WO2000050464A1

WO2000050464A1 - Fucogalactane sulfate

Info

Publication number: WO2000050464A1
Application number: PCT/JP2000/000965
Authority: WO
Inventors: Takeshi Sakai; Hitomi Kimura; Kaoru Kojima; Kaoru Katayama; Kazuo Shimanaka; Katsushige Ikai; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date: 1999-02-23
Filing date: 2000-02-21
Publication date: 2000-08-31
Also published as: ATE277085T1; JP3523597B2; EP1176153A1; CN1305884C; CN1341126A; ES2225084T3; TWI247751B; CA2359839A1; DE60014065D1; KR20020002372A; EP1176153B1; DE60014065T2; AU2575100A; US6590097B1; CN1191261C; EP1176153A4; KR100601330B1; CN1670027A

Description

明細書硫酸化フコ技術分野

本発明は、糖鎖工学用試薬として有用な硫酸化フコガラタタン、該硫酸化多糖由来低分子化物、及びその製造方法、さらに糖鎖工学分野において有用な硫酸ィ匕フコガラタタン分解酵素、該酵素の製造方法に関する。

背景技術

褐藻類には何種類もの硫酸化フコース含有多糖が含まれている。例えば、 ①フコースと硫酸基のみからなる硫酸ィヒフカン、 ②グルクロン酸、マンノ一ス、フコース及び硫酸基を含有する硫酸化フコダルクロノマンナン、例えば W097/2 6896公報に記載のフコース硫酸含有多糖一 U (構成糖及びそのモル比がフコース：マンノース：ガラクトース：ゥロン酸：硫酸基 =約 10 : 7 : 4 : 5 : 2

0、以下、 U—フコィダンと称す）、 ③フコース、ガラクトースよりなる硫酸ィ匕フコガラタタン、例えば、 W〇97/26896公報に記載のフコース硫酸含有多糖一 F (構成糖及びそのモル比がフコース：ガラクトース=約 10 : 1、以下、 F—フコィダンと称す）等の硫酸化フコース含有多糖が知られている。これらの硫酸化フコース含有多糖は、おおよそ総て高分子の陰イオンであるため、様々な精製工程において理化学的に同じ挙動を取り、分離が困難であった。そのため褐藻類の硫酸化フコース含有多糖はそれぞれ分離されることなく、そのまま生物活性が調べられることが多く、見出された生物活性を担うのがどの硫酸化フコース含有多糖であるのかを決定することは困難であった。

現在までに活性と分子の相関関連が知られているのは、ァグリカルチュラルアンドノくィォロジカノレケミストリー (Agricultural and Biological Chemistry )、第 44卷、第 8号、第 1 965頁〜第 1 966頁（1 980) 記載の抗凝血作用を担う硫酸化フカン画分、 WO 97ノ 26896公報記載の癌細胞に対するアポトーシス誘発作用を担う U—フコィダンである。硫酸化フカン画分の抗凝血作用に関しては、へパリンの代わりに使用することが検討されてきた。し力し、薬品として使用する場合、予期せぬ活性すなわち副作用を防ぐためにも、高純度の硫酸化フカンを得る必要があり、その方法が求められていた。

同様に、 U—フコィダンに関しても癌細胞に対するアポトーシス誘発作用を利用した薬品類を調製するために高純度のフコース硫酸含有多糖一 Uを簡便に得る必要があり、その方法が求められていた。

一般的に、多糖の構造解析やオリゴ糖の製造に酵素分解を利用する方法は、最も効率良い方法である。また、分離が困難な多糖の混合物から一種類の多糖だけを除去する際にも、除去したい多糖を特異的に分解する酵素があれば、その多糖をその酵素で低分子化した後、限外ろ過等の分子量分画を行うことにより容易にその他の多糖と分離することができる。

硫酸化フコガラクタンに関して、硫酸化フコガラクタンを特異的に分解する酵素があれば、硫酸化フコガラクタンの構造解析、硫酸化フコガラクタンオリゴ糖の製造が容易である。

以上のことから硫酸化フコガラクタン分解酵素、及び酵素的に製造した硫酸ィ匕フコガラタタンオリゴ糖を得る方法が求められていた。

発明の目的

即ち、本発明の目的は、（1 ) 糖鎖工学用試薬あるいは肝細胞増殖因子

(hepatocyte growth factor； H G F ) 産生誘導物質として有用な硫酸化フコガラクタン又はその塩、（2 ) 該硫酸ィ匕フコガラクタンに硫酸化フコガラタタン分解酵素を作用させて得られる低分子化物又はその塩、（3 ) 糖鎖工学的に有用な硫酸化フコガラクタン分解酵素、（4 ) 硫酸化フコガラクタン又はその塩に該酵素を作用させて得られる低分子化物の製造方法、及び（5 ) 硫酸化フコガラクタン分解酵素の製造方法を提供することにある。発明の概要

本願の発明者らは鋭意研究の結果、褐藻類に含まれる硫酸化フコガラクタン、該硫酸化多糖を分解する硫酸化フコガラクタン分解酵素及びその製造方法を見出した。さらに、糖鎖工学用試薬として利用できる硫酸化フコガラクタンの低分子化物及びその製造方法を見出し、本発明を完成させた。

本発明の第 1の発明は、下記の理化学的性質を有することを特徴とする硫酸ィ匕フコガラタタン又はその塩に関する。該硫酸化フコガラタタンは、構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、そのモル比が 1 ： 1〜6 ： 1であり、下記一般式（X I ) で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とする。

(式中、 Rは H又は S〇₃ Hである）

さらに、本発明の硫酸化フコガラタタン分解酵素により低分子化され、下記一般式（I ) 〜（I V) で表される化合物より選択される 1種以上の化合物が生成する。

(式中、 Rは H又は S〇₃Hである）

本発明の第 2の発明は、下記一般式（1 1) 、（I I I，）又は（I V) から選択される化学構造を有する糖化合物またはその塩に関する。 (I I)

OR H OR H OR H OR

(式中、 Rは H又は S0₃Hである）

本発明の第 3の発明は、下記の理化学的性質を有することを特徴とする硫酸ィ匕フコガラタタン分解酵素に関する。該酵素は、構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、そのモル比が 1 ： 1〜6 ： 1である硫酸化フコガラクタン又はその塩に作用して該硫酸化フコガラクタンを低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガラタトースあるいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成させることができ、至適 p Hは、約 7〜9の範囲であり、至適温度は、約 2 5〜4 5 °Cである。

本発明の第 4の発明は、上記第 3の発明に記載の硫酸ィ匕フコガラクタン分解酵素を褐藻類由来の硫酸化フコガラクタン又はその塩に作用させて取得することを特徴とする硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はその塩の製造方法に関する。該酵素によって得られる低分子化物は、例えば、上記第 2の発明に記載のオリゴ糖又はその塩が挙げられる。

本発明の第 5の発明は、硫酸化フコガラクタン分解酵素生産能を有するフラボパクテリゥム属細菌を培養し、その培養物から該酵素を採取することを特徴とする上記第 3の発明に記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素の製造方法に関する。図面の簡単な説明

図 1 ：本発明により得られる硫酸化フコガラタタン分解酵素の p Hと相対活性

(%) の関係を表すグラフである。

図 2 ：本発明により得られる硫酸ィ匕フコガラクタン分解酵素の温度と相対活性 (%) の関係を表すグラフである。

図 3 ：本発明により得られる硫酸化フコガラクタン低分子化物（A) の¹ H— NM Rスぺクトルを示す図である。

図 4 ：本発明により得られる硫酸化フコガラクタン低分子化物（A) の^{1 3} C— NMRスぺクトルを示す図である。

図 5 ：本発明により得られる硫酸化フコガラクタン低分子化物（A) の質量分析（マス）スぺクトルを示す図である。

図 6 ：本発明により得られる硫酸化フコガラクタン低分子化物（B ) の¹ H—

NM Rスぺクトルを示す図である。

図 7 ：本発明により得られる硫酸化フコガラクタン低分子化物（B ) の^{1 3} C— NMRスぺクトルを示す図である。

図 8 ：本発明により得られる硫酸化フコガラクタン低分子化物（B ) の質量分析（マス）スぺクトルを示す図である。

図 9 ：本発明により得られる硫酸ィヒフコガラクタン低分子化物（C) の¹ H— NMRスぺクトルを示す図である。

図 10 ：本発明により得られる硫酸化フコガラタタン低分子化物（C) の¹³ C 一 NMRスぺクトルを示す図である。

図 1 1 ：本発明により得られる硫酸化フコガラクタン低分子化物（C) の質量分析（マス）スぺクトルを示す図である。

図 12 ：本発明により得られる硫酸化フコガラタタン低分子化物（D) の¹ H 一 NMRスぺクトルを示す図である。

図 1 3 ：本発明により得られる硫酸化フコガラクタン低分子化物（D) の¹³ C 一 NMRスぺクトルを示す図である。

図 14 ：本発明により得られる硫酸化フコガラクタン低分子化物（D) の質量分析（マス）スぺクトルを示す図である。

図 1 5 ：本発明により得られる硫酸化フコガラクタン低分子化物（E) の¹ H 一 NMRスぺクトルを示す図である。

図 16 ：本発明により得られる硫酸化フコガラクタン低分子化物（E) の¹³ C 一 NMRスぺクトルを示す図である。

図 1 7 ：本発明により得られる硫酸化フコガラタタン低分子化物（E) の質量分析（マス）スぺクトルを示す図である。

図 18 ：本発明により得られる硫酸化フコガラクタン低分子化物（F) の¹ H

— NMRスぺクトルを示す図である。

図 19 ：本発明により得られる硫酸化フコガラクタン低分子化物（F) の¹³ C — DEPT— 135° スペクトルを示す図である。

図 20 ：本発明により得られる硫酸化フコガラタタン低分子化物（F) の質量分析（マス）スぺクトルを示す図である。

図 21 ：本発明により得られる硫酸化フコガラクタンの¹ H— NMRスぺクトルを示す図である。

図 22 ：本発明により得られる硫酸ィヒフコガラクタンの¹³ C— NMRスぺクトノレを示す図である。図 2 3 ：本発明により得られる硫酸化フコガラクタンの赤外吸収スぺクトルを示す図である。

図 2 4 ：フコース硫酸含有多糖の低分子化物の 0 . 4 M塩化ナトリゥム溶出画分の質量分析（マス）スぺクトルを示す図である。

図 2 5 ：フコース硫酸含有多糖の低分子化物の 0 . 4 M塩化ナトリゥム溶出画分の¹ H— NM Rスぺクトルを示す図である。

図 2 6 ：フコース硫酸含有多糖の低分子化物の 0 . 4 M塩化ナトリゥム溶出画分の^{1 3} C— NMRスぺクトルを示す図である。

図 2 7 ：フコース硫酸含有多糖の低分子化物の 0 . 6 M塩化ナトリウム溶出画分の¹ H— NM Rスペクトルを示す図である。発明の詳細な説明

以下本発明に関して具体的に説明する。

褐藻類に属する海藻には複数種の硫酸ィヒフコース含有多糖が含まれている。その分子種としては、硫酸化フカン及び硫酸化フコダルクロノマンナン等や他にも何種類もの分子種が報告されている。

本発明の硫酸ィ匕フコガラタタンとは、構成糖として主にガラクトースとフコースを含有し、そのモル比が 1 ： 1〜6 ： 1であり、以下、本発明の硫酸化フコガラクタンあるいは G—フコィダンと称し、例えば、 2 ： 1の硫酸化フコガラクタンが例示される。また、平均分子量は、例えば、 H P L Cゲルろ過法で約 1 3万 (分子量分布は、約 1 0万〜約 2 0万）の硫酸化多糖である。なお、上記硫酸ィ匕フコガラクタンの分子量、糖組成、及び硫酸基含量は、該硫酸化フコガラクタンの原料の収穫期、該原料の乾燥方法、該原料の保存方法により異なり、また硫酸化フコガラタタンの抽出時の加熱条件、 p H条件等により異なる。例えば、酸により該硫酸化フコガラクタンは加水分解される場合がある。従って、本明細書に記載した硫酸化フコガラクタンの分子量、分子量分布、糖組成、あるいは硫酸基含量はその 1例にすぎず、該硫酸化フコガラクタンの抽出処理条件により、その分子量、分子量分布、糖組成、あるいは硫酸基含量は容易に変化させ得る。例えば、本明細書に記載のフコース硫酸含有多糖— u分解酵素及びフコース硫酸含有多糖一 F分解酵素を用いて本発明の硫酸化フコガラクタンを調製する場合、例えば上記の糖組成と分子量を示す本発明の硫酸化フコガラクタンが得られる。すなわち、調製方法の条件によって任意の分子量、分子量分布、糖組成、あるいは硫酸基含量の硫酸ィヒフコガラクタンを調製することができる。例えば、本発明の硫酸化フコガラタタンの主要な構成糖は、 6糖あたりおよそ 5残基の硫酸基を含んでいるが、一般的に糖にエステル結合している硫酸基は、化学的に不安定であり、酸やアルカリあるいは熱により容易に切断される。例えば、酸性やアルカリ性条件下で加熱処理を行えばその硫酸含量は減少するものである。すなわち、本発明の硫酸化フコガラクタンから意図的に脱硫酸が可能である。また、脱硫酸の際、酸やアルカリの種類や濃度、加熱処理時の温度や時間を調整すれば、切断する硫酸基の量も調整することができる。従って、本発明の硫酸化フコガラタタンは、前述の特徴を備えた硫酸化フコガラクタンもしくは、本発明の硫酸化フコガラタタン分解酵素で低分子化される硫酸化フコガラクタンであればすべての褐藻類由来のものを包含する。

本発明の硫酸化フコガラクタンの主骨格は、下記一般式（X I I ) に表される。下記一般式において、 nは、 1以上の整数であり、例えば、 1〜1 0 0 0の範囲、さらに好ましくは 1〜5 0 0の範囲のものが本発明の硫酸ィヒフコガラクタンに含まれる。また、本発明の硫酸化フコガラタタンには、上記範囲であれば、下記一般式（X I I ) が連続的に繰り返した構造をもつもの及び他の構造が介在して、非連続的に下記一般式（X I I ) が含有される構造をもつもののいずれもが含まれる。

(式中、 Rは H又は S〇₃ Hである）

本発明の硫酸ィヒフコガラクタンが由来する褐藻類は、特に限定されるものではないが例えば、ガゴメ昆布、ワカメ、マ昆布、ァラメ、カジメ、クロメ、レツソニアニダレセンス、ジャイアントケルプ、ダービリア（durvillaea) 由来のものを調製することができる。特に限定はないが、例えば、ガゴメ昆布由来フコイダンには、 U—フコィダン、 F—フコィダン及び本発明の G—フコィダンが含まれている。

