JP4170665B2 - フェニル基を有する核酸塩基アナログが導入された核酸 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸塩基アナログ、該核酸塩基アナログが導入された核酸、例えば、ＤＮＡ及び核酸、例えば、ＤＮＡの酸化耐性能の増強方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、フェニル基を有する核酸塩基アナログが導入されたＤＮＡ、該ＤＮＡの製造方法、ＤＮＡの酸化耐性能の増強方法及びフェニル基を有する核酸塩基に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡは、ヌクレオチド塩基対のπ電子がスタックした構造からなるものであり、電荷移動の媒体として認識され、実際に、実験理論的研究により、ある距離の電荷移動を媒介することが知られている。ＤＮＡの一電子酸化反応により生じたグアニンラジカルカチオン（ホール）は、近傍のＧ（デオキシグアニル酸残基）間の連続的なホッピングにより、離れたＧ部位に移動しうる。すなわち、ＤＮＡの酸化損傷は、グアニン塩基（デオキシグアニル酸残基）で生じ、離れた場所のグアニン塩基（デオキシグアニル酸残基）に伝搬する。
【０００３】
前記ＤＮＡは、例えば、疾患の遺伝子診断、個体の同定等の診断分野又は研究分野において、ＤＮＡチップ等として利用されている。
【０００４】
しかしながら、前記ＤＮＡを、ＤＮＡチップ等に用いる場合、前記一電子酸化反応を介したＤＮＡの酸化損傷（例えば、切断等）及びＤＮＡ全体への該酸化損傷の伝搬により、診断の精度、装置の耐久性が低下する場合があるという欠点がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、一電子酸化反応を介した酸化損傷及び該酸化損傷の伝搬を抑制し、一電子酸化反応を介した酸化に対して耐性である、フェニル基を有する核酸塩基アナログが導入された核酸、例えば、ＤＮＡなどを提供することを目的とする。また、本発明は、前記核酸、例えば、ＤＮＡを簡便かつ効率よく製造することができる、酸化耐性能を有するＤＮＡの製造方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、所望の塩基配列を有する核酸の酸化耐性能を向上させることができる、核酸の酸化耐性能の増強方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、一電子酸化反応を介した核酸の酸化損傷及び核酸全体への該酸化損傷の伝搬を抑制すること、一電子酸化反応を介した酸化に対する耐性を核酸に付与することを可能にするプリンヌクレオチド誘導体を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 ＤＮＡにおけるデオキシグアニル酸残基（Ｇ）を、Ｎ 2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換することを特徴とする、ＤＮＡの酸化耐性能の増強方法、
〔２〕 塩基配列中のＧ n （Ｇ n は、デオキシグアニル酸残基の連続配列を示し、ｎは、２以上の整数を示す）から１０塩基長未満の位置に存在するＧを、Ｎ 2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換する、前記〔１〕記載の増強方法、並びに
〔３〕 塩基配列中のＧ n （Ｇ n は、デオキシグアニル酸残基の連続配列を示し、ｎは、２以上の整数を示す）中のＧを、Ｎ 2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換する、前記〔１〕又は〔２〕記載の増強方法、
に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡは、フェニル基を有する核酸塩基アナログが導入されたＤＮＡであり、グアニンのＮ2 位にフェニル基が導入されたフェニルグアニン残基を有するプリンデオキシリボヌクレオチド残基を構成単位の１つとして含有したＤＮＡである。
【００１０】
なお、本明細書において、「核酸塩基」とは、核酸の構成単位であるデオキシリボヌクレオチド残基を構成する塩基を意味する。
【００１１】
また、「残基」とは、特定の化合物から誘導される官能基を意味し、例えば、フェニルグアニン残基とは、フェニルグアニル基を意味し、グアニン残基とは、グアニル基を意味する。
【００１２】
さらに、本明細書において、「フェニル基を有する核酸塩基アナログ」とは、フェニルグアニンなどをいう。
【００１３】
また、前記「フェニルグアニン残基を有するプリンデオキシリボヌクレオチド」としては、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸が挙げられる。
【００１４】
ＤＮＡの構成単位としては、具体的には、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基、デオキシグアニル酸残基、デオキシアデニル酸残基、デオキシシチジル酸残基、デオキシチミジル酸残基などが挙げられている。なお、本発明においては、前記「ＤＮＡの構成単位」には、前記「（フェニル基を有する）核酸塩基アナログ残基を有するデオキシリボヌクレオチド」以外の慣用のデオキシリボヌクレオチドアナログをも包含する。
【００１５】
本発明のＤＮＡは、フェニル基を有する核酸塩基、特に、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基を構成単位として含有するため、デオキシグアニル酸残基を構成単位として含有するＤＮＡよりも、一電子酸化反応を介した酸化損傷（切断）及び該酸化損傷の伝搬が抑制され、一電子酸化反応を介した酸化に対して耐性であるという優れた性質を発現する。したがって、本発明のＤＮＡにより、安定性、特に、酸化条件下での安定性に優れた核酸材料を提供することが可能になる。
【００１６】
本発明のＤＮＡは、所望の塩基配列中の所望の位置のＧが、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換された核酸であればよく、具体的には、塩基配列中のＧ（デオキシグアニル酸残基）の代わりに、下記式（Ｉ）：
【００１７】
【化３】
【００１８】
で表わされる基（Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基）を構成単位として含有するＤＮＡが挙げられる。
【００１９】
本発明のＤＮＡにおいて、塩基配列におけるＮ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基への置換の数は、ＤＮＡのＧＣ含量及び配列により適宜設定されうるが、例えば、少なくとも１個、具体的には、１個若しくは数個又はそれ以上が挙げられる。また、ＤＮＡの塩基配列中の全てのＧが、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換されていてもよい。
【００２０】
また、本発明のＤＮＡにおいて、塩基配列におけるＮ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基の導入部位は、特に限定されないが、例えば、一電子酸化反応を介した酸化損傷の伝搬を抑制する観点から、塩基配列中のＧn 中のＧ、該塩基配列中のＧＧ塩基連鎖から、好ましくは、１０塩基長未満、より好ましくは、６塩基長以下、さらに好ましくは、４塩基長以下の位置等が挙げられる。なお、前記「Ｇn 」は、デオキシグアニル酸残基の連続配列を示し、ｎは、少なくとも２の整数、具体的には、２以上の整数を示す。
【００２１】
本発明のＤＮＡは、ＤＮＡにおけるデオキシグアニル酸残基を、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換することにより得ることができる。かかるＤＮＡの製造方法も本発明に包含される。
【００２２】
本発明のＤＮＡの製造方法は、ＤＮＡにおけるデオキシグアニル酸残基を、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換することを１つの特徴とする。具体的には、本発明のＤＮＡの製造方法は、（Ａ）ＤＮＡの化学合成に際し、塩基配列中におけるＮ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基の導入対象位置に対応して、デオキシグアニル酸誘導体の代わりに２−フルオロデオキシイノシン酸誘導体を導入して、２−フルオロデオキシイノシン酸残基を有するＤＮＡを合成する工程、及び
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られたＤＮＡ中の２−フルオロデオキシイノシン酸残基を、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に変換する工程、
を含む方法等が挙げられる。本発明のＤＮＡの製造方法によれば、ＤＮＡにおけるデオキシグアニル酸残基を、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換するため、本発明のＤＮＡを簡便かつ効率よく製造することができ、従来、核酸の化学合成に用いられている方法及び装置をそのまま適用することができる。
【００２３】
前記工程（Ａ）において、２−フルオロデオキシイノシン酸残基を有するＤＮＡの合成は、慣用のホスホロアミダイト(phosphoramidite)法、ホスホトリエステル(phosphotriester) 法等に従って行なわれる。ここで、所望の塩基配列中の所望のＧの位置に、２−フルオロデオキシイノシン酸残基が導入されたＤＮＡが得られる。
【００２４】
前記工程（Ａ）において、慣用のホスホロアミダイト(phosphoramidite)法によりＤＮＡを合成する場合、２−フルオロデオキシイノシン酸誘導体とは、２−フルオロ−５’−Ｏ（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシイノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイトをいう。
【００２５】
前記２−フルオロ−５’−Ｏ（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシイノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイトは、図１に示される合成スキームに従って合成されうる。
【００２６】
図１に示される合成スキームにおいて、まず、例えば、アセド(Acedo, M.) ら、Nucleic Acid Res., 22, 2982-2989 (1994) に従って、２−デオキシグアノシン（図１中、化合物１）を出発物質として、２−フルオロ−３’−Ｏ，５’−Ｏ−ビス（ターシャリーブチルジメチルシリル）−Ｏ６（ｐ−ニトロフェネチル）−２’−デオキシイノシン（図１中、化合物４）を合成する。ここで、ジメチルホルムアミドを溶媒として、イミダゾール存在下に、化合物１と、ターシャリーブチルメチルシリルクロリド(TBDMSCL) とを反応させ、該化合物１の２つの水酸基をシリル化して、化合物２を得る。化合物１とTBDMSCL との反応における使用量の量比は、１〜５（重量比）、好ましくは、１〜３（重量比）、より好ましくは、１〜１．８（重量比）であることが望ましい。また、反応条件としては、例えば、室温で２４時間などが挙げられる。ついで、１，４−ジオキサンを溶媒として、前記化合物２と、ジエチルアゾダイカルボキシレート（DEAD）と、トリフェニルフォスフィン（Ph3P）と、パラニトロフェニルェタノール(NPE) とを反応させ、化合物３を得る。前記化合物２と、DEADと、Ph3Pと、NPE との反応における使用量の量比は、１：０．５：０．５：０．５〜１：５：５：５（重量比）、好ましくは、１：０．５：０．５：０．５〜１：３：３：３（重量比）、より好ましくは、１：０．５：０．５：０．５〜１：１：１：１（重量比）であることが望ましい。また、反応条件は、−１０℃〜５０℃であることが望ましい。その後、得られた化合物３を、トルエン中ターシャリーブチルナイトライト(t-Butyl nitrite) と反応させ、ジアゾニウム塩を系中で発生させ、続いて、ポリビニルピリジンフッ化水素塩(PVPHP) と反応させて、アミノ基をフッ素に置換して、化合物４を得る。前記化合物３とt-Butyl nitrite との反応における使用量の量比は、１０：１〜２：１（重量比）、好ましくは、５：１〜２：１（重量比）、より好ましくは、３：１〜１：１（重量比）であることが望ましい。また、反応条件は、−２０℃〜１０℃であることが望ましい。
【００２７】
ついで、化合物４から、２−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｏ６−（ｐ−ニトロフェネチル）−２’−デオキシイノシン（図中、化合物５）を合成する。ここで、酢酸及びテトラヒドロフラン(THF) 中、化合物４とテトラブチルアンモニウムフルオライド(TBAF)とを攪拌する。酢酸とTHF と化合物４とTBAFとの量比は、１：１０：１：３〜５：５０：１：１５（重量比）、好ましくは、１：１０：１：３〜２：２０：１：６（重量比）であることが望ましい。ついで、得られた混合物から、溶媒を留去し、得られた産物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相は、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）に供して精製し、粗生成物を得る。得られた粗生成物とジメチルアミノピリジン(DMAP)の無水ピリジン溶液に、ジメトキシトリチルクロライドを添加し、室温で攪拌する。粗生成物とDMAPとジメトキシトリチルクロライドとの量比は、２：０．０１：１〜２：０．５：１（重量比）、好ましくは、２：０．０１：１〜２：０．１：１（重量比）であることが望ましい。得られた混合物から、溶媒を留去し、得られた産物を、酢酸エチルで抽出し、さらに、得られた抽出物を、水及び飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、ついで、無水硫酸マグネシウムで乾燥させる。得られた産物から、溶媒を留去し、濃縮し、濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相は、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）に供して精製し、無色泡状の化合物５を得る。
