WO1999006836A1

WO1999006836A1 - Methodes permettant de detecter ou d'analyser un virus

Info

Publication number: WO1999006836A1
Application number: PCT/JP1998/003476
Authority: WO
Inventors: Katsumi Aoyagi; Chiharu Ohue; Kumiko Iida; Tatsuji Kimura; Shintaro Yagi
Original assignee: Tonen Corporation
Priority date: 1997-08-04
Filing date: 1998-08-04
Publication date: 1999-02-11
Also published as: EP1801591B1; DE69837703T2; CN1207569C; CA2267207C; US20110262892A1; EP0967484B1; KR20030070138A; DE69837703D1; EP0967484A4; ES2286852T3; KR20000068705A; EP1801591A3; CN1492231A; CA2267207A1; CN1287154C; EP0967484A1; KR100523685B1; CN1239548A; KR100661760B1; US7776542B1

Description

明細書ゥィルスの検出又は測定方法技術分野

本発明はウィルスの検出又は測定方法及びそのための試薬に関する。背景技術

現在、種々のウィルス検出法は、血液や血液製剤中の感染性ウイルスの存在のスクリーニングゃ、疾患患者中のウィルスの有無の判定などに用いられている。しかしながら、それらの方法は、各種ゥィルスによっても若干異なるが、必ずしも高感度、高特異性を有している場合だけではなく、たとえそうであっても、高コストであつたり、ウイルス分離培養のように長時間を必要としたりするものが多い。以下、主に C型肝炎に関して述べ、本発明の背景技術とする

C型肝炎は、長い間その原因因子が明らかではなかったが、その遺伝子がクロ一ニングされ（S c i e n c e 2 4 4 ： 3 5 9 - 3 6 2， 1 9 8 9 ) 、その遺伝子を基に作られたリコンビナント抗原を用いた抗体測定による診断法が開発されたことにより（ S c i e n c e 2 4 4 ： 3 6 2 - 3 6 4 , 1 9 8 9 ) ；特表平 2 — 5 0 0 8 8 0号公報）、 H C V (C型肝炎ウィルス、 H e p a t i t i s

C V i r u s ) を原因因子とする、血液及び血液関連製剤を主たる感染経路とする感染症であることが明らかとなつた。組換えコァ抗原、組換え N S 3抗原を加えたいわゆる第 2世代抗体検査法の開発により、 H C V感染者のほとんどを血清検査により判別する事が可能となった。このことにより国内献血による感染をほとんど絶つことが可能となつた。

しかし H I V (ヒト免疫不全症ウィルス）などの一般的なウィルス感染症同様に、感染初期の抗体が生じて来るまでの期間、いわゆるウィンドピリオドと呼ばれる判別不能期間が存在し、売血が認められている地域などや国内の一部でも抗体検査では判別できなかつた血液由来の成分により、依然として二次感染が起こるリスクが存在している。また抗体検査は、その原理から感染後治癒した既住者力、、活動性の感染者か否かを判別することが出来ないことが問題である。

また現在 C型肝炎の治療にはインターフヱロン（ I F N) が用いられているが、 I F Nにより H C Vが駆除されて 6 ヶ月後には H C V抗体価が低下することから H C V抗体価を測定することのみにて治療効果を判別することが可能であるとする研究者もいる。しかし抗体価の動きは抗原刺激低下後、すなわち抗原駆除後数力月間以降でないと低下しないことから、抗体検査を行なうのみでは I F N投与により H C Vが駆除されたか否かを適時に的確に判別することが出来ない。すなわち治療のモニタリングを行なうためには、 H C V に対する抗体ではなく、 H C Vそのものを検出する方法が必要である

H C Vは他のウィルスたとえば H B V ( B型肝炎ウィルス）などに比して血中ウィルス量が低い事、および生体外（ i n i t r o ) で、または動物などを宿主としてウィルスを増殖させることが出来ないため、ウィルス粒子（ウィルス抗原）を直接検出する方法を確立することが困難であった。そのためウィルス抗原を検出する代わりに P C R (ポリメレ一スチェーンリアクション）法（ S c i e n c e 2 3 0 : 1 3 5 0 - 1 3 5 4 , 1 9 8 5 ) や分岐鎖 D N Aプローブ法により、ウィルスゲノム R N Aを検出する方法が開発された。しかしウィルスゲノムを検出する方法は、ウィルス抗原を検出する方法と比較していくつかの問題点がある。

まず検出する物質が R N Aであるため保存安定性が低いため、血清の凍結融解操作により定量値が低下するなどの問題が指摘されている。そのため従来の血清検査法よりも検体の保存に留意する必要が生じる。また検体の輸送の際にも細心の注意をはらう必要が有る o

例えば P C R法を用いた検査法は、遺伝子断片を検出するには最も高感度な検出方法であるが、検体中から H C Vゲノム R N Aを抽出する際、またゲノム R N Aから铸型 D N Aへの逆転写の際にロスを生じやすく安定した定量値を得るためには熟練を要すること、また増幅を行うことが重要な原理であるために、コンタミネ一ションを起こした際、高頻度に偽陽性を生ずるなどの問題があり、一度に大量の検体を処理することができない。また簡便とされる方法を用いても前処理時間が 2 時間以上も必要であり、多数回の遠心操作を含むなど煩雑である。加えて、このように操作が繁雑であるために、コンタミネ一シヨンの機会が増え、偽陽性検体の生じる可能性を増加させている。一方分岐鎖 D N Aプローブ法は検出感度が低く、結果が得られるまで約 2 0 時間を要し（医学と薬学 3 1 : 9 6 1 - 9 7 0 , 1 9 9 4 ) 、感度、操作時間という点で課題が残されている。

上記のウィルスゲノムを検出する方法の問題点を解決するために、ウィルス抗原を直接検出する方法も開発された。 '特開平 8 — 2 9 4 2 7 に示されているように、 H C Vのコア抗原に対して特異性を有するモノクロ一ナル抗体を用いて、血清中のコア抗原を検出する方法が開発された。本報は田中等（ J 0 u n a 1 o f H e p a t o 1 o g y 2 3 : 7 4 2 - 7 4 5 , 1 9 9 5 ) および藤野等（医学と薬学 3 6 : 1 0 6 5 — 1 0 7 0， 1 9 9 6 ) に報告されているように血清中に存在するコア抗原を検出することにより、上記のウィルスゲノムを検出する方法同様に臨床的有用性を持つことが示されている。しかしながらウィルスゲノム検出法と同様にいくつかの点で大きな問題が残されている。

一点は P C R法と比較して感度が低いため、血清スクリーニングの最終検査に用いることが出来ないことである。田中等（ J o u n a 1 o f H e p a t o l o g y 2 3 ： 7 4 2 - 7 4 5 , 1 9

9 5 ) は， H C V R N A量として、 1 0 ¹ 〜 1 0 ⁵ コピー Zml間が検出限界であることを示しており、藤野等（医学と薬学 3 6 ：

1 0 6 5 — 1 0 7 0 , 1 9 9 6 ) は、最も感度が高い検出方法である C R T (コニペティテブリバーストランスクリプション）一 P C R法で R N A陽性に分類される C型慢性肝炎患者 1 0 2例の治療前血清において、 6 7 %の陽性率であることを報告している。すなわち、感度の高い C R T— P C R法と比較した場合に感度の面で大きく劣っている。

さらに測定のための検体処理の工程が繁雑であり、かつ時間がかかることがスクリーニングなどの用途に用いようとした際に問題となる。すなわち検体（血清）の処理のために、ウィルス粒子の濃縮と血清成分の'除去のためのポリエチレングリコール（ P E G) 処理 ( 4 °C 1 時間）、遠心操作（ 1 5分間）、上清の除去、尿素処理、アルカリ処理（ 3 7 °C 3 0分間）、中和剤添加といった多段階処理工程を必要とする。また強固に形成され、 P E Gにより粘性を増した沈殿の尿素処理による分散工程は、非常に熟練を要する作業である。そのため、再現性を得るためには熟練度が必要であり、また最低約 2 時間の処理時間が必要である。さらに遠心操作、上清除去等の工程があるために、自動化が困難で、かつ同時大量処理を困難にしており操作面においてもスクリーニングなどの大量処理を必要とする用途に適していない。

一方ウィルス抗原検出系は、以下の点で高感度 P C R法と比較して優れている点がある。すなわち検出過程で過度の増幅処理操作が加わらないため、コンタミネーシヨンに対し、非常に寛容である。また R N Aのように不安定な物質を検出するのではなく、比較的安定な物質である抗原蛋白質を検出することから、検体の保存に過度の注意をはらう必要がなく、 P C R検体に求められる超低温槽のような特別な機器を用いる必要もなく、また検体の輸送も容易になる o

これらの特長は、例えば血液事業や健康診断の様に、多数の検体を測定する用途に適した要件である。しかしながら、既に指摘したように、開示されているコア抗原検出法は、前処理が煩雑で自動化に適していない、感度が低く例えば血液事業などの感度が求められる様な用途におけるゴールデンス夕ンダードになり得ないなどの理由により、多数の検体を扱ういわゆるスクリーニング用途に用いることが出来ず、 P C R法に対して優れている点を活かすことが出来ていない。また、臨床的に有用性が高い測定方法は、常に感度、特異性、再現性、操作性、低コストを課題とし、これらを全て満たすように鋭意開発していく必要性がある。 H C V以外のウィルス抗原の検出に関しても、特に多数の検体を測定するスクリーニング用途においては、 P C R法と比較して低感度であったり、また有用な前処理法やその抗原の露出がされないといった理由のために実用化されていないものが多い。発明の開示本発明の目的は、血液事業や健康診断のような、いわゆるスクリ

—ニング用途の如き多数の検体を処理するのに適した H C V抗原検出法を含めた各種ウィルス抗原検出法を提供することである。すなわち P C R法と比較し同等の感度、特異度を持ち、前処理を簡便化すること、あるいは前処理操作をせずに容易に自動化などの大量処理システムに適用可能な H C V抗原を含めた各種ウィルス抗原検出系を提供することである。以下主に H C Vに関して本発明の態様を説明する。

本発明の第一の態様（その 1 ) によれば、ウィルス粒子を破壊して、ウィルス抗原を十分に露出し、ウィルス抗原に対する抗体が存在する場合には該抗体を破壊して、ウィルス抗原を検出又は測定することにより H C Vを検出又は測定する手段を提供する。

従って、本発明は、（丄）ウィルスを含む検体を、（ 1 ) 陰ィォン性界面活性剤及び、（ 2 ) 両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤又は蛋白質変性剤のいずれかを含む処理液で処理することを特徴とするウィルス含有検体の処理方法を提供する。

本発明はまた、（ ) ウィルスを含む検体を、（ 1 ) 陰イオン性界面活性剤、（ 2 ) 両イオン性界面活性剤、及び（ 3 ) 非イオン性界面活性剤又は蛋白質変性剤のいずれかを含んだ処理液で処理することを特徴とするウィルス含有検体の処理方法を提供する。

本発明はまた、（ _) ウィルスを含む検体を、（ 1 ) 陰イオン性界面活性剤、（ 2 ) 両イオン性界面活性剤、（ 3 ) 非イオン性界面活性剤、及び（ 4 ) 蛋白質変性剤を含んだ処理液で処理することを特徴とするウィルス含有検体の処理方法を提供する。

