JP3540624B2 - 光感応性ヌクレオシドおよびそのフォスフォロアミダイト - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光感応性の基が三重結合を介して核酸に結合してなる核酸又はその反応性誘導体、好ましくは次式（Ｉ）、
【化７】
（式中、Ｒは、水素原子又はシアノ基を示す。）
で表される基で置換された核酸又はその反応性誘導体に関する。また、本発明は、この核酸を含有する核酸オリゴマー、この核酸のフォスフォロアミダイト誘導体からなるフォスフォロアミダイト試薬、及び、このフォスフォロアミダイト試薬を用いる核酸オリゴマーの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ＤＮＡの一電子酸化による損傷機構が大変注目され、主に電子受容性分子とＤＮＡとの分子間電子移動反応が調べられている。
このような電子受容性分子とＤＮＡとの分子間電子移動反応を解析するために、各種の光感応性物質をフォスフォロアミダイド試薬を用いて核酸中に導入し、光ＤＮＡ切断の研究が行われてきた。例えば、次式
【０００３】
【化８】
【０００４】
で示されるフォスフォロアミダイド試薬を用いた光ＤＮＡ切断知られている（アメリカ化学会誌、第１１９巻、１２７６２−１２７７１頁、１９９７年（J. Am.Chem. Soc., 119(52), 12762-12771,1997））。
しかしながら、従来の光感応性物質による光ＤＮＡ切断は、選択性に乏しく位置選択的なＤＮＡの切断は困難であった。
また、本発明者らは、次式（１）
【０００５】
【化９】
【０００６】
で示されるシアノベンゾフェノン（ＣＮＢＰ）（１）がＤＮＡの一電子酸化における優れた電子受容体であることを報告してきたが、このものも選択性が充分ではなかった。
【０００７】
このような従来の光感応性物質は、これをＤＮＡに導入したときにその自由度が大きく、その結果として選択性が低くなるのではないかと考えられ、本発明者らは、ＤＮＡに光感応性ヌクレオシドを自由度無く固定して導入する技術を開発した。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＤＮＡ鎖中に光感応性ヌクレオシドを構造の自由度無く簡便に導入するための光感応性物質を提供する。
また、本発明は、当該光感応性物質をＤＮＡに導入するための核酸又はその反応性誘導体、好ましくはフォスフォロアミダイド試薬を提供し、選択的な光ＤＮＡ切断を提供する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、ヌクレオシドの一つであるウリジンに自由度のないアセチレン結合を介して、光感応性のベンゾフェノンを導入する手法を見出した。本発明は、次式（Ｉ）、
【００１０】
【化１０】
（式中、Ｒは、水素原子又はシアノ基を示す。）
で表される基がヌクレオシドの塩基部分に結合しているヌクレオシド、又はそのフォスフォロアミダイド誘導体に関する。
【００１１】
また、本発明は、前記の式（Ｉ）で表される基がヌクレオシドの塩基部分に結合しているヌクレオシド部分を少なくともひとつ含有してなる核酸オリゴマーに関する。さらに、本発明は、前記の式（Ｉ）で表される基で置換されたヌクレオシドのフォスフォロアミダイト誘導体からなるフォスフォロアミダイト試薬に関する。より詳細には、本発明は、次式（III）、
【００１２】
【化１１】
【００１３】
（式中、Ｒは、水素原子又はシアノ基を示す。）
で表されるヌクレオシドのフォスフォロアミダイト誘導体からなるフォスフォロアミダイト試薬に関する。また、本発明は、前記したフォスフォロアミダイト試薬を用いて、前記の式（Ｉ）で表される基がヌクレオシドの塩基部分に結合しているヌクレオシド部分を少なくともひとつ含有する核酸オリゴマーを製造する方法に関する。さらに、本発明は、前記の式（Ｉ）で表される基がヌクレオシドの塩基部分に結合しているヌクレオシド部分を少なくともひとつ含有してなる核酸オリゴマーに光を照射して、当該核酸オリゴマーを選択的に切断する方法に関する。
【００１４】
本発明の「光感応性の基」としては、可視光線、紫外線、遠紫外線などの光に感応して電子受容体として作用するものであって、三重結合が結合し得るものであればよい。本発明の好ましい光感応性の基としては、ベンゾフェノン基、４’−シアノベンゾフェノン基などが挙げられる。
本発明の三重結合としては、前記した光感応性の基の自由度を無くせるものであればよく、通常は炭素−炭素三重結合が好ましい。
当該三重結合が前記した光感応性の基に結合する位置も特に制限はないが、これらの基が核酸オリゴマーの中に収容されることができ、かつ、その自由度が無くなるような位置が好ましい。
本発明の三重結合が結合した光感応性の基としては、次式（IV）
【００１５】
【化１２】
【００１６】
（式中、Ｒ１は、水素原子又は置換基を示す。）
で表される基が好ましい。
式（IV）中のＲ１の置換基としては、電子受容体として作用を害しないものであればよく、好ましくはシアノ基が挙げられる。より好ましくは、前記した式（Ｉ）で表される基が挙げられる。
【００１７】
前記した三重結合が結合した光感応性の基は、当該三重結合の他の端において核酸に結合する。核酸としては、各種ヌクレオシドをあげることができるが、ウリジンが好ましい。
核酸に結合する位置は、核酸の糖部分であっても、塩基部分であってもよいが、好ましくは塩基部分が挙げられる。
特に好ましい態様としては、三重結合がウラシルの５位に結合したものを挙げることができる。
【００１８】