【００２８】
その後、前記化合物をアセトニトリルで共沸し、得られた産物を、アセトニトリルに溶解する。ついで、得られた産物に、テトラゾール、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイトを添加し、さらに、室温で攪拌する。得られた産物を、酢酸エチルで抽出し、得られた抽出物を、水及び飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。得られた産物から、溶媒を留去して濃縮する。以上の操作により、淡黄色泡状の２−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシイノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（図中、化合物６）が得られる。
【００２９】
ついで、工程（Ｂ）において、前記工程（Ａ）で得られたＤＮＡ中の２−フルオロデオキシイノシン酸残基を、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に変換する。
【００３０】
２−フルオロデオキシイノシン酸残基のＮ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基への置換には、アニリンなどが用いられる。ここで、２−フルオロデオキシイノシン酸残基のＮ2 −フェニルデオキシグアニン残基への置換に際し、アニリンは、大過剰であることが望ましい。２−フルオロデオキシイノシン酸残基のＮ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基への置換の反応条件としては、例えば、反応系に、３Ｍ アニリン−塩酸塩と３Ｍ トリエチルアミンとを含有した水溶液５００μｌを添加し、得られた混合物を６０℃で４０時間インキュベートすることなどが挙げられる。
【００３１】
本発明により、ＤＮＡの酸化耐性能の増強方法も提供される。本発明のＤＮＡの酸化耐性能の増強方法は、ＤＮＡにおけるデオキシグアニル酸残基を、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換することに１つの特徴がある。
【００３２】
本発明のＤＮＡの酸化耐性能の増強方法によれば、ＤＮＡにおけるデオキシグアニル酸残基を、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換するため、得られたＤＮＡに酸化耐性能を付与すること又は向上させることができるという優れた効果を発揮する。
【００３３】
本発明のＤＮＡの酸化耐性能の増強方法は、前記ＤＮＡの製造方法と同様の操作及び条件で実施できる。
【００３４】
なお、本発明によれば、グアニンのＮ2 位にフェニル基が導入されたフェニルグアニン残基により、一電子酸化反応による損傷を防ぐことに基づき、グアニンのＮ2 位にフェニル基が導入されたフェニルグアニン残基を有するプリンリボヌクレオチド残基を構成単位の１つとして含有した、フェニル基を有する核酸塩基アナログが導入されたＲＮＡ、及びＲＮＡにおけるグアニル酸残基をＮ2 −フェニルグアニル酸残基に置換することにより、ＲＮＡの酸化耐性能を増強する方法が提供される。本発明のＲＮＡは、所望の塩基配列中の所望の位置のグアニル酸残基をＮ2 −フェニルグアニル酸に置換することにより得られうる。例えば、所望の塩基配列中の所望の位置に２−フルオロイノシン酸残基が導入されたＲＮＡを合成し、ついで、得られた産物とアニリンとを反応させることにより得られうる。
【００３５】
ここで、ＲＮＡの構成単位としては、具体的には、Ｎ2 −フェニルグアニル酸、グアニル酸残基、アデニル酸残基、シチジル酸残基、チミジル酸残基などが挙げられている。なお、本発明においては、前記「ＲＮＡの構成単位」には、「（フェニル基を有する）核酸塩基アナログ残基を有するリボヌクレオチド」（すなわち、前記Ｎ2 −フェニルグアニル酸）以外の慣用のリボヌクレオチドアナログをも包含する。
【００３６】
また、本発明によれば、グアニンのＮ2 位にフェニル基が導入されたフェニルグアニン残基を有したプリンデオキシリボヌクレオチド誘導体、すなわち、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸などが提供される。前記Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸は、例えば、２−フルオロデオキシイノシン酸とアニリンとの反応により得られうる。
【００３７】
さらに、本発明によれば、グアニンのＮ2 位にフェニル基が導入されたフェニルグアニン残基を有したプリンリボヌクレオチド誘導体、すなわち、Ｎ2 −フェニルグアニル酸などが提供される。前記Ｎ2 −フェニルグアニル酸は、例えば、２−フルオロイノシン酸とアニリンとの反応により得られうる。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。
【００３９】
実施例１ Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基が導入されたＤＮＡの合成
表１に列挙されたＮ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基（ｄPhＧ）が導入されたＤＮＡオリゴマーとその相補鎖とを合成した。なお、以下、本実施例においては、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基（ｄPhＧ）が導入されたＤＮＡオリゴマー及びその相補鎖を、「ｄPhＧ含有ＤＮＡ」と表記する。
【００４０】
【表１】
【００４１】
表１において、PhＧＧ１は、２１マーのＧＧ１中におけるＧ15Ｇ二塩基連鎖のＧ15がｄPhＧに置換されたものである。CNBPＵ１は、前記ＧＧ１に相補的な配列を有するものであり、シアノベンゾフェノン置換ウリジル酸残基（ｄCNBPＵ）を光誘導一電子酸化剤として含むものである。なお、かかるCNBPＵ１は、後述の製造例１に従って、製造される。Ｔ１は、前記CNBPＵ１におけるｄCNBPＵの代わりにチミジンを含むものである。二本鎖ＧＧ１／CNBPＵ１及び二本鎖PhＧＧ１／CNBPＵ１において、グアニンラジカルカチオンは、光励起したｄCNBPＵへの一電子移動によりＧ8 に選択的に生じた部位である。ＧＧ５は、ＧＧ１と同じ隣接配列を有し、かつ５つのＧＧ二塩基連鎖を含むものである。PhＧＧＧ５（８）及びPhＧＧ５（１６）は、ＧＧ５のＧ8 及びＧ16のそれぞれがｄPhＧに置換されたものである。ＧＧ４及びPhＧＧ４（８）は、それぞれ、ＧＧ５のＧ16Ｇ部位及びPhＧＧ５（８）のＧ16Ｇ部位がＴ16Ａに置換されたものである。ｃ−ＧＧ５及びｃ−ＧＧ４は、それぞれ、ＧＧ５及びＧＧ４に対する相補鎖である。
【００４２】
ｄPhＧ含有ＤＮＡを、２−フルオロデオキシイノシン酸残基が導入された対応のＤＮＡから、アニリンによるフッ素の置換により合成した。ｄPhＧ含有ＤＮＡの合成スキームを図１及び図２に示す。
【００４３】
図１は、２−フルオロ−５’−Ｏ（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシイノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（図中、化合物６）の合成スキームを示す。
【００４４】
（１）２−フルオロ−３’−Ｏ，５’−Ｏ−ビス（ターシャリーブチルジメチルシリル）−Ｏ６（ｐ−ニトロフェネチル）−２’−デオキシイノシン[2-fluoro-3'-O,5'-O-bis(tert-butyldimethylsilyl)-O6-(p-nitrophenetyl)-2'-deoxyinosine]（化合物４）の合成
図１において、２−デオキシグアノシン（化合物１）からの化合物４の合成は、例えば、アセド(Acedo, M.) ら、Nucleic Acid Res., 22, 2982-2989 (1994) に従って行なわれうる。
【００４５】
まず、ジメチルホルムアミドを溶媒として、化合物１ 10.0gを、イミダゾール13.7g 存在下に、ターシャリーブチルメチルシリルクロリド(TBDMSCL) 17.4g と37℃12時間反応させ、該化合物１の２つの水酸基をシリル化して、化合物２を得た。ついで、１，４−ジオキサンを溶媒として、前記化合物２ 5.1g と、ジエチルアゾダイカルボキシレート（DEAD）40％トルエン溶液を5.9 mLと、トリフェニルフォスフィン（Ph3P）3.4gと、パラニトロフェニルェタノール(NPE) 2.1gとを、37℃20時間の条件下に反応させ、化合物３を得た。前記化合物３ 1.8g を、トルエン50mL中ターシャリーブチルナイトライト(t-Butyl nitrite) 750 μl とポリビニルピリジンフッ化水素塩(PVPHP) 6.1gを-4℃２時間反応させて、アミノ基をフッ素に置換して、化合物４を得た。
【００４６】
（２）２−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｏ６−（ｐ−ニトロフェネチル）−２’−デオキシイノシン[2-fluoro-5'-O-(4,4'-dimethoxytirityl)-O6-(p-nitorophenetyl)-2'-deoxyinosine] （化合物５）の合成
前記（１）で得られた化合物４ 650.0mg (1.01mmol)と酢酸145 μl (2.53mmol)を含むテトラヒドロフラン(THF) 溶液12mlにテトラブチルアンモニウムフルオライド(TBAF)の1M THF溶液2.5ml (2.50mmol)を添加し、90分間攪拌した。得られた混合物から、溶媒を留去し、得られた産物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相は、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）に供して精製し、2-fluoro-2'-deoxyinosineの粗生成物を得た。
【００４７】
得られた粗生成物とジメチルアミノピリジン(DMAP) 1.3mg(0.01mmol)の無水ピリジン溶液10mlに、ジメトキシトリチルクロライド 375.0mg (1.11mmol) を添加し、室温で４時間攪拌した。得られた混合物から、溶媒を留去し、得られた産物を、酢酸エチルで抽出した。得られた抽出物を、水及び飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、ついで、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。得られた産物から、溶媒を留去し、濃縮した。得られた産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相は、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）に供して精製し、無色泡状の２−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｏ６−（ｐ−ニトロフェネチル）−２’−デオキシイノシン[2-fluoro-5'-O-(4,4'-dimethoxytirityl)-O6-(p-nitorophenetyl)-2'-deoxyinosine] （図１中の化合物５）484.0mg (0.671mmol, ２段階合計収率６７％）を得た。
【００４８】
化合物５の核磁気共鳴スペクトルデータは、 1H NMR(CDCl3, 400MHz) 2.50 (ddd, 1H, J=13.2, 6.4, 4.0 Hz), 2.74 (ddd, 1H, J=13.2, 6.8, 6.4 Hz), 3.28 (t, 2H, J=6.8 Hz), 3.34 (dd, 1H, J=10.2, 5.0 Hz), 3.40 (dd, 1H, J=10.2, 4.6 Hz), 3.72 (m, 1H), 3.74 (s, 6H), 4.64 (m, 1H), 4.80 (t, 2H, J=6.8 Hz), 6.34 (pseudo t, 1H, J=6.6 Hz), 6.74-6.78 (4H), 7.14-7.37 (9H), 7.46 (d, 2H, J=8.8 Hz), 8.02 (s, 1H), 8.14 (d, 2H, J=8.8Hz); FAB-MS m/z 722 [(M+H)+]である。
【００４９】
（３）２−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシイノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）[2-fluoro-5'-0-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyinosine 3'-O-(2-cyanoetyl N,N-diisopropylphosphoramidite)]（化合物６）の合成
前記（２）で得られた化合物５ 111.8mg (0.155mmol)をアセトニトリルで共沸した。得られた産物を、アセトニトリル(1.5ml) に溶解し、得られた溶解物に、テトラゾール 16mg(0.228mmol)、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト 65ml (0.226 mmol)を添加し、室温で１時間攪拌した。得られた産物を、酢酸エチルで抽出した。得られた抽出物を、水及び飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。得られた産物から、溶媒を留去して濃縮し、淡黄色泡状の化合物６（ホスホロアミダイト化合物）を158.5mg 得た。
