WO2000014102A1 - Phosphoramidites et nucleosides photosensibles - Google Patents

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WO2000014102A1
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hydrogen atom
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PCT/JP1999/004898
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Isao Saito
Chikara Dohno
Kazuhiko Fujisawa
Kazuhiko Nakatani
Takashi Nakamura
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Japan Science And Technology Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid comprising a light-sensitive group bonded to a nucleic acid via a triple bond, or a reactive derivative thereof, preferably, the following formula (I):
  • R represents a hydrogen atom or a cyano group.
  • the present invention also provides a nucleic acid oligomer containing the nucleic acid, a phosphoramidite reagent comprising a phosphoramidite derivative of the nucleic acid, and a method for producing a nucleic acid oligomer using the phosphoramidite reagent About.
  • a photosensitive nucleoside is easily introduced into a DNA chain without structural flexibility. To provide a light-sensitive substance.
  • the present invention provides a nucleic acid or a reactive derivative thereof, preferably a phosphoramidite reagent, for introducing the photosensitive substance into DNA, and provides selective photo-DNA cleavage. Disclosure of the invention
  • the present inventors have found a method for introducing a photosensitive benzophenone through an acetylene bond having no flexibility in peridine, which is one of the nucleosides.
  • the present invention relates to a nucleic acid or a reactive derivative thereof, in which a photosensitive group is bound to a nucleic acid via a triple bond.
  • the photosensitive group is represented by the following formula (I):
  • R represents a hydrogen atom or a cyano group.
  • the present invention relates to a nucleic acid oligomer containing at least one nucleic acid in which a photosensitive group is bonded to a nucleic acid via a triple bond.
  • the present invention relates to a phosphoramidite reagent comprising a phosphoramidite derivative of a nucleic acid substituted with a group represented by the above formula (I). More specifically, the present invention provides a compound represented by the following formula (III):
  • R represents a hydrogen atom or a cyano group.
  • a phosphoramidite reagent comprising a phosphoramidite derivative of a nucleic acid represented by the formula:
  • the present invention relates to a method for producing a nucleic acid oligomer containing a nucleic acid in which a photosensitive group is bound to a nucleic acid via a triple bond, using the above-described phosphoramidite reagent.
  • the present invention provides a method for selectively irradiating a nucleic acid oligomer comprising at least one nucleic acid having a light-sensitive group bonded to a nucleic acid via a triple bond with a nucleic acid oligomer to selectively react the nucleic acid oligomer. To how to cut into.
  • the “photosensitive group” of the present invention may be any group that can act as an electron acceptor in response to light such as visible light, ultraviolet light, or far ultraviolet light, and that can form a triple bond.
  • Preferred photosensitive groups of the present invention include a benzophenone group and a 4′-cyanobenzophenone group.
  • the triple bond of the present invention may be any as long as it can eliminate the above-mentioned degree of freedom of the photosensitive group, and usually a carbon-carbon triple bond is preferable. There are no particular restrictions on the position at which the triple bond binds to the above-described photosensitive group, but such a group can be accommodated in the nucleic acid oligomer and the degree of freedom is reduced. Position is preferred.
  • the light-sensitive group to which the double bond of the present invention is bonded includes the following formula (IV)
  • R ′ represents a hydrogen atom or a substituent.
  • the substituent for R 1 in formula (IV) may be any substituent that does not impair the function as an electron acceptor, and is preferably a cyano group. More preferably, the above formula
  • the light-sensitive group to which the triple bond is bonded binds to the nucleic acid at the other end of the triple bond.
  • the nucleic acid include various nucleosides, and lysine is preferred.
  • the position of binding to the nucleic acid may be a sugar moiety or a base moiety of the nucleic acid, but preferably a base moiety.
  • a particularly preferred embodiment is one in which a triple bond is bonded to the 5-position of peracyl.
  • the reactive derivative of the nucleic acid of the present invention is a nucleic acid in which the hydroxyl group in the sugar chain of the nucleic acid is replaced with a reactive group.
  • the other hydroxyl group may not show reactivity in the target reaction. May be protected with a suitable protecting group.
  • Preferred nucleic acids of the present invention or reactive derivatives thereof include the following formula (II):
  • ⁇ and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ each independently represent a hydrogen atom, a protecting group, or a reactive group.
  • R represents a hydrogen atom or a cyano group.
  • R represents a hydrogen atom or a cyano group.
  • Preferred reactive derivatives of the present invention include phosphoramidite derivatives.
  • Preferred phosphoramidite reagents of the present invention include the following formula (III):
  • R represents a hydrogen atom or a cyano group.
  • a phosphoramidite reagent comprising a phosphoramidite derivative of the nucleic acid represented by
  • the phosphoramidite reagent of the present invention is not limited to the compound represented by the above formula (IV), and is not particularly limited as long as it is a compound that can be immediately used in DNA synthesis, preferably in an automatic DNA synthesizer. Absent.
  • the nucleic acid of the present invention as a phosphoramidite reagent, it can be incorporated into an arbitrary DNA using a commercially available automatic DNA synthesizer.
  • DNA synthesis using such a phosphoramidite reagent is a method commonly used by those skilled in the art as a method for creating DNA having a new function very easily due to the spread of DNA synthesizers. is there.
  • Examples of the phosphoramide group of the phosphoramidite reagent of the present invention include 0-methyl-N, N-diisopropyl-1-phosphonamide group and 0— (2-cyanoethyl) 1 N, N —N, N—Diisopropyl-phosphonamide groups, such as diisopropyl-phosphonamide groups, are preferred.