本発明の硫酸ィ匕フコガラクタンの塩としては、薬学的に許容される塩を用いることができ、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属の塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属の塩、亜鉛等の遷移金属の塩、またはアンモ二ゥム塩等が挙げられる。

本明細書において硫酸ィヒフコガラクタン低分子化物とは、本発明の硫酸化フコガラクタンに本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させて得られるオリゴ糖であり、還元性末端糖が硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースである。本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素とは、本発明の硫酸化フコガラクタンに作用して該硫酸ィヒフコガラクタンを低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成させる。また、 W0 9 7 / 2 6 8 9 6公報には、フコース硫酸含有多糖一 Fを分解するエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素が記載されているが、該酵素は、本発明の硫酸化フコガラクタンを分解しない。また、本発明の硫酸化フコガラタタン分解酵素は、本発明の硫酸化フコガラクタンの D—硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースと D—硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースの間の ;3 1— 6結合及び 1— 4結合をェンド的に分解する酵素である。

本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の基質となる本発明の硫酸化フコガラクタンを製造する際にはまず、褐藻類から硫酸化フコース含有多糖画分を得てから本発明の硫酸化フコガラタタンを精製する方法が簡便である。例えば、硫酸ィ匕フコース含有多糖画分の製造にはまず、褐藻類の水溶性画分抽出液を得る。その際の硫酸ィ匕フコース含有多糖の低分子化を防ぐためには、 ^1は4〜9、温度は 1 0 0 °C以下の抽出が好ましい。

当該抽出液からアルギン酸を除くには、酸性処理によるアルギン酸の等電点沈殿を利用する方法、カルシウム塩等、アルギン酸と沈殿を形成する塩を添加する方法、アルギン酸分解酵素により分解する方法等がある。また、アミノ酸やマン二トール等の低分子を除くには限外ろ過を用いれば効率良く除去できる。疎水性物質の除去には活性炭処理なども有効である。

このようにして硫酸ィヒフコース含有多糖の混合物を得ることができる。この混合物から本発明の硫酸化フコガラタタンを製造する際には、硫酸化フコース含有多糖の混合物に、 WO 9 7 / 2 6 8 9 6公報にエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素として記載のフコース硫酸含有多糖一 F分解酵素及び WO 9 7 / 2 6 8 9 6公報にェンド型フコィダン分解酵素として記載のフコース硫酸含有多糖一 U分解酵素を作用させた後に、低分子画分を限外ろ過法で除去し、本発明の硫酸化フコガラクタンを調製すれば良レ、。

' こうして得られた硫酸化フコガラクタンには硫酸ィヒフコガラタタン以外の何種類かの硫酸化フコース含有多糖が含まれる場合があるが、例えば、陰イオン交換樹脂を用いて分離精製することにより、本発明の硫酸化フコガラクタンを単離することができる。この方法によれば、硫酸化フコース含有多糖の混合物を直接陰イオン交換樹脂により分離する方法と比べて樹脂量も少なくて済み、上記 2種の硫酸ィ匕フコース含有多糖の混入がないため、分離が格段に向上する。

前述の方法で得られた本発明の硫酸化フコガラクタンは本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を精製する際の活性測定用基質、あるいは本発明の硫酸化フコガラクタンオリゴ糖製造時の原料としても使用できる。また、硫酸ィヒフコガラタタンオリゴ糖製造時の原料としては、上記の硫酸ィヒフコース含有多糖の混合物を使用してもよい。

本発明の酵素の製造に使用される菌株としては、本発明の硫酸化フコガラクタンを低分子化する酵素を産生する菌であれば特に限定はないが例えば、 W097 /26896公報記載のフラボパクテリゥム（Flavobacterium ) s p. S A 一 0082株（通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 [日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305-8566) ] に平成 7年（1 99 5年） 3月 29日より FERM P— 14872として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に FERM BP— 5402 [国際寄託への移管請求日：平成 8年（1 996年） 2月 1 5日] として寄託）が好適に使用できる。上記菌株はグラム染色性、 DNAの GC含量、主要キノン系等の菌学的性質から、フラボパクテリゥム属であると考えられた。一方、最近の分類基準に 1 6 S r DNAの塩基配列が考慮されていることが多いため、本発明者らも本細菌の 16 S r DNAの塩基配列についてインターネット National Center for

Biotechnology Information (NCBI)の Advanced BLAST searchでホモロジー検索を行った。

上記塩基配列と相同性の高い遺伝子を持つ細菌を検索したところ、全域に渡つて相同性が最も高いものは、ポーラリバクタ一フイラメンタス（Polaribacter filamentus) で、その相同性は 1424塩基にわたって 89 %であった。その他の細菌では全域にわたって相同性が高いものはなかった。なお、比較的相同性の高いものとしては、ポーラリバクタ一ィルジエンシー（Polaribacter irgensii、 1360塩基にわたって 89%の相同性）、サイトファ一ガスピーシーズ（Cytophaga sp.、 1249塩基にわたって 92%の相同'！ "生）、フレキシパクターマリティムス（Flexibacter maritimus、 1 247塩基にわたって 9

1 %の相同性）等があった。一般的に 16 S r DNAの塩基配列の相同性が 9 0%以下の場合、同属の細菌と判断できないため、本細菌は、遺伝子学的分類には既知の細菌と同じ属に帰属しないことが考えられた。即ち、本細菌の菌学的性質がサイトファーガ（Cytophaga) 目に属するフラボバタテリゥム (Flavobacterium ) 属細菌とほぼ一致すること及び本細菌の 1 6 S r D N Aの塩基配列について相同性が高い上記 4菌株が総て、サイトファーガ目細菌であることなど力ら、本細菌は、サイトファーガ目に属する新規細菌であると考えられる。なお、本明細書に記載のフラボバタテリゥム属細菌には、菌学的性質から分類されるフラボバタテリゥム属細菌及び遺伝子学的分類において相同性のあるサィトファーガ目細菌も含まれる。従って、サイトファーガ目に属する細菌を培養して本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を生産する場合は、本発明の硫酸ィ匕フコガラクタン分解酵素の製造方法に含まれる。

本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の製造方法に使用する菌株の培地は、使用する菌株が代謝し、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を生産するものであればよく、炭素源としては例えば硫酸化フコガラクタン、硫酸化フコース含有多糖の混合物、海藻粉末、アルギン酸、フコース、ガラクトース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース等が利用でき、窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキス等が好適に使用できる。また、本菌株は、上記栄養素を含んだ海水あるいは人工海水中で非常に良く生育する。

本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の生産菌を培養するに当たり、生産量は培養条件により変動するが、培養温度は 1 5〜 3 0 °C、培地の p Hは 6〜 9がよく、 5〜 7 2時間の通気攪拌培養で本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の生産量は最高に達する。培養条件は使用する菌株、培地組成等に応じ、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の生産量が最大になる様に設定するのは当然のことである。また、当該硫酸化フコガラタタン分解酵素は菌体中にも培養物上清中にも存在する。

上記のフラボバタテリゥム s p . S A— 0 0 8 2を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常用いられる細胞破砕手段、例えば、超音波処理等で菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。次いでこの抽出液から通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩析、イオン交換カラムク口マト、疎水結合カラムクロマト、ゲルろ過等により精製を行い、実質的に他の硫酸ィ匕フコース含有多糖分解酵素を含まない純化された本発明の硫酸ィ匕フコガラクタン分解酵素を得ることができる。また、上述の培養液から菌体を除去した培養上清中にも本酵素が大量に存在するので、菌体内酵素と同様の精製手段により精製することができる。

本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の理化学的性質は以下の通りである。

( I ) 作用①：構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、そのモル比が 1 ：：！〜 6 ： 1である硫酸ィ匕フコガラクタン又はその塩に作用して該硫酸ィ匕フコガラクタンを低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成させる。

( I I ) 至適 p H：本酵素の至適 p Hは約 7〜9付近にある（図 1 ) 。

すなわち図 1は本酵素の反応時の p Hと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性 (%) 、横軸は p Hを示す。

( I I I ) 至適温度：本酵素の至適温度は約 2 5〜4 5 °C付近にある（図 2 ) 。すなわち図 2は、本酵素の反応時の温度と相対活性の関係を表すダラフであり、縦軸は相対活性 (%) 、横軸は温度 (°C) を示す。

本発明の硫酸化フコガラタタン分解酵素の確認は、例えば、該酵素を硫酸化フコガラクタンに作用させて得られる分解物を H P L Cにより分析し、低分子化の程度を測定することによって、あるいは生成する還元末端を常法により測定することによって行なうことができる。活性測定は、産生菌の細胞抽出液もしくはクロマト精製後の酵素液のいずれにおいても可能である。

本発明の硫酸ィヒフコガラクタンの低分子化物又はその塩は、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を本発明の硫酸化フコガラタタン、若しくは該硫酸化フコガラクタン含有物に作用させることによって調製することができる。本発明の硫酸ィ匕フコガラクタン含有物としては、例えば本発明の硫酸化フコガラクタンの部分精製品、褐藻類由来の硫酸化フコース含有多糖画分、褐藻類の水性溶媒抽出物、もしくは褐藻類藻体が好適に使用できる。

本発明の硫酸ィ匕フコガラタタン、若しくは該硫酸ィ匕フコガラクタン含有物の溶解は通常の方法で行えばよく、溶解液中の本発明の硫酸ィヒフコガラクタン、若しくは該硫酸化フコガラタタン含有物濃度はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作十生、酵素力価を考慮して選定すればよレ、。本発明の硫酸化フコガラクタンの溶解液としては水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよレ、。溶解液の p Hは通常中性付近で、酵素反応は通常 3 0 °C付近で行う。酵素量や反応時間等を調整することによって、低分子化物の分子量を調整することもできる。次に低分子化物を分子量分画する.ことによって、更に均一な分子量分布の本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化物を調製することができる。分子量分画は通常よく使用されている方法を適用することができ、例えばゲルろ過法や分子量分画膜を使用すればよレ、。低分子化物は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭処理等の精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処理、無菌処理、凍結乾燥処理をすることもできる。

本発明の硫酸化フコガラタタンの低分子化物は、特に限定はないが、例えば本発明の硫酸化フコガラクタンに本発明の硫酸化フコガラタタン分解酵素を作用させて得られる低分子化物として 2糖類〜 6糖類が挙げられる。本発明の低分子化物中に存在する硫酸基の置換位置は、調製方法によって変化するが、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させて得られたものであれば、本発明の低分子化物に含まれる。該低分子化物の化学構造は、例えば、下記一般式（I ) 〜

( I V) に示される。その中で、下記一般式（I I I ) は、前述の硫酸化フコガラクタンの構成単位であると考えられる。

OR H OR H

OR OR H H OR

(式中、 Rは H又は S〇₃ Hである）

また、本発明の低分子化物は、硫酸基を分子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し、塩を形成する。これらの本発明の硫酸化フコガラタタンの低分子化物は、塩になった状態が安定であり、通常ナトリゥム及び Z又は力リゥム及び Z 又はカルシウム等の塩の形態で提供される。これらの物質の塩はダウエックス 5 0 W (ダウケミカル社製）等の陽イオン交換樹脂を利用することによって遊離の本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化物に導くことが可能である。また、これらは、更に必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩に交換することができる。

本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化物の塩としては、薬学的に許容される塩を用いることができ、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属の塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属の塩、亜鉛等の遷移金属の塩、またはアンモニゥム塩等が挙げられる。

本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を用レ、れば任意の硫酸化フコース含有多糖画分に含まれている本発明の硫酸化フコガラクタンのみを低分子化させることができるので、分子量分画と組み合わせることによつて本発明の硫酸化フコガラタタンを選択的に除去することが可能である。例えば、硫酸化フカン画分には抗凝血活性、癌転移抑制活性、ウィルス感染抑制活性等様々な生物活性があることが報告されている。これまで、褐藻類から得られた硫酸ィヒフカン画分には硫酸化フカン及びその他の多糖類が含まれている。従って、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を利用することにより、当該硫酸化フカン画分から硫酸化フコガラクタンを取り除くことができ、その結果、高純度の硫酸ィ匕フカンを得ることができる。

さらに例えば、硫酸化フコダルク口ノマンナンには癌細胞に対するアポトーシス誘発作用があることが報告されている。従って、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を利用することにより、褐藻類から得た硫酸化フコダルクロノマンナンに共雑する本発明の硫酸化フコガラタタンを容易に取り除くことができ、その結果、高純度の硫酸ィ匕フコグルクロノマンナンを簡便に得ることができる。本発明の硫酸化フコガラタタンを除去する方法としては、たとえば、本発明の硫酸化フコガラクタン含有物が水系溶媒に溶けた溶液を調製する。本発明の硫酸ィ匕フコガラクタン含有物の溶解は通常の方法で行えばよく、溶解液中の本発明の硫酸化フコガラクタン含有物濃度はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、酵素力価を考慮して選定すればよい。本発明の硫酸化フコガラクタン溶解液としては水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよレ、。溶解液の p Hは通常中性付近が好ましい。次に本発明の硫酸化フコガラタタン含有物溶液に本発明の硫酸ィ匕フコガラクタン分解酵素もしくは該酵素の固定化物、あるいは両方を添加して反応させ本発明の硫酸化フコガラクタンを低分子化する。酵素反応は通常 3 0 °C付近で行い、酵素量や反応時間等は、次工程の分子量分画能に応じて適宜調整すればよい。その後、分子量分画すれば、本発明の硫酸化フコガラタタンの低分子化物を容易に除去された目的物を調製することができる。分子量分画は、通常よく使用されている方法を適用することができ、例えばゲルろ過法や分子量分画膜を利用した限外ろ過法を使用すればよい。

本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素は、本発明の硫酸化フコガラクタンに作用するため、本発明の硫酸化フコガラクタンの構造解析に用いることができる。例えば、本発明の硫酸化フコガラクタンに本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させると、前記一般式（I ) 〜（I V) に示される化学構造を有する低分子化物が得られる。

さらに本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を用いれば、本発明の硫酸化フコガラクタンを含有する硫酸ィ匕フコース含有多糖から本発明の硫酸化フコガラクタン成分を選択的に除去することができる。例えば、本発明の硫酸化フコガラクタン成分を除去した後の高純度の硫酸化フカンもしくは硫酸化フコダルクロノマンナンは、医薬品の原材料としても好適に使用できる。

本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素は、 W0 9 7 Z 2 6 8 9 6号公報に記載のフコース硫酸含有多糖一 F分解酵素及び/又は WO 9 7 / 2 6 8 9 6号公報記載のフコース硫酸含有多糖— U分解酵素と組み合わせて使用することができる。特に限定はないが例えば、ガゴメ昆布から p H 4〜9、 1 0 0 °C以下の温度で抽出する方法で得た硫酸化フコース含有多糖の混合物を上記フコース硫酸含有多糖 - U分解酵素及び本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素で処理すると下記一般式（X I V) で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とし、その繰り返し構造を有する硫酸化多糖を得ることができる。下記一般式において nは、 1以上の整数であり、例えば、 1〜 1 0， 0 0 0の範囲、さらに好ましくは 1〜5， 0 0 0の範囲のものが得られる