【００５０】
（４）ｄPhＧ含有ＤＮＡの合成
図２に示すように、ｄPhＧ含有ＤＮＡの合成は、まず、２−フルオロデオキシイノシンが導入されたＤＮＡを得、ついで、ポストモデイフイヶーションにより、前記２−フルオロデオキシイノシンが導入されたＤＮＡ中の２−フルオロデオキシイノシンを、ｄPhＧに変換することによって行なった。
【００５１】
前記２−フルオロデオキシイノシンを含むＤＮＡの合成は、前記化合物６（ホスホロアミダイト化合物）を用いた標準的な固相合成法により行なった。
【００５２】
支持体を保持したまま、合成したＤＮＡを取り出した。ついで、前記ＤＮＡをそのまま、0.5M DBU（１，８−ジアザビシクロウンデセン）のアセトニトリル溶液で、室温で２０分間処理して、６位のｐ−ニトロフェニル基を脱離させた。得られた産物を、１％ トリエチルアミンのアセトニトリル溶液及びアセトニトリルで洗浄し、さらに、3Mアニリンで、60℃、40時間処理して、２位へのフェニル基の導入、脱保護及び支持体からの切り出しを同時に行なった。得られた産物を、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に供して、精製し、ｄPhＧ含有ＤＮＡを得た。
【００５３】
製造例１ シアノベンゾフェノン置換ウリジンが導入されたＤＮＡの合成
図３及び図４に示す合成スキームに従って、ｍ−ブロモ安息香酸（化合物２）から、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄCNBPＵ １とそのホスホロアミダイト誘導体（化合物１４）とを合成した。
【００５４】
（１）３’−ブロモ−４−メトキシベンゾフェノン（化合物８）の合成
ベンゼン（３５ｍｌ）中化合物７（１０．４ｇ、５１．８ｍｍｏｌ）の懸濁物に、塩化オキサリル（７．０ｍｌ、８０．２ｍｍｏｌ）と、触媒としてＤＭＦとを添加し、得られた混合物を室温で３時間攪拌した。得られた産物を真空下、蒸発乾固させ、得られた残渣をＣＳ2 （４０ｍｌ）に溶解させた。ついで、得られた溶液に、アニソール（１１．３ｍｌ、１０４ｍｍｏｌ）と三塩化アルミニウム無水物（１０．９ｇ、８２．１ｍｍｏｌ）とを添加し、得られた混合物を室温で３時間攪拌した。得られた産物を、クラッシュアイス（４５ｇ）上、濃塩酸（１０ｍｌ）に注ぎ、３０分間攪拌した。得られた粗生成物をヘキサンと酢酸エチルで再結晶化し、化合物８を得た（１２．０ｇ、収率８０％）。
【００５５】
（２）３’−ブロモ−４−ヒドロキシベンゾフェノン（化合物９）の合成
ベンゼン（４５ｍｌ）中化合物８（１０．１ｇ，３４．７ｍｍｏｌ）の溶液に三塩化アルミニウム（１１．６ｇ，８６．７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を還流下２時間攪拌した。得られた産物をクラッシュアイス（４０ｇ）上、濃塩酸（５ｍｌ）に注ぎ、３０分間攪拌した。得られた粗生成物をヘキサンと酢酸エチルとで再結晶化し、化合物９を得た（６．８１ｇ，収率７２％）。
【００５６】
（３）３’−トリメチルシリルエチニル−４−ヒドロキシベンゾフェノン（化合物１０）の合成
トリエチルアミン（２０ｍｌ）中化合物９（１．５１ｇ，５．４１ｍｍｏｌ）と酢酸パラジウム（II）（３１．７ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（１０３ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ）との混合物にエチニルトリメチルシラン（１．５０ｍｌ，１０．６ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を窒素還流下５時間攪拌し、得られた産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相として、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝８：１を使用）に供して、化合物１０を得た（１．２８ｇ，８０％）。
【００５７】
（４）４−（３’−トリメチルシリルエチニルベンゾイル）フェニル トリフルオロメタンスルフォネート（化合物１１）の合成
化合物１０（１．０４ｇ，３．５２ｍｍｏｌ）のピリジン（１５ｍｌ）溶液に、穏やかにトリフルオロメタンスルホン酸無水物（０．６８ｍｌ，４．０４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を０℃で５分間攪拌し、室温まで温め、さらに、２時間攪拌し、得られた産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相として、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２０：１を使用）に供して、化合物１１を得た（１．４２ｇ，９４％）。
【００５８】
（５）４−（３−トリメチルシリルエチニルベンゾイル）ベンゾニトリル（化合物１２）の合成
ベンゼン（１２ｍｌ）中化合物１１（５３７ｍｇ，１．２６ｍｍｏｌ）とシアン化カリウム（９８．６ｍｇ，１．５１ｍｍｏｌ）と１８−クラウン−６（１３２ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）との混合物に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（２９０ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を窒素還流下２時間攪拌し、得られた産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相として、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２０：１を使用）に供して、化合物１２を得た（１５２ｍｇ，４０％）。
【００５９】
（６）４−（３−エチニルベンゾイル）ベンゾニトリル（化合物１３）の合成
ＴＨＦ（１０ｍｌ）中化合物７（７３０ｍｇ，２．４０ｍｍｏｌ）に酢酸（０．２ｍｌ，３．５ｍｍｏｌ）とフッ化テトラブチルアンモニウム（３．６０ｍｌの１．０Ｍ フッ化テトラブチルアンモニウムのＴＨＦ溶液，３．６ｍｍｏｌ）とを添加し、得られた混合物を室温で２時間攪拌し、得られた産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相として、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１５：１を使用）に供して、化合物１３を得た（５１３ｍｇ，９２％）。
【００６０】
（７）５−〔３−（４−シアノベンゾイル）フェニルエチニル〕−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（化合物１５）の合成
１０ｍｌの脱気ＤＭＦ中化合物１３（２７５ｍｇ，１．１９ｍｍｏｌ）と２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−ヨードウリジン（化合物１４）とトリエチルアミン（０．２８ｍｌ，２．０ｍｍｏｌ）との溶液に、窒素雰囲気下、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１２１ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）とヨウ化銅（１８９ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で５時間攪拌し、得られた産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相として、クロロホルム：メタノール＝１００：１を使用）に供して、淡黄色泡状の化合物１５を得た（７２０ｍｇ，９３％）。 1H NMR(CDCl3, 400MHz)δ2.33(m, 1H), 2.53(m, 1H), 3.31(m, 1H), 3.42(m, 1H), 3.66(s, 3H), 3.67(s, 3H), 4.09(m, 1H), 4.57(m, 1H), 6.34(m, 1H), 6.72-6.76 (4H), 7.07-7.42 (12H), 7.65-7.77 (5H), 8.26(s, 1H); 13C NMR (CDCl3, 100MHz)δ40.4, 54.9, 63.4, 70.4, 79.1, 83.1, 85.2, 85.9, 86.1, 90.7, 98.0, 113.1, 113.2, 114.7, 118.0, 122.6, 126.6, 127.5, 127.8, 129.1, 129.3, 129.4, 129.5, 129.7, 129.9, 131.7, 135.2, 135.5, 136.3, 140.4, 143.1, 144.5, 149.2, 158.0, 158.0, 161.3, 194.0; FAB-MS m/z 760 [(M+H) + ] ；HRMS C46H38O8N3 [(M+H)+ ] 計算値760.2660, 測定値760.2660。
【００６１】
（８）５−〔３−（４−シアノベンゾイル）フェニルエチニル〕−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソ−プロピルホスホロアミダイト）（化合物１６）の合成
無水アセトニトリル（２ｍｌ）中化合物１５（２４１ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．１３ｍｌ，０．４５ｍｍｏｌ）とテトラゾール（０．９３ｍｌの０．５Ｍ テトラゾールＣＨ3 ＣＮ溶液，０．４７ｍｍｏｌ）とを添加した。得られた混合物を室温で１．５時間攪拌した。得られた混合物を酢酸エチルで希釈し、水及び塩水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ4 で乾燥した。その後、溶媒を除去することにより、２つのジアステレオマーの混合物として、化合物１４を得た（２９２ｍｇ，収率９６％）。前記化合物１６を、精製せずに、自動化ＤＮＡ合成に用いた。ホスホロアミダイトの形成について、31P NMR により確認した。31P NMR (C6D6, 162MHz)δ149.5, 149.1。
【００６２】
（９）オリゴマー合成
アプライド・バイオシステム ３９２ ＤＮＡシンセサイザーを用い、標準のβ−（シアノエチル）ホスホロアミダイト法により自動化ＤＮＡ合成を行なった。化合物１６のカップリングに際し、カップリング時間を１５分間としてことを除き、通常条件にて行なった。濃アンモニアで３７℃で３時間の処理により、合成オリゴマーを脱保護し、固相から取り除いた。オリゴマーの精製は、ＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ ５−ＯＤＳ−Ｈ ＨＰＬＣカラム（１０×１５０ｍｍ）上、１００ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸（ＴＥＡＡ）中５−２５％アセトニトリル、２０分間のリニアグラジェントで行なった。
【００６３】
実施例２ ｄPhＧ及びｄPhＧ含有ＤＮＡの評価
０．１Ｍ ＬｉＣｌＯ4 を含むＤＭＦ中において、サイクリックボルタンメトリーにより、ｄPhＧの酸化電位を測定した。その結果、ｄPhＧの酸化電位は、０．７０Ｖ（Ａｇ／Ａｇ+ 比，なお、Ｇは０．６７Ｖである）であった。
【００６４】
また、５０μＭ 塩基濃度、１００ｍＭ ＮａＣｌ下において、１０マーのｄPhＧ含有ＤＮＡ（二本鎖）であるd(GATAGTPhGGAC)[配列番号：１２]/d(GTCCACTATC)[配列番号：１３] の融解温度（Ｔｍ値）を、260nm の吸光度の温度変化により求めた。その結果、前記ｄPhＧ含有ＤＮＡのＴｍ値は、対応するＧ含有ＤＮＡ（二本鎖）よりも３．７℃高かった。
【００６５】
また、前記ｄPhＧ含有ＤＮＡの円二色性（ＣＤ）スペクトルを調べた。その結果を図５に示す。
【００６６】
図５に示すＣＤスペクトルの結果より、前記ｄPhＧ含有ＤＮＡは、典型的なＢ型構造を有することがわかる。
【００６７】
実施例３ ｄPhＧ含有ＤＮＡの評価
（１）内部酸化剤含有ＤＮＡを用いた酸化反応
二本鎖ＤＮＡ CNBPＵ１／ＧＧ１及びｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ CNBPＵ１／PhＧＧ１のそれぞれに対して、３１２ｎｍで０℃、６０分間、光照射した。得られた各産物を、Neatピペリジン200 μl と共に、９０℃２０分間インキュベートした。得られた各産物を、それぞれ、変性１５％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで電気泳動した。 各レーンでゲルにサプライする前にシンチレーションカウンターで同じカウント数になるように揃えた。各レーン間の比較のため、バンド強度はデンシトメトリーで定量した。結果を図６のパネルａ）に示す。なお、図６中、ｄCNBPＵは、四角で囲んで示されたＡの逆側に位置する。図６のパネルａ）において、レーン１は、ＧＧ１のマキサム−ギルバートＡ＋Ｇシークエンス反応の結果を示し、レーン２は、二本鎖ＤＮＡ CNBPＵ１／ＧＧ１の結果を示し、レーン３は、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ CNBPＵ１／PhＧＧ１の結果を示す。また、各レーンの最上部のバンドは、未切断の全長ＧＧ１に対応する。
【００６８】
図６のパネルａ）のレーン２に示すように、二本鎖ＤＮＡ CNBPＵ１／ＧＧ１への光照射及びピペリジン処理により、Ｇ15Ｇ二塩基連鎖の５’末端側のＧの酸化を介した切断を示す強いバンドの生成が観察される。顕著に対照的に、パネルａ）のレーン３に示すように、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ PhＧＧ１／CNBPＵ１におけるPhＧ15の酸化を介した切断を示すバンドは、レーン２の二本鎖ＤＮＡ ＧＧ１／CNBPＵ１におけるＧ15の酸化を介した切断を示すバンドよりも顕著に弱いことがわかる。