本発明はさらに（丄）前記（丄）〜（）のいずれかに記載の検体処理方法を用いて、ウィルス抗原を特異的に認識するプローブを反応させることにより、ウィルス抗原の存在を検出又は定量することを特徴とするウイルスの測定方法を提供する。

本発明はさらに、前記（）の免疫測定方法に用いるための、陰ィォン性界面活性剤を含んで成る、検体中のゥィルスの有無を判別するキット、定量するキット又は診断薬を提供する。

本発明はさらに、前記（）の免疫測定方法に用いるための、後記のモノクローナル抗体を含んでなる、検体中のウィルスの有無を判別するキッ卜、定量するキット又は診断薬を提供する。

本発明の第一の態様（その 2 ) によれば、ウィルス粒子を破壊して、ウィルス抗原を十分に露出し、ウィルス抗原に対する抗体が存在する場合には該抗体を破壊して、ウィルス抗原を検出又は測定することによりウィルスを検出又は測定する手段を提供する。

従って本発明は、（）ウィルスを含む検体を、（ 1 ) カオ卜口ピックイオン、及び（ 2 ) 酸性化剤を含む処理液で処理することを特徴とするウィルス含有検体の処理方法を提供する。

本発明はさらに、（A) ウィルスを含む検体を、（ 1 ) カオトロピックイオン、（ 2 ) 酸性化剤、及び（ 3 ) 非ィォン性界面活性剤を含む処理液で処理することを特徴とするウィルス含有検体の処理方法を提供する。

本発明はさらに、（丄）上記（ ) 及び（_ _ ) の検体処理方法を用いて、ウィルス抗原を特異的に認識するプローブを反応させることにより、ウィルス抗原の存在を検出又は定量することを特徴とするウィルスの測定方法を提供する。

本発明はさらに、上記（丄）の方法に使用するためのカオトロピック剤を含んで成る、検体中のウィルスの有無を判別するキット、定量するキット又は診断薬を提供する。

本発明はさらに、上記（丄）の内、 H C Vの免疫測定方法に用いるための、ハイプリドーマ H C 1 1 — 1 4 ( F E R M B P— 6 0 0 6 ) ， H C 1 1 — 1 0 ( F E RM B P— 6 0 0 4 ) または H C 1 1 - 1 1 ( F E RM B P— 6 0 0 5 ) により生産されるモノク口一ナル抗体を含んでなる、検体中の H C Vの有無を判別するキット、定量するキット又は診断薬を提供する。

本発明の第二の態様によれば、ウィルスに対する抗体がまだ生成していないウインドピリォドにおけるウイルス抗原の検出又は測定方法を提供する。この方法においては、ウィルス粒子を破壊してゥィルス抗原を露出せしめるだけで十分であり、ウィルス抗原に対する血中の抗体を破壊する必要がない。

従って本発明はさらに、ウィルスの測定方法において、炭素数 1 0個以上のアルキル基と第 2、第 3 または第 4級アミンとを有する界面活性剤もしくは 1 2 ~ 1 4 の新水疎水比（ H L B ) を有する非イオン界面活性剤、又はこの両者の存在下で、ウィルス抗原をそのプローブとの結合により測定することを特徴とする方法を提供する本発明はさらに、上記のウィルス抗原の内、 H C Vコア抗原の検出のためのプローブとして適するモノクローナル抗体を生産する H C 1 1 一 1 1 ( F E RM B P - 6 0 0 5 ) , H C 1 1 - 1 4 ( F E R M B P - 6 0 0 6 ) , H C 1 1 - 1 0 ( F E RM B P— 6 0 0 4 ) ， H C 1 1 - 3 ( F E RM B P— 6 0 0 2 ) 、及び H C 1 1 - 7 ( F E RM B P— 6 0 0 3 ) から成る群から選択されるハイプリドーマ細胞株を提供する。

本発明はまた、 H C 1 1 — 1 1 ( F E RM B P— 6 0 0 5 ) ， H C 1 1 - 1 4 ( F E RM B P - 6 0 0 6 ) ， H C 1 1 - 1 0 ( F E RM B P - 6 0 0 4 ) , H C 1 1 - 3 ( F E RM B P— 6 0 0 2 ) ， H C 1 1 — 7 ( F E RM B P - 6 0 0 3 ) から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクロ一ナル抗体を提供する。

さらに、 R NAウィルスである H C Vや、 D NAウィルスである H B Vはともにこれらのゲノム R N Aや D N Aを包む構造蛋白質と、それを取り囲む膜蛋白質や脂質膜からなる構造をもつウィルス粒子を形成するウィルスである。いずれの態様においても、本発明の処理法を用いることにより、 H C Vや H B Vだけでなく、これらと同じような構造をもつウイルス粒子を破壊して、ウィルスの抗原を十分に露出させ、その抗原を検出または測定することによりそのゥィルスを検出または測定することをも提供する。図面の簡単な説明

図 1 は、検体処理において S D S添加濃度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ n o r m a 1 ) および H C V— R N A陽性パネル血清 1 3， 5 0を使用した。

図 2 は、検体処理において C H A P S添加濃度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ n o r m a 1 ) および H C V— R N A陽性パネル血清 1 3 , 5 0を使用した。

図 3 は、検体処理において尿素添加濃度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ n o r m a 1 ) および H C V— R N A陽性パネル血清 1 3， 4 4， 5 0を使用した。

図 4 は、検体処理における T r i t 0 n X 1 0 0添加温度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ n o r m a 1 ) および H C V— R N A陽性パネル血清 1 3， 4 4， 5 0を使用した o

図 5は、検体処理中の温度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（n o r m a 1 ) および H C V— R N A陽性パネル血清 1 3， 4 4， 5 0を使用した。図 6 は、標準血清のパネル血清を 5 0を l U/mlとして段階的に希釈し、検体処理した試料を本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドィッチ反応系の希釈検量線と検出感度を示す図である。

図 7 は、標準血清のパネル血清 5 0を l U/mlとして段階的に希釈し、検体処理した試料をサンドィツチィムノアッセィ反応系で測定したときの希釈検量線と検出感度を示す図である。基質に発光物質を用いている。

図 8 は、パネル血清 1 3を、検体処理をおこなってから、ゲル口力カラムを用いて分画し、その分画中のコア抗原免疫活性を測定したものである。分子量は、 I g Gは約 1 5 0 k D、アルブミンは約 6 8 k Dである。

図 9 は、 P C R陽性検体を、本発明の検体処理後その遊離したコァ抗原活性を測定した値とアンプリコア H C Vモニター（ P C R法 ) で求めた H C V— R N A量との相関性を示す図である。

図 1 0 は、検体処理において塩酸グァニジン添加濃度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ n o r m a 1 ) および H C V— R N A陽性パネル血清 1 3， 5 0を使用した。

図 1 1 は、検体処理において T r i t o n X I 0 0添加濃度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ n o r m a 1 ) および H C V— RNA陽性パネル血清 1 3， 5 0を使用した。図 1 2 は、検体処理において T w e e n 2 0添加濃度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ n o r m a 1 ) および H C V— R N A陽性パネル血清 1 3， 5 0を使用した。

図 1 3 は、検体処理中の温度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ n o r m a 1 ) および H C V— R N A陽性パネル血清 1 3 , 5 0を使用した。

図 1 4 は、標準血清のパネル血清 5 0を l UZmlとして段階的に希釈し、検体処理した試料をサンドィツチィムノアッセィ反応系で測定したときの希釈検量線と検出感度を示す図である。

図 1 5 は、パネル血清 1 3を、検体処理をおこなってから、ゲルロカカラムを用いて分画し、その分画中のコア抗原活性を測定したものである。分子量は、 I g Gは約 1 5 O k D、アルブミンは約 6 8 k Dである。

図 1 6 は、アンプリコア H C Vモニターキッ卜で陽性を示した検体について、本発明の検体処理後その遊離したコァ抗原活性を測定した値とアンプリコア H C Vモニタ一（ P C R法）で求めた H C V 一 R N A量との相関性を示す図である。

図 1 7 は、組換え B型肝炎（H B V) コア抗原を本発明の方法により測定した場合の標準曲線を示す。発明の実施の形態

本発明の対象となるウィルスは、ゲノム R N A又は D N Aを包む構造蛋白質と、それを取り囲む膜蛋白質又は脂質膜から構成される構造を有するウィルス粒子を形成するウィルスである。

ゲノムとして R N Aを有する上記ウィルスの代表的例としては C 型肝炎ウィルス（H C V) 、及び H C V類縁ウィルスが挙げられる

H C V類縁ウィルスとしては、 D型肝炎ウィルス、 E型肝炎ウイルス、 G型肝炎ウィルス、手足口病ウィルス、フラビウィルス（黄熱ウィルス、西ナイルウィルス、日本脳炎ウィルス、デングウィルス）、トガウィルス（アルファゥイノレス、ノレピウイノレス、アルテリゥイノレス、ノレべラウイノレス）、ぺスチウイノレス（ブタコレラウィルス、ゥシ下痢ウィルス）、パラミクソウィルス °ラインフルェンザゥイノレス 1 2 3 4、ィヌジステム —ゥイノレス、ニュー力ッスル病ウィルス、 R S ウィルス、リンダペストウィルス、サルパラインフルエンザウイルス、麻疹ウィルス、ムンプスウィルス）、オルソクソウィルス（ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルェンザゥイノレス、ゥマインフノレエンザウィルス、ブタインフルェンザウィルス）、ラブドウィルス（狂犬病ウィルス、水泡性口内炎ゥィルス）、ピコルナウィルス（ポリオウイルス、コクサツキ一ウイルス、エコーウイノレス、ゥシェンテロウイノレス、ブタエンテロウイルス、サルェンテロウィルス、マウス脳脊髄炎ウィルス、ヒトライノウィルス、ゥシライノウィルス、ゥマライノウィルス、口蹄疫ゥィルス、 A型肝炎ウィルス）、コロナウィルス（ヒトコロナウィルス、ニヮトリ伝染性気管支炎ウィルス、マウス肝炎ウィルス、豚伝染性胃腸炎ウィルス）、ァレナウィルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ゥィルス、ラサウィルス、韓国型出血熱ウィルス）、レトロウイルス ( H T L V ：ヒト成人白血病ゥィルス、 H I V ：エイズウイルス、ネコ白血病肉腫ウィルス、牛白血病ウィルス、ラウス肉腫ウィルス ) 、レオウィルス（ロタウィルス）、力リシウィルス（ノーウォークウィルス）、ブンャウィルス（腎症候性出血熱ウィルス）、フィロウィルス（エボラウィルス、マールブルグウィルス）などがあげれる。

また、ゲノムとして D N Aを有する上記ウィルスの代表例としては B型肝炎ウィルス（H B V ) 、及び H B V類縁ウィルスが挙げられる。 H B V類縁ウィルスとしては、ボックスウィルス（ヮクシ二ァウィルス、アラストリウムウィルス、牛痘ウィルス、天然痘ウイノレス）、ルボウイノレス（ヒ、°ルボウイルス、豚パルボウイルス、牛パルボウイルス、犬パルボウイルス、ネコ白血球減少症ウィルス、ミンクァリュ一シャン病ウィルス）、パボーバウィルス、°ピ口一マウイノレス、ポリオ一マウイノレス）、アデノウイノレス、ヘルべスウィルス（単純へルぺスウィルス、サイ卜メガロウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、 E B ウィルス、馬へルぺスウィルス、ネコヘルぺスゥイノレス、マレック病ゥイノレス）、アフリカ豚コレラウイノレスなどがあげられる。