  • a nucleoside in which a photosensitive group is bonded via a triple bond can be obtained, and this nucleoside can be used in a usual method, for example, by a DNA automatic synthesizer.
  • a nucleic acid oligomer (polynucleoside) containing at least one nucleoside containing a photosensitive group through a triple bond can be produced.
  • the nucleic acid oligomer of the present invention can be selectively cleaved by light in the vicinity of a nucleoside to which a photosensitive group is bound via a triple bond.
  • a nucleoside to which a photosensitive group is bound via a triple bond For example, Shianoben Zofueno emissions (CNBP) Echiniru substituted ⁇ lysine to (C U) was synthesized as an electron-accepting KakuShun base, Hosuhoroa Midai Ri by the Bok method, likely to be the most oxidized DNA 5, one GG- 3. Oligomers containing the sequence were synthesized.
  • the nucleotide sequence of this nucleic acid oligomer is given by the following formula (V)
  • wavelength 3 1 2 nm results of the light irradiated 2 hours, just before the the Xia Bruno benzo Hue Bruno emissions (CNBP) Echiniru substituted ⁇ lysine (C U) Selective cleavage at G on the 5 and 5 sides of the 5'-GG-3 'sequence characteristic of the one-electron oxidation was observed.
  • CNBP Xia Bruno benzo Hue Bruno emissions
  • C U Echiniru substituted ⁇ lysine
  • a wavelength in the visible ultraviolet region more preferably, a wavelength of 312 nm is irradiated for about 1 to 5 hours, preferably for 1 to 2 hours. This can be done.
  • a light-sensitive nucleotide can be easily incorporated into a DNA chain without any structural freedom.
  • the nucleic acid oligomer produced by the method of the present invention can be regioselectively photocleaved.
  • Conventionally used photosensitive nucleotides have a flexible structure with a high degree of freedom after introduction into DNA, so that the effect is significantly lower than that of the present invention.
  • the DNA into which the nucleic acid of the present invention has been introduced can be more selectively cleaved by a photosensitizing group, for example, a photochemical reaction of a benzophenone moiety.
  • a photosensitizing group for example, a photochemical reaction of a benzophenone moiety.
  • reaction mixture was extracted with ethyl acetate, washed with water, saturated sodium bicarbonate solution, and saturated sodium chloride solution, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated by removing the solvent.
  • the crystals were recrystallized in ethyl acetate-hexane to obtain a colorless crystalline compound (1) (57547 g, 20.89 ram 01, 81%).
