen-specific HLA-A2-restricted cytotoxic activity against those target cells which had previously been incubated with the respective peptide with which the cytotoxic T cells were activated or against MUC-1-expressing tumor cells .
  • the peptide has the sequence SEQ ID No .: 1 and / or a sequence which is derived from the signal peptide, in particular the sequence SEQ ID No .: 2 from the enclosed sequence listing and / or a modified form of the sequence SEQ ID No .: 1 and / or the sequence SEQ ID No .: 2.
  • the object underlying the invention is completely achieved in this way.
  • cytotoxic T cells can be generated which develop and destroy an antigen-specific MHC-restricted cytotoxic activity against tumor cells expressing MUC-1.
  • This peptide thus opens up the possibility of effective tumor therapy in which the suppression of an immune response against tumor cells, which is frequently observed in tumor patients, can be reversed.
  • the peptide SEQ ID No .: 1 is a nonapeptide derived from the amino acid sequence of a tandem repeat of MUC-1 and which is derived from another peptide previously described, among others. distinguished by two amino acids, one of which enables the peptide to bind to the HLA-A2 molecule.
  • the inventors have succeeded in proving that the nonapeptide can be used very effectively to generate cytotoxic T cells which kill the tumor cells which produce MUC-1 in an MHC class I-restricted manner .
  • These tumor cells present, via MHC class I molecules, certain fragments of all proteins that they produce. If cytotoxic T cells now recognize the peptide presented by an MHC class I molecule by which they were originally activated, they kill this cell.
  • this peptide which is represented by MHC class I molecules of MUC-1 expressed cells tiert, the advantageous possibility of specifically triggering an immune response against tumors that produce MUC-1.
  • cytotoxic T cells which are MHC-restricted cytotoxic can also be induced with the aid of a peptide whose sequence is not found in the mature MUC-1 protein on the cell surface but only in the signal peptide of the immature protein Have activity against MUC-1 expressing tumor cells.
  • a signal peptide of the immature protein is understood to mean a peptide which is encoded by the gene MUC-1 and which is produced in the cell in one piece with the remaining protein, but is split off from it during processing in the endoplasmic reticulum of the cells.
  • the peptide SEQ ID No .: 2 is an example of a nonapeptide derived from the amino acid sequence of the signal peptide of MUC-1. This peptide leads to an effective immune reaction against MUC-1 producing tumor cells.
  • the ability to generate cytotoxic T cells that are directed against another peptide presented by MHC-1 molecules has the advantage that the immune response against tumor cells can be further increased by simultaneously using cytotoxic T cells that are directed against both peptides presented by MHC-1 molecules.
  • a signal peptide can also be presented by those MUC-1-producing tumor cells by means of an MHC class I molecule which, as a result of degeneration, do not have a functional system which produced in the cell's cytosol """,,, O 00/63363
  • MHC class I molecules Peptides to be presented by MHC class I molecules are transported into the endosplasmic reticulum (ER).
  • the peptides are first assembled with the MHC class I molecules and only then brought to the cell surface.
  • the signal peptide is only split off in the ER, no transport to the ER is necessary for its MHC class I-mediated presentation.
  • an immune response that can be achieved using the peptide with the sequence SEQ ID no. : 2 was directed against a larger number of tumor cells than an immune response which was triggered by peptides which are not derived from the MUC-1 signal peptide.
  • Modified forms of the peptides SEQ ID No .: 1 and / or 2 can also lead to the desired immune response.
  • Modified in the sense of the invention is understood to mean any chemical, enzymatic or other change in the peptide. This can be done, for example, already during the production of the peptide or later by removing or adding individual amino acid residues, the exchange of individual amino acid residues, but also by chemically changing individual amino acid residues by adding certain chemical groups.
  • the invention relates to a nucleic acid which comprises a sequence section which codes for at least one peptide according to the invention.
  • the nucleic acid may have further sequences that are necessary for the expression of the nucleic acid sequence corresponding to the peptide.
  • the nucleic acid used can be contained in a vector which is suitable for the expression of the enable the nucleic acid sequence corresponding to the peptide in a cell.
  • nucleic acid has the advantage that it is chemically more stable and less sensitive than peptides. Handling is therefore easier than that of peptides, and the shelf life of nucleic acids is almost infinite. They are chemically and / or molecular biologically very cheap and in principle can be produced in unlimited quantities. Any nucleic acid sequences necessary for expression, like a vector containing the nucleic acids, have the advantage that it is possible to produce large amounts of the peptides very cheaply by means of cellular expression systems with the aid of the nucleic acids.
  • the nucleic acids can also be used to transform antigen-presenting cells, in particular dendritic cells, in such a way that they produce the corresponding peptides themselves and then present them with cytotoxic T cells or their precursor cells using MHC-1 molecules. It is advantageous that the presentation of the corresponding peptides by the antigen-presenting cells takes place in the longer term than in the presentation of peptides that are only offered from the outside.
  • a further aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition which contains a peptide according to the invention or a nucleic acid according to the invention in an effective amount which triggers an MHC-1-restricted immune response.
  • the peptides and / or nucleic acids can be prepared in the appropriate customary galenics.
  • these could, for example, be preparations which are usually se used for vaccinations, and contain an adjuvant.
  • nucleic acids preparation with liposomes or vesicles is also possible.
  • a suitable pharmaceutical preparation it is possible to treat organisms directly without having to remove antigen-presenting cells or their precursor cells beforehand in order to grow them first and to introduce them into the patient after treatment with peptides or nucleic acids.
  • a tumor treatment in the form of a vaccination can be carried out by means of an appropriate pharmaceutical preparation.