〔X I V]

(式中、 Rは、 H又は O S 0₃ Hである）

上記硫酸化多糖は、構成糖としてフコースを含有する。例えば、抽出時の処理条件が、 p H 6〜8、 9 5 °C 2時間程度の場合は、平均分子量は約 2 0万（分子量分布は、約 1万〜約 1 0 0万）である。さらに例えば、抽出時の処理条件が、 p H 6〜8、 2 5 °C 2 4時間程度の場合は、平均分子量は約 1 , 3 0 0万（分子量分布は、約 1 0万〜約 2， 0 0 0万）である。このように抽出条件によって平均分子量及び分子量分布は異なってくる。しかしながら、いずれの抽出条件においても得られる硫酸化多糖は、上記フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素で低分子化される。なお、上記硫酸化多糖の分子量及び硫酸基含量は、該硫酸化多糖の原料の収穫期、該原料の乾燥方法、該原料の保存方法により異なり、また抽出時の加熱条件、 p H条件等により異なる。例えば、酸により加水分解される場合がある。従って、本明細書に記載した上記硫酸化多糖の分子量、分子量分布あるいは硫酸基含量はその 1例にすぎず、該硫酸化多糖の抽出処理条件により、その分子量、分子量分布あるいは硫酸基含量は容易に変化させ得る。すなわち、調製方法の条件によつて任意の分子量、分子量分布あるいは硫酸基含量の上記硫酸化多糖を調製することができる。例えば、上記硫酸化多糖の主要な構成糖は、 7糖あたりおよそ 1 2残基の硫酸基を含んでいるが、一般的に糖にエステル結合している硫酸基は、化学的に不安定であり、酸やアルカリあるいは熱により容易に切断される。例えば、酸性やアルカリ性条件下で加熱処理を行えばその硫酸含量は減少するものである。すなわち、上記硫酸ィ匕多糖から意図的に脱硫酸が可能である。また、脱硫酸の際、酸やアルカリの種類や濃度、加熱処理時の温度や時間を調整すれば、切断する硫酸基の量も調整することができる。

さらに、上記硫酸化フコガラクタン分解酵素、フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素及びフコース硫酸含有多糖一 U分解酵素を組み合わせて使用することにより新規硫酸化糖を取得することができる。また、前述の 3種類の分解酵素の組み合わせにより従来とは異なる硫酸化糖の分類をすることができる。特に限定はない力例えば、上記ガゴメ昆布のような褐藻類由来の硫酸ィヒフコース含有多糖の混合物に作用させて、

①フコース硫酸含有多糖— F分解酵素及びフコース硫酸含有多糖一 U分解酵素で分解されず、硫酸化フコガラクタン分解酵素で分解される硫酸化糖画分（本発明の硫酸化フコガラクタン）；

②フコガラクタン分解酵素及びフコース硫酸含有多糖— F分解酵素で分解されず、フコース硫酸含有多糖一 U分解酵素で分解される硫酸化糖画分；

③フコガラクタン分解酵素及びフコース硫酸含有多糖一 U分解酵素で分解されず、フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素で分解される硫酸化糖画分；

④フコガラクタン分解酵素、フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素及びフコース硫酸含有多糖一 U分解酵素で分解されない硫酸化糖画分；

をそれぞれ得ることができる。これらの硫酸化糖画分は、本発明のフコガラクタン分解酵素とフコース硫酸含有多糖一 F分解酵素あるいはフコース硫酸含有多糖一 U分解酵素を組み合わせることによって初めて得られる。

本発明の硫酸化フコガラタタン又はその塩は、成長因子産生誘導活性、特に H G F (hepatocyte growth factor)産生誘導活性を有する。

部分肝切除を受けた肝臓は、速やかに再生し、もとのサイズになる。この肝再生因子の本体は、長年不明であつたが、劇症肝炎患者の血漿中に H G Fが見出され、その患者血漿から、単離、精製された（J . Clin. Invest. ， 88 414-419, 1988) 。さらに、ヒト H G Fの c D N Aもクローニングされ、 H G Fの 1次構造も明らかにされた（Biochem. Biophys. Res. Commun. , 163 967-973， 1989) 。また、細胞の運動性を亢進させる s c a t t e r f a c t o r ( S F ) および、腫瘍細胞障害因子である t umo r c y t o t o x i c f a c t o r (TC F) と HGFが同一物質であることも明らかになった（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 7001-7005, 1991： Biochem. Biophys. Res. Commun. , 180 1151 - 1158, 1991) 。

HGFは、干細胞だけでなく胆管上皮細胞、腎尿細管上皮細胞、胃粘膜細胞など多くの上皮細胞の増殖を促進させる。また、上皮細胞の運動性の亢進や血管新生、上皮細胞の管腔形成で見られるような形態形成を誘導するなど、 HGFは極めて多彩な生理活性を示す多機能活性物質である。つまり、様々な臓器において、その臓器の障害を修復する際の上皮細胞の増殖を促進、運動性の亢進や血管新生などの形態形成の誘導等を行う。また、 HGFは、肝細胞増殖作用、タンパク合成促進作用、胆汁うっ滞改善作用、さらには薬剤による腎障害の予防作用などを示す。これらのことからも、重症肝炎、肝硬変および肝内胆汁うっ滞の治療薬として期待されている。

また HGFの mRNAは、脳、腎臓、肺等でも合成されており、肝実質細胞、腎細尿管細胞、表皮細胞等に対しても増殖活性がある、中胚葉性細胞成長因子である。従って、本発明の硫酸化フコガラクタン又はその塩は、肝細胞増殖因子の産生を誘導することにより、肝炎、重症肝炎、肝硬変および肝内胆汁うっ滞、慢 1生腎炎、肺炎、創傷の治療剤又は予防剤の成分として有用である。

本発明の硫酸化フコガラクタン又はその塩は、その H G F産生誘導作用により、化粧料の有効成分として使用することができ、例えば HGF産生誘導用化粧料として有用であり、 HG F産生誘導作用を有するバイオィヒ粧品が提供できる。

さらに、本発明の硫酸化フコガラクタン又はその塩を含有する成長因子産生誘導用化粧品、例えば HGF産生誘導用化粧品は、常法に従って製造することができ、例えばローション類、乳液類、クリーム類、パック類、浴用剤、洗顔剤、浴用洗剤、毛髪剤、育毛剤又は洗髪剤が挙げられる。

本発明の硫酸化フコガラクタン、若しくは該硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれらの塩は、抗原として使用することができる。抗体の作製は、常法により行われるが、例えば、本発明の硫酸ィヒフコガラクタン、若しくは該硫酸化フコガラタタンの低分子化物又はそれらの塩をアジュバンドとともにゥサギ等の動物に免疫することによって、ポリクローナル抗体を調製することができる。また、モノクローナル抗体は、抗原を免疫して得られた抗体産生 B細胞とメラノーマ細胞を融合し、目的の抗体を産生するハイプリドーマを選択し、この細胞を培養することによって調製することができる。これらの抗体は、本発明の硫酸化フコガラクタン若しくは該硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれらの塩の精製に使用することができる。また、海藻中の本発明の硫酸化フコガラタタンの同定に使用することができる。例えば、本発明の硫酸化フコガラクタンを認識する抗体を使用し、海藻抽出液中の本発明の硫酸化フコガラクタン含量を容易に測定でき、高含有抽出液を効率よく調製することが可能になる。さらに、本発明の硫酸化フコガラタタン、若しくは該硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれらの塩を認識する抗体は、本発明の硫酸ィ匕フコガラクタン、若しくは該硫酸化フコガラタタンの低分子化物又はそれらの塩の受精阻害作用機作、ウィルス感染阻害機作、生体内での代謝等の解析等に有用である。

また、本発明の硫酸化フコガラクタン又はその塩に本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させて得られた低分子化物即ちオリゴ糖類は、糖鎖工学用試薬として用いることができる。例えば、特公平 5— 6 5 1 0 8号公報記載の方法によりピリジルー（2 ) —ァミノ化（P A化）を行い、該低分子化物の P A化物を調製すれば、糖鎖工学用試薬として極めて有用な物質を提供することができる。実施例

以下に本発明を実施例をもって具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。

実施例 1 硫酸化フコガラクタンの調製

( 1 ) 硫酸化フコガラクタンを下記の工程により調製した。

乾燥ガゴメ昆布 2 K gを穴径 l mmのスクリーンを装着したカッターミル（増幸産業社製）により破砕し、 2 0リットルの 8 0 %エタノール中で 2 5 °C、 3時間攪拌後ろ過、洗浄した。得られた残さを 5 O mMの塩ィ匕カルシウム、 1 0 0 m Mの塩化ナトリウム、 1 0 %のエタノール、及ぴ WO 9 7 / 2 6 8 9 6公報記載のアルテロモナス s p . S N— 1 0 0 9株（通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 [日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305— 8

566) ] に平成 8年（1 996年） 2月 1 3日より FERM P— 15436 として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に FERM B P-5747 [国際寄託への移管請求日：平成 8年（1 996年） 1 1月 1 5 日] として寄託）を培養し、該培養物から得られたフコース硫酸含有多糖— F分解酵素を 1 U含む 20リツトルの 30 mMィミダゾール緩衝液（ p H 8. 2) に懸濁し、 25°Cで 2日攪拌すると高分子の硫酸化フコース含有多糖による強い粘弾性が完全に消失したので低分子化した硫酸化フコース含有多糖を除去するため、穴径 32 /zmのステンレス金網でろ過し、洗浄した。得られた残さを 1 O OmM の塩化ナトリウム、 10%のエタノール、及び 4 gのアルギン酸リアーゼ K (ナガセ生化学工業製）を含む 40リットルのリン酸ナトリウム緩衝液（_PH6. 6) に懸濁し、 25°C、 4日攪拌後、遠心分離し上清を得た。得られた上清中に含まれるアルギン酸の低分子化物を除去するため排除分子量 10万のホロフアイバーを装着した限外ろ過機により 2リツトルに濃縮後、 10%のエタノールを含む 10 OmMの塩化ナトリゥムで溶液交換した。この溶液に等量の 400 mM酢酸カルシウムを添加攪拌後、遠心分離し、得られた上清を氷冷しながら、 1 Nの塩酸で p H 2とした。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を 1 N の水酸化ナトリウムにより pH8. 0とした。この溶液を限外ろ過により 1 リツトルに濃縮後、 10 OmMの塩ィヒナトリウムで溶液交換した。この時生じた沈殿は遠心分離により除去した。得られた上清中の疎水性物質を除去するため、上清に 1 Mとなるように塩化ナトリウムを加えて、 1 Mの塩化ナトリゥムで平衡化した 3リットルのフエニルセル口ファインカラム（生化学工業製）にかけ、素通り画分を集めた。この画分を限外ろ過機により濃縮後、 2 OmMの塩化ナトリウムで溶液交換し、凍結乾燥した。凍結乾燥物の重量は 29. 3 gであった。

(2) 上記の凍結乾燥物 1 5 gを 400 mMの塩化ナトリウム及び WO 97/2

6896公報記載のフラボバタテリゥム s p. S A-0082 (通商産業省ェ業技術院生命工学工業技術研究所 [日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305— 8566) ] に平成 7年（1 995年） 3月 29日より FERM P— 14872として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に FERM BP— 5402 [国際寄託への移管請求日：平成 8年（ 1 99 6年） 2月 1 5日] として寄託）を培養し、該培養物から得られたフコース硫酸含有多糖一 U分解酵素を 9 U含む 1. 5リットルの 50 mMトリス塩酸緩衝液に溶解し、 25°Cで 6日間反応後、エバポレーターで約 30 Om 1に濃縮した。濃縮液を排除分子量 3500の透析チューブに入れて徹底的に透析し、低分子化された硫酸化フコダルクロノマンナンを除去した。透析チューブ内に残つた液を、 5 OmMの塩^ (匕ナトリゥムで平衡ィ匕した 4リットルの DEAE—セル口ファイン A— 800 (チッソ社製）に力、け、 5 OmM塩化ナトリゥムで充分洗浄後、 50 〜65 OmMの塩化ナトリゥムの濃度勾配による溶出を行った。更に同カラムを 65 OmMの塩ィヒナトリウムで充分溶出させた。溶出画分のうち 650 mMの塩化ナトリゥムで溶出した画分を硫酸ィ匕フコガラクタン画分として集め、排除分子量 10万の限外ろ過機により濃縮後、 1 OmMの塩化ナトリゥムで溶液を置換し、凍結乾燥して硫酸化フコガラクタン画分の凍結乾燥物を 0. 85 g得た。この画分について、糖組成分析を行なった。まず、ジャーナルォブバイオロジカルケミストリー（ Journal of Biological Chemistry), 第 1 75卷、第 595頁

(1 948) の記載に従い、フコース量を定量した。

次に、得られた硫酸化フコガラタタンの乾燥標品を 1規定の塩酸に 0. 5%の濃度で溶解し、 1 10°Cで 2時間処理し、構成単糖に加水分解した。次に、グラィコタツグ（宝酒造社製）及びグライコタツグリージントキット（宝酒造社製）を用いて加水分解して得られた単糖の還元性末端をピリジルー（2) —ァミノ化（PA化）し、 HP LCにより構成糖の比率を調べた。なお、 HP じの条件は下記によった。

装置； L—6200型（日立製作所製）

カラム；パルパックタイプ A (4. 6 mm X 1 50 mm；宝酒造社製）溶離液； 700 mMホゥ酸緩衝液（ p H 9. 0 ) ：ァセトニトリル = 9 ： 1 検出；蛍光検出器 F— 1 1 50 (日立製作所製）にて励起波長 31◦ nm、蛍光波長 380 nmで検出。

流速； 0. 3m l 分

力ラム温度； 65 °C 次に、アナリティカルバイオケミストリ一（Analytical Biochemistry), 第 4卷、第 330頁（1 962) の記載に従いゥロン酸量を定量した。さらに、ノィォケミカルジャーナル（Biochemical Journal) , 第 84卷、第 106頁（1 962) の記載に従い硫酸含量を定量した。

以上の結果、得られた硫酸化フコガラクタンは、構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、そのモル比は、約 2 ： 1であった。ゥロン酸及びその他の中性糖は実質的に含有されていなかった。また、フコースと硫酸基のモル比は約 1 ： 2であった。

( 3 ) 硫酸化フコガラクタン分解酵素の活性測定方法

(2) で得られた硫酸化フコガラタタン画分を用いて本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の活性を測定するときは下記の要領で行った。

すなわち、 60 μ 1の 50 mMのィミダゾールー塩酸緩衝液（ p H 7. 5) と、 4. 8 μ 1の 2. 5%の硫酸ィ匕フコガラクタン画分溶液と、 6 1の4^塩化ナトリウムと、 37. 2 1の水と 12 μ 1の本発明の第 1の発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素とを混合し、 37 °C、 3時間反応させた後、反応液を 100 °C で 10分間処理し、遠心分離後 1 00 μ 1を H P L Cにより分析し、低分子化の程度を測定した。対照として、本発明の第 1の発明の硫酸化フコガラタタン分解酵素の代わりに、その酵素を溶解してある緩衝液を用いて同様の条件により反応させたもの及び硫酸化フコガラクタン画分の代わりに水を用いて反応を行つたものを用意し、それぞれ同様に H PLCにより分析した。

1単位の酵素は、上記反応系において 1分間に 1 μ m o 1の硫酸化フコガラクタン画分のガラクトシル結合を切断する酵素量とする。切断されたガラクトシル結合の量は下記式により求めた。 {(4.8X1000X2.5/100) / G} X {(MG/M) -1} X {1/(180X0.012) } =U/ml

4.8X1000X2.5/100：反応系中に添加した硫酸化フコガラクタン g) MG：基質硫酸化フコガラクタン画分の平均分子量

M：反応生成物の平均分子量 (MG/M)— 1： 1分子の硫酸ィ匕フコガラクタンが酵素により切断された数

180：反応時間（分）

0.012：酵素液量（m 1.)