  • Example 9 The compound (7) (167.8 mg, 0.241 mmo 1) obtained in the above Example 7 was azeotroped with acetonitrile, and then acetonitril (l mL), and add tetrazol (0.320 mmol), 2-cyanoethyl-N, N, N ', N, -tetrisoprovir phosphoramidite (0.093 mL, 0 mL). 3.586 mm o 1) and stirred at room temperature for 2 hours. The reaction mixture was extracted with ethyl acetate, washed with water and a saturated sodium chloride solution, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated by removing the solvent. A pale yellow foamy compound (8) (193.4 mg, 0.1963 mmol, 92%) was obtained.
  • Example 9 A pale yellow foamy compound (8) (193.4 mg, 0.1963 mmol, 92%) was obtained.
  • C U is Xia Bruno benzo Hue Bruno emissions (CNBP) Echiniru substituted ⁇ the lysine shown to.
  • the nucleic acid oligomer produced in Example 13 was irradiated with light having a wavelength of 312 nm for 2 hours. After light irradiation, when the product is analyzed, as shown in the cutting position of the following formula,
  • a photosensitive group for example, a photosensitive benzophenone can be fixedly introduced into DNA without any degree of freedom, so that a reaction such as cross-linking can be performed.
  • a reaction such as cross-linking can be performed.

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Description

明 細 書
光感応性ヌク レオシ ド及びフォスフォロアミダイ ト
技術分野
本発明は、 光感応性の基が三重結合を介して核酸に結合してなる核酸又はその 反応性誘導体、 好ましくは次式 （ I ) 、
Figure imgf000003_0001
(式中、 Rは、 水素原子又はシァノ基を示す。 ）
で表される基で置換された核酸又はその反応性誘導体に関する。 また、 本発明は. この核酸を含有する核酸オリ ゴマー、 この核酸のフォスフォロアミダイ ト誘導体 からなるフォスフォロアミダイ 卜試薬、 及び、 このフォスフォロアミダイ ト試薬 を用いる核酸オリ ゴマーの製造方法に関する。 背景技術
近年、 D N Aの一電子酸化による損傷機構が大変注目され、 主に電子受容性分 子と D N Aとの分子間電子移動反応が調べられている。
このような電子受容性分子と D N Aとの分子間電子移動反応を解析するために. 各種の光感応性物質をフォスフォロアミダイ ド試薬を用いて核酸中に導入し、 光 D N A切断の研究が行われてきた。 例えば、 次式
Figure imgf000004_0001
で示されるフォスフォロアミダイ ド試薬を用いた光 D N A切断知られている （ァ メリ力化学会誌、 第 1 1 9巻、 1 2 7 6 2 — 1 2 7 7 1頁、 1 9 9 7年 （J. Am. Chem. Soc. , 119 (52), 12762-12771, 1997) ) 。
しかしながら、 従来の光感応性物質による光 D Ν Α切断は、 選択性に乏しく位 置選択的な D NAの切断は困難であった。
また、 本発明者らは、 次式 （ 1 )
Figure imgf000004_0002
で示されるシァノベンゾフエノ ン （C N B P ) ( 1 ) が D N Aの一電子酸化にお ける優れた電子受容体であることを報告してきたが、 このものも選択性が充分で はなかった。
このような従来の光感応性物質は、 これを D NAに導入したときにその自由度 が大きく、 その結果として選択性が低くなるのではないかと考えられ、 本発明者 らは、 D NAに光感応性ヌクレオシ ドを自由度無く固定して導入する技術を開発 した。
本発明は、 D NA鎖中に光感応性ヌク レオシ ドを構造の自由度無く簡便に導入 するための光感応性物質を提供する。
また、 本発明は、 当該光感応性物質を D N Aに導入するための核酸又はその反 応性誘導体、 好ましくはフォスフォロアミダイ ド試薬を提供し、 選択的な光 D N A切断を提供する。 発明の開示
本発明者らは， 上記課題を解決するために、 ヌク レオシ ドの一つであるゥリジ ンに自由度のないアセチレン結合を介して、 光感応性のベンゾフエノンを導入す る手法を見出した。
本発明は、 光感応性の基が三重結合を介して核酸に結合してなる核酸又はその 反応性誘導体に関する。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 光感応性の基が次式 （ I ) 、
Figure imgf000005_0001
(式中、 Rは、 水素原子又はシァノ基を示す。 ）