  • Another aspect of the invention relates to the use of a nucleic acid according to the invention in the context of gene therapy.
  • gene therapy can take the form of the transformation of antigen-presenting cells, in particular dendritic cells, which have been previously removed from the body of an organism to be treated, in order to be reintroduced into the body after the transformation.
  • antigen-presenting cells in particular dendritic cells, which have been previously removed from the body of an organism to be treated, in order to be reintroduced into the body after the transformation.
  • the longer-lasting presentation is advantageous, as already explained.
  • the invention further relates to the use of a nucleic acid according to the invention for transforming or transfecting cells in vitro.
  • the use of the nucleic acid in vitro has the advantage that methods such as electroporation and / or auxiliaries such as calcium phosphate or DEAE-dextran can be used, which significantly facilitate and improve the uptake of nucleic acids in cells, but which in cannot be used in vivo.
  • antigen-presenting cells in particular dendritic cells, which or their progenitor cells were removed from a patient and which are later reintroduced into the patient, can be treated.
  • Another aspect of the present invention is the use of at least one peptide according to the invention or a nucleic acid according to the invention for triggering an immune reaction in connection with tumor therapy or with a treatment which prevents the development of a tumor. It is advantageous here that the immunosuppression and tolerance towards MUC-1 frequently observed in a tumor disease can be reversed by using the peptides or nucleic acids according to the invention.
  • the use according to the invention can be used in addition to established tumor therapies.
  • Preventive treatment is particularly advantageous for people who have an increased risk of developing a tumor, for example due to inheritance or because they have previously had a tumor.
  • the peptides or nucleic acids according to the invention are used in combination with a Pan-HLA-DR-binding peptide.
  • pan-HLA-DR binding peptide It is advantageous when using such a pan-HLA-DR binding peptide that the antigen-specific cytotoxic activity of the generated T cells is increased.
  • At least one of the peptides or nucleic acids according to the invention is incubated together with antigen-presenting cells, in particular dendritic cells, and only then introduced into an organism from which the antigen-presenting cells or their precursor cells were previously removed.
  • the advantage of this method is that the success of triggering an immune response is more assured and controllable in this way than injecting a peptide together with an adjuvant, in which the immune response can be stronger and weaker. Especially with tumor therapy, one should be able to ensure the success of triggering an immune reaction, so as not to lose valuable time due to ineffective treatment.
  • Example 1 Induction of antigen-specific cytotoxic T cells using peptides and dendritic cells
  • the non-adherent cells were removed and the adherent blood monocytes were cultured in RPIO medium containing the following cytokine additions: human recombinant GM-CSF (Leukomax, Sandoz, 100 ng / ml), IL-4 (Genzyme, 1000 IU / ml), and TNF-cc (Genzyme, 10 ng / ml).
  • human recombinant GM-CSF Leukomax, Sandoz, 100 ng / ml
  • IL-4 Genzyme, 1000 IU / ml
  • TNF-cc Gene, 10 ng / ml
  • HLA-A * 0201 a certain HLA-A2 type binding peptide motifs
  • the selected sequences and control sequences as well as a PAN-HLA-DR binding peptide were synthesized using standard Fmoc chemistry on a peptide synthesizer.
  • the cells were stimulated again by adding autologous, mononuclear cells from peripheral blood pre-incubated with the synthetic peptide from 1.2.
  • 1 ng / ml human recombinant IL-2 (Genzyme) was added.
  • the cytokine IL-2 is necessary for the cultivation and proliferation of cytotoxic T cells. In total, stimulation was carried out up to three times a week. 1.4 Detection of cytotoxic T cell activity
  • T2 cells which are distinguished by the fact that they produce HLA-A2, but cannot present self-synthesized peptides via these MHC class I molecules, were preincubated with 50 ⁇ g / ml of synthetic peptide from 1.2 for two hours and labeled with [ 51 Cr] sodium chromate in RP10 at 37 ° C for one hour. In each case 10 4 of these cells were transferred into one well of a 96-well plate. Cytotoxic T cells generated after 1.3 were added so that a final volume of 200 ⁇ l per well was reached. The mixture was then incubated at 37 ° C. for four hours.
  • the cytotoxic T cells kill the cells previously labeled with Sl Cr, they lyse these cells and the 51 Cr contained in the cells is released. The radioactivity released is determined at the end of the experiment in the removed cell supernatants by counting in a ⁇ -counter. This gives a measure of the cytotoxic activity of the T cells.
  • cytotoxic T cells Two of the synthesized peptides derived from the sequence of the MUC-1 gene were able in the previously described method to induce cytotoxic T cells with the aid of dendritic cells in vitro. These are the two peptides with the sequence SEQ ID No .: 1 and the sequence SEQ ID No .: 2 from the sequence listing.
  • the cytotoxic T cells which were induced using the peptide with the sequence SEQ ID NO: 1, were able to specifically kill T2 cells which had been pretreated with this peptide during they were unable to kill T2 cells pretreated with other peptides.
  • cytotoxic T cells that were induced using other peptides were unable to kill T2 cells pretreated with the peptide with the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the situation was similar with cytotoxic T cells which were induced using the peptide with the sequence SEQ ID No .: 2. These cells could only kill those T2 cells that had been pretreated with the peptide with the sequence SEQ ID NO: 2.
  • cytotoxic T cells which were induced in the presence of the PAN-HLA-DR-binding peptide showed a higher cytotoxic activity than those which were induced in the absence of this peptide.