なお、 HP LC条件は下記によった。

装置： L一 6200型（日立製作所製）

カラム： OHp a k SB— 806 HQ (8 X 30 Omm、昭和電エネ： t ) 溶離液： 5 mMのアジ化ナトリゥムを含む 5 OmMの塩化ナトリウム

検出：視差屈折率検出器 (Sh o d e X R I— 71、昭和電工社製）流； iS： 1 m 1 Z分

カラム温度： 25°C

反応生成物の平均分子量の測定のために、市販の分子量既知のプルラン（ST ANDARD P— 82、昭和電工社製）を上記の H P L C分析と同条件で分析し、プルランの分子量と保持時間との関係を曲線に表し、上記酵素反応生成物の分子量測定のための標準曲線とした。

蛋白質の定量は、酵素液の 280 nmの吸光度を測定することにより行った。その際 1 mg/m 1の蛋白質溶液の吸光度を 1. 0として計算した。実施例 2 硫酸化フコガラクタン分解酵素の作用機作の決定

( 1 ) 硫酸化フコガラクタン分解酵素の調製

硫酸化フコガラクタン分解酵素の生産のため、フラボパクテリゥム s p. S

A- 0082 (FERM BP— 5402) をグノレコース 0. 1%、ペプトン 1. 0%、酵母エキス 0. 05%を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製） pH 7. 5からなる培地 600m 1を 1 20°C、 20分間殺菌した培地に接種し、 2 4 °Cで 23時間培養して種培養液とした。下記の実施例 3 (1) の方法で調製したガゴメ昆布由来の硫酸化フコース含有多糖画分 0. 2%、ペプトン 2. 0%、酵母エキス 0. 01%、及び消泡剤（KM70、信越化学工業製） 0. 01%を含む人工海水（pH7. 5) からなる培地 20リットルを 30リツトル容のジャーフアーメンターにいれ 120 Cで 20分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液 600mlを接種し、 24°Cで 23時間、毎分 10リツトルの通気量と毎分 12 5回転の攪拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を得た。

得られた菌体を、 1， 200m lの 0. 4M塩ィ匕ナトリウムを含む 1 OmMのトリス—塩酸緩衝液 (pH8. 0) に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。得られた菌体抽出液を同じ緩衝液で充分透析し、遠心分離して上清を得た。得られた上清に終濃度が 90%飽和となるように硫安を添加し生じた沈殿を遠心分離して集めた。得られた沈殿を 15 Om 1の 5 OmM塩化ナトリウムを含む 10 mMトリス一塩酸緩衝液 (pH8. 0 ) に溶解させ、同じ緩衝液で充分透析し、遠心分離した。得られた上清を同じ緩種 Ϊ液で平衡化した 50 OmL の DEAE—セファロース F F (アマシャムフアルマシア社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、 50 mMから 600 mM塩化ナトリゥムの濃度勾配により溶出させ、活性画分を集めた。

得られた活性画分を 0 · 1 M塩化ナトリウムを含む 10 mMトリス一塩酸緩衝液（pH8. 0) で充分透析し、同じ緩衝液で平衡化した 10 OmLの DEAE —セル口ファイン A— 800 (チッソ社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、 0. 1Mから 0. 4Mの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、活性画分を集めた。得られた活性画分に 4Mとなるように塩ィ匕ナトリウムを添カ卩し、 4 Mの塩化ナトリウムを含む 10 mMのトリス—塩酸緩衝液（ p H 8 · 0 ) で平衡ィ匕した 2 OmLの P h e n y 1—セル口ファイン（チッソ社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、 4Mから 1 Mの塩化ナトリゥムの濃度勾配により溶出後、さらに 1Mの塩ィ匕ナトリゥムを含む 1 OmMのトリス一塩酸緩衝液 (pH8. 0) で充分溶出させ、活性画分を集めた。得られた活性画分に 3 Mとなるように塩化ナトリゥムを添加し、 3Mの塩化ナトリゥムを含む 1 OmMのトリス一塩酸緩衝液（ρΗ8. 0) で平衡化した 1 OmLの P h e n y 1—セル口ファイン (チッソ社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、 3Mから 0. 5Mの塩ィ匕ナトリウムの濃度勾配により溶出後、さらに 0. 5 Mの塩化ナトリウムを含む 1 0 mMのトリス一塩酸緩衝液（ p H 8. 0) で充分溶出させ、活性画分を集めた。この様にして得られた精製酵素を硫酸ィ匕フコガラクタン分解酵素として用いた。 ( 2 ) 硫酸ィ匕フコガラクタンの低分子化物の調製実施例 1 (2) 記載の硫酸化フコガラクタン画分に上記の精製硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させ低分子化物を調製した。すなわち、 1. 94 gの硫酸ィ匕フコガラタタン画分を 0. 2 Mの塩ィ匕ナトリゥムを含む 25 mMトリス一塩酸緩衝液 (pH8. 0) に溶解後、 186mUの実施例 2 (1) 記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を加え、 25°Cで、 6日間反応させた。反応液をエバポレーターにより 8 Om 1に濃縮し、セル口ファイン GCL— 1000 (チッソ社製）のカラム（4 X 9 O cm) による分子量分画を行った。分子量 15， 000以下の画分を集め、硫酸化フコガラクタン酵素消化物画分とした。

次に、硫酸化フコガラタタン酵素消化物画分の一部をグライコタツグ（宝酒造社製）及びグライコタツグリージントキット（宝酒造社製）を用レ、て還元性末端を PAィ匕し、得られた PA化糖を 2規定の塩酸中で 1 00°C、 3時間処理により加水分解し、 HP LCにより還元末端糖を調べた。 HP LC条件は下記によった。

装置： L_6200型（日立製作所製）

カラム：パルパックタイプ A (4. 6 X 1 5 Omm, 宝酒造社製）

溶離液： 0. 7Mホウ酸緩衝液（ρΗ9· 0) ：ァセトニトリル =9 : 1 検出：蛍光検出器（F— 1 150、日立製作所製）にて励起波長 310 nm、蛍光波長 380 n mで検出。

流速： 0. 3 m 1 /分

カラム温度： 65°C

この結果、ガラクトースのみが検出されたので、硫酸化フコガラタタンの酵素消化物画分の還元性末端は総て硫酸化ガラクトースあるいはガラクト一スであることが判明した。

また、硫酸化フコガラクタンの酵素消化物画分の中性糖組成を分析するため、還元性末端糖を分析した試料の一部を再度 P A化し、上記と同じ条件で H PLC により分析した。その結果、硫酸化フコガラタタンの酵素消化物画分はガラタト一スとフコースからなり、そのモル比は、約 2： 1であることが判明した。前述の結果より、本発明の硫酸化フコガラタタン分解酵素は、硫酸ィ匕フコガラタタンのガラクトシル結合を切断して還元性末端に硫酸ィヒガラクトースあるいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成させるエンド型ガラクトシダーゼ類であることが判明した。実施例 3

(1) ガゴメ昆布から硫酸ィ匕フコース含有多糖画分を調製した。すなわち、市販の乾燥ガゴメ昆布 2 Kgを穴径 lmmのスクリーンを装着させたカッターミル

(増幸産業社製）で破砕し、 20リットルの 80 %エタノール中に懸濁後 25 °C で 3時間攪拌し、ろ紙でろ過した。得られた残さを 40リツトノレの 10 OmMの塩ィ匕ナトリウムを含む 3 OmMのリン酸ナトリウム緩衝液 (pH6. 5) に懸濁し、 95°Cで 2時間処理後、穴径 106 / mのステンレス製ふるいでろ過した。得られたろ液に 200 gの活性炭、 4. 5リツトルのエタノール、 12， 000 Uのアルギン酸リアーゼ K (ナガセ生化学工業社製）を添加し、 25°Cで 20時間攪拌後、遠心分離した。得られた上清を排除分子量 10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で 4リットルに濃縮後、遠心分離により不溶物を除去し、 5°Cで 24時間放置した。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を限外ろ過機により溶液交換して 10 OmM塩化ナトリゥム溶液とした。この溶液を 4°C以下に冷却後、塩酸により pHを 2. 0とし、生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清の pHを水酸ィ匕ナトリウムにより 8. 0とし、 4リツトルに濃縮後、限外ろ過機により 2 OmMの塩ィ匕ナトリゥムに溶液交換した。この溶液中の不溶物を遠心分離により除去後、 50 %のエタノールを 82m l添加して凍結乾燥し、ガゴメ昆布由来の硫酸ィヒフコース含有多糖画分の乾燥物を 76 g得た。

(2) フラボパクテリゥム s p. S A- 0082 (FERM BP— 540 2) を実施例 3 (1) の方法で調製したガゴメ昆布由来の硫酸ィヒフコース含有多糖画分 0. 2 %、ぺプトン 1. 0 %、酵母エキス 0. 01 %を含む人工海水（ p

H 7. 5) からなる培地 10 Om 1を 50 Om 1容の三角フラスコにいれ 1 2 0 °Cで 20分間殺菌した培地に接種し、 24 °Cで 23時間、振とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体と培養液上清を得た。

得られた菌体を、 5m lの 0. 4M塩化ナトリウムを含む 1 OmMのトリス一塩酸緩衝液 (pH8. 0) に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。

上記の培養液上清と菌体抽出液に含まれる本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素活性を測定した結果、培養液上清には培地 lmlあたり 2mU、菌体抽出液には培地 1 m 1あたり 2 mUの活性が検出された。上記の培養条件を用いれば、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素はフラボバクテリウム属細菌の菌体内にも菌体外にもほぼ同量含まれることが判明した。実施例 4

実施例 3 (1) で得られた硫酸化フコース含有多糖画分 7 gを 70 Om 1の 5

0 mM塩化ナトリウムと 10 %のエタノールを含む 20 mMのィミダゾールー塩酸緩衝液 (pH8. 0) に溶解し、あらかじめ同緩衝液で平衡化した、 5リットルの DEAE—セル口ファイン A— 800 (チッソ社製）に力け、同緩衝液で洗浄後、 50〜1 55 OmMの塩ィヒナトリウムの濃度勾配により溶出させ、溶出塩濃度 550〜 1550 mMの硫酸化フコース含有多糖画分を集めた。

上記の画分には、硫酸化フコガラクタン分解酵素により低分子化される成分すなわち本発明の硫酸ィヒフコガラタタンも 10%程度含まれていた。そこで、本画分を排除分子量 10万のホロフアイバーを装着させた限外ろ過機により脱塩し、さらに、 200 mMの塩化ナトリゥムを含む 20 mMのィミダゾール一塩酸緩衝液（pH8. 0) で溶液置換した。そこに、 60 OmUの本発明の硫酸化フコガラタタン分解酵素を添加し 25 °Cで 3日間反応後、限外ろ過を行い、ろ液中に含まれる糖の量をフノ一ルー硫酸法により測定し、糖が検出されなくなるまで限外ろ過を続けた。この工程により、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素により低分子化される成分すなわち本発明の硫酸化フコガラクタンを前記の硫酸化フコース含有多糖画分から除去することができた。実施例 5

(1) 硫酸化フコガラクタンの酵素消化物（ i) の調製

実施例 3で得られたガゴメ昆布由来の硫酸化フコース含有多糖画分 70 gを 3 0 OmMの塩ィヒナトリウム、 2 OmMの塩ィ匕カルシウム、及び 10%のエタノールを含む 20 mMのィミダゾールー塩酸緩衝液 (pH 7. 5) に溶解後、排除分子量 10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、ろ過可能な物質を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時に添加する緩衝液は溶解に用いた緩衝液と同じ組成のものを用いた。

次に、限外ろ過内液に、 WO 97/26896公報記載の方法でアルテロモナス s p. 3^^— 1009株（？£1 1^ 8?—5747) を培養し、該培養物力 ^得られたフコース硫酸含有多糖一 F分解酵素を 5 U添加し、 25。Cで 3日間反応させた。上記反応液を排除分子量 10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素で低分子化された物質、すなわち、フコィダンの低分子化物を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時に添加する緩衝液は上記反応液に用いた緩衝液と同じ組成のものを用いた。次に、限外ろ過内液に、 W097Z26896公報記載の方法でフラボバクテリウム s p. SA— 0082株（FERM BP— 5402) を培養し、該培養物から得られたフコース硫酸含有多糖— U分解酵素を 20U添加し、 25°Cで 5日間反応させた。上記反応液を排除分子量 10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多糖一 U分解酵素で低分子化された物質、すなわち、硫酸化フコダルクロノマンナンの低分子化物を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時には水を添カ卩し、最後に 20 OmMの塩ィヒナトリウムを含む 1 0 mMのトリス—塩酸緩衝液（ p H 8 ) に置換した。

次に、限外ろ過內液に、実施例 2 (1) 記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を 2U添カ卩し、 25 °Cで 5日間反応させた。反応液を 2等分し、一方は排除分子量 10万のホロファイバ一を装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上記硫酸化フコガラクタン分解酵素で低分子化された物質、すなわち、硫酸化フコガラタタンの低分子化物を徹底的に限外ろ過した。なお、限外ろ過時には 5 OmMの塩化ナトリウムを含む 1 OmMのトリス一塩酸緩衝液 (pH8) を添加した。こうして得られたろ過液を硫酸化フコガラタタン酵素消化物（ i) とした。