また、これらの他にも各種病原性のあるウィルスが知られているし、また未確認のウィルスもまだ存在しているが、それらのウィルス構造が前述のように、ゲノム R N A又は D N Aを包む構造蛋白質と、それを取り囲む膜蛋白質や脂質膜から構成される構造をもつゥィルス粒子を形成するウィルスであれば、本発明の処理方法により、免疫測定法に適した状態に遊離させることができることは明白である。

主に H C Vを中心に実施形態を述べる。 H C Vは血中濃度が 1 0 ² コピー Z ml〜 1 0 ^s コピー mlと、 H B V ( 1 0 ⁹ コピー/ ml ) と比較し低いことから、ウィルス抗原を検出するためには極めて高い感度を必要とする。

一般に抗体をプローブとする免疫学的な手法に代表される検出方法に於て、検出感度を増加させる方法としては、 I ) 検出する抗原分子の分子数を上昇させる、 I I ) 抗原に結合するプローブ、例えば抗体の分子数を上昇させる、 I I I )検出感度の下限を規定するプロ一ブ、例えば抗体と抗原以外の物質との結合などに起因する非特異反応を減少させる、 I V) 検出に用いる標識物の検出感度を増加させる方法が考えられ、これらの方法を組み合わせることにより感度を上昇させることが可能となる。

抗原分子数を増加させる方法としては、 I 一 1 ) 検体の量を増加させる事が最も容易に考えられることである力、一般的に用いられている反応系（例えば 9 6 w e 1 1 ィムノプレート）では最大添加可能な容量は 3 0 0 1 程度であり自ずと上限が規定されるので、 I - 2 ) 濃縮により反応系に加える分子数を増加させる方法が用いれ

抗原に結合する検出のためのプローブ、例えば抗体の分子数を上昇させるためには、 Π— 1 ) 複数のプローブ、例えば抗体を用いることにより認識ェピトープの数を増加させる、 1 1一 2 ) プローブ、例えば抗体と抗原との親和性（ァフィニティ一及びアビディティ一 ) を上昇させることにより、単位時間あたりに結合する抗体の数を増加させる事が容易に考えつく手法である。ここで抗原とプローブ

、例えば抗体の親和性を向上させる方法としては、反応系の緩衝液の組成を変化させる方法、プローブを改変する方法、これらの組み合わせが考えられる。 I I一 3 ) ビーズや磁性粒子などの表面積の広い担体に多量に抗体を結合させることによって、限られた量の抗原との反応面積を広くすることにより、多くの抗原を捕獲することも考えられる。

また感染症の場合は検体中に抗原と結合する高い親和性を示すヒト抗体が存在することが予想され、これらの抗体のェピトープが検出に用いるプローブ、例えば抗体のェピトープと重なることにより競合反応が起こり検出に用いる抗体数の減少につながることが予想されるため、この検体中の反応を阻害する抗体を除く事により抗原に結合する検出のための抗体の分子数を増加させる事につながる（ I I一 3 ) 。

非特異反応を減少させる方法を一般化することは困難であるが、 I I I - 1 ) 緩衝液組成を変化させることによりプローブ、例えば抗体の抗原との親和性（ァフィニティ一及びアビディティー）を上昇させることにより非特異反応を軽減させる、 I I I - 2 ) 非特異反応の原因物質を除去するなどの方策が考えられる。

標識物の検出感度を上昇させる方法としては、 I V— 1 ) 検出感度の高い標識物（放射性同位元素など）を用いる、 IV— 2 ) 酵素や触媒を標識物に用いることにより信号を増幅させる、 IV— 3 ) 酵素基質をより感度の高い基質に改変する、 IV— 4 ) 酵素反応、化学反応の基質のシグナルを化学的、または電気的、機械的に増幅させる、 IV- 5 ) 抗体当たりの標識物の数を增加させる、 IV— 6 ) シグナルの検出に用いる機器の感度を上昇させるなどの方法が考えられる。開示されている H C Vコア抗原検出法の前処理法の工程を解析すると、検体にポリエチレングリコールを加えた後に遠心操作により H C Vを沈殿として回収することにより抗原を濃縮する（ I 一 2 ) ことと同時に血清成分の一部を除去する（II一 2 ) 工程を行った後、尿素とアル力リ剤を含む溶液に再懸濁することにより検体中に存在するヒト抗体を不活化し（11— 3 ) H C Vからコア抗原を遊離させる工程、非イオン性界面活性剤（ T r i t o n - X 1 0 0 ) と中和剤を含む溶液を加えることによりモノクローナル抗体と反応させる溶液にする工程から成り立つている。

既に上記に指摘したように遠心操作、沈殿の再懸濁操作が操作上煩雑な過程であり、熟練度を必要とする過程である。従って本発明の達成目標は、これらの操作上の問題点を解決したコア抗原検出系である。

H C Vそれ自体はいまだその姿が明らかとなっていないが、そのゲノム構造、類縁のウィルス粒子の構造、一般的なウィルスに関する情報から、 H C V粒子はゲノム R N Aがコア抗原によりパッキングされ、それを取り囲むように脂質膜にアンカリングしている E 1 ， E 2 /N S 1抗原からなる外被蛋白質によって囲まれた状態で存在するものと推定される。

そのためコア抗原を検出するためには外被を取り除き、コア抗原の検出に用いるプローブ、例えば抗体が結合できるようにする必要がある。またウィルス粒子は血中では L D L (低密度リポ蛋白質）などに囲まれた複合構造を取っていることが報告されており、さらに外被蛋白質に対する抗体も存在することから、ウィルス粒子と抗外被蛋白質抗体との免疫複合体としても存在することが予想される。すなわち検出する抗原の分子数を增加させるためには、ウィルス粒子から効率よく外被やウィルス粒子を取り囲む夾雑物を取り除き、かつコア抗原分子を効率よく遊離させることことが重要である。

H C V以外のウィルスに関してもほぼ同じことが言え、ウィルスの構造タンパク質を効率よく遊離させなくてはいけない。

従って、本発明は、検体（血清）中のウィルス抗原を、遠心分離のような煩雑な操作によつて濃縮することなく、プローブを用いた検出に適した状態にさせる処理方法に関する。

さらに上記のように検体中には検出に用いるプローブ、例えば抗体と結合を競合するヒト抗体が高力価で存在するため、これを取り除く操作が、感度上昇のために重要である。

従って本発明の 1 つの態様においては、検体中のウィルス抗原を簡易に遊離させる処理方法を用い、検体中に存在するヒト抗体をも同時に不活化させる処理方法に関する。

本発明によって示される処理方法を用いることにより、検体中に存在するウィルス抗原は、プローブ、例えば抗体との免疫複合体を形成するのに適した状態でウイルス粒子または免疫複合体から遊離し、同時に検出反応を阻害する検体中に存在するヒ卜抗体をも同時に不活化させることにより、例えば抗体のようなプ口一ブを用いた免疫測定法によって容易にかつ感度高く検出することが可能となる本発明の第一の態様（その 1 ) によれば、検出に用いるプローブ、例えば抗体はウィルス抗原に特異的に結合するものであり、一定の高い親和性を示し、反応系に加えた際に非特異反応などを誘発しないようなものであればよい。例えば、 H C Vコア抗原の検出においては、実施例 4 に示す様に、一次反応に用いるプローブの一つは H C Vコア抗原の C端側を認識し結合できるものが含まれていることが好ましい。ここでコア抗原の C端側とは、配列番号 2 に示す配列の 8 1 番目から 1 6 0番目の配列、もしくはその一部をいう。さらにここにコァ抗原の N端側に対するプロ一ブが含まれていても良い。ここでコア抗原の N端側とは、配列番号 2 に示す配列 1 0番目から 7 0番目の配列、もしくはその一部をいう。

また、本発明の第一の態様（その 2 ) によれば、検出に用いるプローブ、例えば抗体はウィルス抗原に特異的に結合するもので有り、一定の高い親和性を示し、反応系に加えた際に非特異反応などを誘発しないようなものであればよい。例えば、 H C Vコア抗原の検出においては、一次反応に用いるプローブの一つは H C Vコア抗原の N端側を認識し結合できるものが含まれていることが好ましい。ここでコァ抗原の N端側とは、配列番号 2 に示す配列の 1 0番目から 7 0番目の配列、もしくはその一部をいう。さらにここにコア抗原の C端側に対するプローブが含まれていても良い。ここでコア抗原の C端側とは、配列番号 2 に示す配列 8 1 番目から 1 6 0番目の配列、もしくはその一部をいう。

いずれの態様においても、プローブとしては、マウス、ゥサギ、ニヮトリ、ャギ、ヒッジ、ゥシなどの実験動物を免疫して得られるポリクローナル抗体、免疫した個体から、脾臓細胞を分離し、ミエローマ細胞と融合させることによって得られるハイプリドーマの産生するモノクローナル抗体、または脾臓細胞、血中白血球を E Bゥィルスによって不死化させた細胞の産生するモノクローナル抗体、 H C Vに感染しているヒトもしくはチンパンジーなどが産生している抗体；マウス、ヒトなどのィムノグロプリンの c D N Aもしくは染色体 D N Aから得られる可変領域遺伝子断片、またはィムノグロプリンの c D N Aもしくは染色体 D N Aの一部と人工的に作製した配列とを組み合わせることによって構成される可変領域遺伝子断片、人工的な遺伝子配列を用いて構成される可変領域遺伝子断片またはこれらを材料に遺伝子組換え手法によつて作製される可変領域遺伝子断片を、ィムノグロブリン定常領域遺伝子断片を組み合わせることによって構成される組換え抗体遺伝子によって形質転換された細胞が産生する組換え抗体；上記の可変領域遺伝子断片と例えばバクテリオファージの構造蛋白質と融合させて作られるファージ抗体、上記の可変聴域遺伝子断片を他の適用な遺伝子断片例えば m y c 遺伝子の一部などと組み合わせることにより構成される組換え抗体遺伝子によって形質転換された細胞が産生する組換え抗体、トリプシン分子に可変領域を人工的に導入することによって産生されるプローブ、レセプターなどの蛋白質に特異的に結合する分子を人工的に改変することによって得られるプローブ、その他コンビナトリアルケミス卜リ一技術によって作製されたプローブなど、コア抗原に高い特異性、親和性を示す分子であればそれを用いることが出来るさらに本発明はウィルス抗原を含む検体から、上記のウィルス抗原とそのプローブ、例えば抗体との免疫複合体を形成するのに適した状態にするため、ウィルス粒子または免疫複合体から遊離し、同時に検出反応を阻害する検体中に存在するヒト抗体をも同時に不活化させる処理剤によって検体を処理する工程、遊離したコア抗原を例えば抗体のようなプロ一ブを用いた免疫測定法によって検出並びに定量するアツセィ方法、並びに検査キットを提供する。

本発明によつて示される検体処理剤と処理方法本発明における検体には、全血、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液などの生物学的体液、および肝組織などが含まれる。