本発明の核酸の反応性誘導体としては、核酸の糖鎖中の水酸基が反応性の基で置換されたものであり、この場合には他の水酸基が目的とする反応において反応性を示さないように適当な保護基で保護されていてもよい。
本発明の好ましい核酸又はその反応性誘導体としては、次式（II）、
【００１９】
【化１３】
【００２０】
（式中、Ｙ及びＺは、それぞれ独立に水素原子、保護基又は反応性の基を示し、Ｒは、水素原子又はシアノ基を示す。）
で表される化合物、及び、次式（III）、
【００２１】
【化１４】
【００２２】
（式中、Ｒは、水素原子又はシアノ基を示す。）
で表される化合物を挙げることができる。
本発明の好ましい反応性誘導体としては、フォスフォロアミダイド誘導体を挙げることができる。好ましい本発明のフォスフォロアミダイド試薬としては、次式（III）、
【００２３】
【化１５】
【００２４】
（式中、Ｒは、水素原子又はシアノ基を示す。）
で表される核酸のフォスフォロアミダイト誘導体からなるフォスフォロアミダイト試薬が挙げられる。
本発明のフォスフォロアミダイド試薬は、前記した式（IV）で表される化合物に限定されるものではなく、ＤＮＡ合成、好ましくはＤＮＡ自動合成機に直ちに利用できる化合物であれば特に制限はない。本発明の核酸をフォスフォロアミダイト試薬とすることにより、市販のＤＮＡ自動合成機を用いて任意のＤＮＡに組み込むことが出来る。この様なフォスフォロアミダイト試薬を用いたＤＮＡ合成は、ＤＮＡ自動合成機の普及により非常に簡単に、新しい機能を持つＤＮＡを創出する方法として当業者に通常使用しているものである。
【００２５】
本発明のフォスフォロアミダイド試薬のフォスフォンアミド基としては、例えば、Ｏ−メチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォンアミド基、Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォンアミド基などのＮ，Ｎ−ジイソプロピルフォスフォンアミド基が好ましい。
【００２６】
本発明の方法により、光感応性の基が三重結合を介して結合したヌクレオシドを得ることができ、このヌクレオシドを用いて通常の方法、例えば、ＤＮＡ自動合成機による合成法などにより、三重結合を介して光感応性の基を含有するヌクレオシドを少なくともひとつ含有する核酸オリゴマー（ポリヌクレオチド）を製造することができる。本発明の核酸オリゴマーは、光感応性の基が三重結合を介して結合したヌクレオシドの近傍で選択的に光による切断をすることができる。例えば、シアノベンゾフェノン（ＣＮＢＰ）エチニル基置換ウリジン（ＣＵ）を電子受容性核酸塩基として合成し、ホスホロアミダイト法により、ＤＮＡの最も酸化されやすい５’−ＧＧ−３’配列を含むオリゴマーを合成した。この核酸オリゴマーの塩基配列は次式（Ｖ）
【００２７】
５’−ＡＡＴＡＣＡＴＴＧＧＴＧＧＣＵＴＴＧＡＧＴＡＴ−３’ （Ｖ）
（式中、ＣＵは、シアノベンゾフェノン（ＣＮＢＰ）エチニル基置換ウリジンを示す。）
で表されるものである。
このオリゴマーを相補鎖と二本鎖形成後、波長３１２ｎｍの光を２時間照射した結果、シアノベンゾフェノン（ＣＮＢＰ）エチニル基置換ウリジン（ＣＵ）の直前に位置する一電子酸化に特徴的な５’−ＧＧ−３’配列の５’側のＧでの選択的切断が認められた。
【００２８】
本発明における光による核酸オリゴマーを切断する方法は、好ましくは可視紫外領域の波長、より好ましくは３１２ｎｍの波長を約１〜５時間、好ましくは１〜２時間照射することにより行うことができる。
【００２９】
本発明により、ＤＮＡ鎖中に光感応性ヌクレオシドを構造の自由度無く簡便に導入することができ、本発明の方法により製造された核酸オリゴマーは位置選択的に光切断することができる。従来用いられている光感応ヌクレオシドでは、ＤＮＡに導入後自由度の高いフレキシブルな構造をとるために、その効果は本発明に比べて著しく低かった。
【００３０】
本発明の核酸を導入したＤＮＡは光感応性の基、例えば、ペンゾフェノン部分の光化学反応によりより選択的な切断が行えるために、１）ＤＮＡータンパクとのクロスリンクによるＤＮＡータンパク相互作用の解析、２）ＤＮＡ−ＤＮＡ間の電子移動反応解析、３）ＤＮＡ切断反応の解析、４）光遺伝子治療、５）アンチセンスＤＮＡ、６）光ＤＮＡ接合等への利用が期待される。
【００３１】
【実施例】
次に実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１
３’−ブロモ−４−メチルベンゾフェノン（１）の製造
３−ブロモ安息香酸（５．１５７４ｇ、２５．６６ｍｍｏｌ）の塩化チオニル溶液（３０ｍＬ）を一時間還流の後、塩化チオニルを留去し、トルエン（４０ｍＬ）に溶した。この溶液中に無水塩化アルミニウム（７．２７５４ｇ、５４．５６ｍｍｏｌ）を数回にわけて加え、３時間室温で撹拌。氷水と塩酸を加えさらに３０分撹拌。反応混合物は酢酸エチルで抽出し、水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとばして濃縮。酢酸エチル−へキサン中で再結晶して無色結晶の化合物（１）（５．７４７０ｇ、２０．８９ｍｍｏｌ、８１％）を得た。
【００３３】
実施例２
３’−ブロモ−４−（ジブロモメチル）ベンゾフェノン（２）の製造