(2) 硫酸化フコガラクタン酵素消化物（ i i) の調製

実施例 5 (1) で 2等分した反応液のもう一方に、実施例 2 (1) 記載の硫酸ィ匕フコガラタタン分解酵素を 55 OmU添カ卩し、 25°Cで 7日間反応させ、低分子化の進行を確認した。反応液を、排除分子量 10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、硫酸化フコガラクタンの低分子化物を徹底的に限外ろ過した。なお、限外ろ過時には 5 OmMの塩化ナトリゥムを含む 1 OmMのトリス一塩酸緩衝液（ p H 8 ) を添カ卩した。こうして得られたろ過液を硫酸ィ匕フコガラタタン酵素消化物（ i i) とした。

(3) 硫酸化フコガラタタン酵素消化物（ i) の分離精製

実施例 5 (1) で得られた硫酸化フコガラタタン酵素消化物（ i) をエバポレ一ターで 50 Om 1に濃縮後、電気透析装置により脱塩し、あらかじめ 1 OmM の塩化ナトリウムを含む 10 mMのィミダゾールー塩酸緩衝液（ p H 8 ) で平衡ィ匕した 1リットルの DEAE—セル口ファイン A— 800 (チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、 1 OmMから 90 OmMの塩化ナトリゥムのグラジェントにより溶出させた。溶出画分は 62m 1ずつ分取し、それぞれの糖含量をフヱノ一ルー硫酸法により測定した。 130 mM付近及び 220 mM付近の塩化ナトリゥムで溶出される画分が糖含量のピークを形成していたので、それぞれを集め、 1 3 OmM溶出画分（ i ) 及び 22 OmM溶出画分（ i ) とした。

1 3 OmM溶出画分（i) を電気透析装置により脱塩後、 5 OmMとなるように塩化ナトリゥムを溶解させ、あらかじめ 5 OmMの塩化ナトリゥムを含む 10 mMのィミダゾール一塩酸緩衝液（ p H 8 ) で平衡化した 1 00mlの DEAE —セル口ファイン A— 800 (チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、

5 OmMから 20 OmMの塩化ナトリゥムのグラジェントにより溶出させた。溶出画分は 10m lずつ分取し、それぞれの糖含量をフエノ一ルー硫酸法により測定した。 55mMから 75 mM付近の塩化ナトリゥムで溶出される画分が糖含量のピークを形成していたので、 6 OmM付近の塩化ナトリゥムで溶出される画分を集めた。この画分をスピードノック（サバントインストルメンッ社製； SAVANT Instruments Inc.) で 2 m lに濃縮後、あらかじめ 10 %のエタノールで平衡ィ匕した 20 Om 1のセル口ファイン GCL— 25 (チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で溶出させた。溶出画分は 2 mlずつ分取し、それぞれの糖含量をフユノール一硫酸法により測定した。糖含量がピークを形成している画分を集め、 (A) とした。

一方、上記の 22 OmM溶出画分（ i) に関しては、電気透析装置により脱塩後、 10 OmMとなるように塩ィ匕ナトリウムを溶解させ、あらかじめ 10 OmM の塩化ナトリウムを含む 10 mMのィミダゾールー塩酸緩衝液（ p H 8 ) で平衡ィ匕した 10 Omlの DEAE—セル口ファイン A— 800 (チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、 10 OmMから 350 mMの塩化ナトリゥムのグラジェントにより溶出させた。溶出画分は 1 Om 1ずつ分取し、それぞれの糖含量をフエノールー硫酸法により測定した。 16 OmM付近の塩化ナトリゥムで溶出される画分を集め、スピードバック（サバントインストルメンッ社製； SAVANT Instruments Inc.) で 2mlに濃縮後、あらかじめ 10 %のエタノールで平衡ィヒした 20 Om 1のセル口ファイン GCL— 25 (チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で溶出させた。溶出画分は 2m 1ずつ分取し、それぞれの糖含量をフエノ一ルー硫酸法により測定した。糖含量がピークを形成している画分を集め、

(B) とした。

(4) 硫酸化フコガラクタン酵素消化物（ i i) の分離精製

実施例 5 (2) 記載の硫酸化フコガラクタン酵素消化物（i i) をエバポレーターで 50 Om 1に濃縮後、電気透析装置により脱塩し、あらかじめ 1 OmMの塩ィ匕ナトリゥムを含む 10 mMのィミダゾールー塩酸緩衝液（ p H 8 ) で平衡ィ匕した 1 リットルの DEAE—セル口ファイン A— 800 (チッソ社製）のカラムに力け、同緩衝液で洗浄後、 10 mMから 900 mMの塩化ナトリゥムのグラジェントにより溶出させた。溶出画分は 6 lm 1ずつ分取し、それぞれの糖含量をフエノ一ルー硫酸法により測定した。 130 mM付近、 220 mM付近及び 27 OmM付近の塩化ナトリゥムで溶出される画分が糖含量のピークを形成していたので、それぞれを集め、 13 OmM溶出画分（ i i ) 、 22 OmM溶出画分（ i i ) 及び 27 OmM溶出画分（ i i) とした。

130mM溶出画分（i i) を電気透析装置により脱塩後、 20mMとなるように塩化ナトリゥムを溶解させ、あらかじめ 2 OmMの塩ィ匕ナトリゥムを含む 1 0 mMのィミダゾール—塩酸緩衝液（ p H 8 ) で平衡化した 200mlの DEA E—セル口ファイン A— 800 (チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、 2 OmMから 15 OmMの塩ィ匕ナトリゥムのグラジェントにより溶出させた。溶出画分は 13m lずつ分取し、それぞれの糖含量をフエノ一ルー硫酸法により測定した。 5 OmMから 7 OmM付近の塩ィ匕ナトリゥムで溶出される画分を集め、エバポレーターで 3 Omlに濃縮後、あらかじめ 10%のエタノールで平衡化した 120 Om 1のセル口ファイン GC L— 25 (チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で溶出させた。溶出画分は 1 Omlずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノ一ル一硫酸法により測定した。糖含量がピークを形成している画分を集め、

1 OmMとなるように酢酸を添加後、塩酸で pH 3. 5とし、 20 mMの塩ィ匕ナトリウムを含む 1 OmMの酢酸緩衝液 (pH3. 5) の導電率と同じになるように塩ィ匕ナトリウムを添加し、あらかじめ 2 OmMの塩化ナトリウムを含む 1 Om Mの酢酸緩衝液 (pH 3. 5) で平衡ィ匕した 3 Om 1の DEAE—セルロフアイン A— 800 (チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、 2 OmMから

1 2 OmMの塩ィ匕ナトリウムのグラジェントにより溶出させた。溶出画分は 3 m

1ずつ分取し、それぞれの糖含量をフエノ一ルー硫酸法により測定した。 65m Mから 8 OmM付近の塩ィヒナトリウムで溶出される画分を集め、 4 OmMの塩化ナトリウムを含む 1 OmMの酢酸緩衝液 (pH3. 5) の導電率と同じになるように水で希釈し、あらかじめ 4 OmMの塩化ナトリウムを含む 1 OmMの酢酸緩衝液（ρΗ3. 5) で平衡化した 2 Om 1の DEAE—セル口ファイン Α— 80

0 (チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、 4 OmMから 8 OmMの塩ィヒナトリウムのグラジェントにより溶出させた。溶出画分は 3m 1ずつ分取し、それぞれの糖含量をフエノールー硫酸法により測定した。 5 OmMから 65mM 付近の塩化ナトリウムで溶出される画分を集め、スピードバック（サバントインストルメンッ社製； SAVANT Instruments Inc.) で 2m 1に濃縮後、あら力じめ

1 0 %のエタノ一ノレで平後 ϊ化した 200 m 1のセル口ファイン GCL— 25 (チッソ社製）のカラムにかけ、同溶液で溶出させた。溶出画分は 2m 1ずつ分取し、それぞれの糖含量をフエノールー硫酸法により測定した。糖含量がピークを形成している画分について質量分析したところ、前半の画分には（A) と同じ物質が存在したが、後半の画分には実質的に（A) と同じ物質が含まれていなかつたので、後半の画分を集め、（C) とした。一方上記の 220 mM溶出画分（ i i ) に関しては、 100 mMの塩化ナトリゥムを含む 10 mMのィミダゾールー塩酸緩衝液の導電率と同じになるように水を添カ卩し、あらかじめ 1.0 OmMの塩ィ匕ナトリゥムを含む 1 OmMのィミダゾ一ルー塩酸緩衝液 (pH8) で平衡化した 20 Om 1の DEAE—セル口ファイン A— 800 (チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、 10 OmMから

30 OmMの塩ィ匕ナトリゥムのグラジェントにより溶出させた。溶出画分は 1 3 m 1ずつ分取し、それぞれの糖含量をフヱノ一ルー硫酸法により測定した。 14 OmMから 1 7 OmM付近の塩ィ匕ナトリゥムで溶出される画分を集め、エバポレ一ターで 3 Om lに濃縮後、あらかじめ 10%のエタノールで平衡ィ匕した 1 20 Omlのセル口ファイン GCL— 25 (チッソ社製）のカラムにかけ、同溶液で溶出させた。溶出画分は 1 Om 1ずつ分取し、それぞれの糖含量をフエノールー硫酸法により測定した。糖含量がピークを形成している画分を集め、質量分析を行ったところ、実施例 5 (3) 記載の（B) と同じ物質であると推定された。また上記の 27 OmM溶出画分（ i i ) に関しては、 150 mMの塩化ナトリゥムを含む 10 mMのィミダゾールー塩酸緩衝液 (pH8) と同じ導電率になるように水を添加し、あらかじめ 1 5 OmMの塩化ナトリゥムを含む 1 OmMのィミダゾールー塩酸緩衝液 (pH8) で平衡化した 200m lの DEA E—セル口ファイン A— 800 (チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、 1 50 mMから 30 OmMの塩化ナトリゥムのグラジェントにより溶出させた。溶出画分は 1 2m lずつ分取し、それぞれの糖含量をフエノールー硫酸法により測定した。 16 OmMから 18 OmM付近の塩化ナトリゥムで溶出される画分を集め、スピードバック（サバントインストルメンッ社製； SAVANT Instruments Inc. ) で 2 m 1に濃縮後、あら力じめ 100/₀のェタノールで平衡化した 200 m 1のセルロファイン GCL— 25 (チッソ社製）のカラムにかけ、同溶液で溶出させた _c 溶出画分は 2 m 1ずつ分取し、それぞれの糖含量をフヱノ一ルー硫酸法により測定した。糖含量がピ一クを形成している画分を集め、（D) とした。実施例 6

(1) 硫酸化フコガラクタンの酵素消化物 (i i i) の調製実施例 3で得られたガゴメ昆布由来の硫酸ィヒフコース含有多糖画分 1 5 gを 1 5◦ Om 1の 30 OmMの塩化ナトリウム、 20 mMの塩ィ匕カルシウム、及び 1 0 %のエタノールを含む 20 mMのィミダゾール一塩酸緩衝液 (pH 7. 5) に溶解後、排除分子量 10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、ろ過可能な物質を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時に添加する緩衝液は上記反応液に用いた緩衝液と同じ組成のものを用いた。限外ろ過内液に、実施例

5 (1) で使用したフコース硫酸含有多糖— F分解酵素を 1U添加し、 25°Cで 3日間反応させた。

上記反応液を排除分子量 10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多糖— F分解酵素で低分子化された物質、すなわち、フコィダンの低分子化物を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時に添加する緩衝液は溶解に用いた緩衝液と同じ組成のものを用レヽた。

該限外ろ過内液に、実施例 5 (1) で使用したフコース硫酸含有多糖一 U分解酵素を 1 U添加し、 25 °Cで 5日間反応させた。

上記反応液を排除分子量 10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多糖一 u分解酵素で低分子化された物質、すなわち、硫酸ィ匕フコグルクロノマンナンの低分子化物を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時には 20 OmMの塩化ナトリゥム及び 10%のエタノールを含む 10 mMのトリス一塩酸緩衝液 (ρΗ 8) を添加した。

次に限外ろ過内液に、実施例 2 (1) 記載の硫酸化フコガラタタン分解酵素を

60 OmU添加し、 25°Cで 5日間反応させた。反応液を排除分子量 10万のホロフアイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上記硫酸化フコガラタタン分解酵素で低分子化された物質、すなわち、硫酸化フコガラタタンの低分子化物を徹底的に限外ろ過した。なお、限外ろ過時には 2 OmMの塩化ナトリゥムを含む 10%のエタノールを添カ卩した。こうして得られたろ過液を硫酸化フコガラタタン酵素消化物（ i i i) とした。

(2) 硫酸化フコガラタタン酵素消化物（i i i) の分離精製

実施例 6 (1) で得られた硫酸ィ匕フコガラタタン酵素消化物（i i i) を電気透析装置により脱塩し、エバポレーターで 5 Om 1に濃縮後、あらかじめ 50m Mの酢酸アンモニゥム（pH5. 5) で平衡化した 10 Om 1の DE AE—セル口ファイン A— 800 (チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、 50 mMから 4Mの酢酸アンモニゥムのグラジェントにより溶出させた。溶出画分は 1 Omlずつ分取し、それぞれの糖含量をフエノールー硫酸法により測定した。

42 OmMから 620 mM付近の酢酸アンモニゥムで溶出される画分が量のピークを形成していたので、その画分を集め 420から 62 OmM溶出画分とした。

(3) 420から 62 OmM溶出画分の精製

該画分を、電気透析装置により脱塩し、 5 OmMの酢酸アンモニゥム溶液と同じ導電率とし、あらかじめ 5 OmMの酢酸アンモニゥム（pH5. 5) で平衡化した 10 Om 1の DE AE—セル口ファイン A— 800 (チッソ社製）のカラムにかけ、同緩律 ί液で洗浄後、 100 mMの酢酸ァンモニゥム（ p H 5. 5) で洗浄し、 10 OmMから 80 OmMの酢酸アンモニゥムのグラジェントにより溶出させた。溶出画分は 1 Om 1ずつ分取し、それぞれの糖含量をフヱノール一硫酸法により測定した。 44 OmMから 53 OmM付近の酢酸アンモニゥムで溶出される画分を集めた。

該画分を、電気透析装置により脱塩し、 20 OmMの酢酸アンモニゥム溶液と同じ導電率とし、あらかじめ 20 OmMの酢酸アンモニゥム（pH5. 5) で平衡ィ匕した 10 Om 1の DEAE—セル口ファイン A— 800 (チッソネ環）の力ラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、 20 OmMから 70 OmMの酢酸アンモニゥムのグラジェントにより溶出させた。溶出画分は 1 Om 1ずつ分取し、それぞれの糖含量をフエノ一ルー硫酸法により測定した。 420 mMから 470 mM付近の酢酸アンモニゥムで溶出される画分を集めた。該画分について質量分析及び核磁気共鳴スペクトル（NMR) 分析を行ったところ実施例 5 (3) 記載の（B) と同じ物質であると推定された。なお、質量分析は AP I— I I I質量分析器（パ一キンエルマ一'サイェクス社製）を用いて行った。 NMR分析は核磁気共鳴装置 JMN— A500 (日本電子社製）を用いて行った。