で表される基である前記の核酸又はその反応性誘導体に関する。
また、 本発明は、 光感応性の基が三重結合を介して核酸に結合してなる核酸を 少なく ともひとつ含有してなる核酸オリゴマーに関する。
さらに、 本発明は、 前記の式 （ I ) で表される基で置換された核酸のフォスフ ォロアミダイ ト誘導体からなるフォスフォロアミダイ ト試薬に関する。 より詳細 には、 本発明は、 次式 （I I I ) 、
Figure imgf000006_0001
(式中、 Rは、 水素原子又はシァノ基を示す。 ）
で表される核酸のフォスフォロアミダイ ト誘導体からなるフォスフォロアミダイ ト試薬に関する。
また、 本発明は、 前記したフォスフォロアミダイ ト試薬を用いて、 光感応性の 基が三重結合を介して核酸に結合してなる核酸を含有する核酸ォリゴマ一を製造 する方法に関する。
さらに、 本発明は、 光感応性の基が三重結合を介して核酸に結合してなる核酸 を少なく ともひとつ含有してなる核酸オリ ゴマ一に光を照射して、 当該核酸オリ ゴマーを選択的に切断する方法に関する。
本発明の 「光感応性の基」 としては、 可視光線、 紫外線、 遠紫外線などの光に 感応して電子受容体として作用するものであって、 三重結合が結合し得るもので あればよい。 本発明の好ましい光感応性の基としては、 ベンゾフエノ ン基、 4 ' -シァノベンゾフエノン基などが挙げられる。
本発明の三重結合としては、 前記した光感応性の基の自由度を無くせるもので あればよく、 通常は炭素一炭素三重結合が好ましい。 当該三重結合が前記した光感応性の基に結合する位置も特に制限はないが、 こ れらの基が核酸オリゴマーの中に収容されることができ、 かつ、 その自由度が無 くなるような位置が好ましい。
本発明の Ξ重結合が結合した光感応性の基としては、 次式 （I V)
Figure imgf000007_0001
(式中、 R 'は、 水素原子又は置換基を示す。 ）
で表される基が好ましい。
式 （I V) 中の R 1の置換基としては、 電子受容体として作用を害しないものであ ればよく、 好ましくはシァノ基が挙げられる。 より好ましくは、 前記した式
( I ) で表される基が挙げられる。
前記した三重結合が結合した光感応性の基は、 当該三重結合の他の端において 核酸に結合する。 核酸としては、 各種ヌク レオシドをあげることができるが、 ゥ リジンが好ましい。
核酸に結合する位置は、 核酸の糖部分であっても、 塩基部分であってもよいが、 好ましくは塩基部分が挙げられる。
特に好ましい態様としては、 三重結合がゥラシルの 5位に結合したものを挙げ ることができる。
本発明の核酸の反応性誘導体としては、 核酸の糖鎖中の水酸基が反応性の基で 置換されたものであり、 この場合には他の水酸基が目的とする反応において反応 性を示さないように適当な保護基で保護されていてもよい。
本発明の好ましい核酸又はその反応性誘導体としては、 次式 （I I ) 、
- -
Figure imgf000008_0001
02
(式中、 γ及び ζは、 それぞれ独立に水素原子、 保護基又は反応性の基を示し
Rは、 水素原子又はシァノ基を示す。 ）
で表される化合物、 及び、 次式 （III) 、
Figure imgf000008_0002
0ヽ C
Figure imgf000008_0003
(式中、 Rは、 水素原子又はシァノ基を示す。 )
で表される化合物を挙げることができる。
本発明の好ましい反応性誘導体としては、 フォスフォロアミダイ ド誘導体を挙 げることができる。 好ましい本発明のフォスフォロアミダイ ド試薬としては、 次 式 （III) 、
Figure imgf000009_0001
(式中、 Rは、 水素原子又はシァノ基を示す。 ）
で表される核酸のフォスフォロアミダイ 卜誘導体からなるフォスフォロアミダイ ト試薬が挙げられる。
本発明のフォスフォロアミダイ ド試薬は、 前記した式 （IV) で表される化合物 に限定されるものではなく、 DNA合成、 好ましくは D N A自動合成機に直ちに 利用できる化合物であれば特に制限はない。 本発明の核酸をフォスフォロアミダ ィ ト試薬とすることにより、 市販の DN A自動合成機を用いて任意の DN Aに組 み込むことが出来る。 この様なフォスフォロアミダイ ト試薬を用いた DNA合成 は、 DN A自動合成機の普及により非常に簡単に、 新しい機能を持つ DNAを創 出する方法として当業者に通常使用しているものである。 本発明のフォスフォロア ミ ダイ ド試薬のフ ォスフ ォンアミ ド基と しては、 例え ば、 0—メチルー N， N—ジイソプロ ピル一フ ォスフォ ンアミ ド基、 0— （ 2— シァノエチル） 一 N , N—ジイ ソプロ ビル一フ ォスフォ ンア ミ ド基などの N， N —ジイ ソプロ ピルフ ォスフォ ンア ミ ド基が好ま しい。
本発明の方法によ り、 光感応性の基が三重結合を介して結合したヌク レオシ ド を得ることができ、 このヌ ク レオシ ドを用いて通常の方法、 例えば、 D NA自動 合成機による合成法などによ り、 三重結合を介して光感応性の基を含有するヌク レオシ ドを少な く ともひとつ含有する核酸オリ ゴマー （ポリ ヌク レオシ ド） を製 造することができる。
本発明の核酸ォリ ゴマ一は、 光感応性の基が三重結合を介して結合したヌクレ オシ ドの近傍で選択的に光による切断をするこ とができる。 例えば、 シァノベン ゾフエノ ン （ C N B P ) ェチニル基置換ゥ リ ジン （ CU) を電子受容性核駿塩基と して合成し、 ホスホロア ミダイ 卜法によ り、 D N Aの最も酸化されやすい 5， 一 G G— 3 ， 配列を含むオ リゴマーを合成した。 この核酸オリ ゴマーの塩基配列は 次式 （V)
5 ' 一 AA T A C A T T G G T G G ('U T T G A G T A T - 3 ' ( V )
(式中、 （'Uは、 シァノベンゾフエノ ン （ C N B P ) ェチニル基置換ゥ リ ジンを示 す。 ）