前記実施例１で得られた化合物（１）（１．０３３ｇ、３．７５４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２０ｍＬ）にＮＢＳ（１．６５４ｇ、９．２９０ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（６３．７ｍｇ、０．３８７９ｍｍｏｌ）を加え還流下５時間撹拌。反応混合物は酢酸エチルで抽出し、水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとばして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｔｏｌｕｅｎｅ：ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝２：１）により精製し白色固体の化合物（２）（１．３５１ｇ、３．１２１ｍｍｏｌ、８３％）を得た。
【００３４】
実施例３
４−（３−ブロモベンゾイル）ベンズアルデヒド（３）の製造
前記の実施例２で得られた化合物（２）（９６７．６ｍｇ、２．２３５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）に酢酸ナトリウム（９１６．２ｍｇ、１１．１７ｍｍｏｌ）を加え１３０度で５時間撹拌。反応混合物は酢酸エチルで抽出し、水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとぱして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィ−（ｔｏｌｕｅｎｅ：ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ＝９：１）により精製し白色粉末の化合物（３）（３８８．４ｍｇ、１．３４３ｍｍｏｌ、６０％）を得た。
【００３５】
実施例４
４−（３−ブロモベンゾイル）ベンゾニトリル（４）の製造
前記の実施例３で得られた化合物（３）（３２０．５ｍｇ、１．１０８ｍｍｏｌ）、ギ酸ナトリウム（１５１．３ｍｇ、２．２２５ｍｍｏｌ）のギ酸溶液（８ｍＬ）に塩酸ヒドロキシルアミン（１５３．４ｍｇ、２．２０８ｍｍｏｌ）を加え還流下７時間撹拌。ギ酸を留去の後、反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとばして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ＝７：１）により精製し白色粉末の化合物（４）（２７１．８ｍｇ、０．９５０ｍｍｏｌ、８６％）を得た。
【００３６】
実施例５
４−（３−トリメチルシリルエチニルベンゾイル）ベンゾニトリル（５）の製造
前記の実施例４で得られた化合物（４）（８８７．３ｍｇ、３．１０１ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（７．１ｍｇ、０．０３１６２ｍｍｏｌ）及びトリフェニルフォスフィン（４０．５ｍｇ、０．１５４４ｍｍｏｌ）のトリエチルアミン溶液（１５ｍＬ）を脱気後にトリメチルシリルアセチレン（１．２０ｍＬ）を加え窒素雰囲気下、還流６時間撹拌。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとぱして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ＝３０：１）により精製し白色粉末の化合物（５）（８５６．７ｍｇ、２．８２３ｍｍｏｌ、９１％）を得た。
【００３７】
実施例６
４−（３−エチニルベンゾイル）ベンゾニトリル（６）の製造
前記の実施例５で得られた化合物（５）（７３０．０ｍｇ、２．４０６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）にＴＢＡＦ−１Ｍ−ＴＨＦ溶液（３．６０ｍＬ、３．６０ｍｍｏｌ）と酢酸（０．２ｍＬ、３．４６ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間撹拌。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとぱして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ＝１５：１）により精製し白色粉末の化合物（６）（５１３．３ｍｇ、２．２１９ｍｍｏｌ、９２％）を得た。
【００３８】
実施例７
５−｛３−（４−シアノベンゾイル）フェニルエチニル｝−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（７）の製造
前記の実施例６で得られた化合物（６）（２７５．５ｍｇ、１．１９１ｍｍｏｌ）、５−ヨード−２’−デオキシウリジン（６５０．８ｍｇ、０．９９１４ｍｍｏｌ）、及びトリエチルアミン（０．２８ｍＬ、２．００９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）を脱気後にテトラキストリフェニルフォスフィンパラジウム（１２１．５ｍｇ、０．１０５１ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（１８９．７ｍｇ、０．９９６１ｍｍｏｌ）を加え窒素雰囲気下、５時間撹拌。反応混合物をクロロホルムで抽出し、水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとばして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：ｍｅｔｈａｎｏｌ＝１００：１）により精製し淡黄色粉末の化合物（７）（７２０．１０ｍｇ、０．９１８７ｍｍｏｌ、９３％）を得た。
【００３９】
実施例８
アミダイド誘導体（８）の製造