本発明においては、検体を煩雑な操作なく、プローブ例えばモノクローナル抗体と結合反応させるのに適した状態に検体中のコア抗原などのゥィルス抗原を処理する方法が最も重要な要件である。すなわち、抗原分子数を增加させるために、ウィルス粒子中などに含まれるコア抗原などのウィルス抗原を効率よく遊離させることが重要になる。

既に S D S ( ドデシル硫酸ナトリウム）ポリアクリルアミド電気泳動法（ S D S— P A G E ) によっても知られているように、ほとんどの蛋白質は S D S存在下の熱処理により変性し、共有結合によつて結合している分子以外はモノマーになる。すなわち、測定検体に S D S等の陰イオン性界面活性剤を含む処理剤を添加すると、ゥィルスを破壊すると同時に検体中の抗コァ抗体などのウイルス抗原に対する抗体をも変性させ、検体中のコア抗原などのウィルス抗原を遊離させることが可能である。このことは、 H C Vコア抗原を例に挙げると、実施例 7 に示す様に、 S D Sを含む処理剤で処理した H C V感染検体中のコア抗原を、ゲル濾過を用いた分子量解析にかけると、理論上から予想される単量体の位置に検出されることからも確認された。

また柏熊等（J . I mm u n o l o g i c a l M e t h o d s 1 9 0 7 9 — 8 9， 1 9 9 6 ) によって報告されているように、組換え H C V発現細胞抽出液からなる検体を、 S D S— P A G E により分離し、ゥヱスタンプロット法によりコア抗原を検出すると、単量体と思われる分子量の位置にその免疫活性が検出される。 S D Sを含む変性剤を検体に加えることにより、抗原を効率よく遊離させ抗原分子数を増加させることができることはこの分野に属するものであれば容易に考え得る。

しかしながらよく知られているように S D S等の陰イオン性界面活性剤は蛋白質変性作用が大きいため、その存在下でそのままプロ —ブ、例えば抗体との免疫複合体形成反応に加えると、抗体をも変性させ、その機能を失わせ感度低下を導く。また、 S D S等の陰ィォン性界面活性剤処理によってェピトープ構造が失われることが知られており、その結果として抗体の結合が弱められ、感度が低下する。これらの感度低下につながる影響を除くため、 S D S処理後何らかの方法で変性作用を弱める必要が有る。

陰イオン界面活性剤を含む界面活性剤は、例えば透析、限外濾過、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換法、沈殿法、膜転写法などにより除くことが出来ることが知られており、上記のようにウェスタンプロット法、ゲル濾過法により抗原が検出可能であることは、 S D S処理後、なんらかの操作を加えることにより抗原抗体反応を行なわせることが可能であることを示している。しかしながら、これらの処理を行なうことは、何れも時間と煩雑な操作を必要とするため本発明の目的に適した方法ではない。

また過剰量の反応液によって希釈することにより、変性作用を示さない濃度まで低下させることにより反応に影響を与えない様に出来るが、この方法では反応液が増加し、例えばマイクロタイターゥヱルを用いる測定方法などの加えるサンプル量に制約が有る免疫測定法に適用できないため、本発明の目的に適していないことは明らかである。

そこで本発明者は、本発明の第一の態様（その 1 ) において、陰イオン性界面活性剤を含む処理剤を添加し、さらに何らかの添加剤を加えることにより、陰イオン性界面活性剤による変性効果を、抗体などのプローブに影響を与えないように弱めることが出来ないか、また同時に陰ィォン性界面活性剤によるコア抗原遊離作用を増強することができないかを検討した。

ここで本発明者は、 S D S等の陰イオン性界面活性剤以外の界面活性剤を含む処理剤を添加することにより、 S D Sの固相化抗体に対する変性作用を弱め、その結果 S D Sを含む処理剤のみと比較して、感度を上昇させることが出来ることを見いだした。また、 S D S等の陰ィォン性界面活性剤を含む処理剤に、それ以外の界面活性剤や尿素などの水素イオン結合を弱める薬剤を同時に加えた処理剤とした場合にも、同様の効果を認めるとともに、ウィルス粒子からのコア抗原遊離および検体中抗コア抗原抗体の不活化を強くすることによって、コア抗原の遊離がさらに増強されることを見いだした。さらに S D S とその他の界面活性剤を含む処理剤を添加した後熱処理工程を行なうことにより、より高感度にコア抗原を検出できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。

ここで、検体の処理に用いる陰ィォン性界面活性剤は S D S以外でも、セチル硫酸ナトリウムや他のアルキル化硫酸エステル、ドデシルスルホン酸ナトリゥムのようなアルキル化スルホン酸塩、アルキルァリルスルホン酸塩などでも可能であり、陰イオン性界面活性剤以外に加える界面活性剤としては、 C H A P S ( 3 — 〔 3 —コラミドプロピル）ジメチルアンモニォ〕一 1 —プンスルホン酸） , C H A P S O ( 3 — 〔コラミドプロピル）ジメチルアンモニォ〕 - 2 ーヒドロキシ一 1 —プンスルホン酸）、ドデシルー N —べタイン、 3 — ( ドデシルジメチルアンモニォ）一 1 —プロパンスルホン酸などの両イオン性界面活性剤や T r i t o n X 1 0 0 などのポリオキシエチレンイソォクチルフヱニルエーテル類、 N P 4 0 などのポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル類、 T w e e n 8 0 などのポリオキシエチレンソルビトールエステル類、 B r i j 5

2 l 8のようなポリオキシエチレンドデシルエーテル類、ォクチルグルコシドといつた非ィォン性界面活性剤が適当で有り、好ましくは C H A P Sなどの両イオン性界面活性剤と T r i t o n— X 1 0 0などの非イオン性界面活性剤を含む。また、ここに尿素、チォ尿素などの蛋白質の高次構造を壊す様な作用を示す薬剤（蛋白質変性剤）を加えることも効果的である。

処理の際の濃度は、 S D Sは 0. 5 %以上、 C H A P Sは、 0. 1 %以上、尿素は 1 M以上、 T r i t o n X l 0 0 は 0. 1 %以上 0. 7 5 %以下で使用することがより好ましい。

以上のような検体の処理温度は、通常一般実験室で用いられている範囲である 4 °C以上 1 0 0 °C以下であればよいが、非イオン性界面活性剤添加の場合は、その曇点に注意が必要である。好ましくは、 3 7 °C以上であり、さらに血清の非働化に一般的に用いられている 5 0 - 6 0 °C処理が効果的である。

ヘモグロビンによる妨害の除去

測定用試料として血清等を使用する場合、該試料に含まれる赤血球が、前記の前処理の間に溶血してヘモグロビンが放出され、この変性ヘモグロビンが H C Vコアのようなウィルス抗原に結合して測定を妨害する場合がある。従って本発明の第一の態様においては、ヘモグロビン中のヘムを捕捉して測定の妨害を除去することが好ましい。このための添加剤として、尿素、イミダゾール環含有化合物及びインドール環含有化合物の内少なくとも 1種を添加するのが好ましいことを見出した。

ィミダゾ一ル環含有化合物としてはィミダゾール、ヒスチジン、ィミダゾールアクリル酸、イミダゾ一ルカルボキシァルデヒド、ィミダゾールカルボキサミド、イミダゾ一ルジオン、イミダゾ一ルジチォカルボン酸、イミダゾールジカルボン酸、イミダゾールメタノール、イミダゾリジンチオン、イミダゾリドン、ヒスタミン、イミダゾピリジン等が挙げられる。

また、インドール環含有化合物としては、トリブトファン、インドールアクリル酸、インドール、インドール酢酸、インドール酢酸ヒドラジド、インドール酢酸メチルエステル、インドール酪酸、ィンドーノレァセトニトリノレ、インドーノレカノレビノール、インド一ノレ力ノレボキシァルデヒド、インド一ルカルボン酸、インドールエタノーノレ、インドール乳酸、インドールメタノール、インドールプロピオン酸、インドールピルビン酸、インドリルメチルケトン、インドーマイシン、インドールアセトン、インドメタシン、インドプロフエン、インドラミン等が挙げられる。

添加量としては尿素は 0 . 5 M〜 5 Mの濃度が適当であり、インド一ルァクリル酸は 5 mM〜 5 0 mMの濃度が適当であり、その他の添加物は 0 . 0 5 M〜 0 . 5 Mの濃度が適当である。

他方、 H C Vの外被蛋白質などの膜タンパク質などは、何らかの処理をしない限り水に溶けることはない。このような疎水性部分をその一部に持つ蛋白質を水に溶かすには、界面活性剤を用い、疎水性部分を親水性に変換させることによる方法がよく知られているが、グァニジン塩酸などのある種の塩はこのような難溶性の蛋白質を水に溶けやすくさせる性質を持っていることが知られている。このような性質を示す塩（カオトロピック剤）から生じるイオンはカオ卜ロピックイオンと呼ばれており、陰イオンとしてはグァニジンィオン、チォシアン酸イオン、ヨウ素イオン、過ヨウ素酸イオン、可塩素酸ィォンなどが知られており、これらのィォンを生ずる塩が難溶性蛋白質の可溶化に用いられている。カオトロピックイオンは、ウィルス粒子から抗原が効率よく遊離させる機能を持つことが予測された。しかしながら、このようなカオトロピックイオンを加えると蛋白質の 2 次構造が部分的に破壊されるため、その結果としてェピトープ構造が失われる。そのためカオトロピックイオン存在下でそのままプローブ、例えば抗体との免疫複合体形成反応に加えると、抗体の結合が弱められ、感度が低下するので、大きな問題点となると考えられる。

その一方で力オト口ピックィォンの変性作用は可逆的である場合が多く、透析や希釈によりイオン強度を弱めることにより一時的に変性した構造が元に戻る場合がある。このことは、グァニジンなどのカオトロピックイオンによる処理剤を用いた場合のもう一つの問題点を示している。つまり本発明の目標とする処理方法には、検体中に存在するウィルス粒子などに含まれる抗原を効率よく遊離させることのみならず、同時に検体中に存在する抗原に結合する高力価抗体をも失活させる必要がある。すなわち、カオトロピックイオンによる可溶化では、検体中に存在する高力価抗体の失活が不十分で、この抗体の影響により感度が低くなることが考えられる。

そのためカオトロピックイオンを用いた処理方法は 2 つの相反する課題を内包している。つまりカオ卜口ピックイオンにより構造を壊すような条件では抗原抗体反応が阻害される、その一方で力オト口ピックイオンの効果のみでは検体中の反応を阻害する抗体の不活性化が不十分であり、抗原抗体反応を阻害しない様な状況にした場合、夾雑抗体により反応が阻害される。

すなわちこの相反する課題を解決するためには、抗原のェピトープ構造は可逆的に破壊され、検体中の夾雑抗体の機能破壊が不可逆的に起こるような条件を見いだす必要がある。

抗体の活性を失活させる条件は、アルカリ処理、酸処理などが知られている。血清を酸処理すると、一部の血清蛋白質は非可逆的に変性し沈殿を生じるため、検体処理後の例えばピぺッティング操作の障害になることが多く、また測定の際に固相に変性蛋白質を巻き込んだ沈殿が吸着し、濁度として検出されることもあり、擬陽性の原因ともなりえる。加えて、それらの沈殿物の中に、非特異的に目的とする抗原が巻き込まれ、プローブとの反応量の減少による感度低下につながるなどの問題点も生じる。