( 4 ) 硫酸化フコガラクタン酵素消化物の再酵素消化及び分離精製

実施例 6 (2) の 420から 62 OmM溶出画分以外は比較的分子量が大きかつたので再度硫酸化フコガラクタン分解酵素により分解した。すなわち、 420 から 62 OmM溶出画分以外の溶出画分を集め、電気透析装置で脱塩後、該溶液が 200 mMの塩化ナトリゥム及び 10 %のエタノールを含む 10 mMリン酸緩衝液（pH7. 5) となるように調整し、実施例 2 (1) 記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を 460 mU添カ卩し、 25 °Cで 8日間反応させた。反応液を電気透析装置により脱塩し、 5 OmMの酢酸アンモニゥム溶液と同じ導電率とし、あらかじめ 5 OmMの酢酸アンモニゥム（pH5. 5) で平衡ィ匕した 100 m 1の DEAE—セル口ファイン A— 800 (チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、 10 OmMから 1Mの酢酸アンモニゥムのグラジェントにより溶出させた。溶出画分は 10m lずつ分取し、それぞれの糖含量をフエノ一ルー硫酸法により測定した。 18 OmMから 28 OmM付近の酢酸アンモニゥム溶出画分及び 36 OmMから 430 mM付近の酢酸アンモニゥムで溶出される画分を集め、それぞれ、 (E) 及び（F) とした。実施例 7 硫酸化フコガラクタン酵素消化物の構造決定

実施例 5及び 6で得られた 6つの画分（A) 、 (B) 、 (C) 、 (D) 、 (E) 、及び（F) についてそれぞれ電気透析装置により脱塩後、凍結乾燥し、糖糸且成及び質量を分析した。質量分析は、 AP I— I I I質量分析機（パーキンエルマ一 'サイェクス社製）を用いた。また、 NMR分析は、 J NM—o: 500 型核磁気共鳴装置（日本電子社製）を用いた。分析試料は、定法により重水で置換後、構造解析を行った。構成糖の結合様式は、 ¹H—検出異種核検出法である HMB C法を用いて行った。 ¹ H— NMRの帰属には DQF—COS Y法及び H OHAHA法を、 ¹³ C— NMRの帰属には HSQC法を用いた。

(1) 低分子化物（A) の物性

質量分析及び N MRの帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（A) の¹ H— NMRスペクトルを図 3に、 ¹³C— NMRスぺタトルを図 4に、マススペクトルを図 5にそれぞれ示した。即ち、図 3は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（A) の¹ H— NMRスぺクトルを示す図であり、図 4は本発明の硫酸化フコガラタタン低分子化物（A) の¹³ C— NMRスぺタトルを示す図であり、図 5は本発明の硫酸化フコガラタタン低分子化物（A) のマススペクトルを示す図である。図 3、図 4において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（p p.m) を示す。また、図 5において、縦軸は相対強度

(%) を、横軸は、 mZZ値を示す。

分子量； 632

MS m/z 653. 2 [M+ N a +— 2 H+ ] -、 31 5. 0 [M— 2H+] ²- ¹ H-NMR (D₂ O)

6 ； 5. 1 5 (1 H, d， J =4. 3H z, F l— l—H) , 4. 93 ( 1 H, d， J = 3. 7H z, F 2- 1 -H) ， 4. 53 (1H， d-d, J = 10. 4， 4. 3Hz, F 1 - 3-H) ， 4. 49 ( 1 H, d, J = 7. 6Hz, G 1 - 1

-H) ， 4. 46 (1 H, d-d, J = 10. 7， 3. 1 H z, F 2— 3— H) ， 4. 36 ( 1 H, q， J = 6. 7 H z , F2— 5— H) ， 4. 14 ( 1 H, q, J = 6. 7H z, F 1 - 5 -H) ， 4. 09 ( 1 H, d, J = 2. 4H z, F 1 一 4— H) ， 4. 03 (1 H, d, J二 3. 1Ηζ， F2— 4一 H) ， 3. 97 (1 H, d-d, J = 10. 4, 4. 3Hz， F 1 - 2-H) ， 3. 90 (1 H, b r— s， G l— 4一 H) ， 3. 81 (1 H, d-d, J = 10. 7， 3. 7H z， F 2 - 2 -H) ， 3. 59 ( 1 H， m， G l— 3— H) ， 3. 59 ( 1 H， m， G l— 5— H) , 3. 59 (2H, m, G l— 6— H) ， 3. 56 ( 1 H, m， G l - 2— H) , 1. 1 9 (3H, d, J = 6. 7, F 1 - 6 -H) , 1. 14 (3H, d, J = 6. 7, F 2 - 6 -H)

¹³ C-NMR (D₂0) 各炭素の¹³ C— NMR分析時のケミカルシフト値を表 1に示す。炭素の位置 ¹³ C— NMRケミカルシフト値（p pm)

Gl-1 97.1

Gl-2 71.9

Gl - 3 81.8

Gl-4 69.6

Gl - 5 76.0

Gl - 6 61.8

Fl-1 101.6

Fl-2 67.4

Fl-3 77.2

Fl-4 78.2

Fl-5 68.9

Fl-6 16.4

F2-1 100.8

F2-2 67.4

F2-3 78.5

F2-4 71.3

F2-5 67.9

F2-6 16.2

糖組成 Lーフコース： D—ガラクトース = 2 ： 1

硫酸基 2分子

なお、 ¹ H- NMRにおけるピークの帰属の番号は、下記式（V) の通りである。

(2) 低分子化物（B) の物性

質量分析及び NMRの帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（B) の¹ H— NMRスペクトルを図 6に、 ¹³C— NMRスぺクトルを図 7に、マススペクトルを図 8にそれぞれ示した。即ち、図 6は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（B) の¹ H— NMRスペクトルを示す図であり、図 7は本発明の硫酸化フコガラタタン低分子化物（B) の¹³ C— NMRスぺクトルを示す図であり、図 8は本発明の硫酸ィヒフコガラタタン低分子化物（B) のマススペクトルを示す図である。図 6、図 7において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ppm) を示す。また、図 8において、縦軸は相対強度

(%) を、横軸は、 mZZ値を示す。

分子量； 1 1 16

MS m/z 1 181. 2 [M+ 3 N a +— 4 H⁺ ]-、 579. 0 [M+ 2Na +— 4H+]²-、 378. 6 [M+ N a ⁺— 4 H+ ] ³ -

¹ H-NMR (D₂ O)

δ ； 5. 20 ( 1 H, d, J =4. 3Hz， F 1 - 1 -H) , 4. 95 ( 1 H, d， J = 3. 7H z, F 2— 1— H) ， 4. 64 (1 H, HODと重複， G l— 1一 H) ， 4. 60 ( 1 H, d， J = 7. 9 H z , G 2 - 1 -H) ， 4. 55 ( 1 H, d-d, J = 10. 7, 1. 8Hz， F 1 - 3 -H) ， 4. 47 ( 1 H， m， F 2-3-H) ， 4. 45 ( 1 H, d， J = 7. 6Hz， G3— 1— H) ， 4. 42 (1 H, b r— s， G2— 4_H) ， 4. 38 ( 1 H, q, J -6. 4 Hz， F 2 - 5 -H) ， 4. 28 ( 1 H， m, G 2 - 3 -H) ， 4. 20 ( 1 H, m, G 3 - 3 -H) , 4. 1 7 ( 1 H, b r— s， G3— 4—H) ， 4. 14 (1 H， q, J = 6. 4H z， F 1— 5— H) ， 4. 1 1 (1H， d， J 1

8H z, F 1一 4一 H) ， 4 . 06 (1 H, d, J = 1. 8Hz, F 2— 4 ―

H) ， 4 • 01 (1 H, .m, G2-6- H) ， 3 97 (1H, d— d, J = 1

0. 7, 4 . 3Hz ， P I - 2-H) 、 3. 90 ( 1H， b r— s , G 1 ― 4 ―

H) ， 3 • 88 (1 H, m, G 2 - 5 - H) ， 3 83 (1 H, m， G 2 ― 6 ―

H) ， 3 • 82 (1 H, m, F 2 - 2 - H) , 3 68 (1H， m， G 1 ― 3 ―

H) ， 3 66 (1 H, m, G 2 - 2 - H) ， 3 65 (2H, m， G 3 6

H) ， 3 62 (1 H, m, G 3— 5— H) ， 3 61 (2H， m, G 1 6

H) ， 3 59 (1 H， m, G 1— 2— H) ， 3 55 (1H， m, G 1 5

H) ， 3 54 (1 H, m, G 3 - 2 - H) ， 1 21 (3H, d, J = 6 4

F 1一 6 H) ， 1 . 1 5 (3H, d， J = 6. 4， F 2 - 6 -H)

¹³ C-NMR (D₂ O) 各炭素の¹³ C— NMR分析時のケミカルシフト値を表 2に示す。

表 2

炭素の位置 ¹³ C— NMRケミカルシフト値（p pm)

Gl-1 103.4

Gl-2 71.4

Gl-3 81.0

Gl-4 69.6

Gl-5 75.6

Gl-6 61.6

G2 - 1 97.0

G2-2 70.3

G2-3 80.9

G2-4 73.9

G2-5 74.3

G2-6 70.7

G3-1 103.8

G3-2 69.6

G3-3 81.0

G3-4 67.4

G3-5 75.5

G3-6 61.7

Fl-1 101.3

Fl-2 67.4

Fl-3 77.2

Fl-4 78.2

Fl-5 68.8

Fl-6 16.3

F2 - 1 100.8

F2-2 67.4

F2-3 78.5

F2-4 71.2

F2-5 67.7

F2-6 16.2 糖組成 L—フコース： D—ガラクトース = 2 ： 3

硫酸基 4分子

なお、 'H— NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（V I) の通りである。

(3) 低分子化物（C) の物性

質量分析及び NMRの帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（C) の¹ H— NMRスペクトルを図 9に、 ¹³C— NMRスぺクトルを図 10に、マススぺクトルを図 1 1にそれぞれ示した。即ち、図 9は本発明の硫酸化フコガラタタン低分子化物（C) の¹ H— NMRスペクトルを示す図であり、図 10は本発明の硫酸ィ匕フコガラクタン低分子化物（C) の¹³ C— NMR スぺクトルを示す図であり、図 1 1は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物 (C) のマススペクトルを示す図である。図 9、図 10において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（p pm) を示す。また、図 1 1において、縦軸は相対強度（％) を、横軸は、 m/Z値を示す。

分子量； 502

MS m/z 523 [M+ N a +— 2 H+ ]-、 250 [M— 2H+]² - Ή-NMR (D₂0)

δ 4. 57 (1 Η, d, J = 7. 9Ηζ， G 1— 1一 Η) ， 4. 43 ( 1 Η, d， J = 7. 9H z, G2 - 1 -H) ， 4. 20 ( 1 H， b r - s , G l— 3— H) ， 4. 20 (1 H, b r— s， G l— 4— H) ， 4. 20 ( 1 H, b r— s， G 2 - 3-H) ， 4. 15 (1 H, b r— s， G 2-4-H) ， 3. 95 ( 1 H， m，

G 1一 6— H) 3. 82 (1H, m， G1— 5—H) ， 3. 80 ( 1 H， m， G 1一 6— H) 3. 63 (2H, m, G 2 - 6 -H) ， 3. 62 ( 1 H, m, G2-5-H) 3. 55 ( 1 H, m， G2— 2— H) ， 3. 50 ( 1 H, m， G 1 - 2-H)

1³ C-NMR (D₂0) 各炭素の¹³ C— NMR分析時のケミカルシフト値を表 3に示す。表 3

糖組成 D—ガラクトースのみ

硫酸基 2分子

なお、 — NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（V I I) の通りである。

(4) 低分子化物（D) の物性

質量分析及び NMRの帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（D) の¹ H— NMRスペクトルを図 1 2に、 ¹³C— NMRスぺクトルを図 1 3に、マススぺクトルを図 14にそれぞれ示した。即ち、図 1 2は本発明の硫酸化フコガラタタン低分子化物（D) の¹ H— NMRスペクトルを示す図であり、図 13は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（D) の¹³ C— N MRスぺクトルを示す図であり、図 14は本発明の硫酸化フコガラタタン低分子化物（D) のマススペクトルを示す図である。図 12、図 13において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（p pm) を示す。また、図 14において、縦軸は相対強度（％) を、横軸は、 mZZ値を示す。

分子量； 1 358

MS m/z 71 1. 2 [M+ 3 N a +— 5 H+ ]² -、 466. 6 [M+2Na + — 5H+]³-、 344. 2 [M+Na ⁺— 5H+] ⁴- ¹ H-NMR (D_¾ O)

δ ； 5. 1 9 (1 H, d, J =4. 3Hz， F 1 - 1— H) , 4. 93 ( 1 H, d， J = 3. 7Hz， F 2- 1 -H) ， 4. 62 (1 H, HODと重複， G l—

1 -H) , 4. 59 (1 H, HODと重複， G2— 1— H) ， 4. 54 ( 1 H， d-d, J = 10. 6， 2. 7H z, F l— 3— H) , 4. 46 ( 1 H， d， J =7. 6 H z , G 3 - 1 -H) ， 4. 46 (1 H, m， F 2 - 3 -H) ， 4. 4 1 ( 1 H, b r— s , G 2 4. 41 (1 H, d， J = 7• 6H z,

G4- 1 -H) ， 4. 37 (1 H, q， J = 6. 4H z , F 2 - 5 - H) , 4.