  • T cells which were activated using the peptides with the sequence SEQ ID No .: 1 or the sequence SEQ ID No .: 2 were able to produce tumor cells of the MCF-7 lines (breast cancer cells), A- 498 (renal cell carcinoma cells) and MZ1774-RCC (renal cell carcinoma cells), the HLA-A2 and MUC-1 ex- to prime, to lyse.
  • MCF-7 lines breast cancer cells
  • A- 498 renal cell carcinoma cells
  • MZ1774-RCC renal cell carcinoma cells
  • HLA-A2 and MUC-1 ex- to prime to lyse.
  • Croft cell lines EBV-immortalized B cells
  • Caki-2 renal cell carcinoma cells
  • SK-OV-3 ovarian cancer cells
  • K562 proerythroblastic cells
  • cytotoxic T cells activated using the peptides with the sequence SEQ ID No .: 1 and SEQ ID No .: 2 able to lyse the HLA-A2 and MUC-1 expressing renal cell carcinoma cells of the MZ1774-RCC line, if the renal cell carcinoma cells were previously incubated for 30 minutes with 10 ⁇ g / ml of a monoclonal antibody directed against HLA-A2 (BB7.2, Coulter-Immunotech).
  • the peptides according to the invention are therefore suitable for triggering an immune reaction against certain tumor cells even in the context of therapy.

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Abstract

Es wird ein Peptid zur Auslösung einer Immunreaktion gegen Tumorzellen bereitgestellt, das ein ggf. modifiziertes Fragment des durch das Gen MUC-1 codierten Proteines aufweist, das eine HLA-A2-restringierte Immunreaktion auslösen kann.

Description

PEPTID AUS ANTIGEN MUC-1 ZUR AUSLÖSUNG EINER IMMINREAKTION GEGEN TUMORZELLEN
Die vorliegende Erfindung betrifft ein von dem MUC-1-Gen abgeleitetes Peptid, durch das eine HLA-A2-restringierte Immunreaktion gegen Tumorzellen auslösbar ist.
Brossart et al. zeigen in einem Abstract zu einem auf dem 40. jährlichen Treffen der American Society of Hematology, 1998, gehaltenen Vortrag die Möglichkeit auf, ein derartiges Peptid von dem MUC-1-Gen abzuleiten, ohne jedoch die Sequenz eines von ihnen getesteten Peptides oder die Lokalisation der Sequenz eines Peptides, das nicht von dem Tandem-Repeat-Bereich von MUC-1 abgeleitet ist, zu erwähnen.
Peptide zur Auslösung einer Immunreaktion gegen Tumorzellen sind bspw. auch in der Publikation von Finn, O.J., et al., (1995) "MUC-1 Epithelial Tumor Mucin-Based Immunity and Cancer 00/63363
Vaccines", Immunol Rev 145, Seiten 61 bis 89, erwähnt, allerdings ebenfalls ohne Angabe von Sequenzinfoπnationen.
Unter einer I munreaktion wird bspw. die Zerstörung von Zellen durch solche T-Zellen verstanden, die wegen ihrer Fähigkeit, andere Zellen abzutöten, auch als zytotoxische T-Zellen bezeichnet werden. Zur Auslösung einer derartigen Immunreaktion durch zytotoxische T-Zellen müssen den T-Zellen dazu von einem MHC-Molekül auf der Zelloberfläche fremde Proteine z.B. infolge einer Virusinfektion präsentiert werden.
Diese MHC-Moleküle sind Peptidrezeptoren, die normalerweise Peptide innerhalb der Zelle binden, um sie zu der Zelloberfläche zu transportieren, wo der Komplex aus Peptid und MHC- Molekül durch T-Zellen erkannt werden kann. In normalen Zellen werden die durch MHC-Moleküle gebundenen Peptide von den üblichen zelleigenen Proteine abgeleitet. Während ihrer Differenzierung in einem Organismus werden T-Zellen tolerant gegenüber Komplexen von eigenen Peptiden mit eigenen MHC-Molekülen. Somit kann jedes neue Peptid, das später erscheint, z.B. ein solches, das durch die Infektion mit einem Virus von einer Zelle produziert wird, von T-Zellen erkannt werden.
Es gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen, von denen diejenigen, die mit zytotoxischen T-Zellen wechselwirken, der Klasse I angehören. Klassische humane Klasse I-Moleküle sind HLA-A, B und C, wobei HLA-A2 eine Unterklasse der HLA-A-Moleküle darstellt.
Ist das Zustandekommen einer Immunreaktion von dem Vorhandensein eines bestimmten MHC-Moleküles, z.B. HLA-A2, abhängig, so spricht man von einer MHC-restringierten, z.B. einer HLA-A2- restringierten Immunreaktion. Es gibt vereinzelt auch T-Zell- Reaktionen, die unabhängig von MHC-Molekülen stattfinden. Man spricht dann von MHC-unrestringierten Immunreaktionen.
In der eingangs erwähnten Publikation von Finn et al. wurde zur Behandlung eines Tumorpatienten vorgeschlagen, eine solche MHC- unrestringierte Immunreaktion gegen ein Glykoprotein auszulösen, das durch das Gen MUC-1 codiert wird und auf der Oberfläche von Zellen vorkommt. Ziel ist dabei das Hervorrufen einer effektiver. Immunantwort mit lebenslanger Immunität.
Das durch das Gen MUC-1 codierte Protein, das ebenfalls MUC-1 genannt wird, wird von normalen Epithelzellen meistens polarisiert so exprimiert, daß es dem Immunsystem normalerweise nicht zugänglich ist, wie bspw. im Darm, wo es auf der apikalen Seite der Epithelzellen, d.h. ins Darmlumen hineinragend exprimiert wird.