本発明者は、酸処理とグァニジン処理を組み合わせることにより、沈殿物の形成などの酸処理の問題点、グァニジン処理の相反する問題点が解消されることを見いだし本発明を完成させるに至った。また、グァニジンなどのカオトロピックイオンを生じる処理剤と酸性化剤からなる処理剤に、界面活性剤を加えると、さらに好ましいことも見いだした。酸性化剤としては、塩酸、硫酸、酢酸、トリフルォロ酢酸、トリクロル酢酸などが、適当である。

また、界面活性剤としては、 C H A P S ( 3 — 〔 3 —コラミドプ口ピル）ジメチルアンモニォ〕一 1 ープンスルホン酸）， C H A P S O ( 3 — 〔コラミドプロピル）ジメチルアンモニォ〕一 2 — ヒドロキシ一 1 —プロパンスルホン酸）、ドデシル一 N —べタイン 3 - ( ドデシルジメチルアンモニォ）一 1 ープンスルホン酸などの両イオン性界面活性剤や、 T r i t o n X 1 0 0 などのポリォキシエチレンイソォクチルフヱ二ルェ一テル類、 N P 4 0 などのポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル類、 T w e e n 2 0 などのポリオキシエチレンソルビトールエステル類、 B r i j 5 8 のようなポリオキシエチレンドデシルエーテル類、ォクチルグルコシドといった非ィォン性界面活性剤が適当である。さらにここに尿素などの水素イオン結合を弱めることにより蛋白質の高次構造を部分的に壊す様な作用を示す薬剤を加えてもよい。

特に、塩酸グァニジン濃度は 2 M以上で、 T r i t o n X l 0 0 濃度は 2 %以上で、 Tw e e n 2 0濃度は 0. 0 2 %以上で、 4 °C から 4 5 °Cの範囲で使用することがより好ましい。

いずれの態様においても、本発明の処理方法を用いることにより、 H C Vや H B Vと同様の構造を持つウィルス粒子を含む検体から、ウィルス抗原を、抗体などをプローブとして用いるいわゆる免疫測定方法に適した状態に遊離させることが出来ることは明らかである。ここで H C Vや H B Vと同様の構造を持つウィルスとは、ゲノム R NA又は D N Aをパッキングする蛋白質と、それを取り囲む膜タンパク質や脂質膜から構成される構造を持つウィルス粒子を形成するウィルスであり、例えば H C Vの類縁のウィルスであるフラビウィルス類、ヒト免疫不全ウィルス（ H I V ) などのレトロウィルスなどが含まれる。さらに H B Vと同じようにゲノムとして D N A を持つものであっても同様の構造を持つものが含まれる。

ウィルス抗原の露出

本発明の第二の態様によれば、ウインドピリオドにおいて採取した試料中のウィルス抗原を検出方法に関し、この方法においてはゥィルス抗原に対する抗体はまだ生成していないので、ウイルス粒子を破壊してウィルス抗原を露出させるだけで十分であり、試料中に存在する抗体を破壊する必要はない。従って、前に説明した試料の前処理は必要でなく、測定反応液中に、ウィルス抗原を露出するためのゥィルス粒子破壊剤が存在すれば十分である。特にウイルス粒子内部に存在するウィルス抗原においては、ウィルス粒子破壊剤は必須である。

一般的なウィルス粒子は、ゲノムである核酸とコア抗原が複合体を形成して粒子を形成し、その粒子を脂質膜とエンベロープタンパク質からなる外膜が覆った構造をしていると考えられている。さらに血液中では低密度リポプロテイン（ L D L) やウィルスに対する抗体などとの複合体を形成して存在していると考えられている。そのため、血液中に存在するウィルス粒子のままでは、プローブはゥィルス抗原特にウィルス粒子内部の抗原を認識し結合することが出来ない。故にウィルス抗原を検出するためには、ウィルス抗原を取り囲むこれらの構造物を除去するなどの処理をして、ウィルス抗原がプロ一ブに認識されるようにする必要がある。

すなわち本発明においては、検体中に含まれるウィルス粒子中のゥィルス抗原を、ゥィルス抗原を認識するためのプローブが認識できるように露呈させる反応条件、反応させる系からなる反応方法、および反応させる系を含む試薬をも提供する。

本発明が提供する系における抗原検出に適した反応系とは、ウイルス抗原ェピトープに対する抗体の機能を失わせない程度のマイルドな条件でありながら、検体中に存在する複雑な構造体であるゥィルス粒子から、ウイルス抗原を認識するプロ一ブである抗体の認識する領域を十分に露呈させる条件からなる系である。

H C Vにおいては、すでに超遠心法にて分離したウィルス粒子（ T a k a h a s h i e t a l . , 1 9 9 2 , J . G e n . V i r o 1 , 7 3 ： 6 6 7 - 6 7 2 ) 、ポリエチレングリコールによつて凝集沈殿させた H C V粒子を Tw e e n 8 0や T r i t o n X 1 0 0の様な非イオン性の界面活性剤によって処理することにより（ a s h i w a k u m a e t a 1 . ， 1 9 9 6 , J . I mm u n o l o g i c a l m e t h o d s ： 1 9 0 ： 7 9 — 8 9 ) 、コア抗原が検出可能であることが示されているが、前者においてはその検出感度が不十分であり、十分に抗原が露呈されているかは疑問である。また後者においては他の処理剤を加えることにより抗体を失活させており、界面活性剤の効果そのものについては触れられていない。本発明においては、始めに界面活性剤を基本に条件を検討し、反応液を界面活性剤を中心とした組成にすることにより、遠心操作や加熱などの操作からなる前処理操作を適用することなく、単に反応液中で検体を希釈することのみにより、ウィルス粒子中の抗原を効率良く検出することが可能となった。

効果的にウィルス粒子中からウィルス抗原を抽出し、かっ血清中の様々な物質との相互反応を抑制し、効率よくプローブと抗原とが反応できる条件を与えることが必要である。この際の効果的な界面活性剤としては、炭素数 1 0個以上のアルキル基と第 2、第 3 または第 4級ァミンを同一分子内に有する界面活性剤、又は非イオン性界面活性剤が挙げられる。

前記アルキル基と第 2、第 3 または第 4 アミンを有する界面活性剤において、アルキル基は好ましくは直鎖アルキル基であり、その炭素原子数は好ましくは 1 0個以上、さらに好ましくは 1 0〜 2 0 個である。ァミンとしては第 3級ァミン又は第 4級ァミン（アンモ二ゥム）が好ましい。具体的な界面活性剤としては、ドデシルー N —サルコシン酸、ドデシルトリメチルアンモニゥム塩、セチルトリメチルアンモニゥム塩、 3 — ( ドデシルジメチルアンモニォ）一 1 —プロパンスルホン酸、 3 — (テトラデシルジメチルアンモニォ） _ 1 ープロノンスルホン酸、ドデシルピリミジゥム塩、セチルピリジゥム塩、デカノィルー N —メチルダルカミド（ M E G A— 1 0 ) 、ドデシルー N —ベタイン等が挙げられる。ドデシルー N —サルコシン酸及びドデシル卜リメチルアンモニゥム塩が好ましい。

前記の非イオン性界面活性剤としては 1 2〜 1 4の間の親水疎水比を有するものが好ましく、ポリオキシエチレンイソォクチルフヱニルエーテル類、例えば T r i t o n X I 0 0、 T r i t o n X I 1 4 など、あるいはポリオキシエチレンノニファニルエーテル類、例えば N o n i d e t P 4 0 T r i t o n N 1 0 K N i k k o 1 P等が好ましい。

本発明においては、上記 2 つのタイプの界面活性剤を単独で用いてもよいが、併用するのがー層好ましく、併用により相乗効果が得られる。

さらに、尿素など、水環境を変化させるような因子を加えてもよい。

本発明によって示されるプローブとしてのモノクローナル抗体本発明でいう H C Vの構造蛋白質遺伝子断片とは、 H C Vの構造蛋白質遺伝子のコア領域を含む遺伝子断片であり、少なくとも H C Vの N末端の 1 番目から 1 6 0番目のアミノ酸配列を含むポリぺプチドをコ一ドする塩基配列を有する D N A断片である。具体的には、配列番号 2 のァミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子断片である。

本発明でいう H C V抗原活性を有するポリべプチドとは、抗 H C V抗体と免疫学的に反応する融合ポリペプチドもしくはポリべプチドを意味し、本発明のハイブリドーマならびにそれから得られるモノクローナル抗体の作製に利用するための抗原として用いることができる。具体的には、配列番号 1 のァミノ酸配列を含む H C V抗原活性を有する融合ポリぺプチドもしくは配列番号 1 のァミノ酸配列の一部を含む H C V抗原活性を有するポリべプチドであり、その N 末端あるいは C末端に余分なァミノ酸配列が付加されたものであつてもよい。

本発明の上記融合ポリぺプチドならびに配列番号 3 〜 6 に示されるァミノ酸配列を含有するポリぺプチドに対するモノクロ一ナル抗体類は、当業者により容易に作製することができる。ハイプリドーマによるモノクローナル抗体の作製は良く知られている。例えば、 B A L B / cマウスなどの腹腔内あるいは皮内に、上記融合ポリべプチドもしくはポリペプチド（以下、本抗原）を単独もしくは B S A， K L Hなどと結合させた抗原として、単純あるいはフロイン卜完全アジュバン卜等のアジュバン卜と混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で、追加免疫として本抗原を尾静脈内に投与し、無菌的に脾臓を摘出した後、適当なマウス骨髄腫細胞株と細胞融合し、ハイブリドーマを得る。本方法は、 Κ ό h 1 e r と M i l s t e i nの方法（N a t u r e 2 5 6 : 4 9 5 - 4 9 7 ， 1 9 7 5 ) に従って行なうことができる。

上記方法により得られたハイブリドーマ細胞株を適当な培養液中で培養し、その後、本抗原に対して特異的な反応を示す抗体を産生するハイプリドーマ細胞株を選択してクローン化する。抗体産生ハイブリドーマのクロ一ニングには限界希釈法のほか軟寒天法（ E u r . J . I mm u n o l . 6 : 5 1 1 - 5 1 9 , 1 9 7 6 ) などを利用することができる。そして、産生されたモノクローナル抗体をプロテイン Aなどを用いたカラムクロマトグラフィーなどの方法により精製する。

上記のモノクロ一ナル抗体以外にもプローブとして用いる分子は作製することが出来る。例えば組換え抗体については H o o g e n b o o nの総説などに詳しく記載されている（T r e n d s i n

B i o t e c h n o l o g y, 1 5 ： 6 2 - 7 0 , 1 9 9 7 ) 。プローブを用いた検出系

本発明に従って調製されたモノクロ一ナル抗体は、 H C V構造蛋白質の検出および定量用に、ェンザィムーリンクイムノソルベントアツセィ（E L I S A ) 、酵素ィムノドッ卜アツセィ、ラジオィムノアッセィ、凝集に基づいたアツセィ、あるいは他のよく知られているィムノアッセィ法で検査試薬として用いることができる。また、検出に標識化抗体が使用される場合は、標識化合物としては例えば蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、酵素、染色物質などが使用される。