【００６９】
また、未切断の完全長ＧＧ１に対するＧ15の酸化を介した切断を示すバンドの相対バンド強度は、０．３１であり、PhＧＧ１のPhＧ15の酸化を介した切断を示すバンドの相対バンド強度は、わずか０．０５であった。
【００７０】
以上の結果より、内部酸化剤を含有した二本鎖ＤＮＡにおいて、ｄPhＧは、酸化反応を介した切断を抑制することがわかる。
【００７１】
（２）一電子酸化剤リボフラビンを用いたｄPhＧにおける酸化反応
リボフラビンの存在下、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ Ｔ１／PhＧＧ１及び二本鎖ＤＮＡ Ｔ１／ＧＧ１のそれぞれに対して、３６６ｎｍで０℃、60分間光照射した。得られた各産物を、ピペリジン200 μl と共に、９０℃２０分間インキュベートした。得られた各産物を、それぞれ、変性１５％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで電気泳動した。結果を、図６のパネルｂ）に示す。図６のパネルｂ）において、レーン１は、二本鎖ＤＮＡ Ｔ１／ＧＧ１の結果を示し、レーン２は、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ Ｔ１／PhＧＧ１の結果を示し、レーン３は、ＧＧ１のマキサム−ギルバートＡ＋Ｇシークエンス反応の結果を示す。また、各レーンの最上部のバンドは、未切断の全長ＧＧ１に対応する。
【００７２】
図６のパネルｂ）のレーン１に示すように、二本鎖ＤＮＡ ＧＧ１／Ｔ１におけるＧ15の酸化を介した切断を示す強いバンドの生成が観察されたが、レーン２に示すように、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ Ｔ１／PhＧＧ１におけるPhＧ15の酸化を介した切断を示すバンドは、かすかなバンドであった。
【００７３】
以上の結果より、二本鎖ＤＮＡにおいて、ｄPhＧは、リボフラビンの存在下の酸化反応を介した切断を抑制することがわかる。
【００７４】
（３）切断部位の確認
リボフラビンの存在下、一本鎖ｄPhＧ含有オリゴマーd(ATTTATAGTAGTAGTAPhGTATTT)[配列番号：１４] に対して、３６６ｎｍで０℃、60分間光照射した。得られた産物を、ピペリジン200 μl と共に、９０℃２０分間インキュベートした。
【００７５】
ついで、得られた各産物を、それぞれ、変性１５％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで電気泳動した。その結果を図７に示す。
【００７６】
図７に示すように、リボフラビン存在下での光照射及び続くピペリジン処理により、鎖切断が、ｄPhＧで実際に生じることが確認された。
【００７７】
（４）ｄPhＧ含有ＤＮＡの酸化耐性の評価
ｄPhＧ含有ＤＮＡについて、酸化耐性を調べた。
【００７８】
リボフラビン200 μM の存在下、ｄPhＧ含有ＤＮＡ 50 μM strand濃度に対して、３６６ｎｍで０℃、６０分間光照射した。得られた産物を、alkaline phosphatase (33Ｕ／μｌ) 、ヘビ毒リン酸ジエステラーゼ (0.1 Ｕ／μｌ) とP1 nuclease (33 Ｕ／μｌ) を加え、０℃で12時間反応させた。
【００７９】
ついで、得られた産物を、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供した。移動相は、0.1M TEAA pH7.0-アセトニトリルであり、流速は、3.0 ml/minである。結果を図８に示す。
【００８０】
図８に示すように、二本鎖で６８％のｄPhＧが、無傷のままであり、一本鎖で３６％のｄPhＧが、無傷のままであることがわかった。
【００８１】
また、複数個のＧＧ二塩基連鎖を有するｄPhＧ含有ＤＮＡについて、酸化耐性を調べた。
【００８２】
リボフラビンの存在下、複数個のＧＧ二塩基連鎖を有するＤＮＡ〔ＧＧ５／ｃ−ＧＧ５、PhＧＧ５（８）／ｃ−ＧＧ５、PhＧＧ５（１６）／ｃ−ＧＧ５、PhＧＧ５（１６）／ｃ−ＧＧ５、PhＧＧ４（１６）／ｃ−ＧＧ４及びＧＧ４／ｃ−ＧＧ４〕のそれぞれに対して、３６６ｎｍで０℃、６０分間光照射した。得られた各産物を、ピペリジン200 μｌと共に、９０℃２０分間インキュベートした。得られた各産物を、それぞれ、変性１５％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで電気泳動した。結果を、図９に示す。図９中、レーン１は、ＧＧ５のマキサム−ギルバートＡ＋Ｇシークエンス反応の結果を示し、レーン２は、二本鎖ＤＮＡ ＧＧ５／ｃ−ＧＧ５の結果を示し、レーン３は、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ PhＧＧ５（１６）／ｃ−ＧＧ５の結果を示し、レーン４は、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ PhＧＧ５（８）／ｃ−ＧＧ５の結果を示し、レーン４は、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ PhＧＧ５（１６）／ｃ−ＧＧ５の結果を示し、レーン５は、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ PhＧＧ４（１６）／ｃ−ＧＧ４の結果を示し、レーン６は、二本鎖ＤＮＡ ＧＧ４／ｃ−ＧＧ４の結果を示し、レーン７は、ＧＧ４のマキサム−ギルバートＡ＋Ｇシークエンス反応の結果を示す。
【００８３】
図９に示されるように、ｄPhＧ含有二本鎖の酸化分解は、ｄPhＧだけでなく、ｄPhＧから離れたＧＧ部位でも顕著に抑制されることがわかる。リボフラビン存在下での光照射されたＧＧ５の鎖切断は、同等の効率で全ＧＧ部位で生じたが、PhＧＧ５（８）のＧＧ部位の切断は、PhＧ8 Ｇに加え、Ｇ12Ｇ及びＧ16Ｇで抑制された。
【００８４】
また、Ｇ12Ｇと対照的に、Ｇ24Ｇでの切断は、ＧＧ５における切断に比べて弱くしか抑制されず、鎖切断の抑制の効率は、ｄPhＧからの距離が増えるにつれて減少することを示す。切断抑制の距離依存性は、５つのＧＧ部位の中央にｄPhＧを含むPhＧＧ５（１６）の酸化反応で明らかに示された。PhＧＧ部位に加え、全４つのＧＧ部位で切断の効率は、顕著に減少した。
【００８５】
ｄPhＧによる切断抑制の機構における顕著な見識が、ＧＧ４及びPhＧＧ４（８）のリボフラビン感受性酸化により得られた。ＧＧ４の鎖切断は、全４つのＧＧ部位で観察され、PhＧＧ４（８）の切断は、Ｇ8 Ｇ部位及びＧ12Ｇ部位で強く抑制されるが、Ｇ20Ｇ部位及びＧ24Ｇ部位では全く抑制されなかった。
【００８６】
PhＧＧ４（８）／ｃ−ＧＧ４におけるＧ12Ｇ部位及びＧ20Ｇ部位は、６つの介在ＡＴ塩基対で分離されており、２つの部位間のホール移動速度は、Ｇ8 とＧ12との間のホール移動速度（例えば、Ｇ.+ＴＴＧからＧＴＴＧ.+に関して２．５×１０6 ｓ-1）及びＧ部位における水でのホールトラッピングの推測速度（例えば、６×１０4 ｓ-1）よりも極めて小さいことが予想された。したがって、ｄPhＧ含有二本鎖における任意のＧ部位における酸化分解の抑制の効率は、ｄPhＧへのホール移動の速度の増加に伴い増加したことが明らかである。
【００８７】
以上の結果より、
１）ｄＧの環外アミノ基の置換が、一電子酸化反応に対するｄＧの化学的性質を調節するのに有効であること、
２）グアニンラジカルカチオンの分解が、ｄPhＧ付近で効率よく抑制されることが示された。これらの結果から、ｄPhＧが、一電子酸化反応に対する二本鎖ＤＮＡの内部抗酸化剤として用いることができることが示唆される。また、ＤＮＡへのかかるｄPhＧの多数の取り込みは、好気性条件でのＤＮＡ、特に高ＧＣ含量のＤＮＡの化学的不安定性を補うことが期待される。
【００８８】
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、合成ＤＮＡの配列である。
【００８９】
配列番号：２は、合成ＤＮＡの配列であり、該配列中、１５位のｎは、Ｎ2 −フェニルデオキシグアノシンである。
【００９０】
配列番号：３は、合成ＤＮＡの配列である。
【００９１】
配列番号：４は、合成ＤＮＡの配列であり、該配列中、７位のｎは、Ｎ2 −シアノベンゾフェノン置換デオキシウリジンである。
【００９２】
配列番号：５は、合成ＤＮＡの配列である。
【００９３】
配列番号：６は、合成ＤＮＡの配列であり、該配列中、８位のｎは、Ｎ2 −フェニルデオキシグアノシンである。
【００９４】
配列番号：７は、合成ＤＮＡの配列であり、該配列中、１６位のｎは、Ｎ2 −フェニルデオキシグアノシンである。
【００９５】
配列番号：８は、合成ＤＮＡの配列である。
【００９６】
配列番号：９は、合成ＤＮＡの配列である。
【００９７】
配列番号：１０は、合成ＤＮＡの配列であり、該配列中、８位のｎは、Ｎ2 −フェニルデオキシグアノシンである。
【００９８】
配列番号：１１は、合成ＤＮＡの配列である。
【００９９】
配列番号：１２は、合成ＤＮＡの配列であり、該配列中、７位のｎは、Ｎ2 −フェニルデオキシグアノシンである。
【０１００】
配列番号：１３は、合成ＤＮＡの配列である。
【０１０１】
配列番号：１４は、合成ＤＮＡの配列であり、該配列中、１７位のｎは、Ｎ2 −フェニルデオキシグアノシンである。
【０１０２】
【発明の効果】
本発明の核酸によれば、一電子酸化反応を介した酸化損傷（切断）及び該酸化損傷の伝搬を抑制し、一電子酸化反応を介した酸化に対して耐性であるため、安定性、特に、酸化条件下での安定性に優れた核酸材料を提供することが可能になるという優れた効果を奏する。また、本発明のＤＮＡの製造方法によれば、酸化耐性能を有するＤＮＡを簡便かつ効率よく製造することができ、従来、核酸の化学合成に用いられている方法及び装置をそのまま適用することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の核酸の酸化耐性能の増強方法によれば、所望の塩基配列を有する核酸の酸化耐性能を向上させることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のプリンヌクレオチド誘導体によれば、一電子酸化反応を介した核酸の酸化損傷（切断）及び核酸全体への該酸化損傷の伝搬を抑制すること、一電子酸化反応を介した酸化に対する耐性を核酸に付与することを可能にするという優れた効果を奏する。
【０１０３】
【配列表】
【０１０４】
【０１０５】
【０１０６】
【０１０７】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【０１１１】
【０１１２】
【０１１３】
【０１１４】
【０１１５】
【０１１６】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、２−フルオロ−５’−Ｏ（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシイノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（図中、化合物６）の合成スキームを示す。
【図２】図２は、ｄPhＧ含有ＤＮＡの合成スキームの一例を示す。なお、配列は、任意である。
【図３】図３は、４−（３−エチニルベンゾイル）ベンゾニトリル（図中、化合物１３）の合成スキームを示す。
【図４】図４は、ｄCNBPＵ含有ＤＮＡの合成スキームを示す。
【図５】図５は、ｄPhＧ含有ＤＮＡの円二色性（ＣＤ）スペクトルの結果を示す。
【図６】図６は、酸化反応に曝露したｄPhＧ含有ＤＮＡを電気泳動した変性シークエンスゲルのオートラジオグラムを示す。塩基配列をオートラジオグラムの横に示す。ｄCNBPＵは、四角で囲んで示されたＡの逆側に位置する。パネルａ）は、３１２ｎｍ６０分の光照射した二本鎖の結果を示す。パネルａ）において、レーン１は、ＧＧ１のマキサム−ギルバートＡ＋Ｇシークエンス反応の結果を示し、レーン２は、二本鎖ＤＮＡ CNBPＵ１／ＧＧ１の結果を示し、レーン３は、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ CNBPＵ１／PhＧＧ１の結果を示す。また、各レーンの最上部のバンドは、未切断の全長ＧＧ１に対応する。パネルｂ）において、レーン１は、二本鎖ＤＮＡ Ｔ１／ＧＧ１の結果を示し、レーン２は、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ Ｔ１／PhＧＧ１の結果を示し、レーン３は、ＧＧ１のマキサム−ギルバートＡ＋Ｇシークエンス反応の結果を示す。また、各レーンの最上部のバンドは、未切断の全長ＧＧ１に対応する。
【図７】図７は、リボフラビン存在下での光照射及び続くピペリジン処理による鎖切断の部位を調べた結果を示す。
【図８】図８は、リボフラビン存在下での光照射及び続くピペリジン処理に供したｄPhＧ含有ＤＮＡをＨＰＬＣにより解析した結果を示す。