Auf Tumorzellen wird dagegen MUC-1 nicht polarisiert exprimiert, sondern bedeckt die gesamte Zelle. Das Level der Expression ist bei Tumorzellen höher als bei normalen Zellen, aber die Moleküle liegen bei Tumorzellen unvollständig glykosiliert vor, d.h. die Seitenketten aus Zuckermolekülen weisen eine verkürzte Struktur gegenüber MUC-1 auf, das von gesunden Zellen hergestellt wird. Die unvollständige Glykosilierung führt dazu, daß Epitope auf dem Protein-Anteil von MUC-1, die normalerweise durch Zucker-Seitenketten maskiert vorliegen, auf Tumorzellen dem Immunsystem zugänglich sind. Somit kann das Immunsystem dieses unterglykosilierte MUC-1 von normalem, nicht unterglyko- siliertem MUC-1 unterscheiden. Neben den Seitenketten aus Zuckermolekülen besteht ein weiteres wesentliches Strukturmerkmal von MUC-1 in den sogenannten Tan- dem-Repeats. Dabei handelt es sich um Abfolgen aus jeweils 20 Aminosäureresten, die sich in identischer oder ähnlicher Weise ca. 20 bis 125 Mal in dem MUC-1-Molekül wiederholen.
Zur Auslösung einer effektiven Immunreaktion durch T-Zellen sind nun aber Co-Stimulatoren erforderlich, zu denen insbesondere die sogenannten dendritischen Zellen zählen, die von außen angebotene Proteine aufnehmen und nach deren Prozessierung zu Peptiden so präsentieren können, daß zytotoxische T-Zellen dadurch aktiviert werden können. Finn et al. schlagen daher vor, synthetische Peptide, die die MUC-1-Tandem-Repeats repräsentieren, zusammen mit einem Adjuvans, das dendritische Zellen anlockt, zu injizieren. Bei einem Adjuvans handelt es sich um eine Substanz, die bei gemeinsamer Injektion mit einem Stoff, gegen den eine Immunreaktion ausgelöst werden soll, die Antwort des Immunsystems auf diesem Stoff unspezifisch verstärkt. Durch eine derartige Impfung soll eine MHC-unrestringierte T- Zellreaktion gegen die Tandem-Repeats erhalten werden. Es wird sogar vorgeschlagen, in den synthetischen Peptiden Aminosäuren, die eine MHC-Klasse-I-Bindung vermitteln könnten, durch andere zu ersetzen, damit keine MHC-restringierten T-Zellen durch eine Präsentation der Peptide durch MHC-Klasse-I-Moleküle entstehen können.
Einerseits kann durch die Verhinderung einer MHC-restringierten Immunantwort das Problem einer möglichen Autoimmunität verringert werden, andererseits besteht ein großer Nachteil in der geringeren Effizienz einer MHC-unrestringierten Immunantwort gegenüber einer MHC-restringierten. Somit sind auch die Chan- cen, mit einer MHC-unrestringierten Immunantwort einen Tumor zum Verschwinden zu bringen, geringer als mit einer MHC- restringierten Immunantwort.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben daher anläßlich des eingangs erwähnten Vortrages vorgeschlagen, eine MHC- restringierte Immunantwort gegen MUC-1-exprimierende Zellen auszulösen. Sie berichten, daß hierzu die bekannte MUC-1- Aminosäuresequenz mittels einer Computeranalyse nach HLA-A2- bindenden Motiven abgesucht wurde. Peptide mit hoher Bindungswahrscheinlichkeit wurden identifiziert, synthetisiert und daraufhin untersucht, ob sie mit Hilfe von dendritischen Zellen in vitro zytotoxische T-Zellen induzieren können. Die so erzeugten zytotoxischen T-Zellen entwickelten eine Antigen-spezifische HLA-A2-restringierte zytotoxische Aktivität gegen diejenigen Zielzellen, die zuvor mit dem jeweiligen Peptid inkubiert wurden, mit dem die zytotoxischen T-Zellen aktiviert wurden, oder gegen MUC-1-exprimierende Tumorzellen.
Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, mindestens eine Aminosäuresequenz für ein derartiges Peptid zur Auslösung einer Immunreaktion gegen Tumorzellen bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das Peptid die Sequenz SEQ ID-Nr.: 1 und/oder eine Sequenz, die sich von dem Signalpeptid ableitet, insbesondere die Sequenz SEQ ID- Nr.: 2 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll und/oder eine modifizierte Form der Sequenz SEQ ID-Nr.: 1 und/oder der Sequenz SEQ ID-Nr.: 2 aufweist. Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Peptides können zytotoxische T- Zellen generiert werden, die eine Antigen-spezifische MHC- restringierte zytotoxische Aktivität gegen MUC-1 exprimierende Tumorzellen entwickeln und diese zerstören.
Somit eröffnet dieses Peptid die Möglichkeit einer wirkungsvollen Tumortherapie, bei der die in Tumorpatienten häufig beobachtete Unterdrückung einer Immunreaktion gegen Tumorzellen umgekehrt werden kann.
Bei dem Peptid SEQ ID-Nr.: 1 handelt es sich um ein Nonapeptid, das von der Aminosäuresequenz eines Tandem-Repeats von MUC-1 abgeleitet ist, und das sich von einem anderen, früher beschriebenen Peptid u.a. durch zwei Aminosäuren unterscheidet, von denen eine eine Bindung des Peptides an das HLA-A2-Molekül ermöglicht.