前記の実施例７で得られた化合物（７）（１６７．８ｍｇ、０．２１４１ｍｍｏｌ）をアセトニトリルで共沸した後、アセトニトリル（１ｍＬ）に溶かし、テトラゾール（０．３２０ｍｍｏｌ）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト（０．０９３ｍＬ、０．３５８６ｍｍｏｌ）を加え室温２時間撹拌。反応混合物は酢酸エチルで抽出し、水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒をとぱして濃縮。淡黄色泡状の化合物（８）（１９３．４ｍｇ、０．１９６３ｍｍｏｌ、９２％）を得た。
【００４０】
実施例９
３−ブロモベンゾフェノン（９）の製造
３−ブロモ安息香酸（４．１６００ｇ、２０．６９ｍｍｏｌ）の塩化チオニル溶液（１５ｍＬ）を一時間還流の後、塩化チオニルを留去し、ベンゼン（１５ｍＬ）に溶した。この溶液中に無水塩化アルミニウム（５．５０２ｇ、４１．２５ｍｍｏｌ）を数回にわけて加え、６時間室温で撹拌。氷水と塩酸を加えさらに３０分撹拌。反応混合物は酢酸エチルで抽出し、水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとばして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ＝２０：１）により精製し白色粉末の化合物（９）（４．３２１６ｇ、１６．５５ｍｍｏｌ、８０％）を得た。
【００４１】
実施例１０
３−トリメチルシリルエチニルベンゾフェノン（１０）の製造
前記の実施例９で得られた化合物（９）（３．０１２６ｇ、１１．５３７ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（２５．９ｍｇ、０．１１５４ｍｍｏｌ）及びトリフェニルフォスフィン（１２１．１ｍｇ、０．４６１７ｍｍｏｌ）のトリエチルアミン溶液（２０ｍＬ）を脱気後にトリメチルシリルアセチレン（５．０ｍＬ、３５．３８ｍｍｏｌ）を加え窒素雰囲気下、還流６時間撹拌。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとばして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ＝８０：１）により精製し淡黄色粉末の化合物（１０）（２．９２８２ｇ、１０．５１６９ｍｍｏｌ、９１％）を得た。
【００４２】
実施例１１
３−エチニルベンゾフェノン（１１）の製造
前記の実施例１０で得られた化合物（１０）（２．７２７２ｇ、９．７９５ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１５ｍＬ）に炭酸カリウム（１４．３ｍｇ、０．１０３５ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間撹拌。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとばして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ＝１００：１） により精製し白色粉末の化合物（１１）（１．５２１６ｇ、７．３３４ｍｍｏｌ、７５％）を得た。
【００４３】
実施例１２
５−｛３−ベンゾイルフェニルエチニル｝−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（１２）の製造
前記の実施例１１で得られた化合物（１１）（４７０．３ｍｇ、２．２８０ｍｍｏｌ）、５−ヨード−２’−デオキシウリジン（１００１．４ｍｇ、１．５２５ｍｍｏｌ）、及びトリエチルアミン（０．４２０ｍＬ、３．０１３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１２ｍＬ）を脱気後にテトラキストリフェニルフォスフィンパラジウム（１９４．３ｍｇ、０．１６８１ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（２８６．５ｍｇ、１．５０４ｍｍｏｌ）を加え窒素雰囲気下、４時間撹拌。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとぱして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ＝１：１）により精製し淡黄色粉末の化合物（１２）（９８１．８ｍｇ、１．２９４ｍｍｏｌ、８５％）を得た。
【００４４】
実施例１３
実施例８で得られた化合物（８）を用いて、常法により次式、
５’−ＡＡＴＡＣＡＴＴＧＧＴＧＧＣＵＴＴＧＡＧＴＡＴ−３’
（式中、ＣＵは、シアノベンゾフェノン（ＣＮＢＰ）エチニル基置換ウリジンを示す。）
で表される核酸オリゴマーを製造した。
【００４５】
実施例１４
実施例１３で製造された核酸オリゴマーに、波長３１２ｎｍの光を２時間照射した。光照射後、生成物を分析すると次式の切断位置に示されるように、
【００４６】
ＣＵの直前にある５’−ＧＧ−３’の位置で選択的に切断された生成物のスポットを観察することができた。
【００４７】
【発明の効果】
本発明の光感応性ヌクレオシドを用いることにより、ＤＮＡに光感応性の基、例えば、光感応性ベンゾフェノンを自由度無く固定して導入出来るために、クロスリンクなど反応の選択性は極めて高い。また、ＤＮＡに損傷を与えない波長の光により、容易に活性化できる利点を持つ。
【発明の属する技術分野】
本発明は、光感応性の基が三重結合を介して核酸に結合してなる核酸又はその反応性誘導体、好ましくは次式（Ｉ）、
【化７】