で表されるものである。
このオリゴマーを相補鎖と二本鎖形成後、 波長 3 1 2 n mの光を 2時間照射し た結果、 シァノベンゾフエノ ン （ C N B P ) ェチニル基置換ゥ リ ジン （CU ) の直 前に位置する一電子酸化に特徴的な 5 ' - G G - 3 ' 配列の 5 ， 側の Gでの選択 的切断が認められた。
本発明における光による核酸オリゴマーを切断する方法は、 好ま しく は可視紫 外領域の波長、 よ り好ま しくは 3 1 2 n mの波長を約 1〜 5時間、 好ま しく は 1 〜 2時間照射するこ とによ り行う ことができる。
本発明によ り、 D N A鎖中に光感応性ヌ ク レオシ ドを構造の自由度無く簡便に 導入するこ とができ、 本発明の方法によ り製造された核酸オリゴマーは位置選択 的に光切断することができる。 従来用いられている光感応ヌ ク レオシ ドでは、 D N Aに導入後自由度の高いフ レキシブルな構造をとるために、 その効果は本発明 に比べて著しく低かった。
本発明の核酸を導入した D N Aは光感応性の基、 例えば、 ペンゾフエノ ン部分 の光化学反応によ り よ り選択的な切断が行えるために、 1 ) D N A—タ ンパクと のクロス リ ンクによる D NA—タンパク相互作用の解析、 2 ) D N A— D N A間 の電子移動反応解析、 3 ) D N A切断反応の解析、 4 ) 光遺伝子治療、 5 ) アン チセンス D NA、 6 ) 光 D N A接合等への利用が期待される。 実施例
次に実施例によ り本発明をよ り具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例 に限定されるものではない。 実施例 1
3 ， 一プロモー 4—メチルベンゾフエノ ン （ 1 ) の製造
3 -ブロモ安息香酸 （ 5 . 1 5 7 4 g、 2 5 . 6 6 m m o 1 ) の塩化チォニル 溶液 （ 3 0 m L ) を一時間還流の後、 塩化チォニルを留去し、 トルエン （ 4 0 m L ) に溶した。 この溶液中に無水塩化アルミニウム （ 7 . 2 7 5 4 g、 5 4 . 5 6 mm 0 1 ) を数回にわけて加え、 3時間室温で撹拌。 氷水と塩酸を加えさ らに 3 0分撹拌。 反応混合物は舴酸ェチルで抽出し、 水、 飽和炭酸水素ナ ト リ ウム溶 液、 飽和塩化ナ ト リ ウム溶液で洗浄、 無水硫酸マグネシウムで乾燥後、 溶媒をと ばして濃縮。 酢酸ェチル—へキサン中で再結晶して無色結晶の化合物 （ 1 ) ( 5 7 4 7 0 g、 2 0 . 8 9 ram 0 1 , 8 1 %) を得た。
Ή NMR ( C D C 1 3、 2 0 0 M H z ) δ ；
2.43(s、3H), 7.26- 7.37(m、3H), 7.65-7.71 (m, 4H) , 7.88-7.90( 1H)
M S m/ z (%) ； 276(M+)(48), 274(M+)(48), 261(3), 259(3),
195(8), 185(9), 183(9), 157(9), 155(9), 119(100), 91(33). 実施例 2
3， 一プロモ一 4— (ジブロモメチル） ベンゾフエノ ン （ 2 ) の製造
前記実施例 1で得られた化合物 （ 1 ) ( 1 , 0 3 3 g、 3. 7 5 4 mm o 1 ) のァセ トニ ト リル溶液 （ 2 0 mL) に NB S ( 1 . 6 5 4 g、 9. 2 9 0 m m o 1 ) 、 A I B N ( 6 3. 7 m g、 0. 3 8 7 9 mm o l ) を加え還流下 5時間撹 拌。 反応混合物は酢酸ェチルで抽出し、 水、 飽和炭酸水素ナ ト リ ウム溶液、 飽和 塩化ナ ト リ ウム溶液で洗浄、 無水硫酸マグネシウムで乾燥後、 溶媒をとばして濃 縮。 シリカゲルカラムクロマ トグラフィー （ t o l u e n e ： n- h e x a n e = 2 : 1 ) によ り精製し白色固体の化合物 （ 2 ) ( 1 . 3 5 1 g、 3. 1 2 1 m m o 1、 8 3 %) を得た。
Ή NMR ( CD C 13、 2 0 0 MH z ) δ ；
6.67(s、lH), 7.32-7.40(ts3H, J=7.8Hz), 7.66-7.80(m, 4H) ,
7.91-7.93(1H)
M S m/ z (%) ； 434(M+)(2)s 432(M+) (2 ), 355(56 ), 353( 100 ), 351(58), 327(20 )、325(40、 323(21 )、275(8)、 273(8)、 245(7)、 185(5)、 183(5)、 165(17)、157(9)、 155(9)、 89(24). 実施例 3
4 - ( 3—ブロモベンゾィル） ベンズアルデヒ ド （ 3 ) の製造
前記の実施例 2で得られた化合物 （ 2 ) ( 9 6 7. 6 m g、 2. 2 3 5 mmo 1 ) の D M F溶液 （ 1 0 m L ) に酢酸ナ ト リ ウム （ 9 1 6. 2 m g、 1 1. 1 7 mmo 1 ) を加え 1 3 0度で 5時間撹拌。 反応混合物は酢酸ェチルで抽出し、 水、 飽和塩化ナ ト リ ウム溶液で洗浄、 無水硫酸マグネシウムで乾燥後、 溶媒をとばし て濃縮。 シリカゲルカラムクロマ トグラフィー （t o l u e n e ： c h l o r o f o rm= 9 : l ) によ り精製し白色粉末の化合物 （ 3 ) ( 3 8 8. 4 mg、 1 . 3 43 mm 0 1 , 6 0 %) を得た。
Ή NMR ( CD C 13、 4 0 0 MH z ) δ ；
7.38(t、 1H、 J=7.8Hz), 7.69-7.71(m、 1Η), 7.73-7.75(m 1H),
7.89-8.01(m、4H)， 7.92- 7.93 (m、 1H)， 10.12(s、 lH) MS m/z (%) ; 290(M+)(73)、 288(M+)(73)、263(6 )、261(10)、259(6)、