例えば、検体（血清）中のウィルス抗原を検出するためにサンドィツチ反応系を原理とした方法を用いる場合、使用すべき診断キットは、固体支持体（例えばマイクロタイターゥエルの内壁）に被覆された本発明の 1 種類以上のモノクローナル抗体および標識物質と結合させた 1 種類以上のモノクロ一ナル抗体またはそのフラグメントを含む。固体支持体に固相化するモノクローナル抗体および標識するモノクロ一ナル抗体の組み合わせは自由であり、高感度の得られる組み合わせを選択できる。

使用できる固体支持体としてはポリスチレンゃポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリビニール製のマイクロタイタープレート、試験管、キヤビラリ一、ビーズ（ラテックス粒子や赤血球、金属化合物など）、膜（リボソームなど）、フィルターなどが挙げられる

発明の効果

本発明により示される方法により、抗体などをプローブとして検出するいわゆる免疫測定方法に適した状態に、ゥィルス粒子から簡便にウイルス抗原を遊離させることが可能となる。また本発明によつて示される方法によってウィルス粒子を含む検体を処理することにより、抗体などをプローブとして抗原を検出するいわゆる免疫測定方法により、ウィルス抗原を簡便にかつ感度よく検出、及び定量することが可能となる。また本発明によつて示される検体処理方法を用いた免疫測定方法を用いた、検体中のウィルスの有無を判別するキット、定量するキット及び診断薬を作製することが可能となる実施例

以下の実施例は本発明を例証するものであるが、これによつて本発明の範囲を制限するものではない。

実施例 1 . H C V由来ポリべプチドの発現および精製

( A) 発現プラスミドの構築

H C Vのコア領域に相当する発現プラスミドは以下の方法で構築した。 C I 1 - C 2 1 クローンおよび C 1 0 - E 1 2 クローン（特開平 6 — 3 8 7 6 5 ) を p U C 1 1 9 に組み込んで得られたプラスミド p U C ' C l 1 — C 2 1 および p U C ' C l 0 — E l 2の各 D NA l 〃 gを制限酵素反応液 2 [ 5 0 mM T r i s — H C l

(pH 7. 5 ) ， 1 0 mM M g C 1 ₂ , 1 m ジチオスレィトール、 1 0 0 mM N a C 1 , 1 5単位の E c o R I および 1 5単位の C I a I酵素〕中、および〔 1 0 mM T r i s — H C l (pH 7. 5 ) , 1 0 mM M g C 1 ₂ , 1 mM ジチオスレィトール、 5 0 mM N a C 1， 1 5単位の C 1 a I および 1 5単位の K p n I酵素〕中で各々 3 7 °C 1 時間消化し、その後 0. 8 %ァガロースゲル電気泳動を行ない、約 3 8 0 bpの E c 0 R I — C 1 a I 断片および約 9 2 0 bpの C 1 a I - K p n I断片を精製した。

この 2つの D N A断片と p U C l 1 9を E c o R I および K p n Iで消化したベクターに 1 0 X リガ一ゼ用緩衝液〔 6 6 0 mM T r i s - H C 1 (pH 7. 5 ) ， 6 6 mM M g C 1 ₂ , 1 0 0 mMジチォスレトール、 1 mM A T P] 5 〃 1 ， T 4 リガ一ゼ 1 / 1 ( 3 5 0単位 Z〃 1 ) に水を加えて 5 0 1 とし、 1 6 °Cで一晩保温し、連結反応を行なつた。このプラスミドを用い大腸菌 J M 1 0 9を形質転換させ、プラスミド p U C · C 2 1 一 E l 2を得た。このプラスミド 11〇 ' じ 2 1 — £ 1 2 D N A 1 ngを 2つのプライマー（ 5 ' - G A A T T C A T G G G C A C G A A T C C T A A A— 3 ' (配列番号： 7 ) ， 5 ' — T T A G T C C T C C A G A A C C C G G A C— 3 ' (配列番号： 8 ) ) を用い P C Rを行なつた。 P C Rは GeneAmpTM (DNA Amplification Reagent Kit, Perkin Elmer Cetus製）のキットを用い D N A変性 9 5 °C 1 . 5分、ァニ一リング 5 0 °C 2分、 D N A合成 7 0 °C 3分の条件で行ない、得られた D N A断片を 0. 8 %ァガロースゲル電気泳動により分離し、グラスパウダー法（G e n e C 1 e a n ) で精製した。

一方、 p U C 1 9 を制限酵素 S m a l で消化し、 P C R法によつて得られた D N A断片を 1 0 X リガ一ゼ用緩衝液〔 6 6 0 mM T r i s — H C 1 (pH 7. 5 ) ， 6 6 mM M g C 1 ₂ , 1 0 0 mMジチォスレトール、 1 mM A T P ] 5 〃 1， T 4 リガ一ゼ 1 〃 1 ( 3 5 0単位ノ / 1 ) に水を加えて 5 0 1 とし、 1 6 °Cで一晩保温し、連結反応を行なった。このプラスミドを用い大腸菌 J M 1 0 9 を形質転換させ、プラスミド p U C 1 9 · C 2 1 — E 1 2 · S m a I を得た。このプラスミド D N A 1 〃 gを制限酵素反応液 2 0 a 1 〔 1 5 0 mM N a C 1 , 6 mM T r i s - H C 1 ( pH 7. 5 ) ， 6 mM M g C 1 2 ， 1 5単位の E c o R I および 1 5単位の B a mH I 酵素〕中で 3 7 °C 1 時間消化反応を行ない、その後 0. 8 %ァガロースゲル電気泳動を行ない、約 4 9 0 bpの E o o R I — B a mH I 断片を分離し、これをグラスパウダー法で精製した。

次に発現べクタ一である T r p · T r p E (特開平 5 — 8 4 0 8 5 ) の D N A l /z gを制限酵素反応液 2 0 〃 1 C 1 5 0 mM N a C 1， 6 mM T r i s - H C 1 (pH 7. 5 ) ， 6 mM M g C l ₂ ， 1 5単位の E c o R I および 1 5単位の B a m H I 酵素〕中で 3 7 °C で 1 時間消化し、その反応液に水 3 9 1 を加え、 7 0 °Cで 5分間熱処理した後にバクテリアアルカリ性ホスファターゼ（ B A P ) 1 1 ( 2 5 0単位 Z / 1 ) を加えて 3 7 °Cで 1 時間保温した。

この反応液にフヱノールを加えてフヱノール抽出を行ない、得られた水層をエタノール沈殿し、沈殿物を乾燥した。得られた E c o R I — B a mH I 処理ベクター D N A 1 /z gと上述のコア 1 4 0断片を 1 0 X リガ一ゼ用緩衝液〔 6 6 0 mM T r i s - H C 1 (pH 7 . 5 ) , 6 6 mM M g C 1 2 , 1 0 0 mMジチオスレトール、 I mM A T P 5 ^ 1 , T 4 リガ一ゼ 1 1 ( 3 5 0単位/ / 1 ) に水を加えて 5 0 1 とし、 1 6 °Cでー晚保温し、連結反応を行なったこの反応液の 1 0 a 1 を用いて大腸菌 H B 1 0 1株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌株は塩化カルシウム法〔Mandel ， M.と Higa， A. , J. Mol. Biol. , 53, 159-162 (1970) 〕により作られる。形質転換大腸菌を 2 5 ^ _§ /1111のァンピシリンを含む1^ 8 プレート（ 1 % トリプトン、 0. 5 %N a C し 1. 5 %寒天）上に塗布し、 3 7 °Cに一晩保温した。プレート上に生じた菌のコロニ —を 1 白金耳取り、 2 5 g Zmlのァンピシリンを含む L B培地に移し、一晩 3 7 °Cで培養した。 1. 5 mlの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミド D N Aのミニプレパレーシヨンをアルカリ法〔 Mann iatis ら、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ( 1982) 〕により行なった。

得られたプラスミド D N A 1 gを制限酵素反応液 2 0 1 〔 1 5 0 mM N a C 1 , 6 mM T r i s - H C 1 (pH 7. 5 ) ， 6 mM M g C 1 2 , 1 5単位の E c o R I および 1 5単位の B a mH I酵素〕中で 3 7 °C、 1 時間消化し、ァガロースゲル電気泳動を行なつて、約 4 9 0 bpの E c o R I — B a mH I 断片が生じる T r p · Τ r ρ Εコア 1 6 0発現プラスミドを選別した。 ( B ) クローンコア 1 6 0でコードされるポリペプチドの発現および精製

発現プラスミド T r p ' T r p Eコア 1 6 0 をもつ大腸菌 H B 1 0 1 株を 5 0 g /mlのァンピシリンを含む 3 mlの 2 Y T培地（ 1 . 6 % トリプトン、 1 %酵母エキス、 0. 5 % N a C 1 ) に接種し、 3 7 °Cで 9 時間培養する。この培養液 l mlを 5 0 z gZmlのアンピシリンを含む 1 0 O mlの M 9 — C A培地（ 0. 6 % N a ₂ H P O 4 , 0. 5 % K H 2 P 0₄ , 0. 5 % N a C 1 , 0. 1 % N H ₄ C 1， 0. 1 m C a C 1 2 , 2 mM M g S 0 , 0. 5 %カザミノ酸、 0. 2 %グルコース）に植え継ぎ、 3 7 °Cで培養した。〇 D 6 0 0 = 0. 3 の時に終濃度 4 0 g/ 1 になるようにィンドールァクリル酸を加え、さらに 1 6 時間培養した。この培養液を遠心分離して菌体を集めた。

菌体に 2 0 mlの緩衝液 A 〔 5 O mM T r i s — H C 1 ( H 8. 0 ) , 1 mM E D T A, 3 0 mM N a C I 〕を加えて懸濁し、再び遠心分離を行なって発現菌体 2. 6 gを得た。得られた菌体を緩衝液 A 1 0 ml中に懸濁し、超音波破砕により大腸菌膜を破砕した後に遠心分離を行ない、 H C V c D N Aでコードされるポリペプチドと T r p Eの融合ポリべプチドを含む不溶性画分を得た。その画分に 1 0 mlの 6 M尿素を含む緩衝液 Aを加えて融合ポリべプチドを可溶化抽出した。可溶化した抽出物を S— S e p h a r o s eを用いたイオン交換カラムクロマトグラフィ一にかけて、融合ポリべプチドの精製を行なつた。

実施例 2. ハイブリド一マの作製法

前記方法により調製した融合ポリペプチド（T r p C l 1 ) を 6 M尿素溶解後、 0. 1 5 M N a C l を含む l O mMリン酸緩衝液（ PH7. 3 ) に終濃度が 0. 2〜 1 . 0 mgZmlとなるように希釈し、等量のァジュバント（タイターマックス）と混和し、 T r p C 1 1 懸濁液とした。 T r p C 1 1 濃度が 0. 1 〜 0. 5 mg/mlとなるように調製した該懸濁液を 4〜 6週令の B A L B/ c系マウスに腹腔内投与した。 2週間ごとに同様の免疫を行いさらに約 2週間後、生理食塩水に溶解した T r P C 1 1 1 0 / gを尾静脈内に投与した o

最終追加免疫後 3 日目に、この免疫動物より無菌的に脾臓を摘出し、ハサミで切片としてさらにメッシュを用いて脾臓を個々の細胞にほぐし、 R P M I — 1 6 4 0培地で 3回洗浄した。対数増殖期のマウス骨髄腫細胞株 S P 2 / 0 A g l 4を前記と同様に洗浄後、該細胞 2. 5 6 X 1 0 ⁷ 個と脾臓細胞 1. 6 4 X 1 0 ⁸ 個を 5 0 ml容の遠心管に入れ混合した。 2 0 0 x g、 5分間遠心分離を行ない、上清を除去し、 3 7 °Cに保温した 5 0 %ポリエチレングリコール（ P E G) 4 0 0 0 (メノレク社製）を含む R P M I — 1 6 4 0培地 1 mlを加え、さらに R P M I — 1 6 4 0培地 1 0 mlを加えて細胞融合させた。