【図９】図９は、酸化反応に曝露したｄPhＧ含有ＤＮＡを電気泳動した変性シークエンスゲルのオートラジオグラムを示す。塩基配列をオートラジオグラムの横に示す。図中、レーン１は、ＧＧ５のＡ＋Ｇ反応の結果を示し、レーン２は、ＧＧ５／ｃ−ＧＧ５の結果を示し、レーン３は、PhＧＧ５（８）／ｃ−ＧＧ５の結果を示し、レーン４は、PhＧＧ５（１６）／ｃ−ＧＧ５の結果を示し、レーン４は、PhＧＧ５（１６）／ｃ−ＧＧ５の結果を示し、レーン５は、PhＧＧ４（１６）／ｃ−ＧＧ４の結果を示し、レーン６は、ＧＧ４／ｃ−ＧＧ４の結果を示し、レーン７は、ＧＧ４のＡ＋Ｇ反応の結果を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸塩基アナログ、該核酸塩基アナログが導入された核酸、例えば、ＤＮＡ及び核酸、例えば、ＤＮＡの酸化耐性能の増強方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、フェニル基を有する核酸塩基アナログが導入されたＤＮＡ、該ＤＮＡの製造方法、ＤＮＡの酸化耐性能の増強方法及びフェニル基を有する核酸塩基に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡは、ヌクレオチド塩基対のπ電子がスタックした構造からなるものであり、電荷移動の媒体として認識され、実際に、実験理論的研究により、ある距離の電荷移動を媒介することが知られている。ＤＮＡの一電子酸化反応により生じたグアニンラジカルカチオン（ホール）は、近傍のＧ（デオキシグアニル酸残基）間の連続的なホッピングにより、離れたＧ部位に移動しうる。すなわち、ＤＮＡの酸化損傷は、グアニン塩基（デオキシグアニル酸残基）で生じ、離れた場所のグアニン塩基（デオキシグアニル酸残基）に伝搬する。
【０００３】
前記ＤＮＡは、例えば、疾患の遺伝子診断、個体の同定等の診断分野又は研究分野において、ＤＮＡチップ等として利用されている。
【０００４】
しかしながら、前記ＤＮＡを、ＤＮＡチップ等に用いる場合、前記一電子酸化反応を介したＤＮＡの酸化損傷（例えば、切断等）及びＤＮＡ全体への該酸化損傷の伝搬により、診断の精度、装置の耐久性が低下する場合があるという欠点がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、一電子酸化反応を介した酸化損傷及び該酸化損傷の伝搬を抑制し、一電子酸化反応を介した酸化に対して耐性である、フェニル基を有する核酸塩基アナログが導入された核酸、例えば、ＤＮＡなどを提供することを目的とする。また、本発明は、前記核酸、例えば、ＤＮＡを簡便かつ効率よく製造することができる、酸化耐性能を有するＤＮＡの製造方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、所望の塩基配列を有する核酸の酸化耐性能を向上させることができる、核酸の酸化耐性能の増強方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、一電子酸化反応を介した核酸の酸化損傷及び核酸全体への該酸化損傷の伝搬を抑制すること、一電子酸化反応を介した酸化に対する耐性を核酸に付与することを可能にするプリンヌクレオチド誘導体を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 ＤＮＡにおけるデオキシグアニル酸残基（Ｇ）を、Ｎ 2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換することを特徴とする、ＤＮＡの酸化耐性能の増強方法、
〔２〕 塩基配列中のＧ n （Ｇ n は、デオキシグアニル酸残基の連続配列を示し、ｎは、２以上の整数を示す）から１０塩基長未満の位置に存在するＧを、Ｎ 2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換する、前記〔１〕記載の増強方法、並びに
〔３〕 塩基配列中のＧ n （Ｇ n は、デオキシグアニル酸残基の連続配列を示し、ｎは、２以上の整数を示す）中のＧを、Ｎ 2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換する、前記〔１〕又は〔２〕記載の増強方法、
に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡは、フェニル基を有する核酸塩基アナログが導入されたＤＮＡであり、グアニンのＮ2 位にフェニル基が導入されたフェニルグアニン残基を有するプリンデオキシリボヌクレオチド残基を構成単位の１つとして含有したＤＮＡである。
【００１０】
なお、本明細書において、「核酸塩基」とは、核酸の構成単位であるデオキシリボヌクレオチド残基を構成する塩基を意味する。
【００１１】
また、「残基」とは、特定の化合物から誘導される官能基を意味し、例えば、フェニルグアニン残基とは、フェニルグアニル基を意味し、グアニン残基とは、グアニル基を意味する。
【００１２】
さらに、本明細書において、「フェニル基を有する核酸塩基アナログ」とは、フェニルグアニンなどをいう。
【００１３】
また、前記「フェニルグアニン残基を有するプリンデオキシリボヌクレオチド」としては、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸が挙げられる。
【００１４】
ＤＮＡの構成単位としては、具体的には、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基、デオキシグアニル酸残基、デオキシアデニル酸残基、デオキシシチジル酸残基、デオキシチミジル酸残基などが挙げられている。なお、本発明においては、前記「ＤＮＡの構成単位」には、前記「（フェニル基を有する）核酸塩基アナログ残基を有するデオキシリボヌクレオチド」以外の慣用のデオキシリボヌクレオチドアナログをも包含する。
【００１５】
本発明のＤＮＡは、フェニル基を有する核酸塩基、特に、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基を構成単位として含有するため、デオキシグアニル酸残基を構成単位として含有するＤＮＡよりも、一電子酸化反応を介した酸化損傷（切断）及び該酸化損傷の伝搬が抑制され、一電子酸化反応を介した酸化に対して耐性であるという優れた性質を発現する。したがって、本発明のＤＮＡにより、安定性、特に、酸化条件下での安定性に優れた核酸材料を提供することが可能になる。
【００１６】
本発明のＤＮＡは、所望の塩基配列中の所望の位置のＧが、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換された核酸であればよく、具体的には、塩基配列中のＧ（デオキシグアニル酸残基）の代わりに、下記式（Ｉ）：
【００１７】
【化３】
で表わされる基（Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基）を構成単位として含有するＤＮＡが挙げられる。
【００１９】
本発明のＤＮＡにおいて、塩基配列におけるＮ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基への置換の数は、ＤＮＡのＧＣ含量及び配列により適宜設定されうるが、例えば、少なくとも１個、具体的には、１個若しくは数個又はそれ以上が挙げられる。また、ＤＮＡの塩基配列中の全てのＧが、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換されていてもよい。
【００２０】
また、本発明のＤＮＡにおいて、塩基配列におけるＮ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基の導入部位は、特に限定されないが、例えば、一電子酸化反応を介した酸化損傷の伝搬を抑制する観点から、塩基配列中のＧn 中のＧ、該塩基配列中のＧＧ塩基連鎖から、好ましくは、１０塩基長未満、より好ましくは、６塩基長以下、さらに好ましくは、４塩基長以下の位置等が挙げられる。なお、前記「Ｇn 」は、デオキシグアニル酸残基の連続配列を示し、ｎは、少なくとも２の整数、具体的には、２以上の整数を示す。
【００２１】
本発明のＤＮＡは、ＤＮＡにおけるデオキシグアニル酸残基を、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換することにより得ることができる。かかるＤＮＡの製造方法も本発明に包含される。
【００２２】
本発明のＤＮＡの製造方法は、ＤＮＡにおけるデオキシグアニル酸残基を、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換することを１つの特徴とする。具体的には、本発明のＤＮＡの製造方法は、（Ａ）ＤＮＡの化学合成に際し、塩基配列中におけるＮ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基の導入対象位置に対応して、デオキシグアニル酸誘導体の代わりに２−フルオロデオキシイノシン酸誘導体を導入して、２−フルオロデオキシイノシン酸残基を有するＤＮＡを合成する工程、及び
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られたＤＮＡ中の２−フルオロデオキシイノシン酸残基を、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に変換する工程、
を含む方法等が挙げられる。本発明のＤＮＡの製造方法によれば、ＤＮＡにおけるデオキシグアニル酸残基を、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換するため、本発明のＤＮＡを簡便かつ効率よく製造することができ、従来、核酸の化学合成に用いられている方法及び装置をそのまま適用することができる。
【００２３】
前記工程（Ａ）において、２−フルオロデオキシイノシン酸残基を有するＤＮＡの合成は、慣用のホスホロアミダイト(phosphoramidite)法、ホスホトリエステル(phosphotriester) 法等に従って行なわれる。ここで、所望の塩基配列中の所望のＧの位置に、２−フルオロデオキシイノシン酸残基が導入されたＤＮＡが得られる。
【００２４】
前記工程（Ａ）において、慣用のホスホロアミダイト(phosphoramidite)法によりＤＮＡを合成する場合、２−フルオロデオキシイノシン酸誘導体とは、２−フルオロ−５’−Ｏ（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシイノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイトをいう。
【００２５】
前記２−フルオロ−５’−Ｏ（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシイノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイトは、図１に示される合成スキームに従って合成されうる。
【００２６】
図１に示される合成スキームにおいて、まず、例えば、アセド(Acedo, M.) ら、Nucleic Acid Res., 22, 2982-2989 (1994) に従って、２−デオキシグアノシン（図１中、化合物１）を出発物質として、２−フルオロ−３’−Ｏ，５’−Ｏ−ビス（ターシャリーブチルジメチルシリル）−Ｏ６（ｐ−ニトロフェネチル）−２’−デオキシイノシン（図１中、化合物４）を合成する。ここで、ジメチルホルムアミドを溶媒として、イミダゾール存在下に、化合物１と、ターシャリーブチルメチルシリルクロリド(TBDMSCL) とを反応させ、該化合物１の２つの水酸基をシリル化して、化合物２を得る。化合物１とTBDMSCL との反応における使用量の量比は、１〜５（重量比）、好ましくは、１〜３（重量比）、より好ましくは、１〜１．８（重量比）であることが望ましい。また、反応条件としては、例えば、室温で２４時間などが挙げられる。ついで、１，４−ジオキサンを溶媒として、前記化合物２と、ジエチルアゾダイカルボキシレート（DEAD）と、トリフェニルフォスフィン（Ph3P）と、パラニトロフェニルェタノール(NPE) とを反応させ、化合物３を得る。前記化合物２と、DEADと、Ph3Pと、NPE との反応における使用量の量比は、１：０．５：０．５：０．５〜１：５：５：５（重量比）、好ましくは、１：０．５：０．５：０．５〜１：３：３：３（重量比）、より好ましくは、１：０．５：０．５：０．５〜１：１：１：１（重量比）であることが望ましい。また、反応条件は、−１０℃〜５０℃であることが望ましい。その後、得られた化合物３を、トルエン中ターシャリーブチルナイトライト(t-Butyl nitrite) と反応させ、ジアゾニウム塩を系中で発生させ、続いて、ポリビニルピリジンフッ化水素塩(PVPHP) と反応させて、アミノ基をフッ素に置換して、化合物４を得る。前記化合物３とt-Butyl nitrite との反応における使用量の量比は、１０：１〜２：１（重量比）、好ましくは、５：１〜２：１（重量比）、より好ましくは、３：１〜１：１（重量比）であることが望ましい。また、反応条件は、−２０℃〜１０℃であることが望ましい。
【００２７】
ついで、化合物４から、２−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｏ６−（ｐ−ニトロフェネチル）−２’−デオキシイノシン（図中、化合物５）を合成する。ここで、酢酸及びテトラヒドロフラン(THF) 中、化合物４とテトラブチルアンモニウムフルオライド(TBAF)とを攪拌する。酢酸とTHF と化合物４とTBAFとの量比は、１：１０：１：３〜５：５０：１：１５（重量比）、好ましくは、１：１０：１：３〜２：２０：１：６（重量比）であることが望ましい。ついで、得られた混合物から、溶媒を留去し、得られた産物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相は、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）に供して精製し、粗生成物を得る。得られた粗生成物とジメチルアミノピリジン(DMAP)の無水ピリジン溶液に、ジメトキシトリチルクロライドを添加し、室温で攪拌する。粗生成物とDMAPとジメトキシトリチルクロライドとの量比は、２：０．０１：１〜２：０．５：１（重量比）、好ましくは、２：０．０１：１〜２：０．１：１（重量比）であることが望ましい。得られた混合物から、溶媒を留去し、得られた産物を、酢酸エチルで抽出し、さらに、得られた抽出物を、水及び飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、ついで、無水硫酸マグネシウムで乾燥させる。得られた産物から、溶媒を留去し、濃縮し、濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相は、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）に供して精製し、無色泡状の化合物５を得る。