で表される基で置換された核酸又はその反応性誘導体に関する。また、本発明は、この核酸を含有する核酸オリゴマー、この核酸のフォスフォロアミダイト誘導体からなるフォスフォロアミダイト試薬、及び、このフォスフォロアミダイト試薬を用いる核酸オリゴマーの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ＤＮＡの一電子酸化による損傷機構が大変注目され、主に電子受容性分子とＤＮＡとの分子間電子移動反応が調べられている。
このような電子受容性分子とＤＮＡとの分子間電子移動反応を解析するために、各種の光感応性物質をフォスフォロアミダイド試薬を用いて核酸中に導入し、光ＤＮＡ切断の研究が行われてきた。例えば、次式
【０００３】
【化８】
で示されるフォスフォロアミダイド試薬を用いた光ＤＮＡ切断知られている（アメリカ化学会誌、第１１９巻、１２７６２−１２７７１頁、１９９７年（J. Am.Chem. Soc., 119(52), 12762-12771,1997））。
しかしながら、従来の光感応性物質による光ＤＮＡ切断は、選択性に乏しく位置選択的なＤＮＡの切断は困難であった。
また、本発明者らは、次式（１）
【０００５】
【化９】
で示されるシアノベンゾフェノン（ＣＮＢＰ）（１）がＤＮＡの一電子酸化における優れた電子受容体であることを報告してきたが、このものも選択性が充分ではなかった。
【０００７】
このような従来の光感応性物質は、これをＤＮＡに導入したときにその自由度が大きく、その結果として選択性が低くなるのではないかと考えられ、本発明者らは、ＤＮＡに光感応性ヌクレオシドを自由度無く固定して導入する技術を開発した。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＤＮＡ鎖中に光感応性ヌクレオシドを構造の自由度無く簡便に導入するための光感応性物質を提供する。
また、本発明は、当該光感応性物質をＤＮＡに導入するための核酸又はその反応性誘導体、好ましくはフォスフォロアミダイド試薬を提供し、選択的な光ＤＮＡ切断を提供する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、ヌクレオシドの一つであるウリジンに自由度のないアセチレン結合を介して、光感応性のベンゾフェノンを導入する手法を見出した。本発明は、次式（Ｉ）、
【００１０】
【化１０】
で表される基がヌクレオシドの塩基部分に結合しているヌクレオシド、又はそのフォスフォロアミダイド誘導体に関する。
【００１１】
また、本発明は、前記の式（Ｉ）で表される基がヌクレオシドの塩基部分に結合しているヌクレオシド部分を少なくともひとつ含有してなる核酸オリゴマーに関する。さらに、本発明は、前記の式（Ｉ）で表される基で置換されたヌクレオシドのフォスフォロアミダイト誘導体からなるフォスフォロアミダイト試薬に関する。より詳細には、本発明は、次式（III）、
【００１２】
【化１１】
（式中、Ｒは、水素原子又はシアノ基を示す。）
で表されるヌクレオシドのフォスフォロアミダイト誘導体からなるフォスフォロアミダイト試薬に関する。また、本発明は、前記したフォスフォロアミダイト試薬を用いて、前記の式（Ｉ）で表される基がヌクレオシドの塩基部分に結合しているヌクレオシド部分を少なくともひとつ含有する核酸オリゴマーを製造する方法に関する。さらに、本発明は、前記の式（Ｉ）で表される基がヌクレオシドの塩基部分に結合しているヌクレオシド部分を少なくともひとつ含有してなる核酸オリゴマーに光を照射して、当該核酸オリゴマーを選択的に切断する方法に関する。
【００１４】
本発明の「光感応性の基」としては、可視光線、紫外線、遠紫外線などの光に感応して電子受容体として作用するものであって、三重結合が結合し得るものであればよい。本発明の好ましい光感応性の基としては、ベンゾフェノン基、４’−シアノベンゾフェノン基などが挙げられる。
本発明の三重結合としては、前記した光感応性の基の自由度を無くせるものであればよく、通常は炭素−炭素三重結合が好ましい。
当該三重結合が前記した光感応性の基に結合する位置も特に制限はないが、これらの基が核酸オリゴマーの中に収容されることができ、かつ、その自由度が無くなるような位置が好ましい。
本発明の三重結合が結合した光感応性の基としては、次式（IV）
【００１５】
【化１２】
（式中、Ｒ１は、水素原子又は置換基を示す。）
で表される基が好ましい。
式（IV）中のＲ１の置換基としては、電子受容体として作用を害しないものであればよく、好ましくはシアノ基が挙げられる。より好ましくは、前記した式（Ｉ）で表される基が挙げられる。
【００１７】
前記した三重結合が結合した光感応性の基は、当該三重結合の他の端において核酸に結合する。核酸としては、各種ヌクレオシドをあげることができるが、ウリジンが好ましい。
核酸に結合する位置は、核酸の糖部分であっても、塩基部分であってもよいが、好ましくは塩基部分が挙げられる。
特に好ましい態様としては、三重結合がウラシルの５位に結合したものを挙げることができる。
【００１８】
本発明の核酸の反応性誘導体としては、核酸の糖鎖中の水酸基が反応性の基で置換されたものであり、この場合には他の水酸基が目的とする反応において反応性を示さないように適当な保護基で保護されていてもよい。
本発明の好ましい核酸又はその反応性誘導体としては、次式（II）、
【００１９】
【化１３】
（式中、Ｙ及びＺは、それぞれ独立に水素原子、保護基又は反応性の基を示し、Ｒは、水素原子又はシアノ基を示す。）
で表される化合物、及び、次式（III）、
【００２１】
【化１４】
（式中、Ｒは、水素原子又はシアノ基を示す。）
で表される化合物を挙げることができる。
本発明の好ましい反応性誘導体としては、フォスフォロアミダイド誘導体を挙げることができる。好ましい本発明のフォスフォロアミダイド試薬としては、次式（III）、
【００２３】
【化１５】