209(8)、 185(57)、 183(57)、 157(14)、 155(15)、 133(100)、 105(22)、 89( 10)、 77(29), 76(25). 実施例 4
4一 （ 3—ブロモベンゾィル） ベンゾニ ト リル （ 4 ) の製造
前記の実施例 3で得られた化合物 （ 3 ) ( 3 2 0. 5 m g、 1 . 1 0 8 mm o 1 ) 、 ギ酸ナ ト リ ウム （ 1 5 1. 3 m g、 2. 2 2 5 mm o 1 ) のギ酸溶液 （ 8 m L ) に塩酸ヒ ドロキシルァミ ン （ 1 5 3. 4 m g、 2 . 2 0 8 m m o 1 ) を加 え還流下 7時間撹拌。 ギ酸を留去の後、 反応混合物を酢酸ェチルで抽出し、 水、 飽和炭酸水素ナ ト リ ウム溶液、 飽和塩化ナ ト リ ウム溶液で洗浄、 無水硫酸マグネ シゥムで乾燥後、 溶媒をとばして濃縮。 シ リカゲルカラムクロマ トグラフィー (n- h e x a n e ： e t h y l a c e t a t e = 7 ： 1 ) によ り精製し白色 粉末の化合物 （ 4 ) ( 2 7 1 . 8 mg、 0. 9 5 0 mm o l、 8 6 %) を得た。
'Η NMR ( CD C l a, 4 0 0 MH z ) δ ；
7.38(t、 1Η、 J=7.8Hz)， 7.66-7.68(m, 1H), 7.74- 7.76(m、 1H)，
7.78-7.86(m,4H), 7.89- 7.91(m、 1H)
MS m/z (%) ； 287(M+)(92)、 285(M+)(93)、206( 16 )、 185(93)、
183(95)、 157(26)、 155(26)、 130(100)、 102(50) 実施例 5
4— ( 3— ト リメチルシリルェチニルペンゾィル） ベンゾニ ト リル （ 5 ) の製 造
前記の実施例 4で得られた化合物 （ 4 ) ( 8 8 7. 3 m g、 3. 1 0 1 mm o 1 ) 、 酢酸パラジゥム （ 7. l m g、 0. 0 3 1 6 2 mm o l ) 及びト リ フエ二 ルフォスフィ ン （ 4 0. 5 m g、 0. 1 5 44 mm o l ) の ト リエチルァミ ン溶 液 （ 1 5 mL) を脱気後に ト リメチルシリルアセチレン （ 1 . 2 0 mL) を加え 窒素雰囲気下、 還流 6時間撹拌。 反応混合物を酢酸ェチルで抽出し、 水、 飽和塩 化ナ ト リウム溶液で洗浄、 無水硫酸マグネシウムで乾燥後、 溶媒をとばして濃縮, シリカゲルカラムクロマ トグラフィー （n— h e x a n e ： e t h y l a c e t a t e = 3 0 ： 1 ) によ り精製し白色粉末の化合物 （ 5 ) ( 8 5 6. 7 m g、 2. 8 2 3 mm o 1 , 9 1 %) を得た。
Ή NMR ( CD C 13、 2 0 0 MH z ) δ ；
0.23(s、9H), 7.40-7.47(t、 1H、J=7.6), 7.66-7.73(m, 2H) ,
7.76- 7.87(m、5H)
MS m/ z ( ) ； 303(M+)(55), 288( 100). 実施例 6
4— ( 3—ェチニルペンゾィル） ベンゾニ ト リル （ 6 ) の製造
前記の実施例 5で得られた化合物 （ 5 ) ( 7 3 0 . O mg, 2. 4 0 6 mm o 1 ) の TH F溶液 （ l O mL) に T B A F— 1 M— T H F溶液 （ 3. 6 0 mL、 3. 6 0 m m o 1 ) と酢酸 （ 0. 2 mL、 3. 4 6 m m o 1 ) を加え室温で 2時 間撹拌。 反応混合物を酢酸ェチルで抽出し、 水、 飽和塩化ナ ト リ ウム溶液で洗浄、 無水硫酸マグネシウムで乾燥後、 溶媒をとばして濃縮。 シリカゲルカラムクロマ トグラフィ一 (, η - h e x a n e ： e t h l a c e t a t e = 1 5 ： 1 ) に よ り精製し白色粉末の化合物 （ 6 ) ( 5 1 3. 3 m g、 2. 2 1 9 mm o 1 , 9 2 %) を得た。
Ή NMR ( CD C 13、 4 0 0 MH z ) δ
3.13(s、lH), 7.47(t、 1H、 J=7.8), 7.71-7.76(m, 2H) , 7.78-7.86(m、 5H) MS m/ z (%) ； 231(M+)( 100), 129(77), 101(20)
H R M S 計算値 ： C 16H 9〇 N (M + ) 2 3 1 . 0 6 8 3 6
実測値 ： 2 3 1 . 0 6 9 2 実施例 7
5— { 3 - ( 4一シァノベンゾィル） フエ二ルェチ二ル} 一 2， ーデォキシ一 5 ' 一 0— （ 4 , 4， 一ジメ トキシ ト リチル） ゥリ ジン （ 7 ) の製造
前記の実施例 6で得られた化合物 （ 6 ) ( 2 7 5 . 5 m g、 1. 1 9 1 mm o 1 ) 、 5—ョ一 ドー 2 ' —デォキシゥ リ ジン （ 6 5 0. 8 m g、 0. 9 9 1 4 m m o l ) 、 及び ト リェチルァ ミ ン （ 0. 2 8 m L、 2. 0 0 9 mmo l ) の DM F溶液 （ 1 0 m L ) を脱気後にテ トラキス ト リ フエニルフォスフィ ンパラジウム ( 1 2 1. 5 m g、 0. 1 0 5 1 mm o l ) 、 ヨウ化銅 （ 1 8 9. 7 mg、 0. 9 9 6 1 mm o 1 ) を加え窒素雰囲気下、 5時間撹拌。 反応混合物をクロ口ホル ムで抽出し、 水、 飽和塩化ナ ト リ ウム溶液で洗浄、 無水硫酸マグネシウムで乾燥 後、 溶媒をとばして濃縮。 シ リカゲルカラムクロマ トグラフィー （ c h l o r o f o r m : m e t h a n o l = 1 0 0 ： 1 ) によ り精製し淡黄色粉末の化合物 ( 7 ) ( 7 2 0 . 1 0 m g, 0. 9 1 8 7 mm o 1 , 9 3 %) を得た。