融合細胞は、遠心分離（ 2 0 0 X g、 5分間）によって P E Gを除いた後、 9 6 ゥエルプレートを用いて、 1 0 %ゥシ胎児血清ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（以下、 H A Tと省略 ) を含む R P M I — 1 6 4 0培地中で約 1 0 日間培養してハイプリドーマのみを増殖させた。その後、目的の抗体を産生するクローンを E L I S A法により検索し、所望の反応特異性を有する本発明のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを得た。

得られたハイプリドーマについて、常法の限界希釈法に従い、単一クローン化を行ない、得られたハイプリドーマを H C 1 1 — 1 1 ， H C 1 1 — 1 4， H C 1 1 — 1 0、および H C 1 1 — 3、および H C 1 1 — 7 と命名した。該 4種類のハイプリドーマは、工業技術院生工学工業技術研究所に平成 9年 7月 4 日付でそれぞれ F E RM B P - 6 0 0 5 , F E RM B P - 6 0 0 6 , F E RM B P - 6 0 0 4， F E RM B P— 6 0 0 2及び F E RM B P— 6 0 0 3 として寄託された。

実施例 3. モノクローナル抗体の作製法

実施例 2 に記載の方法により得られたハイブリドーマをプリスタン等で処理したマウス腹腔に移植し、腹水中に産生されてくるモノクローナル抗体を取得した。該モノクローナル抗体の精製は、プロティン Aを結合させたセファロ一スカラムにより I g Gフラクションを分離した。

前記 5種類のハイプリドーマから産生されたそれぞれのモノクロ一ナル抗体、 C 1 1 — 1 4， C 1 1 - 1 1 , C 1 1 - 1 0 , C 1 1 一 7および C I 1 一 3のアイソタイプは、ゥサギ抗マウス I g各ァイソタイプ抗体（ Z y m e d社製）を用いたィムノアッセィにより、 C 1 1 — 1 0及び C I 1 — 7力く I g G 2 aであり； C H 1 1 — 1 1， C 1 1 — 1 4及び C 1 1 — 3力く I g G 1 であることが明らかとなった。得られた 5種類のモノクローナル抗体について、 H C V · コア領域由来の配列によつて合成した 2 0 ァミノ酸からなる合成べプチドを用いてェピト一プ解析を行なつた結果、表 1 に示す如くコァ領域の一部を特異的に認識するモノクローナル抗体であることがわ力、つた。

表 1

実施例 4. 検体処理条件検討

U S D S濃度検討

健常人血清および H C V - R N A陽性血清 1 0 0 1 に、種々の濃度に溶解した S D S と 0. 6 % C H A P Sを含んだ処理液を 1 0 0 1 添加した。 5 6 °Cに設定している保温箱に入れて 3 0分間処理をおこない、その 8 0 1 を測定試料とした。以下に記す測定法による結果を、横軸に処理反応時の S D S濃度をとり、図 1 に示した。

2 ) C H A P S濃度検討

健常人血清および H C V— R N A陽性血清 1 0 0 1 に、種々の濃度に溶解した C H A P S と 5 % S D Sを含んだ処理液を 1 0 0 〃 1 添加した。 5 6 °Cに設定している保温箱に入れて 3 0分間処理をおこない、その 8 0 // 1 を測定試料とした。以下に記す測定法による結果を、横軸に処理反応時の C H A P S濃度をとり、図 2 に示した。

3 ) 尿素濃度検討

健常人血清および H C V - R N A陽性血清 1 0 0 / 1 に、種々の濃度に溶解した尿素を含んだ処理液（ 5 % S D S , 0. 6 % C H A P S ) を 1 0 0 z 1 添加した。 5 6 °Cに設定している保温箱に入れて 3 0分間処理をおこない、その 8 0 1 を測定試料とした。以下に記す測定法による結果を、横軸に処理反応時の尿素濃度をとり、図 3 に示した。

4 ) T r i t o n X 1 0 0濃度検討

健常人血清および H C V - R N A陽性血清 1 0 0 1 に、種々の濃度に溶解した T r i t o n X l O Oを含んだ処理液（ 5 % S D S , 0. 6 % C H A P S , 6 M尿素）を 1 0 0 ^ 1添加した。 5 6 °C に設定している保温箱に入れて 3 0分間処理をおこない、その 8 0 1 を測定試料とした。以下に記す測定法による結果を、横軸に処理反応時の T r i t o n X l 0 0濃度をとり、図 4 に示した。

5 ) 反応温度検討

健常人血清および H C V - R N A陽性血清 1 0 0 ^ 1 に、処理液 ( 5 % S D S , 0. 6 % C H A P S , 6 M尿素、 0. 7 5 %T r i t 0 n X 1 0 0 ) を 1 0 0 〃 1 添加した。 4 °C、室温（ 2 3 °C ) 、 3 7 °C， 4 5 °C, 5 6 °C, 7 0 °Cで 3 0分間処理をおこない、その 8 0 n 1 を測定試料とした。以下に記す測定法を用いて検討した結果を図 5 に示した。

測定法

血清処理法の検討で得られた試料は各々以下の測定法を用いて評価した。すなわち、抗 H C Vコア抗原モノクロ一ナル抗体（抗体 C 1 1 一 3 と C I 1 一 7の等量混合）を終濃度が計 6 i gZmlになるように 1 M炭酸緩衝液（pH9. 6 ) で希釈し、 9 6 ウェルマィクロプレート（ヌンク社製） 1 ゥエルにつき 1 0 0 〃 1ずつ分注した。 4 °Cで一晚静置後、 0. 1 5 M N a C l を含む l O mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7. 3 ) 0. 3 5 mlを用いて 2回洗浄し、 0 . 5 %カゼイン一 N aを含む 1 O mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7 . 3 5 ) (以下ブロッキング液）、 0. 3 5 mlを添加し、さらに室温で 2時間静置した。ブロッキング液除去後、 0 . 1 5 M N a C 1 , ί % B S A, 0 . 5 %カゼイン— N a， 0 . 0 5 % T w e e n 2 0 を含む l O O mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7 . 3 ) 1 6 0 1 と各々の血清処理法で得られた測定試料をそれぞれのゥエルに加え、室温で 2 時間反応させ、洗浄液 3 0 0 1 で 5 回洗浄し、さらにペルォキシダ一ゼ ( P O D ) 標識したモノクローナル抗体（。 1 1 ー 1 0 とじ 1 1 ー 1 4の等量混合） 1 0 0 // 1 を添加して室温で 3 0分間反応させた。反応後、上記洗浄液 3 0 0 pi 1 で 5 回洗浄し、基質（オルトフエ二レンジアミン、以下 0 P D ) 溶液 1 0 0 / 1 を加え室温で 3 0分間反応させた後、 2 N硫酸溶液 1 0 0 1 を添加し、波長 6 3 0 nm の吸光度を対照として波長 4 9 2 nmにおける吸光度（0 D 4 9 2 ) を測定した。

図 1〜 4 から、各々の処理条件の最適化が行われたが、未処理検体ではコア抗原の検出が困難であつたが、このような簡易な処理を行うことによって、劇的にコア抗原の検出が可能となった。特に、処理反応時の S D S濃度は 0 . 5 %以上で、 C H A P S濃度は 0 . 1 %以上で、尿素濃度は 1 M以上で、 T r i t o n X 1 0 0 濃度は 0 . 1〜 0 . 7 5 %で使用することで、 4でから 7 0 ¾の範囲で、良好にコア抗原を検出できることが示された。

実施例 5 . 構造領域コア抗原の検出および測定法（ 1 )

血清 1 0 0 〃 1 に、処理液（ 5 % S D S， 0 . 6 % C H A P S , 6 M尿素、 0 . Ί 5 % T r i t o n X l 0 0 ) を 1 0 0 l 添加した。 5 6 °Cに設定している保温箱に入れて 3 0分間処理をおこない、その 1 2 0 / 1 を測定試料とした。

抗 H C Vコア抗原モノクローナル抗体（ C I 1 — 3 と C I 1 一 7 等量混合）を終濃度が計 6 / g Zmlになるように 0 . 1 M炭酸緩衝液（pH 9 . 6 ) で希釈し、 9 6 ウェルマイク口プレート（ヌンク社製） 1 ゥエルにつき 1 0 0 β 1 ずつ分注した。 4 °Cで一晚静置後、 0. 1 5 M N a C 1 を含む 1 0 nMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7 . 3 ) 0. 3 5 mlを用いて 2 回洗浄し、ブロッキング液 0. 3 5 ml を添加し、さらに室温で 2 時間静置した。

プロッキング液を除去後、反応緩衝液 1 2 0 1 と前述した処理法で得た測定試料をそれぞれのゥエルに加え、室温で 2 時間反応させた。洗浄液 3 0 0 UL 1 で 5 回洗浄し、さらにペルォキシダーゼ（ P O D) 標識したモノクローナル抗体（じ 1 1 ー 1 0 とじ 1 1 ー 1 4 ：等量混合） 1 0 0 1 を添加して室温で 3 0分間反応させた。洗浄液 3 0 0 1 で 5 回洗浄し、基質（ 0 P D ) 溶液 1 0 0 / 1 を加え室温で 4 5分間反応させた後、 2 N硫酸溶液 1 0 0 / 1 を添加し、波長 6 3 0 nmの吸光度を対照として波長 4 9 2 nmにおける吸光度（ 0 D 4 9 2 ) を測定した。尚、標準血清として、パネル血清 5 0 を l U/mlとして、 1 % B S Aを含む 1 O mMリン酸ナトリウム緩衝液（ pH 7. 3 ) で段階的に希釈したものについて同様に処理をおこない測定した。

図 6 に、標準血清として使用したパネル血清 5 0 の希釈直線を示した。試料中コア抗原が濃度依存的に測定されており、約 0. 5 m U/mlの検出が可能であった。すなわち、本発明の極めて簡易な検体処理法とモノクローナル抗体を組み合わせて用いることにより、 H C Vコア抗原を検出または定量できることが明らかとなつた。

実施例 6. H C V構造領域コア抗原の検出および定量（ 2 ) アル力リフォスファタ一ゼ標識モノクローナル抗体を用いた方法固相担体として 9 6 ゥエル黒マイクロプレート（ヌング社）を、標識抗体としてアルカリフォスファターゼ標識モノクローナル抗体を、基質として C D P s t a r (増感剤としてエメラルド II) を使用した。標準血清として使用したパネル血清 5 0の希釈直線を図 7 に示したが、試料中コア抗原が濃度依存的に測定されており、約 0 . 5 m U Z m lの検出が可能であった。このアルカリフォスファタ一ゼ標識モノクローナル抗体を用いた測定法を用いても、 H C Vコア抗原を検出または定量できることが明らかとなった。