Wie den Ausführungsbeispielen zu entnehmen ist, ist es den Erfindern gelungen, nachzuweisen, daß mittels des Nonapeptides sehr wirksam zytotoxische T-Zellen erzeugt werden können, die die Tumorzellen, die MUC-1 herstellen, in einer MHC-Klasse-I- restringierten Weise abtöten. Diese Tumorzellen präsentieren nämlich über MHC-Klasse-I-Moleküle bestimmte Fragmente sämtlicher Proteine, die von ihnen hergestellt werden. Erkennen nun zytotoxische T-Zellen das von einem MHC-Klasse-I-Molekül präsentierte Peptid, durch das sie ursprünglich aktiviert wurden, so töten sie diese Zelle ab. Somit bietet dieses Peptid, das von MHC-Klasse-I-Molekülen MUC-1 exprimierter Zellen präsen- tiert wird, die vorteilhafte Möglichkeit, gezielt eine Immunreaktion gegen Tumore auszulösen, die MUC-1 herstellen.
Besonders überraschend war, daß auch mit Hilfe eines Peptides, dessen Sequenz sich nicht in dem reifen MUC-1-Protein auf der Zelloberfläche sondern nur in dem Signalpeptid des unreifen Proteines findet, zytotoxische T-Zellen induziert werden können, die eine MHC-restringierte zytotoxische Aktivität gegen MUC-1 exprimierende Tumorzellen aufweisen.
Unter einem Signalpeptid des unreifen Proteines versteht man dabei ein Peptid, das durch das Gen MUC-1 codiert wird und das in der Zelle in einem Stück mit dem restlichen Protein hergestellt, aber im Laufe der Prozessierung im Endoplasmatischen Retikulum der Zellen von diesem abgespalten wird.
Bei dem Peptid SEQ ID-Nr.: 2 handelt es sich um ein Beispiel für ein Nonapeptid, das von der Aminosäuresequenz des Signal- peptides von MUC-1 abgeleitet ist. Dieses Peptid führt zu einer effektiven Immunreaktion gegen MUC-1 herstellende Tumorzellen. Die Möglichkeit, zytotoxische T-Zellen zu erzeugen, die gegen ein weiteres von MHC-1-Molekülen präsentiertes Peptid gerichtet sind, hat den Vorteil, daß die Immunreaktion gegen Tumorzellen noch weiter gesteigert werden kann, indem gleichzeitig zytotoxische T-Zellen eingesetzt werden, die sich gegen beide von MHC-1-Molekülen präsentierte Peptide richten.
Darüber hinaus kann ein Signalpeptid auch von denjenigen MUC-1 herstellenden Tumorzellen durch ein MHC-Klasse-I-Molekül präsentiert werden, die infolge einer Entartung über kein funktionsfähiges System verfügen, das im Zytosol der Zelle erzeugte „„„,,, O 00/63363
Peptide, die durch MHC-Klasse-I-Moleküle präsentiert werden sollen, in das Endosplasmatische Retikulum (ER) transportiert. Im ER werden die Peptide nämlich erst mit den MHC-Klasse-I- Molekülen zusammengebaut und erst dann auf die Zelloberfläche gebracht. Da das Signalpeptid aber erst im ER abgespalten wird, ist zu seiner MHC-Klasse-I-vermittelten Präsentation kein Transport ins ER notwendig. Somit kann sich eine Immunreaktion, die mittels des Peptides mit der Sequenz SEQ ID-Nr. : 2 ausgelöst wurde, gegen eine größere Anzahl von Tumorzellen richten als eine Immunreaktion, die durch Peptide ausgelöst wurde, die sich nicht von dem MUC-1 Signalpeptid ableiten.
Auch modifizierte Formen der Peptide SEQ ID-Nr.: 1 und/oder 2 können zu der gewünschten Immunantwort führen.
Dabei wird unter modifiziert im Sinne der Erfindung jede chemische, enzymatische oder sonstige Veränderung des Peptides verstanden. Dies kann bspw. schon bei der Herstellung des Peptides oder später durch das Entfernen oder Hinzufügen einzelner Aminosäure-Reste, den Austausch einzelner Aminosäure-Reste, aber auch durch die chemische Veränderung einzelner Aminosäure-Reste durch das Anhängen bestimmter chemischer Gruppen erfolgen.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung betrifft die Erfindung eine Nukleinsäure, die einen Sequenzabschnitt umfaßt, der für mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid codiert. Darüber hinaus weist die Nukleinsäure ggf. weitere Sequenzen auf, die zur Expression der dem Peptid entsprechenden Nukleinsäure- Sequenz notwendig sind. Die verwendete Nukleinsäure kann in einem Vektor enthalten sein, der geeignet ist, die Expression der dem Peptid entsprechenden Nukleinsäuresequenz in einer Zelle zu ermöglichen.
Eine derartige Nukleinsäure hat den Vorteil, daß sie chemisch stabiler und unempfindlicher ist als Peptide. Die Handhabung ist daher einfacher als die der Peptide, und die Lagerfähigkeit von Nukleinsäuren ist nahezu unendlich. Sie sind chemisch und/oder molekularbiologisch sehr günstig und im Prinzip in unbegrenzten Mengen herzustellen. Eventuell zur Expression notwendige Nukleinsäuresequenzen haben ebenso wie ein Vektor, der die Nukleinsäuren enthält, den Vorteil, daß es dadurch möglich ist, große Mengen der Peptide sehr kostengünstig durch zelluläre Expressionssysteme mit Hilfe der Nukleinsäuren herzustellen. Die Nukleinsäuren können aber auch dazu verwendet werden, Anti- gen-präsentierende Zellen, insbesondere dendritische Zellen, so zu transformieren, daß sie die entsprechenden Peptide selbst herstellen und dann mittels MHC-1-Molekülen zytotoxischen T- Zellen bzw. deren Vorläuferzellen präsentieren. Vorteilhaft ist dabei, daß die Präsentation der entsprechenden Peptide durch die Antigen-präsentierenden Zellen längerfristig erfolgt als bei der Präsentation von Peptiden, die lediglich von außen angeboten werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Peptid oder eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer eine MHC-1-restringierte Immunantwort auslösenden wirksamen Menge enthält.