'Η NMR ( CD C 1 4 0 0 MH z ) δ ；
2.30-2.54(ms2H), 3.29-3.44(m, H) , 3.66(sゝ 3H)， 3.67(s、3H)， 4.09(m、lH)， 4.57- 4.58(m、 1H), 6.32- 6.36 (m、 1H)， 6.72- 6.76 (m、 4H)， 7.07-7.42(1, 12H), 7.65- 7.77(m、 5H) , 8.26(s、lH)
FABM S m/z ； 7 6 0 [ (M + H ) +] 実施例 8
ァミダイ ド誘導体 （ 8 ) の製造
前記の実施例 7で得られた化合物 （ 7 ) ( 1 6 7. 8 m g、 0. 2 1 4 1 mm o 1 ) をァセ トニ ト リルで共沸した後、 ァセ トニ ト リル （ l mL) に溶かし、 テ ト ラゾール （ 0. 3 2 0 mm o l ) 、 2—シァノエチルー N, N , N ' , N， - テ トライソプロビルホスホロアミダイ ト （ 0. 0 9 3 m L、 0. 3 5 8 6 mm o 1 ) を加え室温 2時間撹拌。 反応混合物は酢酸ェチルで抽出し、 水、 飽和塩化ナ ト リ ウム溶液で洗浄、 無水硫酸ナ ト リ ウムで乾燥後、 溶媒をとばして濃縮。 淡黄 色泡状の化合物 （ 8 ) ( 1 9 3. 4 m g、 0. 1 9 6 3 mm o l、 9 2 %) を得 た。 実施例 9
3—ブロモベンゾフエノ ン （ 9 ) の製造
3一ブロモ安息香酸 （ 4. 1 6 0 0 g、 2 0. 6 9 mm o 1 ) の塩化チォニル 溶液 （ 1 5 mL) を一時間還流の後、 塩化チォニルを留去し、 ベンゼン （ 1 5 m L ) に溶した。 この溶液中に無水塩化アル ミニウム （ 5. 5 0 2 g、 4 1. 2 5 mm o 1 ) を数回にわけて加え、 6時間室温で撹拌。 氷水と塩酸を加えさらに 3 0分撹拌。 反応混合物は酢酸ェチルで抽出し、 水、 飽和炭酸水素ナ ト リ ウム溶液、 飽和塩化ナ ト リ ウム溶液で洗浄、 無水硫酸マグネシウムで乾燥後、 溶媒をとばし て濃縮。 シ リ カゲルカラムク ロマ ト グラフ ィ ー （ n— h e x a n e ： e t h y l a c e t a t e = 2 0 ： 1 ) によ り精製し白色粉末の化合物 （ 9 ) ( 4. 3 2 1 6 g、 1 6. 5 5 mm 0 1 , 8 0 %) を得た。 実施例 1 0
3— ト リ メチルシ リルェチニルベンゾフエノ ン （ 1 0 ) の製造
前記の実施例 9で得られた化合物 （ 9 ) ( 3. 0 1 2 6 g、 1 1 . 5 3 7 mm o l ) 、 酢酸パラジウム （ 2 5. 9 m g、 0. 1 1 5 4 mm o l ) 及び ト リ フエ ニルフォスフィ ン （ 1 2 1 . l m g、 0. 4 6 1 7 mm o l ) の ト リェチルアミ ン溶液 （ 2 0 mL) を脱気後に ト リメチルシ リルアセチレ ン （ 5. 0 mL、 3 5. 3 8 mm 0 1 ) を加え窒素雰囲気下、 還流 6時間撹拌。 反応混合物を酢酸ェチル で抽出し、 水、 飽和塩化ナ ト リ ウム溶液で洗浄、 無水硫酸マグネシウムで乾燥後、 溶媒をとばして濃縮。 シリカゲルカラムクロマ トグラフ ィー （ n— h e x a n e ： e t h y l a c e t a t e = 8 0 : l ) によ り精製し淡黄色粉末の化合物 ( 1 0 ) ( 2. 9 2 8 2 g、 1 0. 5 1 6 9 mm o l、 9 1 %) を得た。
MS m/z (%) ； 278(M+)( 71 ), 263( 100 ), 105(20 ), 77( 17)
H RM S . 計算値 ： C 18H 18O S i (M + ) 2 7 8. 1 1 2 6 8
実測値 ： 2 7 8. 1 1 2 7. 実施例 1 1
3—ェチニルベンゾフ エノ ン （ 1 1 ) の製造
前記の実施例 1 0で得られた化合物 （ 1 0 ) ( 2. 7 2 7 2 , 9. 7 9 5 m m o 1 ) のメタノ ール溶液 ( 1 5 m L ) に炭酸力リ ウム （ 1 4. 3 mg、 0. 1 0 3 5 mm o 1 ) を加え室温で 2時間撹拌。 反応混合物を酢酸ェチルで抽出し、 水、 飽和塩化ナ ト リ ウム溶液で洗浄、 無水硫酸マグネシウムで乾燥後、 溶媒をと ばして濃縮。 シ リカゲルカラムクロマ トグラフ ィー （ n— h e x a n e ： e t h y 1 a c e t a t e = 1 0 0 ： 1 ) によ り精製し白色粉末の化合物 （ 1 1 ) ( 1. 5 2 1 6 g、 7. 3 3 4 mm o l、 7 5 %) を得た。
1 H NMR ( CD C 1 4 0 0 MH z ) δ ；
3.10(s、lH), 7.44(t、 1H、 J=8.0)， 7.46-7.50(m, 2H), 7.59(m、lH)， 7.68(nulH), 7、75- 7.78(m、3H), 7.88(m、lH)
MS m/ z ( % ) ； 206 (M+ ) ( 100 ), 129(40 ) 05(61) 01 (31 ), 77(40)
H R M S 計算値 ： 〇 151^。0 (^[+) 2 0 6. 0 7 3 1 1
実測値 ： 2 0 6. 0 7 3 6. 実施例 1 2
5 - { 3—ベンゾィルフエ二ルェチ二ル} — 2， ーデォキシー 5， - 0 - ( 4： 4， ージメ トキシ ト リチル） ゥリ ジン （ 1 2 ) の製造