27 (1 H， m， G 2一 3一 H) ， 4. 24 (1 Η, b r— s， G 3 -4-H)

4. 21 (1 H, m, G 3 -3-H) ， 4. 19 (1 H, m， G4- 3-H) ，

4. 1 5 (1 H, b r一 s ， G4- 4一 H) ， . 13 (1 H, q, J = 6. 7

Hz, F 1 -5- H) ， 4 . 09 (1 H, d， J =2. 7Hz， F 1 -4-H)

4. 04 (1 H， d， J = 2.寸 8H z， F 2一 4一 H) ， 3. 98 ( 1 H, m,

G 2-6-H) 、 3. 96 (1H, d— d, J = 10. 6, 4. 3H z, F 1 -

-

2 -H) , 3. 93 ( 1 H, m, G 3 - 6一 H) ， 3. 88 ( 1 H, b r— s，

G 1 -4-H) ， 3. 86 (1H, m) G 2一 5一 H) ， 3. 81 ( 1 H, m，

G 2 - 6 -H) ， 3. 81 (1H, m, F 2一 2一 H) , 3. 80 ( 1 H, m，

G3-5-H) ， 3. 80 (1H， m, G 3 -6一 H) ， 3. 66 ( 1 H, m,

G 1 - 3-H) ， 3. 65 (1H， m, G 2一 2 -H) , 3. 64 ( 1 H, m,

G 1— 6— H) ， 3. 64 (1H, m， G4一 6一 H) ， 3. 61 ( 1 H, m,

G4-5-H) ， 3. 58 (1H, m, G 1一 2 -H) ， 3. 56 ( 1 H, m,

G 1 -6-H) ， 3. 56 (1H， m, G4一 6一 H) , 3. 55 ( 1 H, m,

G4- 2-H) ， 3. 54 (1H， m, G 1一 5一 H) ， 3. 54 ( 1 H， m,

G 3 - 2 -H) ， 1. 20 (3H, d, J = 6. 7, F 1 - 6 -H) , 1. 1

(3H, d, J = :6. 4, F 2-6一 H)

¹³ C-NMR (D₂0) 各炭素の¹³ C— NMR分析時のケミカルシフト値を表 4および 5に示す。

表 4 炭素の位置 ¹³ C— NMRケミカルシフト値（p pm)

G1-1 103.4

G1-2 71.4

G1-3 80.9

G1-4 69.5

G1-5 75.6

G1-6 61.7

G2-1 97.0

G2-2 70.7

G2-3 80.9

G2-4 73.8

G2-5 74.1

G2-6 70.8

G3-1 103.7

G3-2 69.5

G3-3 80.8

G3-4 67.4

G3-5 73.6

G3-6 69.0

G4-1 103.6

G4-2 69.5

G4-3 81.1

G4-4 67.7

G4-5 75.5

G4-6 61.7 表 5

(表 4の続き）

糖組成 L—フコース： D—ガラクトース = 2 ： 4

硫酸基 5分子

なお、 ¹ H— NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（V I I I) の通りである。

G 4 G 3

(5) 低分子化物（E) の物性

質量分析及び NMRの帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（E) の¹ H— NMRスペクトルを図 15に、 ¹³C— NMRスぺクトルを図 16に、マススぺクトルを図 17にそれぞれ示した。即ち、図 1 5は本発明の硫酸化フコガラタタン低分子化物（E) の¹ H— NMRスペクトルを示す図であり、図 16は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（E) の¹³ C— N MRスぺクトルを示す図であり、図 1 7は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（E) のマススぺクトルを示す図である。図 1 5、図 1 6において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（p pm) を示す。また、図 1 7において、縦軸は相対強度（％) を、横軸は、 mZZ値を示す。

分子量； 1036

MS m/z 528. 0 [M+ N a ⁺— 3 H⁺ ]² -、 344. 0 [M— 3H⁺] ³- ¹ H— NMR (D₂〇）

δ ; 5. 19 (1 H, d， J =4. 3H z, F l— 1一 H) ， 4. 87 ( 1 H, d， J = 3. 7Hz， F 2— 1—H) ， 4. 63 ( 1 H, HODと重複， G l— 1一 H) , 4. 59 (1 H, d， J = 7. 9H z, G 2 - 1 -H) ， 4. 53 (1 H, d-d, J = 10. 7, 1. 8H z, F 1 - 3-H) ， 4. 44 (1 H， d, J = 7. 6Hz， G3— 1一 H) ， 4. 40 (1 H, b r— s， G2— 4— H) ， 4. 32 (1 H, q, J = 6. 4Hz， F 2— 5— H) ， 4. 27 (1 H, m, G2-3-H) , 4. 19 ( 1 H, m, G3— 3— H) ， 4. 16 ( 1 H, b r— s， G3— 4— H) ， 4. 1 2 ( 1 H, q, J = 6. 4Hz， F 1-5 -H) ， 4. 06 ( 1 H, d， J = 1. 8Hz， F l— 4— H) ， 3. 9 9 ( 1 H, m， G 2 - 6 -H) ， 3. 88 ( 1 H, b r— s， G 1 - 4 -H) ， 3. 88 (1 H, d-d, J = 10. 7, 4. 3Hz， F 1 - 2 -H) ， 3. 8 6 ( 1 H, m， G 2 - 5 -H) 、 3. 81 ( 1 H， m, G 2 - 6 -H) , 3. 8

1 (1H m， F 2-3 -H) ， 3. 69 (1 H d， J = 1. 8Hz， F 2 -

4 -H) 3. 66 (1 H, m, G 1— 3— H) 3. 65 ( 1 H, m, G 2 - 2一 H) 3. 64 ( 1 H, m， F 2 - 2— H) 3. 63 (2 H, m, G l— 6一 H) 3. 61 (1 H， m， G 3— 5— H) 3. 61 (2H, m， G 3 - 6一 H) 3. 60 (1 H， m， G 1— 2— H) 3. 53 (1 H, m， G l—

5一 H) 3. 53 ( 1 H, m, G 3 - 2 -H) 1. 1 9 (3 H, d, J = 6.

4， F 1— 6 -H) ， 1 2 (3H, d， J = 6. 4， F 2-6-H)

1³ C-NMR (D₂〇）各炭素の¹³ C— NMR分析時のケミカルシフト値を表 6に示す。

表 6

炭素の位置 ¹³ C— NMRケミカルシフト値（p pm)

Gl-1 103, 2

Gl-2 71.2

Gl-3 80.3

Gl-4 69.3

Gl-5 75.4

Gl-6 61.3

G2-1 96.7

G2 - 2 70.4

G2-3 80.8

G2-4 73.7

G2-5 74.0

G2-6 70.6

G3-1 103.5

G3-2 69.4

G3-3 80.8

G3-4 67.4

G3-5 75.2

G3-6 61.5

Fl-1 101.1

Fl-2 67.3

Fl-3 76.9

Fl-4 77.8

Fl-5 68.5

Fl-6 16.1

F2-1 100.6

F2-2 69.2

F2-3 69.8

F2-4 72.7

F2-5 67.7

F2-6 16.0 糖組成 L—フコース： D—ガラクトース =2 ： 3

硫酸基 3分子

なお、！H— NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式（I X) の通りである。

G 3

(6) 低分子化物（F) の物性

質量分析及び NMRの帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（F) の¹ H— NMRスペクトルを図 18に、 ¹³ C— DEPT— 1 35。スペクトルを図 1 9に、マススペクトルを図 20にそれぞれ示した。即ち、図 18は本発明の硫酸ィヒフコガラタタン低分子化物（F) の¹ H— NMRスぺクトルを示す図であり、図 19は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物 (F) の¹³ C— DEPT— 1 35° スぺクトルを示す図であり、図 20は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（F) のマススペクトルを示す図である。図 18、図 1 9において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（p p m) を示す。また、図 20において、縦軸は相対強度（％) を、横軸は、値を示す。

分子量； 1 278

MS m/z 660.0 [M + 2N a ⁺— 4 H⁺ ]²-、 432.0 [M+ N a +— 4 H+ ]³ 、 318.2 [M— 4H+] ⁴一 H-NMR (D₂ O)

δ ； 5. 1 9 (1H， d, J =4. 3H z, F 1 - 1一 H) ， 4. 87 (1 H, d, J = 3. 8Hz， F.2- 1 -H) ， 4. 61 ( 1 H， HODと重複， G l— 1一 H) ， 4. 59 (1 H, J = 7. 9Hz、 G 2- 1 -H) ， 4. 53 (1H， d-d, J = 10. 6， 2. 7Hz, F 1 - 3 -H) ， 4. 46 ( 1 H, d, J = 7. 6Hz， G 3 - 1 -H) ， 4. 42 ( 1 H， d， J = 7. 6Hz， G 4 — 1— H) ， 4. 41 (1H， b r— s， G2— 4— H) ， 4. 32 (1H， q， J = 6. 4Hz， F 2 - 5 -H) ， 4. 27 ( 1 H, m， G 2 - 3 -H) , 4. 24 ( 1 H, b r— s， G 3 -4 -H) ， 4. 20 ( 1 H, m， G3— 3— H) ， 4. 20 ( 1 H, m， G4-3-H) , 4. 16 (1 H, b r - s , G4— 4— H) ， 4. 1 2 (1 H, q, J = 6. 7H z, F l— 5— H) ， 4. 06 ( 1 H, d， J = 2. 7H z, F l— 4一 H) ， 3. 98 ( 1 H， m， G2— 6— H) ，

3. 94 ( 1 H, m, G 3 - 6 -H) ， 3. 89 ( 1 H, d-d, J = 10. 6,

4. 3Hz， F 1 - 2 -H) 、 3. 88 (1 H, b r— s， G l— 4— H) ， 3. 86 (1 H, m， G 2 - 5 -H) ， 3. 86 (1 H, m， G 2 - 6 -H) ， 3. 82 ( 1 H, m， F 2 - 3 -H) ， 3. 80 (1 H, m， G 3 - 5 -H) , 3. 80 ( 1 H, m, G 3 - 6 -H) ， 3. 69 ( 1 H， d， J = 2. 8， F 2 - 4

-H) ， 3. 66 (1H, m, G 1— 3 -H) ， 3 . 65 (2H, m, G 1 - 6 一 H) ， 3. 65 (2H， m, G4- 6一 H) ， 3 . 64 ( 1 H， m) G 2— 2 一 H) ， 3. 64 (1 H, m, F 2— 2 -H) ， 3 . 62 ( 1 H, m, G 4— 5

-H) ， 3. 59 (1 H, m， G 1— 2 -H) ， 3 . 54 ( 1 H, m, G 1— 5 一 H) ， 3. 54 (1H, m， G 3— 2 -H) , 3 . 54 (1 H, m, G4- 2 一 H) ， 1. 19 (3H, d， J =6 7, F 1 - 6-H) ， 1. 1 2 (3H, d, J =6. 4, F 2— 6 -H)

¹³ c- NMR (D ₂o) 各炭素の¹³ C一 NMR分析時のケミカノ 1 ンフト値を表

7および 8に示す。表 7

炭素の位置 ¹³C— NMRケミカルシフト値（p pm)

Gl-1 103.2

Gl-2 71.2

Gl-3 80.4

Gl-4 69.3

Gl-5 75.3

Gl - 6 61.3

G2-1 96.7

G2-2 70.4

G2-3 80.5

G2-4 73.7

G2-5 73.8

G2-6 70.5

G3-1 103.5

G3-2 69.2

G3-3 80.5

G3-4 67.2

G3-5 73.4

G3-6 68.8

G4-1 103.4

G4-2 69.2

G4-3 80.8

G4-4 67.4

G4-5 75.3

G4-6 61.3 表 8

(表 7の続き）

糖組成 L—フコース： D—ガラクトース = 2 ： 4

硫酸基 4分子

なお、 — NM Rにおけるピークの帰属の番号は下記式（X) の通りである _c

G 4 G 3

実施例 8

(1) 本発明の硫酸化フコガラタタンの主要構造の解析

実施例 1 (2) で調製した硫酸化フコガラクタン画分の全構造及び硫酸化フコガラクタン分解酵素の切断部位を決定するために、 NMR分析を行った。

質量分析及び NMRの帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化フコガラクタンの¹ H— NMRスぺクトルを図 21に、 ¹³C— NMRスぺクトルを図 22に、赤外吸収 U R) スぺクトルを図 23にそれぞれ示した。即ち、図 21は本発明の硫酸化フコガラタタンの¹ H— NMRスぺクトルを示す図であり、図 22は本発明の硫酸化フコガラタタンの¹³ C— NMRスぺクトルを示す図であり、図 23 は本発明の硫酸化フコガラタタンの赤外吸収スぺクトルを示す図である。図 21、図 22において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（p pm) を示す。また、図 23において、縦軸は透過率（％) を、横軸は、波数（cm-¹) を示す。 ¹ H— NMR及び¹³ C— NMRによる分析結果を表 9および 10に示す。表 9 炭素の位置ケミカルシフト値（p p m)

¹³C— NMR ^XH-NMR

Gl-1 103.4 4.63

Gl- 2 71.3 3.61

Gl- 3 80.8 3.67

Gl- 4 69.6 3.89

Gl- 5 75.6 3.57

Gl - 6 61.7 3.62, 3.68

G2-1 103.7 4.45

G2-2 69.6 3.56

G2-3 80.8 4.32

G2 - 4 74.1 4.44

G2-5 74.1 3.87

G2-6 71.3 3.83, 3.97

G3-1 103.7 4.45

G3-2 69.6 3.56

G3-3 80.8 4.23

G3-4 67.4 4.24

G3-5 74.1 3.82

G3-6 69.6 3.85, 3.99

G4-1 103.7 4.45

G4-2 69.6 3.56

G4-3 80.8 4.23

G4-4 67.4 4.17

G4-5 74.1 3.82 表 10

(表 9の続き）

表 9および 10に示した帰属より、本発明の硫酸化フコガラクタンは、実施例 7 (4) に記載の（D) の化合物が主骨格であり、さらに本発明の硫酸化フコガラクタンは、該化合物が繰り返し結合している構造である事が判明した。また、繰り返し構造間の結合は、下記式（X I I I) に示すように G 2のガラクトースが i3結合で G 4のガラクトースの 6位に結合したものであった。すなわち硫酸ィ匕フコガラクタンは、下記に示す主骨格の繰り返し構造を有することが判明した。

また、本発明の硫酸化フコガラタタンの化学構造及び本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物の化学構造から、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素は、硫酸ィ匕フコガラクタンの D—硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースと D—硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースの間の 1—6結合及び 1— 4結合をエンド的に分解する酵素であることが判明した。さらに、本発明の硫酸化フコガラタタンの分子量は、実施例 1 (3) の条件で測定したところ、その平均値は約 1 3万であった。またその分子量分布は約 1万〜約 20万であった。

(2) 本発明の硫酸化フコガラクタンの HGF産生誘導活性

実施例 1 (2) 記載の方法で得られた本発明の硫酸化フコガラクタンの HGF 産生誘導活性を測定した。 HGF産生誘導活性は、以下のようにして測定した。すなわち、 l X 10⁵ c e 1 1 s /ml となるように 10 %牛胎児血清を含んだ DM E培地に懸濁した MR C- 5細胞懸濁液（CCL 1 71 ：大日本製薬社製、 c o d e. 02-021) 500ju lを 48穴の細胞培養プレートに入れ、 3

7 °C、 5 % C〇₂存在下で 24時間培養後に 1 %牛胎児血清を含んだ DME培地に交換した。その後、試料として実施例 1一（2) に記載の方法で得られた硫酸化フコガラタタンを最終濃度が 1、 10、 1◦ 0 μ gZm 1となるように添加し、さらに 24時間培養した後、培地を回収し、 Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor (HGF) ELISA Kit (フナコシ社製、 Co d e. RS- 0641 -

00) を用いて、培地中の HGFの量を測定した。一方、コントロールとして試料と同量の蒸留水を添加した。コントロールの HGF量は 4. S n gZmlであり、この値を 100%とした、各試料添加区の HGF産生量を表 1 1に示す。なお、実験は全て 2連で行い、その平均値を採用した。表 1 1