Dazu können die Peptide und/oder Nukleinsäuren in den jeweils angemessenen üblichen Galeniken zubereitet sein. Im Falle von Peptiden könnten dies z.B. Zubereitungen sein, die üblicherwei- se für Impfungen verwendet werden, und ein Adjuvans enthalten. Im Falle von Nukleinsäuren ist auch eine Zubereitung mit Lipo- somen oder Vesikeln möglich. Durch eine entsprechende pharmazeutische Zubereitung ist es möglich, Organismen direkt zu behandeln, ohne ihnen vorher Antigen-präsentierende Zellen bzw. deren Vorläuferzellen entnehmen zu müssen, um diese zunächst zu züchten und sie nach Behandlung mit Peptiden oder Nukleinsäuren in den Patienten einzubringen. Mittels einer entsprechenden pharmazeutischen Zubereitung kann eine Tumorbehandlung in Form einer Impfung erfolgen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure im Rahmen einer Gentherapie.
Dabei kann die Gentherapie in Form der oben bereits beschriebenen Transformation von Antigen-präsentierenden Zellen, insbesondere dendritischen Zellen, erfolgen, die oder deren Vorläuferzellen zuvor aus dem Körper eines zu behandelnden Organismus entnommen wurden, um nach der Transformation wieder in den Körper eingebracht zu werden. Gegenüber der Verwendung von Peptiden ist dabei, wie bereits erläutert, die längeranhaltende Präsentation von Vorteil.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Nukleinsäure so in den Körper einzubringen, daß sie selektiv von Antigen- präsentierenden Zellen, insbesondere dendritischen Zellen, aufgenommen und exprimiert wird. Diese Verwendung hat den Vorteil, daß außer der Verabreichung keine weiteren Maßnahmen, wie bspw. die Anzucht und selektive Vermehrung entnommener dendritischer Zellen bzw. deren Vorläuferzellen, notwendig sind. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Transformation oder Transfektion von Zellen in vitro. Der Einsatz der Nukleinsäure in vitro hat den Vorteil, daß Verfahren, wie bspw. die Elektroporation und/oder Hilfsstoffe wie bspw. Calciumphosphat oder DEAE-Dextran, verwendet werden können, die die Aufnahme von Nukleinsäuren in Zellen wesentlich erleichtern und verbessern, die aber in vivo nicht einsetzbar sind.
Dabei können, wie bereits erwähnt, Antigen-präsentierende Zellen, insbesondere dendritische Zellen, behandelt werden, die bzw. deren Vorläuferzellen aus einem Patienten entnommen wurden und die später wieder in den Patienten eingebracht werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Peptides oder einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Auslösung einer Immunreaktion im Zusammenhang mit einer Tumortherapie oder mit einer gegenüber der Entstehung eines Tumors vorbeugenden Behandlung. Vorteilhaft ist dabei, daß die bei einer Tumorerkrankung häufig beobachtete Immunsuppression und Toleranz gegenüber MUC-1 durch die erfindungsgemäße Verwendung der Peptide oder Nukleinsäuren umgekehrt werden kann. Darüber hinaus kann die erfindungsgemäße Verwendung zusätzlich zu etablierten Tumortherapien eingesetzt werden.
Eine vorbeugende Behandlung ist vor allem bei Personen vorteilhaft, die, bspw. erblich bedingt oder weil sie früher bereits einen Tumor hatten, ein erhöhtes Risiko haben, an einem Tumor zu erkranken. In einer Weiterbildung erfolgt die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide oder Nukleinsäuren in Kombination mit einem Pan- HLA-DR-bindenden Peptid.
Vorteilhaft bei der Verwendung eines solchen Pan-HLA-DR- bindenden Peptides ist, daß die Antigen-spezifische zytotoxische Aktivität der generierten T-Zellen verstärkt wird.
In einer Weiterbildung wird mindestens eines der erfindungsgemäßen Peptide oder Nukleinsäuren zusammen mit Antigen- präsentierenden Zellen, insbesondere dendritischen Zellen, inkubiert und erst dann in einen Organismus eingebracht, aus dem die Antigen-präsentierenden Zellen oder deren Vorläuferzellen zuvor entnommen wurden.
Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, daß der Erfolg beim Auslösen einer Immunreaktion auf diese Art und Weise gesicherter und kontrollierbarer ist als bei der Injektion eines Peptides zusammen mit einem Adjuvans, bei der die Immunreaktion einmal stärker und einmal schwächer ausfallen kann. Gerade bei einer Tumortherapie sollte man jedoch den Erfolg beim Auslösen einer Immunreaktion sicherstellen können, um nicht durch eine uneffektive Behandlung möglicherweise wertvolle Zeit zu verlieren.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Ausführungsbeispiele der Erfindung werden in der nachfolgenden Beschreibung dargestellt und erläutert.