前記の実施例 1 1で得られた化合物 （ 1 1 ) ( 4 7 0 . 3 mg、 2. 2 8 0 m m o l ) 、 5—ョ一 ドー 2， 一デォキシゥ リ ジン （ 1 0 0 1 . 4 m g、 1. 5 2 5 mmo l ) 、 及びト リェチルァミ ン （ 0. 4 2 0 mL、 3. 0 1 3 m m o 1 ) の D M F溶液 （ 1 2 m L ) を脱気後にテ ト ラキス ト リ フエニルフォスフィ ンパラ ジゥム （ 1 94. 3 mg、 0. 1 6 8 1 mm o l ) 、 ヨウ化銅 （ 2 8 6. 5 mg、 1. 5 0 4 mm o 1 ) を加え窒素雰囲気下、 4時間撹拌。 反応混合物を酢酸ェチ ルで抽出し、 水、 飽和塩化ナ ト リ ウム溶液で洗浄、 無水硫酸マグネシウムで乾燥 後、 溶媒をとばして濃縮。 シリカゲルカラムク ロマ トグラフィー （ n— h e x a n e ： e t h y 1 a c e t a t e = l ： 1 ) によ り精製し淡黄色粉末の化合物 ( 1 2 ) ( 9 8 1. 8 m g、 1 . 2 9 4 mm o 1 , 8 5 %) を得た。
Ή NMR ( CD C l s, 4 0 0 ΜΗ ζ ) δ ；
2.30-2.54(m、2H)， 3.37(m、2H)， 4.08(m、lH), 4.57 、1H),
4.09(m、lH), 4.57- 4.58(m、 1H)， 6 · 33(m、 1H)， 6.74(m、4H),
7.06-7.72(m、 18H), 8.19(s、lH)， 8,48(s、lH)
,3C NMR ( C D C 13、 4 0 0 MH z ) δ ；
195.83, 158.61， 147.30, 144.32, 142.50, 139.44, 137.58, 137.11, 135.45, 135.36, 132.68, 132.62, 130.07, 129.98, 129.87, 129.56,
129.12， 128.38, 128.11， 128.03, 127.84, 127.82, 127.75, 127.07,
127.03, 122.64, 113.32, 113.16, 100.14, 92.72, 87.10, 86.62,
85.80, 81.43, 80.80, 72.41, 63.35, 55.24, 55.15, 41.69 実施例 1 3
実施例 8で得られた化合物 （ 8 ) を用いて、 常法によ り次式、
5 ' - AATA C AT T G G T GG U T T GAG TAT- 3 '
(式中、 CUは、 シァノベンゾフエノ ン （ C N B P) ェチニル基置換ゥ リ ジンを示 す。 ）
で表される核酸オリゴマーを製造した。 実施例 1 4
実施例 1 3で製造された核酸ォリ ゴマーに、 波長 3 1 2 n mの光を 2時間照射 した。 光照射後、 生成物を分析すると次式の切断位置に示されるように、
5 ' -AA TA CA T T G G T G GcUT T GAG TAT - 3 '
个切断位置
の、 CUの直.前にある 5 ' — G G— 3， の位置で選択的に切断された生成物のスポ ッ トを観察することができた。 産業上の利用可能性
本発明の光感応性ヌク レオシ ドを用いるこ とによ り、 D N Aに光感応性の基、 例えば、 光感応性べンゾフエノ ンを自由度無く 固定して導入出来るために、 クロ スリ ンクなど反応の選択性は極めて高い。 また、 D N Aに損傷を与えない波長の 光により、 容易に活性化できる利点を持つ。

Claims

請 求 の 範 囲 光感応性の基が三重結合を介して核酸に結合してなる核酸又はその反応性誘 導体。
2 . 三重結合に結合する光感応性の基が次式 （ I ) 、
Figure imgf000019_0001
(式中、 Rは、 水素原子又はシァノ基を示す。 ）
で表される基である請求の範囲第 1項に記載の核酸又はその反応性誘導体。
3 . 光感応性の基が三重結合を介して核酸の塩基部分に結合している請求の範囲 第 1項又は第 2項に記載の核酸又はその反応性誘導体。
4 . 塩基がゥラシルである請求の範囲第 3項に記載の核酸又はその反応性誘導体,
5 . 核酸又はその反応性誘導体が、 次式 （I I ) 、
Figure imgf000019_0002
O Z
(式中、 γ及び zは、 それぞれ独立に水素原子、 保護基又は反応性の基を示し Rは、 水素原子又はシァノ基を示す。 ） で表される請求の範囲第 4項に記載の核酸又はその反応性誘導体,
6 . 核酸又はその反応性誘導体が、 次式 （I I I ) 、
Figure imgf000020_0001
(式中、 Rは、 水素原子又はシァノ基を示す。 ）
で表される請求の範囲第 5項に記載の核酸又はその反応性誘導体。
7 . 請求の範囲第 1項から第 6項のいずれかに記載の核酸を少なく ともひとつ含 有してなる核酸オリゴマ一。
8 . 核酸オリゴマーが R N Aである請求の範囲第 7項に記載の核酸オリゴマ一。
9 . 次式 （ I ) 、
Figure imgf000020_0002
(式中、 Rは、 水素原子又はシァノ基を示す。 ）
で表される基で置換された核酸のフォスフォロアミダイ ト誘導体からなるフォス フォロアミダイ 卜試薬。
1 0 . 次式 （I I I )
Figure imgf000021_0001
(式中、 Rは、 水素原子又はシァノ基を示す。 ）
で表される核酸のフォスフォ口アミダイ ト誘導体からなるフォスフォ口アミダイ 卜試薬。
1 1 . 請求の範囲第 9項又は第 1 0項に記載のフォスフォロアミダイ ト試薬を用 いて、 次式 （ I ) 、
Figure imgf000021_0002
(式中、 Rは、 水素原子又はシァノ基を示す。 ） で表される基で置換された核酸を含有する核酸オリ ゴマーを製造する方法。
1 2 . 光感応性の基が三重結合を介して核酸に結合してなる核酸を少な く ともひ とつ含有してなる核酸オリゴマーに光を照射して、 当該核酸オリ ゴマーを選択的 に切断する方法。
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