（式中、Ｒは、水素原子又はシアノ基を示す。）
で表される核酸のフォスフォロアミダイト誘導体からなるフォスフォロアミダイト試薬が挙げられる。
本発明のフォスフォロアミダイド試薬は、前記した式（IV）で表される化合物に限定されるものではなく、ＤＮＡ合成、好ましくはＤＮＡ自動合成機に直ちに利用できる化合物であれば特に制限はない。本発明の核酸をフォスフォロアミダイト試薬とすることにより、市販のＤＮＡ自動合成機を用いて任意のＤＮＡに組み込むことが出来る。この様なフォスフォロアミダイト試薬を用いたＤＮＡ合成は、ＤＮＡ自動合成機の普及により非常に簡単に、新しい機能を持つＤＮＡを創出する方法として当業者に通常使用しているものである。
【００２５】
本発明のフォスフォロアミダイド試薬のフォスフォンアミド基としては、例えば、Ｏ−メチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォンアミド基、Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォンアミド基などのＮ，Ｎ−ジイソプロピルフォスフォンアミド基が好ましい。
【００２６】
本発明の方法により、光感応性の基が三重結合を介して結合したヌクレオシドを得ることができ、このヌクレオシドを用いて通常の方法、例えば、ＤＮＡ自動合成機による合成法などにより、三重結合を介して光感応性の基を含有するヌクレオシドを少なくともひとつ含有する核酸オリゴマー（ポリヌクレオチド）を製造することができる。本発明の核酸オリゴマーは、光感応性の基が三重結合を介して結合したヌクレオシドの近傍で選択的に光による切断をすることができる。例えば、シアノベンゾフェノン（ＣＮＢＰ）エチニル基置換ウリジン（ＣＵ）を電子受容性核酸塩基として合成し、ホスホロアミダイト法により、ＤＮＡの最も酸化されやすい５’−ＧＧ−３’配列を含むオリゴマーを合成した。この核酸オリゴマーの塩基配列は次式（Ｖ）
【００２７】
５’−ＡＡＴＡＣＡＴＴＧＧＴＧＧＣＵＴＴＧＡＧＴＡＴ−３’ （Ｖ）
（式中、ＣＵは、シアノベンゾフェノン（ＣＮＢＰ）エチニル基置換ウリジンを示す。）
で表されるものである。
このオリゴマーを相補鎖と二本鎖形成後、波長３１２ｎｍの光を２時間照射した結果、シアノベンゾフェノン（ＣＮＢＰ）エチニル基置換ウリジン（ＣＵ）の直前に位置する一電子酸化に特徴的な５’−ＧＧ−３’配列の５’側のＧでの選択的切断が認められた。
【００２８】
本発明における光による核酸オリゴマーを切断する方法は、好ましくは可視紫外領域の波長、より好ましくは３１２ｎｍの波長を約１〜５時間、好ましくは１〜２時間照射することにより行うことができる。
【００２９】
本発明により、ＤＮＡ鎖中に光感応性ヌクレオシドを構造の自由度無く簡便に導入することができ、本発明の方法により製造された核酸オリゴマーは位置選択的に光切断することができる。従来用いられている光感応ヌクレオシドでは、ＤＮＡに導入後自由度の高いフレキシブルな構造をとるために、その効果は本発明に比べて著しく低かった。
【００３０】
本発明の核酸を導入したＤＮＡは光感応性の基、例えば、ペンゾフェノン部分の光化学反応によりより選択的な切断が行えるために、１）ＤＮＡータンパクとのクロスリンクによるＤＮＡータンパク相互作用の解析、２）ＤＮＡ−ＤＮＡ間の電子移動反応解析、３）ＤＮＡ切断反応の解析、４）光遺伝子治療、５）アンチセンスＤＮＡ、６）光ＤＮＡ接合等への利用が期待される。
【００３１】
【実施例】
次に実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１
３’−ブロモ−４−メチルベンゾフェノン（１）の製造
３−ブロモ安息香酸（５．１５７４ｇ、２５．６６ｍｍｏｌ）の塩化チオニル溶液（３０ｍＬ）を一時間還流の後、塩化チオニルを留去し、トルエン（４０ｍＬ）に溶した。この溶液中に無水塩化アルミニウム（７．２７５４ｇ、５４．５６ｍｍｏｌ）を数回にわけて加え、３時間室温で撹拌。氷水と塩酸を加えさらに３０分撹拌。反応混合物は酢酸エチルで抽出し、水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとばして濃縮。酢酸エチル−へキサン中で再結晶して無色結晶の化合物（１）（５．７４７０ｇ、２０．８９ｍｍｏｌ、８１％）を得た。
実施例２
３’−ブロモ−４−（ジブロモメチル）ベンゾフェノン（２）の製造
前記実施例１で得られた化合物（１）（１．０３３ｇ、３．７５４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２０ｍＬ）にＮＢＳ（１．６５４ｇ、９．２９０ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（６３．７ｍｇ、０．３８７９ｍｍｏｌ）を加え還流下５時間撹拌。反応混合物は酢酸エチルで抽出し、水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとばして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｔｏｌｕｅｎｅ：ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝２：１）により精製し白色固体の化合物（２）（１．３５１ｇ、３．１２１ｍｍｏｌ、８３％）を得た。
実施例３
４−（３−ブロモベンゾイル）ベンズアルデヒド（３）の製造