Beispiel 1 Induktion von Antigen-spezifischen zytotoxischen T-Zellen unter Verwendung von Peptiden und dendritischen Zellen
1.1 Bereitstellung von dendritischen Zellen
Wie bspw. bei Brossart, P., er al., Cancer Res 58 (1993), Seiten 732 ff., beschrieben, wurden zunächst mononukleäre Zellen aus peripherem Blut durch Ficoll/Paque (Gibco-BRL, Grand Island, NY) Dichtegradienten-Zentrifugation aus buffy coat- Präparationen von heparinisiertem Blut dreier gesunder Spender isoliert. Die Zellen wurden in Zellkulturschalen in RPlO-Medium ausgesät. Nach zwei Stunden bei 37 °C wurden die nicht anhaftenden Zellen entfernt und die anhaftenden Blutmonozyten in RPlO- Medium kultiviert, das folgende Zytokinzusätze enthielt: humanes rekombinantes GM-CSF (Leukomax, Sandoz, 100 ng/ml), IL-4 (Genzyme, 1000 IU/ml), und TNF-cc (Genzyme, 10 ng/ml). Nach siebentägiger Kultivierung zeigten die Zellen in der FACS-Analyse eine starke Expression der für den Phänotyp reifer dendritischer Zellen charakteristischen Oberflächen arker MHC Klasse I und II, CD83, CD80, CD86, CD40 und CD54 und wurden somit als dendritische Zellen identifiziert.
1.2 Identifizierung geeigneter Peptide
Zur Identifizierung von Peptiden, die mit einer hohen Wahrscheinlichkeit durch HLA-A2 präsentiert werden, wurde zunächst die durch das Gen MUC-1 codierte Aminosäuresequenz mit Hilfe eines Computerprogrammes auf potentiell HLA-A*0201 (ein bestimmter HLA-A2-Typ) bindende Peptid-Motive abgesucht, wie es bspw. in Rammensee, H.G., et al., Landes Bioscience, Austin, Texas, USA (1997), beschrieben ist.
Die ausgesuchten Sequenzen und Kontrollsequenzen sowie ein PAN- HLA-DR-bindendes Peptid wurden unter Verwendung von Standard Fmoc-Chemie auf einem Peptidsynthesizer synthetisiert.
1.3 Induktion zytotoxischer T-Zellen
5 x 105 dendritische Zellen aus 1.1. wurden zwei Stunden lang mit 50 μg/ml synthetischem Peptid aus 1.2 inkubiert, gewaschen und mit 2,5 x 10β autologen, d.h. von denselben Spendern abstammenden, ononukleären Zellen aus peripherem Blut in RPlO- Medium inkubiert. Die dendritischen Zellen wurden teilweise zusätzlich zu den Kontrollpeptiden und den potentiell HLA-A2- bindenden Peptiden mit 50 μg/ml eines PAN-HLA-DR-bindenden Peptides inkubiert, das ein T-Helfer-Epitop darstellt.
Nach siebentägiger Kultivierung wurden die Zellen erneut stimuliert, indem autologe, mit dem synthetischen Peptid aus 1.2 vorinkubierte mononukleäre Zellen aus peripherem Blut zugefügt wurden. Am ersten, dritten und fünften Tag wurde jeweils 1 ng/ml humanes rekombinantes IL-2 (Genzyme) zugesetzt. Das Zyto- kin IL-2 ist zur Kultivierung und Vermehrung von zytotoxischen T-Zellen notwendig. Insgesamt wurde bis zu dreimal in wöchentlichem Abstand stimuliert. 1.4 Nachweis zytotoxischer T-Zell-Aktivität
T2-Zellen, die sich dadurch auszeichnen, daß sie HLA-A2 herstellen, aber über diese MHC-Klasse-I-Moleküle keine selbst synthetisierten Peptide präsentieren können, wurden zwei Stunden lang mit 50 μg/ml von synthetischem Peptid aus 1.2 vorinku- biert und eine Stunde lang bei 37 °C mit [51Cr ]-Natriumchromat in RP10 markiert. Jeweils 104 dieser Zellen wurden in je eine Vertiefung einer 96-Well-Platte übertragen. Zuvor nach 1.3 generierte zytotoxische T-Zellen wurden zugesetzt, so daß jeweils ein Endvolumen von 200 μl pro Well erreicht wurde. Anschließend wurde vier Stunden bei 37°C inkubiert. Wenn nun die zytotoxischen T-Zellen die zuvor mit slCr markierten Zellen abtöten, so lysieren sie diese Zellen, und das in den Zellen enthaltene 51Cr wird freigesetzt. Die freigesetzte Radioaktivität wird am Ende des Versuchs in den abgenommenen Zellüberständen durch Zählen in einem ß-Counter bestimmt. Somit erhält man ein Maß für die zytotoxische Aktivität der T-Zellen.
1.5 Peptide, die eine HLA-A2-restringierte Immunantwort auslösen
Zwei der synthetisierten, von der Sequenz des MUC-1-Genes abgeleitete Peptide waren in dem zuvor beschriebenen Verfahren in der Lage, zytotoxische T-Zellen mit Hilfe von dendritischen Zellen in vitro zu induzieren. Dabei handelt es sich um die beiden Peptide mit der Sequenz SEQ ID-Nr.: 1 und der Sequenz SEQ ID-Nr.: 2 aus dem Sequenzprotokoll. Die zytotoxischen T- Zellen, die unter Verwendung des Peptides mit der Sequenz SEQ ID-Nr.: 1 induziert wurden, konnten spezifisch T2-Zellen abtöten, die mit genau diesem Peptid vorbehandelt wurden, während sie nicht in der Lage waren, T2-Zellen abzutöten, die mit anderen Peptiden vorbehandelt waren. Umgekehrt waren zytotoxische T-Zellen, die unter Verwendung anderer Peptide induziert wurden, nicht in der Lage, T2-Zellen abzutöten, die mit dem Peptid mit der Sequenz SEQ ID-Nr.: 1 vorbehandelt waren. Entsprechend verhielt es sich mit zytotoxischen T-Zellen, die unter Verwendung des Peptides mit der Sequenz SEQ ID-Nr.: 2 induziert wurden. Diese Zellen konnten nur solche T2-Zellen abtöten, die mit dem Peptid mit der Sequenz SEQ ID-Nr.: 2 vorbehandelt waren.