【００２８】
その後、前記化合物をアセトニトリルで共沸し、得られた産物を、アセトニトリルに溶解する。ついで、得られた産物に、テトラゾール、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイトを添加し、さらに、室温で攪拌する。得られた産物を、酢酸エチルで抽出し、得られた抽出物を、水及び飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。得られた産物から、溶媒を留去して濃縮する。以上の操作により、淡黄色泡状の２−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシイノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（図中、化合物６）が得られる。
【００２９】
ついで、工程（Ｂ）において、前記工程（Ａ）で得られたＤＮＡ中の２−フルオロデオキシイノシン酸残基を、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に変換する。
【００３０】
２−フルオロデオキシイノシン酸残基のＮ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基への置換には、アニリンなどが用いられる。ここで、２−フルオロデオキシイノシン酸残基のＮ2 −フェニルデオキシグアニン残基への置換に際し、アニリンは、大過剰であることが望ましい。２−フルオロデオキシイノシン酸残基のＮ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基への置換の反応条件としては、例えば、反応系に、３Ｍ アニリン−塩酸塩と３Ｍ トリエチルアミンとを含有した水溶液５００μｌを添加し、得られた混合物を６０℃で４０時間インキュベートすることなどが挙げられる。
【００３１】
本発明により、ＤＮＡの酸化耐性能の増強方法も提供される。本発明のＤＮＡの酸化耐性能の増強方法は、ＤＮＡにおけるデオキシグアニル酸残基を、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換することに１つの特徴がある。
【００３２】
本発明のＤＮＡの酸化耐性能の増強方法によれば、ＤＮＡにおけるデオキシグアニル酸残基を、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換するため、得られたＤＮＡに酸化耐性能を付与すること又は向上させることができるという優れた効果を発揮する。
【００３３】
本発明のＤＮＡの酸化耐性能の増強方法は、前記ＤＮＡの製造方法と同様の操作及び条件で実施できる。
【００３４】
なお、本発明によれば、グアニンのＮ2 位にフェニル基が導入されたフェニルグアニン残基により、一電子酸化反応による損傷を防ぐことに基づき、グアニンのＮ2 位にフェニル基が導入されたフェニルグアニン残基を有するプリンリボヌクレオチド残基を構成単位の１つとして含有した、フェニル基を有する核酸塩基アナログが導入されたＲＮＡ、及びＲＮＡにおけるグアニル酸残基をＮ2 −フェニルグアニル酸残基に置換することにより、ＲＮＡの酸化耐性能を増強する方法が提供される。本発明のＲＮＡは、所望の塩基配列中の所望の位置のグアニル酸残基をＮ2 −フェニルグアニル酸に置換することにより得られうる。例えば、所望の塩基配列中の所望の位置に２−フルオロイノシン酸残基が導入されたＲＮＡを合成し、ついで、得られた産物とアニリンとを反応させることにより得られうる。
【００３５】
ここで、ＲＮＡの構成単位としては、具体的には、Ｎ2 −フェニルグアニル酸、グアニル酸残基、アデニル酸残基、シチジル酸残基、チミジル酸残基などが挙げられている。なお、本発明においては、前記「ＲＮＡの構成単位」には、「（フェニル基を有する）核酸塩基アナログ残基を有するリボヌクレオチド」（すなわち、前記Ｎ2 −フェニルグアニル酸）以外の慣用のリボヌクレオチドアナログをも包含する。
【００３６】
また、本発明によれば、グアニンのＮ2 位にフェニル基が導入されたフェニルグアニン残基を有したプリンデオキシリボヌクレオチド誘導体、すなわち、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸などが提供される。前記Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸は、例えば、２−フルオロデオキシイノシン酸とアニリンとの反応により得られうる。
【００３７】
さらに、本発明によれば、グアニンのＮ2 位にフェニル基が導入されたフェニルグアニン残基を有したプリンリボヌクレオチド誘導体、すなわち、Ｎ2 −フェニルグアニル酸などが提供される。前記Ｎ2 −フェニルグアニル酸は、例えば、２−フルオロイノシン酸とアニリンとの反応により得られうる。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。
【００３９】
実施例１ Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基が導入されたＤＮＡの合成
表１に列挙されたＮ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基（ｄPhＧ）が導入されたＤＮＡオリゴマーとその相補鎖とを合成した。なお、以下、本実施例においては、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基（ｄPhＧ）が導入されたＤＮＡオリゴマー及びその相補鎖を、「ｄPhＧ含有ＤＮＡ」と表記する。
【００４０】
【表１】
表１において、PhＧＧ１は、２１マーのＧＧ１中におけるＧ15Ｇ二塩基連鎖のＧ15がｄPhＧに置換されたものである。CNBPＵ１は、前記ＧＧ１に相補的な配列を有するものであり、シアノベンゾフェノン置換ウリジル酸残基（ｄCNBPＵ）を光誘導一電子酸化剤として含むものである。なお、かかるCNBPＵ１は、後述の製造例１に従って、製造される。Ｔ１は、前記CNBPＵ１におけるｄCNBPＵの代わりにチミジンを含むものである。二本鎖ＧＧ１／CNBPＵ１及び二本鎖PhＧＧ１／CNBPＵ１において、グアニンラジカルカチオンは、光励起したｄCNBPＵへの一電子移動によりＧ8 に選択的に生じた部位である。ＧＧ５は、ＧＧ１と同じ隣接配列を有し、かつ５つのＧＧ二塩基連鎖を含むものである。PhＧＧＧ５（８）及びPhＧＧ５（１６）は、ＧＧ５のＧ8 及びＧ16のそれぞれがｄPhＧに置換されたものである。ＧＧ４及びPhＧＧ４（８）は、それぞれ、ＧＧ５のＧ16Ｇ部位及びPhＧＧ５（８）のＧ16Ｇ部位がＴ16Ａに置換されたものである。ｃ−ＧＧ５及びｃ−ＧＧ４は、それぞれ、ＧＧ５及びＧＧ４に対する相補鎖である。
【００４２】
ｄPhＧ含有ＤＮＡを、２−フルオロデオキシイノシン酸残基が導入された対応のＤＮＡから、アニリンによるフッ素の置換により合成した。ｄPhＧ含有ＤＮＡの合成スキームを図１及び図２に示す。
【００４３】
図１は、２−フルオロ−５’−Ｏ（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシイノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（図中、化合物６）の合成スキームを示す。
【００４４】
（１）２−フルオロ−３’−Ｏ，５’−Ｏ−ビス（ターシャリーブチルジメチルシリル）−Ｏ６（ｐ−ニトロフェネチル）−２’−デオキシイノシン[2-fluoro-3'-O,5'-O-bis(tert-butyldimethylsilyl)-O6-(p-nitrophenetyl)-2'-deoxyinosine]（化合物４）の合成
図１において、２−デオキシグアノシン（化合物１）からの化合物４の合成は、例えば、アセド(Acedo, M.) ら、Nucleic Acid Res., 22, 2982-2989 (1994) に従って行なわれうる。
【００４５】
まず、ジメチルホルムアミドを溶媒として、化合物１ 10.0gを、イミダゾール13.7g 存在下に、ターシャリーブチルメチルシリルクロリド(TBDMSCL) 17.4g と37℃12時間反応させ、該化合物１の２つの水酸基をシリル化して、化合物２を得た。ついで、１，４−ジオキサンを溶媒として、前記化合物２ 5.1g と、ジエチルアゾダイカルボキシレート（DEAD）40％トルエン溶液を5.9 mLと、トリフェニルフォスフィン（Ph3P）3.4gと、パラニトロフェニルェタノール(NPE) 2.1gとを、37℃20時間の条件下に反応させ、化合物３を得た。前記化合物３ 1.8g を、トルエン50mL中ターシャリーブチルナイトライト(t-Butyl nitrite) 750 μl とポリビニルピリジンフッ化水素塩(PVPHP) 6.1gを-4℃２時間反応させて、アミノ基をフッ素に置換して、化合物４を得た。
【００４６】
（２）２−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｏ６−（ｐ−ニトロフェネチル）−２’−デオキシイノシン[2-fluoro-5'-O-(4,4'-dimethoxytirityl)-O6-(p-nitorophenetyl)-2'-deoxyinosine] （化合物５）の合成
前記（１）で得られた化合物４ 650.0mg (1.01mmol)と酢酸145 μl (2.53mmol)を含むテトラヒドロフラン(THF) 溶液12mlにテトラブチルアンモニウムフルオライド(TBAF)の1M THF溶液2.5ml (2.50mmol)を添加し、90分間攪拌した。得られた混合物から、溶媒を留去し、得られた産物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相は、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）に供して精製し、2-fluoro-2'-deoxyinosineの粗生成物を得た。
【００４７】
得られた粗生成物とジメチルアミノピリジン(DMAP) 1.3mg(0.01mmol)の無水ピリジン溶液10mlに、ジメトキシトリチルクロライド 375.0mg (1.11mmol) を添加し、室温で４時間攪拌した。得られた混合物から、溶媒を留去し、得られた産物を、酢酸エチルで抽出した。得られた抽出物を、水及び飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、ついで、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。得られた産物から、溶媒を留去し、濃縮した。得られた産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相は、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）に供して精製し、無色泡状の２−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｏ６−（ｐ−ニトロフェネチル）−２’−デオキシイノシン[2-fluoro-5'-O-(4,4'-dimethoxytirityl)-O6-(p-nitorophenetyl)-2'-deoxyinosine] （図１中の化合物５）484.0mg (0.671mmol, ２段階合計収率６７％）を得た。
【００４８】
化合物５の核磁気共鳴スペクトルデータは、 1H NMR(CDCl3, 400MHz) 2.50 (ddd, 1H, J=13.2, 6.4, 4.0 Hz), 2.74 (ddd, 1H, J=13.2, 6.8, 6.4 Hz), 3.28 (t, 2H, J=6.8 Hz), 3.34 (dd, 1H, J=10.2, 5.0 Hz), 3.40 (dd, 1H, J=10.2, 4.6 Hz), 3.72 (m, 1H), 3.74 (s, 6H), 4.64 (m, 1H), 4.80 (t, 2H, J=6.8 Hz), 6.34 (pseudo t, 1H, J=6.6 Hz), 6.74-6.78 (4H), 7.14-7.37 (9H), 7.46 (d, 2H, J=8.8 Hz), 8.02 (s, 1H), 8.14 (d, 2H, J=8.8Hz); FAB-MS m/z 722 [(M+H)+]である。
【００４９】
（３）２−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシイノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）[2-fluoro-5'-0-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyinosine 3'-O-(2-cyanoetyl N,N-diisopropylphosphoramidite)]（化合物６）の合成
前記（２）で得られた化合物５ 111.8mg (0.155mmol)をアセトニトリルで共沸した。得られた産物を、アセトニトリル(1.5ml) に溶解し、得られた溶解物に、テトラゾール 16mg(0.228mmol)、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト 65ml (0.226 mmol)を添加し、室温で１時間攪拌した。得られた産物を、酢酸エチルで抽出した。得られた抽出物を、水及び飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。得られた産物から、溶媒を留去して濃縮し、淡黄色泡状の化合物６（ホスホロアミダイト化合物）を158.5mg 得た。
【００５０】
（４）ｄPhＧ含有ＤＮＡの合成