前記の実施例２で得られた化合物（２）（９６７．６ｍｇ、２．２３５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）に酢酸ナトリウム（９１６．２ｍｇ、１１．１７ｍｍｏｌ）を加え１３０度で５時間撹拌。反応混合物は酢酸エチルで抽出し、水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとぱして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィ−（ｔｏｌｕｅｎｅ：ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ＝９：１）により精製し白色粉末の化合物（３）（３８８．４ｍｇ、１．３４３ｍｍｏｌ、６０％）を得た。
実施例４
４−（３−ブロモベンゾイル）ベンゾニトリル（４）の製造
前記の実施例３で得られた化合物（３）（３２０．５ｍｇ、１．１０８ｍｍｏｌ）、ギ酸ナトリウム（１５１．３ｍｇ、２．２２５ｍｍｏｌ）のギ酸溶液（８ｍＬ）に塩酸ヒドロキシルアミン（１５３．４ｍｇ、２．２０８ｍｍｏｌ）を加え還流下７時間撹拌。ギ酸を留去の後、反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとばして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ＝７：１）により精製し白色粉末の化合物（４）（２７１．８ｍｇ、０．９５０ｍｍｏｌ、８６％）を得た。
実施例５
４−（３−トリメチルシリルエチニルベンゾイル）ベンゾニトリル（５）の製造
前記の実施例４で得られた化合物（４）（８８７．３ｍｇ、３．１０１ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（７．１ｍｇ、０．０３１６２ｍｍｏｌ）及びトリフェニルフォスフィン（４０．５ｍｇ、０．１５４４ｍｍｏｌ）のトリエチルアミン溶液（１５ｍＬ）を脱気後にトリメチルシリルアセチレン（１．２０ｍＬ）を加え窒素雰囲気下、還流６時間撹拌。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとぱして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ＝３０：１）により精製し白色粉末の化合物（５）（８５６．７ｍｇ、２．８２３ｍｍｏｌ、９１％）を得た。
実施例６
４−（３−エチニルベンゾイル）ベンゾニトリル（６）の製造
前記の実施例５で得られた化合物（５）（７３０．０ｍｇ、２．４０６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）にＴＢＡＦ−１Ｍ−ＴＨＦ溶液（３．６０ｍＬ、３．６０ｍｍｏｌ）と酢酸（０．２ｍＬ、３．４６ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間撹拌。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとぱして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ＝１５：１）により精製し白色粉末の化合物（６）（５１３．３ｍｇ、２．２１９ｍｍｏｌ、９２％）を得た。
実施例７
５−｛３−（４−シアノベンゾイル）フェニルエチニル｝−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（７）の製造
前記の実施例６で得られた化合物（６）（２７５．５ｍｇ、１．１９１ｍｍｏｌ）、５−ヨード−２’−デオキシウリジン（６５０．８ｍｇ、０．９９１４ｍｍｏｌ）、及びトリエチルアミン（０．２８ｍＬ、２．００９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）を脱気後にテトラキストリフェニルフォスフィンパラジウム（１２１．５ｍｇ、０．１０５１ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（１８９．７ｍｇ、０．９９６１ｍｍｏｌ）を加え窒素雰囲気下、５時間撹拌。反応混合物をクロロホルムで抽出し、水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとばして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：ｍｅｔｈａｎｏｌ＝１００：１）により精製し淡黄色粉末の化合物（７）（７２０．１０ｍｇ、０．９１８７ｍｍｏｌ、９３％）を得た。
実施例８
アミダイド誘導体（８）の製造
前記の実施例７で得られた化合物（７）（１６７．８ｍｇ、０．２１４１ｍｍｏｌ）をアセトニトリルで共沸した後、アセトニトリル（１ｍＬ）に溶かし、テトラゾール（０．３２０ｍｍｏｌ）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト（０．０９３ｍＬ、０．３５８６ｍｍｏｌ）を加え室温２時間撹拌。反応混合物は酢酸エチルで抽出し、水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒をとぱして濃縮。淡黄色泡状の化合物（８）（１９３．４ｍｇ、０．１９６３ｍｍｏｌ、９２％）を得た。
【００４０】
実施例９
３−ブロモベンゾフェノン（９）の製造
３−ブロモ安息香酸（４．１６００ｇ、２０．６９ｍｍｏｌ）の塩化チオニル溶液（１５ｍＬ）を一時間還流の後、塩化チオニルを留去し、ベンゼン（１５ｍＬ）に溶した。この溶液中に無水塩化アルミニウム（５．５０２ｇ、４１．２５ｍｍｏｌ）を数回にわけて加え、６時間室温で撹拌。氷水と塩酸を加えさらに３０分撹拌。反応混合物は酢酸エチルで抽出し、水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとばして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ＝２０：１）により精製し白色粉末の化合物（９）（４．３２１６ｇ、１６．５５ｍｍｏｌ、８０％）を得た。