HGFの産生量の増加

,m 1 ) (%)

1 1 94

10 355

00 429

(コントロールの HGF産生量は 4. 3 n gZm lであった。）表 1 1に示したように、本発明の硫酸化フコガラクタンが HGFの産生を誘導することを確認した。即ち、本発明の硫酸化フコガラクタンは、 HGF産生誘導物質として有用であることを確認した。実施例 9

( 1 ) 実施例 3で得られたガゴメ昆布由来の硫酸化フコース含有多糖画分 70 g を 30 OmMの塩化ナトリウム、及び 10%のエタノールを含む 20 mMのィミダゾール—塩酸緩衝液 (pH 7. 5) に溶解後、排除分子量 10万のホロフアイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、ろ過可能な物質を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時に添加する緩衝液は溶解に用いた緩衝液と同じ組成のものを用いた。

次に、限外ろ過内液に、 W097Z26896号公報記載の方法でフラボバタテリゥム s p. SA— 0082株（FERM BP— 5402) を培養し、該培養物から得られたフコース硫酸含有多糖一 U分解酵素を 20U添加し、 25°C で 5日間反応させた。上記反応液を排除分子量 10万のホロフアイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多糖一 U分解酵素で低分子化された物質、すなわち、硫酸化フコダルクロノマンナンの低分子化物を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時には水を添加し、最後に 20 OmMの塩ィ匕ナトリゥムを含む 10 mMのィミダゾ一ルー塩酸緩衝液 (pH8) に置換した。

次に、限外ろ過内液に、実施例 2 (1) 記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を 2 U添加し、 25 °Cで 5日間反応させた。反応液を排除分子量 10万のホ口フアイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上記硫酸化フコガラタタン分解酵素で低分子化された物質、すなわち、硫酸化フコガラクタンの低分子化物を徹底的に限外ろ過した。なお、限外ろ過時に添加する緩衝液は上記反応液に用いた緩衝液と同じ組成のものを用いた。

次に、限外ろ過内液に最終濃度が 2 OmMになるように塩化カルシウムを添加し、さらに W〇 97ノ 26896公報記載の方法でアルテロモナス _S p. SN — 1009株（FERM BP— 5747) を培養し、該培養物から得られたフコース硫酸含有多糖— F分解酵素を 5 U添加し、 25 °Cで 3日間反応させた。上記反応液を排除分子量 10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素で低分子化された物質を徹底的に限外ろ過した。なお、限外ろ過時には水を添加した。こうして得られたろ過液に含まれているフコース硫酸含有多糖の低分子化物について理ィヒ学的性質を調べた。

(2) 上記 (1) で得られたろ過液を集め、排除分子量 3000のホロファイバ一を装着させた限外ろ過機により限外ろ過し、ろ過液と非ろ過液に分離した。このろ過液をロータリーエバポレーターで約 3リットルに濃縮後、遠心分離して上清を得た。得られた上清を排除分子量 300の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、この溶液に 0. 1Mとなるように酢酸カルシウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清をあらかじめ 5 OmMの酢酸カルシゥムにより平衡ィ匕させた DEAE—セル口ファイン（樹脂量 4リットル）に力け、 5 OmMの酢酸カルシウム及び 5 OmMの塩化ナトリゥムで充分洗浄後、 50m

M〜80 OmMの塩化ナトリゥムのグラジェントにより溶出させた。この時の分取量は 1本当り 50 Om 1で行った。分取した画分をセルロースァセテ一ト膜電気泳動法 [アナリティカルバイオケミストリー（An a 1 y t i c a 1 B i o c h em i s t r y) 、第 37卷、第 1 97〜 202頁（1 970) ] により分析したところ塩ィヒナトリウム濃度が約 0. 4Mで溶出される画分（以下、 0. 4 M溶出画分と称す。 ) が均一であることが判明した。また、約 0. 6Mの濃度で溶出される画分（以下 0. 6 M溶出画分と称す。）も電気泳動的にほぼ均一であった。

そこで、まず 0. 4M溶出画分の液を 15 Om 1に濃縮後、濃度が 4Mとなるように塩化ナトリゥムを添加し、あらかじめ 4 Mの塩化ナトリゥムにより平衡ィ匕した Ph e n y 1—セル口ファイン（樹脂量 200 m l) に力、け、 4 Mの塩化ナトリウムにより充分洗浄した。非吸着性の硫酸化糖画分を集め、排除分子量 30 0の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、脱塩液 505m lを得た。

得られた脱塩液のうち 4 Om 1を 10%のエタノールを含む 0. 2 Mの塩化ナトリウムによって平衡ィ匕させたセル口ファイン GCL— 90のカラム（4. 1 c mX 87 c m) にかけて、ゲルろ過を行った。分取は 1フラクション当り 9. 2 m 1で行った。

全フラクションに対して総糖量の分析をフエノール硫酸法〔アナリティカルケミストリー（Analytical Chemistry) 、第 28卷、第 350頁（1956) 〕により行った。

この結果、硫酸化糖は 1つのピークを形成したので、そのピークの中央部分を集め、排除分子量 300の膜を装着させた電気透析器により脱塩後、凍結乾燥し、 1 1 2mgの本発明の硫酸化糖の乾燥品を得た。該乾燥品の一部を取り糖組成分祈及び質量分析を行つた。また、乾燥品のうちの 10 m gを常法により重水置換し、 NMR分析に供した。

糖組成分析の結果、 0. 4 M溶出画分は、フコースのみからなる硫酸化糖であることが判明した。

また、 AP I— I I I質量分析機（パーキンエルマ一 ·サイェクス社）を用いた、硫酸化糖の質量分析の結果を図 24に示し、以下に解析結果を示す。すなわち図 24は硫酸化糖の質量分析の結果を示す図であり、縦軸は相対強度（％) を、横軸は m/z値を示す。その結果、分子量は、全硫酸基がナトリウム塩になっている状態で 2264± 1であった。つまり、構成糖がフコースだけの硫酸化糖であることから、フコースが 7分子、硫酸基が 12分子結合したもので、その硫酸基がすべてナトリウム塩になっているもので、理論的分子量は 2265であることが判明した。

つまり、本物質を Mとすると、図 24中の主なシグナルは下記のように帰属することができる。

m/z 1 109. 05 --- [M- 2 N a ⁺ ] ²— (理論値 1 109. 5)

731. 45—- 〔M— 3Na⁺ 〕 ³— (理論値 732)

542. 75 -― 〔M— 4Na⁺ 〕 ⁴— (理論値 543. 25) 430. 05 --- 〔M— 5Na⁺ 〕 ⁵— (理論値 430) この結果、本物質はフコース 7分子、硫酸基 1 2分子のオリゴ糖である。

次に、フコースの結合様式、及び硫酸基の結合位置を決定するために、 J NM 一ひ 500 型核磁気共鳴装置（日本電子社製）を用い、 NMR分析を行った。構成糖の結合様式は¹ H—検出異種核検出法である HMB C法を用いて行った。 ¹ H-NMRの帰属には D QF-COS Y法及び H O H AH A法を、 ¹³ C— NM R の帰属には HSQC法を用いた。

NMRの帰属の結果を以下に示し、 0. 4 M溶出画分の硫酸化糖の — NM

Rスぺクトルを図 25に、 ¹³C— NMRスぺクトルを図 26にそれぞれ示した。但し、 'Η— NMRでの化学シフト値はジォキサンの化学シフト値を 3. 53 ρ pmに、 ¹³C— NMRではジォキサンの化学シフト値を 66. 5 p pmとして表した。測定は両方共に 60°Cで行った。すなわち図 25は、 0. 4M溶出画分の硫酸化糖の¹ H— NMRスペクトルを示す図であり、図 26は 0. 4M溶出画分の硫酸化糖の¹³ C— NMRスペクトルを示す図である。図 25、図 26において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（p pm) を示す。 — NMR 及び¹³ C— NMRによる分析結果を表 1 2および 1 3に示す。表 12

炭素の位置ケミカルシフト値（p pm)

¹³C— NMR ^XH-NMR

A - 1 89.3 5.30

A-2 75.4 4.30

A-3 73.9 4.17

A-4 78.6 4.67

A- 5 67.5 4.14

A - 6 15.3 1.12

B-l 98.3 5.23

B-2 74.5 4.33

B-3 75.9 4.18

B-4 80.6 4.72

B-5 68.0 4.10

B-6 15.9 1.08 c-i 98.9 5.18

C - 2 73.6 4.35

C-3 70.9 4.32

C-4 77.5 4.62

C-5 66.9 4.24

C-6 16.0 1.11

D-l 89.3 5.16

D- 2 73.9 3.98

D-3 74.2 4.16

D-4 73.0 4.64

D-5 70.6 4.25

D-6 13.1 1.34 表 1 3

(表 12の続き）

なお、 NMRのピークの帰属の番号は下記式（XV) の通りである。

〔XV〕

以上の結果より、本物質は下記式（XV I) で表される硫酸化糖であることが半 IJ明した。

[XV I〕

(3) 実施例 9 (2) に記載した、 DEAE—セル口ファインの 0. 6M溶出画分に関しても 0. 4 M溶出画分と全く同様に精製して凍結乾燥品を得た。この標品は、 HPLCによる分析の結果、 0. 4 M溶出画分よりも分子量の大きな硫酸ィ匕糖であることが判明したが、 NMRの分析結果によると 0. 4M溶出画分とほぼ同じスぺクトルが得られた。

図 27に 0. 6M溶出画分の 'H— NMRスペクトルを示した。但し、溶媒は重水を用い、 'H— NMRでの化学シフト値はジォキサンの化学シフト値を 3. 53 p pmとして表した。測定は 60°Cで行った。すなわち図 27は 0. 6M溶出画分の¹ H— NMRスペクトルを示す図であり、縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（p pm) を示す。

この結果、 0. 6 M溶出画分は 0. 4 M溶出画分が数分子結合した構造を持つことが強く示唆された。そこで、 0. 6 M溶出画分を実施例 9 (1) 記載のフコ —ス硫酸含有多糖一 F分解酵素によりさらに分解して得た分解物を HP LCにより分析したところ、反応生成物の多くが実施例 9 (2) に記載した DEAE—セルロファインの 0. 4 M溶出画分の硫酸化糖と同じ位置に溶出されてきた。

なお、 HP LCの分析条件は下記の通りである。

カラム S h o d e x SB802. 5 (昭和電工社製）

カラム温度 25°C

溶液 5 mMのアジ化ナトリゥムを含む 5 OmMの塩化ナトリウム

検出示差屈折率検出器 Sh o d e x R I -7 1

上記 0. 6 M溶出画分、 0. 4 M溶出画分につきプルラン（昭和電工社製）を標準物質としたゲルろ過法により分子量を測定したところ、 0. 4M溶出画分はプルラン換算で分子量約 8500、 0. 6 M溶出画分は分子量約 26000であり、

0. 6 M溶出画分は 0. 4 M溶出画分の硫酸化糖の 3量体であることが判明した。また、 7糖残基の繰り返しの結合位置は約 0. 6M溶出画分の¹ H— NMRスぺタトルを詳細に検討することにより、式（XV) 中の Fのフコースの 3位に α— (1→3) 結合でつながつていることが明らかとなった。さらに、上記の方法に準じ、上記フコース硫酸含有多糖の低分子化物中より、（XV I) で表される硫酸ィ匕糖の 5量体、すなわち下記一般式（X I V) において n = 5で表される硫酸化糖を得た。〔X I V〕

(式中、 Rは H又は〇S〇₃ Hである）以上のことから、ガゴメ昆布のような褐藻類から得られた硫酸化フコース含有多糖をフコース硫酸含有多糖一 u分解酵素及び本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素で処理することにより、硫酸ィヒフコース含有多糖一 F分解酵素によって低分子化され、下記一般式で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とする硫酸化多糖が得られることが確認できた。また、該硫酸化多糖の分子量は、実施例 1

( 3 ) の方法で測定したところ、抽出時の処理条件が、 p H 6〜 8、 9 5 °C 約 2時間の場合は、平均分子量は約 2 0万（分子量分布は、約 1万〜約 1 0 0万）であった。また、抽出時の処理条件が、 p H 6〜8、 2 5 °C 約 2 4時間の場合は、平均分子量は約 1， 3 0 0万（分子量分布は、約 1 0万〜約 2， 0 0 0万）であった。産業上の利用の可能性

本発明により糖鎖工学用試薬あるいは H G F産生誘導物質として有用な硫酸ィ匕フコガラクタン及びその低分子化物が提供される。また、該硫酸ィ匕フコガラクタンの構造解析や分解、硫酸化フコガラクタンの低分子化物の再現性よい製造に用いることができる新規な硫酸化フコガラタタン分解酵素が提供される。また、該酵素の製造方法についても提供される。また、本発明の硫酸化フコガラタタン分解酵素により硫酸化フコース含有多糖の混合物から硫酸化フコガラクタンを選択的に除去する方法が提供される。さらに、本発明の硫酸化フコガラタタン分解酵素と他のフコース硫酸含有多糖分解酵素を組み合せて使用することにより、新規の硫酸ィ匕糖が提供される。

Claims

O 00/50464 71 請求の範囲

1. 下記の理ィヒ学的性質を有することを特徴とする硫酸ィヒフコガラクタン又はその塩：

(1) 構成糖：ガラクトースとフコースを含有し、そのモル比が 1 ： 1〜6 ： 1 である、

(2) 下記一般式（X I) で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とする：

(式中、 Rは H又は S0₃Hである）、

(3) 硫酸化フコガラクタン分解酵素により低分子化され、下記一般式（I) (I V) で表される化合物より選択される 1種以上の化合物が生成する：

(式中、 Rは H又は S0₃Hである）。

2. 下記一般式（1 1) 、（I I ) 又は（I V) から選択される化学構造を有する糖化合物またはその塩：

(式中、 Rは H又は S〇₃Hである）。

3. 下記の理化学的性質を有することを特徴とする硫酸ィヒフコガラクタン分解 ( 1 ) 作用：構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、そのモル比が 1 ：：!〜 6 ： 1である硫酸ィヒフコガラクタン又はその塩に作用して該硫酸ィ匕フコガラクタンを低分子化させ、還元性末端に硫酸ィ匕ガラタトースあるいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成させる、

( 2 ) 至適 p H：本酵素の至適 p Hは約 7〜9である、

( 3 ) 至適温度：本酵素の至適温度は約 2 5〜 4 5 °Cである。

4 . 請求項 3記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を褐藻類由来の硫酸化フコガラクタン又はその塩に作用させて取得することを特徴とする硫酸ィヒフコガラクタンの低分子化物の製造方法。

5 . 請求項 3記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素生産能を有するフラボバクテリゥム属細菌を培養し、その培養物から該酵素を採取することを特徴とする請求項 3記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素の製造方法。