図２に示すように、ｄPhＧ含有ＤＮＡの合成は、まず、２−フルオロデオキシイノシンが導入されたＤＮＡを得、ついで、ポストモデイフイヶーションにより、前記２−フルオロデオキシイノシンが導入されたＤＮＡ中の２−フルオロデオキシイノシンを、ｄPhＧに変換することによって行なった。
【００５１】
前記２−フルオロデオキシイノシンを含むＤＮＡの合成は、前記化合物６（ホスホロアミダイト化合物）を用いた標準的な固相合成法により行なった。
【００５２】
支持体を保持したまま、合成したＤＮＡを取り出した。ついで、前記ＤＮＡをそのまま、0.5M DBU（１，８−ジアザビシクロウンデセン）のアセトニトリル溶液で、室温で２０分間処理して、６位のｐ−ニトロフェニル基を脱離させた。得られた産物を、１％ トリエチルアミンのアセトニトリル溶液及びアセトニトリルで洗浄し、さらに、3Mアニリンで、60℃、40時間処理して、２位へのフェニル基の導入、脱保護及び支持体からの切り出しを同時に行なった。得られた産物を、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に供して、精製し、ｄPhＧ含有ＤＮＡを得た。
【００５３】
製造例１ シアノベンゾフェノン置換ウリジンが導入されたＤＮＡの合成
図３及び図４に示す合成スキームに従って、ｍ−ブロモ安息香酸（化合物２）から、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄCNBPＵ １とそのホスホロアミダイト誘導体（化合物１４）とを合成した。
【００５４】
（１）３’−ブロモ−４−メトキシベンゾフェノン（化合物８）の合成
ベンゼン（３５ｍｌ）中化合物７（１０．４ｇ、５１．８ｍｍｏｌ）の懸濁物に、塩化オキサリル（７．０ｍｌ、８０．２ｍｍｏｌ）と、触媒としてＤＭＦとを添加し、得られた混合物を室温で３時間攪拌した。得られた産物を真空下、蒸発乾固させ、得られた残渣をＣＳ2 （４０ｍｌ）に溶解させた。ついで、得られた溶液に、アニソール（１１．３ｍｌ、１０４ｍｍｏｌ）と三塩化アルミニウム無水物（１０．９ｇ、８２．１ｍｍｏｌ）とを添加し、得られた混合物を室温で３時間攪拌した。得られた産物を、クラッシュアイス（４５ｇ）上、濃塩酸（１０ｍｌ）に注ぎ、３０分間攪拌した。得られた粗生成物をヘキサンと酢酸エチルで再結晶化し、化合物８を得た（１２．０ｇ、収率８０％）。
【００５５】
（２）３’−ブロモ−４−ヒドロキシベンゾフェノン（化合物９）の合成
ベンゼン（４５ｍｌ）中化合物８（１０．１ｇ，３４．７ｍｍｏｌ）の溶液に三塩化アルミニウム（１１．６ｇ，８６．７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を還流下２時間攪拌した。得られた産物をクラッシュアイス（４０ｇ）上、濃塩酸（５ｍｌ）に注ぎ、３０分間攪拌した。得られた粗生成物をヘキサンと酢酸エチルとで再結晶化し、化合物９を得た（６．８１ｇ，収率７２％）。
【００５６】
（３）３’−トリメチルシリルエチニル−４−ヒドロキシベンゾフェノン（化合物１０）の合成
トリエチルアミン（２０ｍｌ）中化合物９（１．５１ｇ，５．４１ｍｍｏｌ）と酢酸パラジウム（II）（３１．７ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（１０３ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ）との混合物にエチニルトリメチルシラン（１．５０ｍｌ，１０．６ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を窒素還流下５時間攪拌し、得られた産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相として、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝８：１を使用）に供して、化合物１０を得た（１．２８ｇ，８０％）。
【００５７】
（４）４−（３’−トリメチルシリルエチニルベンゾイル）フェニル トリフルオロメタンスルフォネート（化合物１１）の合成
化合物１０（１．０４ｇ，３．５２ｍｍｏｌ）のピリジン（１５ｍｌ）溶液に、穏やかにトリフルオロメタンスルホン酸無水物（０．６８ｍｌ，４．０４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を０℃で５分間攪拌し、室温まで温め、さらに、２時間攪拌し、得られた産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相として、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２０：１を使用）に供して、化合物１１を得た（１．４２ｇ，９４％）。
【００５８】
（５）４−（３−トリメチルシリルエチニルベンゾイル）ベンゾニトリル（化合物１２）の合成
ベンゼン（１２ｍｌ）中化合物１１（５３７ｍｇ，１．２６ｍｍｏｌ）とシアン化カリウム（９８．６ｍｇ，１．５１ｍｍｏｌ）と１８−クラウン−６（１３２ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）との混合物に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（２９０ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を窒素還流下２時間攪拌し、得られた産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相として、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２０：１を使用）に供して、化合物１２を得た（１５２ｍｇ，４０％）。
【００５９】
（６）４−（３−エチニルベンゾイル）ベンゾニトリル（化合物１３）の合成
ＴＨＦ（１０ｍｌ）中化合物７（７３０ｍｇ，２．４０ｍｍｏｌ）に酢酸（０．２ｍｌ，３．５ｍｍｏｌ）とフッ化テトラブチルアンモニウム（３．６０ｍｌの１．０Ｍ フッ化テトラブチルアンモニウムのＴＨＦ溶液，３．６ｍｍｏｌ）とを添加し、得られた混合物を室温で２時間攪拌し、得られた産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相として、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１５：１を使用）に供して、化合物１３を得た（５１３ｍｇ，９２％）。
【００６０】
（７）５−〔３−（４−シアノベンゾイル）フェニルエチニル〕−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（化合物１５）の合成
１０ｍｌの脱気ＤＭＦ中化合物１３（２７５ｍｇ，１．１９ｍｍｏｌ）と２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−ヨードウリジン（化合物１４）とトリエチルアミン（０．２８ｍｌ，２．０ｍｍｏｌ）との溶液に、窒素雰囲気下、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１２１ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）とヨウ化銅（１８９ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で５時間攪拌し、得られた産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相として、クロロホルム：メタノール＝１００：１を使用）に供して、淡黄色泡状の化合物１５を得た（７２０ｍｇ，９３％）。 1H NMR(CDCl3, 400MHz)δ2.33(m, 1H), 2.53(m, 1H), 3.31(m, 1H), 3.42(m, 1H), 3.66(s, 3H), 3.67(s, 3H), 4.09(m, 1H), 4.57(m, 1H), 6.34(m, 1H), 6.72-6.76 (4H), 7.07-7.42 (12H), 7.65-7.77 (5H), 8.26(s, 1H); 13C NMR (CDCl3, 100MHz)δ40.4, 54.9, 63.4, 70.4, 79.1, 83.1, 85.2, 85.9, 86.1, 90.7, 98.0, 113.1, 113.2, 114.7, 118.0, 122.6, 126.6, 127.5, 127.8, 129.1, 129.3, 129.4, 129.5, 129.7, 129.9, 131.7, 135.2, 135.5, 136.3, 140.4, 143.1, 144.5, 149.2, 158.0, 158.0, 161.3, 194.0; FAB-MS m/z 760 [(M+H) + ] ；HRMS C46H38O8N3 [(M+H)+ ] 計算値760.2660, 測定値760.2660。
【００６１】
（８）５−〔３−（４−シアノベンゾイル）フェニルエチニル〕−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソ−プロピルホスホロアミダイト）（化合物１６）の合成
無水アセトニトリル（２ｍｌ）中化合物１５（２４１ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．１３ｍｌ，０．４５ｍｍｏｌ）とテトラゾール（０．９３ｍｌの０．５Ｍ テトラゾールＣＨ3 ＣＮ溶液，０．４７ｍｍｏｌ）とを添加した。得られた混合物を室温で１．５時間攪拌した。得られた混合物を酢酸エチルで希釈し、水及び塩水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ4 で乾燥した。その後、溶媒を除去することにより、２つのジアステレオマーの混合物として、化合物１４を得た（２９２ｍｇ，収率９６％）。前記化合物１６を、精製せずに、自動化ＤＮＡ合成に用いた。ホスホロアミダイトの形成について、31P NMR により確認した。31P NMR (C6D6, 162MHz)δ149.5, 149.1。
【００６２】
（９）オリゴマー合成
アプライド・バイオシステム ３９２ ＤＮＡシンセサイザーを用い、標準のβ−（シアノエチル）ホスホロアミダイト法により自動化ＤＮＡ合成を行なった。化合物１６のカップリングに際し、カップリング時間を１５分間としてことを除き、通常条件にて行なった。濃アンモニアで３７℃で３時間の処理により、合成オリゴマーを脱保護し、固相から取り除いた。オリゴマーの精製は、ＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ ５−ＯＤＳ−Ｈ ＨＰＬＣカラム（１０×１５０ｍｍ）上、１００ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸（ＴＥＡＡ）中５−２５％アセトニトリル、２０分間のリニアグラジェントで行なった。
【００６３】
実施例２ ｄPhＧ及びｄPhＧ含有ＤＮＡの評価
０．１Ｍ ＬｉＣｌＯ4 を含むＤＭＦ中において、サイクリックボルタンメトリーにより、ｄPhＧの酸化電位を測定した。その結果、ｄPhＧの酸化電位は、０．７０Ｖ（Ａｇ／Ａｇ+ 比，なお、Ｇは０．６７Ｖである）であった。
【００６４】
また、５０μＭ 塩基濃度、１００ｍＭ ＮａＣｌ下において、１０マーのｄPhＧ含有ＤＮＡ（二本鎖）であるd(GATAGTPhGGAC)[配列番号：１２]/d(GTCCACTATC)[配列番号：１３] の融解温度（Ｔｍ値）を、260nm の吸光度の温度変化により求めた。その結果、前記ｄPhＧ含有ＤＮＡのＴｍ値は、対応するＧ含有ＤＮＡ（二本鎖）よりも３．７℃高かった。
【００６５】
また、前記ｄPhＧ含有ＤＮＡの円二色性（ＣＤ）スペクトルを調べた。その結果を図５に示す。
【００６６】
図５に示すＣＤスペクトルの結果より、前記ｄPhＧ含有ＤＮＡは、典型的なＢ型構造を有することがわかる。
【００６７】
実施例３ ｄPhＧ含有ＤＮＡの評価
（１）内部酸化剤含有ＤＮＡを用いた酸化反応
二本鎖ＤＮＡ CNBPＵ１／ＧＧ１及びｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ CNBPＵ１／PhＧＧ１のそれぞれに対して、３１２ｎｍで０℃、６０分間、光照射した。得られた各産物を、Neatピペリジン200 μl と共に、９０℃２０分間インキュベートした。得られた各産物を、それぞれ、変性１５％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで電気泳動した。 各レーンでゲルにサプライする前にシンチレーションカウンターで同じカウント数になるように揃えた。各レーン間の比較のため、バンド強度はデンシトメトリーで定量した。結果を図６のパネルａ）に示す。なお、図６中、ｄCNBPＵは、四角で囲んで示されたＡの逆側に位置する。図６のパネルａ）において、レーン１は、ＧＧ１のマキサム−ギルバートＡ＋Ｇシークエンス反応の結果を示し、レーン２は、二本鎖ＤＮＡ CNBPＵ１／ＧＧ１の結果を示し、レーン３は、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ CNBPＵ１／PhＧＧ１の結果を示す。また、各レーンの最上部のバンドは、未切断の全長ＧＧ１に対応する。
【００６８】
図６のパネルａ）のレーン２に示すように、二本鎖ＤＮＡ CNBPＵ１／ＧＧ１への光照射及びピペリジン処理により、Ｇ15Ｇ二塩基連鎖の５’末端側のＧの酸化を介した切断を示す強いバンドの生成が観察される。顕著に対照的に、パネルａ）のレーン３に示すように、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ PhＧＧ１／CNBPＵ１におけるPhＧ15の酸化を介した切断を示すバンドは、レーン２の二本鎖ＤＮＡ ＧＧ１／CNBPＵ１におけるＧ15の酸化を介した切断を示すバンドよりも顕著に弱いことがわかる。
【００６９】