Dabei zeigten zytotoxische T-Zellen, die in Gegenwart des PAN- HLA-DR-bindenden Peptides induziert wurden, eine höhere zytotoxische Aktivität als solche, die in Abwesenheit dieses Peptides induziert wurden.
Beispiel 2 Lyse von Tumorzellen durch MUC-1-Peptid spezifische zytotoxische T-Zellen
Verschiedene Tumorzellinien, die wie durch FACS-Analyse nachgewiesen entweder sowohl HLA-A2 als auch MUC-1 oder jeweils nur eines der beiden Zelloberflächenmoleküle exprimieren, wurden mit 51Cr markiert, wie es unter 1.4 für T2-Zellen beschrieben wurde. Anschließend wurden die Zellen, wie ebenfalls unter 1.4 beschrieben, mit zytotoxischen T-Zellen inkubiert, die wie unter 1.3 beschrieben, induziert wurden.
Diejenigen T-Zellen, die unter Verwendung der Peptide mit der Sequenz SEQ ID-Nr.: 1 oder der Sequenz SEQ ID-Nr.: 2 aktiviert wurden, waren in der Lage, Tumorzellen der Linien MCF-7 (Brustkrebszellen), A-498 (Nierenzellkarzinomzellen) und MZ1774-RCC (Nierenzellkarzinomzellen), die HLA-A2 und MUC-1 ex- primieren, zu lysieren. Sie konnten jedoch keine Zellen der Zellinien Croft (EBV-immortalisierte B-Zellen), die kein MUC-1 exprimieren, sowie Caki-2 (Nierenzellkarzinomzellen), SK-OV-3 (Eierstockkrebszellen) und K562 (proerythroblastische Zellen), die kein HLA-A2 exprimieren, lysieren.
Ebensowenig konnten die unter Verwendung der Peptide mit der Sequenz SEQ ID-Nr.: 1 und SEQ ID-Nr.: 2 aktivierten zytotoxischen T-Zellen die HLA-A2- und MUC-1-exprimierenden Nierenzellkarzinomzellen der Linie MZ1774-RCC lysieren, wenn die Nierenzellkarzinomzellen zuvor 30 Minuten lang mit 10 μg/ml eines gegen HLA-A2 gerichteten monoklonalen Antikörpers (BB7.2, Coul- ter-Immunotech) inkubiert wurden.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide generierten zytotoxischen T-Zellen nur Tumorzellen abtöten, die sowohl HLA-A2 als auch MUC-1 exprimieren.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind somit dazu geeignet, auch im Rahmen einer Therapie eine Immunreaktion gegen bestimmte Tumorzellen auszulösen.
Erste Studien, bei denen eine derartige Therapie bei zwei Patientinnen mit Brustkrebs angewandt wurde, und bei denen die Patientinnen auf die Immun-Therapie angesprochen haben, stehen kurz vor dem Abschluß.

Claims

Patentansprüche
1. Peptid, das von dem MUC-1-Gen abgeleitet ist, und durch das eine HLA-A2-restringierte Immunreaktion gegen Tumorzellen auslösbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß es die Sequenz SEQ ID-Nr.: 1:
Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val,
und/oder eine Sequenz, die sich von dem Signalpeptid ableitet, insbesondere die Sequenz SEQ ID-Nr.: 2:
Leu Leu Leu Leu Thr Val Leu Thr Val,
und/oder
eine modifizierte Form der Sequenz SEQ ID-Nr.: 1 und/oder der Sequenz SEQ ID-Nr.: 2 aufweist.
2. Nukleinsäure, die einen Sequenzabschnitt umfaßt, der für ein Peptid nach Anspruch 1 codiert.
3. Nukleinsäure nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure Sequenzen aufweist, die zur Expression der dem Peptid entsprechenden Nukleinsäuresequenz notwendig sind.
. Nukleinsäure nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure in einem Vektor enthalten ist, der geeignet ist, die Expression der dem Peptid entsprechenden Nukleinsäuresequenz in einer Zelle zu ermöglichen.
5. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Peptid und/oder eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einer eine MHC-1-restringierte Immunantwort auslösenden wirksamen Menge enthält.
6. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 3 bis 5 im Rahmen einer Gentherapie.
7. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 3 bis 5 zur Transformation oder Transfektion von Zellen in vitro.
8. Verwendung mindestens eines Peptides oder einer Nukleinsäure nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 zur Auslösung einer Immunreaktion im Zusammenhang mit einer Tumortherapie oder mit einer gegenüber der Entstehung eines Tumors vorbeugenden Behandlung.
9. Verwendung mindestens eines der Peptide oder einer Nukleinsäure nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 in Kombination mit einem Pan-HLA-DR-bindenden Peptid.
10. Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der Peptide oder eine der Nukleinsäuren zusammen mit Antigen-präsentierenden Zellen, insbesondere dendritischen Zellen, inkubiert und erst dann in ei- nen Organismus eingebracht wird, aus dem die Antigen- präsentierenden Zellen oder deren Vorläuferzellen zuvor entnommen wurden.
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