【００４１】
実施例１０
３−トリメチルシリルエチニルベンゾフェノン（１０）の製造
前記の実施例９で得られた化合物（９）（３．０１２６ｇ、１１．５３７ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（２５．９ｍｇ、０．１１５４ｍｍｏｌ）及びトリフェニルフォスフィン（１２１．１ｍｇ、０．４６１７ｍｍｏｌ）のトリエチルアミン溶液（２０ｍＬ）を脱気後にトリメチルシリルアセチレン（５．０ｍＬ、３５．３８ｍｍｏｌ）を加え窒素雰囲気下、還流６時間撹拌。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとばして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ＝８０：１）により精製し淡黄色粉末の化合物（１０）（２．９２８２ｇ、１０．５１６９ｍｍｏｌ、９１％）を得た。
実施例１１
３−エチニルベンゾフェノン（１１）の製造
前記の実施例１０で得られた化合物（１０）（２．７２７２ｇ、９．７９５ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１５ｍＬ）に炭酸カリウム（１４．３ｍｇ、０．１０３５ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間撹拌。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとばして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ＝１００：１） により精製し白色粉末の化合物（１１）（１．５２１６ｇ、７．３３４ｍｍｏｌ、７５％）を得た。
実施例１２
５−｛３−ベンゾイルフェニルエチニル｝−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（１２）の製造
前記の実施例１１で得られた化合物（１１）（４７０．３ｍｇ、２．２８０ｍｍｏｌ）、５−ヨード−２’−デオキシウリジン（１００１．４ｍｇ、１．５２５ｍｍｏｌ）、及びトリエチルアミン（０．４２０ｍＬ、３．０１３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１２ｍＬ）を脱気後にテトラキストリフェニルフォスフィンパラジウム（１９４．３ｍｇ、０．１６８１ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（２８６．５ｍｇ、１．５０４ｍｍｏｌ）を加え窒素雰囲気下、４時間撹拌。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をとぱして濃縮。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ＝１：１）により精製し淡黄色粉末の化合物（１２）（９８１．８ｍｇ、１．２９４ｍｍｏｌ、８５％）を得た。
実施例１３
実施例８で得られた化合物（８）を用いて、常法により次式、
５’−ＡＡＴＡＣＡＴＴＧＧＴＧＧＣＵＴＴＧＡＧＴＡＴ−３’
（式中、ＣＵは、シアノベンゾフェノン（ＣＮＢＰ）エチニル基置換ウリジンを示す。）
で表される核酸オリゴマーを製造した。
【００４５】
実施例１４
実施例１３で製造された核酸オリゴマーに、波長３１２ｎｍの光を２時間照射した。光照射後、生成物を分析すると次式の切断位置に示されるように、
【００４６】
【００４７】
【発明の効果】
本発明の光感応性ヌクレオシドを用いることにより、ＤＮＡに光感応性の基、例えば、光感応性ベンゾフェノンを自由度無く固定して導入出来るために、クロスリンクなど反応の選択性は極めて高い。また、ＤＮＡに損傷を与えない波長の光により、容易に活性化できる利点を持つ。
Claims (10)
- 次式（Ｉ）、
で表される基がヌクレオシドの塩基部分に結合しているヌクレオシド、又はそのフォスフォロアミダイド誘導体。 - 塩基がウラシルである請求項１に記載のヌクレオシド、又はそのフォスフォロアミダイド誘導体。
- ヌクレオシド、又はそのフォスフォロアミダイド誘導体が、次式（II）、
- ヌクレオシド、又はそのフォスフォロアミダイド誘導体が、次式（III）、
で表されるフォスフォロアミダイド誘導体である請求項３に記載のヌクレオシド、又はそのフォスフォロアミダイド誘導体。 - 請求項１から４のいずれかに記載のヌクレオシド部分を少なくともひとつ含有してなる核酸オリゴマー。
- 核酸オリゴマーが、ＤＮＡである請求項５に記載の核酸オリゴマー。
- 塩基部分が次式（Ｉ）、
で表される基で置換されたヌクレオシドのフォスフォロアミダイド誘導体からなるフォスフォロアミダイド試薬。 - フォスフォロアミダイド試薬が、次式（III）、
で表されるフォスフォロアミダイト誘導体である請求項７に記載のフォスフォロアミダイド試薬。 - 請求項７又は８に記載のフォスフォロアミダイド試薬を用いて、次式（Ｉ）、
で表される基で置換されたヌクレオシド部分を少なくともひとつ含有する核酸オリゴマーを製造する方法。 - 請求項５又は６に記載の核酸オリゴマーに光を照射して、当該核酸オリゴマーを選択的に切断する方法。
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