また、未切断の完全長ＧＧ１に対するＧ15の酸化を介した切断を示すバンドの相対バンド強度は、０．３１であり、PhＧＧ１のPhＧ15の酸化を介した切断を示すバンドの相対バンド強度は、わずか０．０５であった。
【００７０】
以上の結果より、内部酸化剤を含有した二本鎖ＤＮＡにおいて、ｄPhＧは、酸化反応を介した切断を抑制することがわかる。
【００７１】
（２）一電子酸化剤リボフラビンを用いたｄPhＧにおける酸化反応
リボフラビンの存在下、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ Ｔ１／PhＧＧ１及び二本鎖ＤＮＡ Ｔ１／ＧＧ１のそれぞれに対して、３６６ｎｍで０℃、60分間光照射した。得られた各産物を、ピペリジン200 μl と共に、９０℃２０分間インキュベートした。得られた各産物を、それぞれ、変性１５％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで電気泳動した。結果を、図６のパネルｂ）に示す。図６のパネルｂ）において、レーン１は、二本鎖ＤＮＡ Ｔ１／ＧＧ１の結果を示し、レーン２は、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ Ｔ１／PhＧＧ１の結果を示し、レーン３は、ＧＧ１のマキサム−ギルバートＡ＋Ｇシークエンス反応の結果を示す。また、各レーンの最上部のバンドは、未切断の全長ＧＧ１に対応する。
【００７２】
図６のパネルｂ）のレーン１に示すように、二本鎖ＤＮＡ ＧＧ１／Ｔ１におけるＧ15の酸化を介した切断を示す強いバンドの生成が観察されたが、レーン２に示すように、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ Ｔ１／PhＧＧ１におけるPhＧ15の酸化を介した切断を示すバンドは、かすかなバンドであった。
【００７３】
以上の結果より、二本鎖ＤＮＡにおいて、ｄPhＧは、リボフラビンの存在下の酸化反応を介した切断を抑制することがわかる。
【００７４】
（３）切断部位の確認
リボフラビンの存在下、一本鎖ｄPhＧ含有オリゴマーd(ATTTATAGTAGTAGTAPhGTATTT)[配列番号：１４] に対して、３６６ｎｍで０℃、60分間光照射した。得られた産物を、ピペリジン200 μl と共に、９０℃２０分間インキュベートした。
【００７５】
ついで、得られた各産物を、それぞれ、変性１５％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで電気泳動した。その結果を図７に示す。
【００７６】
図７に示すように、リボフラビン存在下での光照射及び続くピペリジン処理により、鎖切断が、ｄPhＧで実際に生じることが確認された。
【００７７】
（４）ｄPhＧ含有ＤＮＡの酸化耐性の評価
ｄPhＧ含有ＤＮＡについて、酸化耐性を調べた。
【００７８】
リボフラビン200 μM の存在下、ｄPhＧ含有ＤＮＡ 50 μM strand濃度に対して、３６６ｎｍで０℃、６０分間光照射した。得られた産物を、alkaline phosphatase (33Ｕ／μｌ) 、ヘビ毒リン酸ジエステラーゼ (0.1 Ｕ／μｌ) とP1 nuclease (33 Ｕ／μｌ) を加え、０℃で12時間反応させた。
【００７９】
ついで、得られた産物を、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供した。移動相は、0.1M TEAA pH7.0-アセトニトリルであり、流速は、3.0 ml/minである。結果を図８に示す。
【００８０】
図８に示すように、二本鎖で６８％のｄPhＧが、無傷のままであり、一本鎖で３６％のｄPhＧが、無傷のままであることがわかった。
【００８１】
また、複数個のＧＧ二塩基連鎖を有するｄPhＧ含有ＤＮＡについて、酸化耐性を調べた。
【００８２】
リボフラビンの存在下、複数個のＧＧ二塩基連鎖を有するＤＮＡ〔ＧＧ５／ｃ−ＧＧ５、PhＧＧ５（８）／ｃ−ＧＧ５、PhＧＧ５（１６）／ｃ−ＧＧ５、PhＧＧ５（１６）／ｃ−ＧＧ５、PhＧＧ４（１６）／ｃ−ＧＧ４及びＧＧ４／ｃ−ＧＧ４〕のそれぞれに対して、３６６ｎｍで０℃、６０分間光照射した。得られた各産物を、ピペリジン200 μｌと共に、９０℃２０分間インキュベートした。得られた各産物を、それぞれ、変性１５％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで電気泳動した。結果を、図９に示す。図９中、レーン１は、ＧＧ５のマキサム−ギルバートＡ＋Ｇシークエンス反応の結果を示し、レーン２は、二本鎖ＤＮＡ ＧＧ５／ｃ−ＧＧ５の結果を示し、レーン３は、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ PhＧＧ５（１６）／ｃ−ＧＧ５の結果を示し、レーン４は、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ PhＧＧ５（８）／ｃ−ＧＧ５の結果を示し、レーン４は、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ PhＧＧ５（１６）／ｃ−ＧＧ５の結果を示し、レーン５は、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ PhＧＧ４（１６）／ｃ−ＧＧ４の結果を示し、レーン６は、二本鎖ＤＮＡ ＧＧ４／ｃ−ＧＧ４の結果を示し、レーン７は、ＧＧ４のマキサム−ギルバートＡ＋Ｇシークエンス反応の結果を示す。
【００８３】
図９に示されるように、ｄPhＧ含有二本鎖の酸化分解は、ｄPhＧだけでなく、ｄPhＧから離れたＧＧ部位でも顕著に抑制されることがわかる。リボフラビン存在下での光照射されたＧＧ５の鎖切断は、同等の効率で全ＧＧ部位で生じたが、PhＧＧ５（８）のＧＧ部位の切断は、PhＧ8 Ｇに加え、Ｇ12Ｇ及びＧ16Ｇで抑制された。
【００８４】
また、Ｇ12Ｇと対照的に、Ｇ24Ｇでの切断は、ＧＧ５における切断に比べて弱くしか抑制されず、鎖切断の抑制の効率は、ｄPhＧからの距離が増えるにつれて減少することを示す。切断抑制の距離依存性は、５つのＧＧ部位の中央にｄPhＧを含むPhＧＧ５（１６）の酸化反応で明らかに示された。PhＧＧ部位に加え、全４つのＧＧ部位で切断の効率は、顕著に減少した。
【００８５】
ｄPhＧによる切断抑制の機構における顕著な見識が、ＧＧ４及びPhＧＧ４（８）のリボフラビン感受性酸化により得られた。ＧＧ４の鎖切断は、全４つのＧＧ部位で観察され、PhＧＧ４（８）の切断は、Ｇ8 Ｇ部位及びＧ12Ｇ部位で強く抑制されるが、Ｇ20Ｇ部位及びＧ24Ｇ部位では全く抑制されなかった。
【００８６】
PhＧＧ４（８）／ｃ−ＧＧ４におけるＧ12Ｇ部位及びＧ20Ｇ部位は、６つの介在ＡＴ塩基対で分離されており、２つの部位間のホール移動速度は、Ｇ8 とＧ12との間のホール移動速度（例えば、Ｇ.+ＴＴＧからＧＴＴＧ.+に関して２．５×１０6 ｓ-1）及びＧ部位における水でのホールトラッピングの推測速度（例えば、６×１０4 ｓ-1）よりも極めて小さいことが予想された。したがって、ｄPhＧ含有二本鎖における任意のＧ部位における酸化分解の抑制の効率は、ｄPhＧへのホール移動の速度の増加に伴い増加したことが明らかである。
【００８７】
以上の結果より、
１）ｄＧの環外アミノ基の置換が、一電子酸化反応に対するｄＧの化学的性質を調節するのに有効であること、
２）グアニンラジカルカチオンの分解が、ｄPhＧ付近で効率よく抑制されることが示された。これらの結果から、ｄPhＧが、一電子酸化反応に対する二本鎖ＤＮＡの内部抗酸化剤として用いることができることが示唆される。また、ＤＮＡへのかかるｄPhＧの多数の取り込みは、好気性条件でのＤＮＡ、特に高ＧＣ含量のＤＮＡの化学的不安定性を補うことが期待される。
【００８８】
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、合成ＤＮＡの配列である。
【００８９】
配列番号：２は、合成ＤＮＡの配列であり、該配列中、１５位のｎは、Ｎ2 −フェニルデオキシグアノシンである。
【００９０】
配列番号：３は、合成ＤＮＡの配列である。
【００９１】
配列番号：４は、合成ＤＮＡの配列であり、該配列中、７位のｎは、Ｎ2 −シアノベンゾフェノン置換デオキシウリジンである。
【００９２】
配列番号：５は、合成ＤＮＡの配列である。
【００９３】
配列番号：６は、合成ＤＮＡの配列であり、該配列中、８位のｎは、Ｎ2 −フェニルデオキシグアノシンである。
【００９４】
配列番号：７は、合成ＤＮＡの配列であり、該配列中、１６位のｎは、Ｎ2 −フェニルデオキシグアノシンである。
【００９５】
配列番号：８は、合成ＤＮＡの配列である。
【００９６】
配列番号：９は、合成ＤＮＡの配列である。
【００９７】
配列番号：１０は、合成ＤＮＡの配列であり、該配列中、８位のｎは、Ｎ2 −フェニルデオキシグアノシンである。
【００９８】
配列番号：１１は、合成ＤＮＡの配列である。
【００９９】
配列番号：１２は、合成ＤＮＡの配列であり、該配列中、７位のｎは、Ｎ2 −フェニルデオキシグアノシンである。
【０１００】
配列番号：１３は、合成ＤＮＡの配列である。
【０１０１】
配列番号：１４は、合成ＤＮＡの配列であり、該配列中、１７位のｎは、Ｎ2 −フェニルデオキシグアノシンである。
【０１０２】
【発明の効果】
本発明の核酸によれば、一電子酸化反応を介した酸化損傷（切断）及び該酸化損傷の伝搬を抑制し、一電子酸化反応を介した酸化に対して耐性であるため、安定性、特に、酸化条件下での安定性に優れた核酸材料を提供することが可能になるという優れた効果を奏する。また、本発明のＤＮＡの製造方法によれば、酸化耐性能を有するＤＮＡを簡便かつ効率よく製造することができ、従来、核酸の化学合成に用いられている方法及び装置をそのまま適用することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の核酸の酸化耐性能の増強方法によれば、所望の塩基配列を有する核酸の酸化耐性能を向上させることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のプリンヌクレオチド誘導体によれば、一電子酸化反応を介した核酸の酸化損傷（切断）及び核酸全体への該酸化損傷の伝搬を抑制すること、一電子酸化反応を介した酸化に対する耐性を核酸に付与することを可能にするという優れた効果を奏する。
【０１０３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、２−フルオロ−５’−Ｏ（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシイノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（図中、化合物６）の合成スキームを示す。
【図２】図２は、ｄPhＧ含有ＤＮＡの合成スキームの一例を示す。なお、配列は、任意である。
【図３】図３は、４−（３−エチニルベンゾイル）ベンゾニトリル（図中、化合物１３）の合成スキームを示す。
【図４】図４は、ｄCNBPＵ含有ＤＮＡの合成スキームを示す。
【図５】図５は、ｄPhＧ含有ＤＮＡの円二色性（ＣＤ）スペクトルの結果を示す。
【図６】図６は、酸化反応に曝露したｄPhＧ含有ＤＮＡを電気泳動した変性シークエンスゲルのオートラジオグラムを示す。塩基配列をオートラジオグラムの横に示す。ｄCNBPＵは、四角で囲んで示されたＡの逆側に位置する。パネルａ）は、３１２ｎｍ６０分の光照射した二本鎖の結果を示す。パネルａ）において、レーン１は、ＧＧ１のマキサム−ギルバートＡ＋Ｇシークエンス反応の結果を示し、レーン２は、二本鎖ＤＮＡ CNBPＵ１／ＧＧ１の結果を示し、レーン３は、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ CNBPＵ１／PhＧＧ１の結果を示す。また、各レーンの最上部のバンドは、未切断の全長ＧＧ１に対応する。パネルｂ）において、レーン１は、二本鎖ＤＮＡ Ｔ１／ＧＧ１の結果を示し、レーン２は、ｄPhＧ含有二本鎖ＤＮＡ Ｔ１／PhＧＧ１の結果を示し、レーン３は、ＧＧ１のマキサム−ギルバートＡ＋Ｇシークエンス反応の結果を示す。また、各レーンの最上部のバンドは、未切断の全長ＧＧ１に対応する。
【図７】図７は、リボフラビン存在下での光照射及び続くピペリジン処理による鎖切断の部位を調べた結果を示す。
【図８】図８は、リボフラビン存在下での光照射及び続くピペリジン処理に供したｄPhＧ含有ＤＮＡをＨＰＬＣにより解析した結果を示す。
【図９】図９は、酸化反応に曝露したｄPhＧ含有ＤＮＡを電気泳動した変性シークエンスゲルのオートラジオグラムを示す。塩基配列をオートラジオグラムの横に示す。図中、レーン１は、ＧＧ５のＡ＋Ｇ反応の結果を示し、レーン２は、ＧＧ５／ｃ−ＧＧ５の結果を示し、レーン３は、PhＧＧ５（８）／ｃ−ＧＧ５の結果を示し、レーン４は、PhＧＧ５（１６）／ｃ−ＧＧ５の結果を示し、レーン４は、PhＧＧ５（１６）／ｃ−ＧＧ５の結果を示し、レーン５は、PhＧＧ４（１６）／ｃ−ＧＧ４の結果を示し、レーン６は、ＧＧ４／ｃ−ＧＧ４の結果を示し、レーン７は、ＧＧ４のＡ＋Ｇ反応の結果を示す。
Claims (3)
- ＤＮＡにおけるデオキシグアニル酸残基（Ｇ）を、Ｎ 2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換することを特徴とする、ＤＮＡの酸化耐性能の増強方法。
- 塩基配列中のＧn （Ｇn は、デオキシグアニル酸残基の連続配列を示し、ｎは、２以上の整数を示す）から１０塩基長未満の位置に存在するＧを、Ｎ2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換する、請求項１記載の増強方法。
- 塩基配列中のＧ n （Ｇ n は、デオキシグアニル酸残基の連続配列を示し、ｎは、２以上の整数を示す）中のＧを、Ｎ 2 −フェニルデオキシグアニル酸残基に置換する、請求項１又は２記載の増強方法。
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