実施例 7 . 溶血血清による感度低下を抑えるための添加剤の検討血清成分の感度に与える影響を検討したところ、ヘモグロビンを加えると著しく感度が低下することが確認された。 S D S， C H A P S又は T r i t o n X 1 0 0 を含む前処理剤による前処理により、ヘモグロビンが変性し、遊離したヘムの影響である可能性が考えられた。そこで、変性ヘモグロビンの影響を軽減することのできる添加剤を前処理剤に加え検討した。

H C Vコア抗原陽性血清（パネル血清 N o 3 ) に、高濃度へモグロビン（国際試薬製：干渉チェック）を添加してモデル検体を作製し、前述の前処理剤に尿素を添加して、実施例 6 に準じてコア抗原測定をおこない、尿素の添加効果を検討した。コントロールとしたへモグ口ビン無添加群のコァ抗原活性量を 1 0 0 %としたときの 4 3 O mgZ d lヘモグロビン添加群のコア抗原活性量を表 2 にあらわした。尿素無添加のときのへモグ口ビン添加群のコァ抗原活性量は約 3 0 %に減少したが、添加尿素量の增加により、ヘモグロビン添加群のコア抗原活性量が増加し、ヘモグロビンによる干渉作用が減じていることが確認された。

表 2 . —尿素のへモグロビンによる干渉の抑制効果

一方各種ァミノ酸とヘムとの相互作用、ァミノ基ゃカルボキシル基による緩衝能効果なども考えられたため、各種アミノ酸を添加し

、その効果の度合いを調べた。結果を表 3 に示した。

表 3 . 各種アミノ酸のヘモグロビンによる干渉の抑制効果

干渉の抑制効果がもっとも認められたものはトリプ卜ファン及びヒスチジンであった。これらの干渉抑制効果の濃度依存性を検討した結果を表 4 に示した。

表 4 . ヒスチジン及びトリプトファンのへモグロビンによる干渉の抑制効果

ヘムはへモグロビン中でヒスチジンの側鎖により配位され、へモグロビン中に保持されていることから、この効果は側鎖によるものであることが示唆された。そこでヒスチジンの側鎖であるィミダゾ —ル、卜リプトファンの側鎖であるィンドール環を含むィンドールァクリル酸の効果を検討した結果を表 5 に示した。

表 5 . イミダゾール及びィンドールァクリル酸のへモグロビンによる干渉の抑制効果添加剤対昭に対する％

v^ -hn r I 22. 1

ミダゾル 35. 2

0 1 Mイミダゾル 42. 0

0. 15 Mィミダゾル 58. 8

0. 2 Mィミダゾル 70. 7

5 mMインドールアクリル酸 50. 4

1 0mMィンド一ルァクリル酸 69. 0

20mMィンド一ルァクリル酸 90. 3

30mMィンド一ルァクリル酸 96. 8 ィンドール、およびィンドールァクリル酸を反応液中に加えた場合、アミノ酸を加えた場合と同様に濃度依存的なヘモグロビンの干渉抑制効果が認められた。このことから反応液にィミダゾール環を含む物質、たとえばヒスチジンまたはインドール環を含む物質、たとえばトリブトフアンを加えることにより、ヘモグロビンを含む検体でも感度良くコア抗原を検出できることが分かった。

上記の各種添加剤を組み合わせた場合の効果を検討した。結果を表 8 に示した。ヒスチジンとトリブトファンを組み合わせることにより、 9 0 %以上回復し、尿素を組み合わせることによりさらに検出感度が上昇した。表 6

実施例 8. 血清処理と測定法で認識されている分子形の解析パネル血清 1 3 の 0. 2 5 mlを各々の血清処理法で処理し、ゲルロカカラム（ S u p e r d e x 2 0 0 H R， 1 3 0 ) で分画し、それらのフラクション中の抗コア免疫活性を測定し、その結果を図 8 に示した。分子量約 2 0 〜 3 0 k D aの分子を認識していると考えられ、ウィルス中のコア抗原は前述した前処理によって、ウィルス破壊および血清中に存在する抗コア抗体の不活化により、遊離されていることが示された。

実施例 9. 血清試料中の H C V構造領域コァ抗原の測定法

P C R法であるアンプリコア H C Vモニターキット（ロッシュ社 ) を用いて、 H C V— R N A量が 1 0 ³ ~ 1 0 ⁷ コピー/ mlと測定された血清と健常人血清を用い、前述の方法で、血清中の H C Vコァ抗原の定量を行なつた。

また、標準血清として、パネル 5 0血清（ l UZmlと設定）を 1 % B S Aを含む 1 0 mMリン酸ナトリウム緩衝液（ pH 7. 3 ) にて段階的に希釈し、同様に処理したものを用い、表 7 にその測定結果を示した。今回測定した検体のうち、健常人検体は全て検出限界以下であり、 P C R法陽性例の全てを検出できた。このときの相関性を図 9 に示したが、 P C R法との相関係数も 0. 8以上となり高い相関性を示した。 7 . HCV- RNA量とコア抗原量

SAMPLE# RNA ( Kコピ ml) コァ抗原（mUZml) 健常人血清 1 N. D

2 N. D

3 N. D

4 N. D

5 N. D

ペネル血清 81 1.6 2. 1

80 8 2. 1

82 8 8.5

33 16 3.7

31 30 37.0

26 87 266.7

39 97 63.8

41 170 116. 1

16 400 133.7

50 1000 1000

45 1300 277.3

13 1600 1806

N. D： Not detect

実施例 1 0. 検体処理条件検討

処理条件検討

1 ) 塩酸グァニジン濃度検討

健常人血清および H C V— R N A陽性パネル血清 1 0 0 1 に、種々の濃度に溶解した塩酸グァニジンと 0 . 5 N H C 1 を含む処理液を 1 0 0 〃 1 添加した。室温で 3 0分間処理をおこない、その 8

0 1 を測定試料とした。以下に記す測定法による結果を、横軸に処理反応時の塩酸グァニジン濃度をとり、図 1 0 に示した。

2 ) T r i t o n X 1 0 0濃度検討

健常人血清および H C V— R N A陽性パネル血清 1 0 0 1 に、種々の濃度に溶解した T r i t o n X 1 0 0含む処理液（ 6 M塩酸グァニジン、 0 . 5 N H C 1 ) を 1 ◦ 0 〃 1 添加した。室温で 3 0分間処理をおこない、その 8 0 Z 1 を測定試料とした。以下に記す測定法による結果を、横軸に処理反応時の T r i t 0 n X 1 0 0 濃度をとり、図 1 1 に示した。

3 ) T w e e n 2 0濃度検討

健常人血清および H C V— R N A陽性パネル血清 1 0 0 〃 1 に、種々の濃度に溶解した T r i t o n X 1 0 0含む処理液（ 6 M塩酸グァニジン、 0. 5 N H C 1 , 1 2. 5 %T r i t o n X 1 0 0 ) を 1 0 0 〃 1 添加した。室温で 3 0分間処理をおこない、その 8

0 fi 1 を測定試料とした。以下に記す測定法による結果を、横軸に処理反応時の Tw e e n 2 0濃度をとり、図 1 2 に示した。

4 ) 反応温度検討

健常人血清および H C V— R N A陽性パネル血清 1 0 0 / 1 に、処理液（ 6 M塩酸グァニジン、 0. 5 N H C 1 , 1 2 . 5 % T r i t o n X 1 0 0 , 0. 7 5 % T w e e n 2 0 ) を 1 0 0 〃 1 添加した。 4 °C、室温（ 2 3 °C) 、 3 7 °C、 4 5 °Cで 3 0分間処理をおこない、その 8 0 1 を測定試料とした。以下に記す測定法を用いて検討した結果を図 1 3 に示した。

測定法

上記の各々の血清処理法によつて得られた試料は、以下の測定法を用いて評価した。すなわち、抗 H C Vコア抗原モノクロ一ナル抗体（抗体 C 1 1 — 1 4 と C 1 1 一 1 1 の等量混合）を終濃度が計 6 g /mlになるように 0. 1 M炭酸緩衝液（pH9. 6 ) で希釈し、 9 6 ウェルマイク口プレート（ヌンク社製） 1 ゥエルにつき 1 0 0 1 ずつ分注した。 4 °Cで一晚静置後、 0. 1 5 M N a C 1 を含む 1 0 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7. 3 ) 0. 3 5 mlを用いて 2回洗浄し、 0. 5 %カゼイン一 N aを含む 1 0 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7. 3 5 ) 、（以下ブロッキング液） 0 . 3 5 mlを添加し、さらに室温で 2 時間静置した。

ブロッキング液除去後、 0. 1 5 M N a C 1 , 1 % B S A, 0 . 5 %カゼイン一 N a， 0. 0 5 % T w e e n 2 0 を含む l O O mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7. 3 ) 1 4 0 1 と 1 1^ 卜リス 2 0 // 1 を混合したもの計 1 6 0 z l (以下反応緩衝液とする）と、前述した処理法で得られた測定試料 8 0 / 1 をそれぞれのゥエルに加え、室温で 2 時間反応させ、洗浄液 3 0 0 1 で 5 回洗浄し、さらにペルォキシダーゼ（ P O D ) 標識したモノクローナル抗体（ C 1 1 一 1 0 ) 1 0 0 1 を添加して室温で 3 0分間反応させた。反応後、上記洗浄液 3 0 0 1 で 5 回洗浄し、基質（オルトフヱ二レンジアミン、以下〇 P D ) 溶液 1 0 0 1 を加え室温で 3 0分間反応させた後、 2 N硫酸溶液 1 0 0 1 を添加し、波長 6 3 0 nmの吸光度を対照として波長 4 9 2 nmにおける吸光度（ 0 D 4 9 2 ) を測定した。

図 1 0〜 1 3 から、処理条件の最適化が行われたが、パネル血清において、未処理検体ではコア抗原の検出が困難であつたが、このような極めて簡易な処理を行うことによって、劇的にコア抗原の検出が可能となった。いずれの場合でも、健常人ではシグナルの上昇は認められなかった。また、特に塩酸グァニジン濃度は 2 M以上で、 T r i t o n X 1 0 0濃度は 2 %以上で使用することで、 4 でから 4 5 °Cの範囲で、良好にコア抗原を検出できることが示された。

実施例 1 1 . コア抗原の検出および測定法

血清 1 0 0 〃 1 に、処理液（ 6 M塩酸グァニジン、 0. 5 N H C 1 , 1 2. 5 %T r i t o n X 1 0 0 , 0. 7 5 % T w e e n 2 0 ) を 1 0 0 1 添加した。室温で 3 0分間処理をおこない、その 1 0 0 1 を測定試料とした。

抗 H C Vコア抗原モノクローナル抗体（ C 1 1 — 1 4 と C I 1 一 1 1 等量混合）を終濃度が計 6 n g /mlになるように 0. 1 M炭酸緩衝液（pH9. 6 ) で希釈し、 9 6 ウェルマイク口プレート（ヌンク社製） 1 ゥエルにつき 1 0 0 // 1 ずつ分注した。

4 °Cで一晚静置後、 0 . 1 5 M N a C 1 を含む 1 0 nMリン酸ナトリウム緩衝液（ PH 7 . 3 ) 0 . 3 5 mlを用いて 2 回洗浄し、プロッキング液 0 . 3 5 miを添加し、さらに室温で 2時間静置した。ブロッキング液を除去後、反応緩衝液 1 5 0 1 と前述した処理法で得た測定試料をそれぞれのゥエルに加え、室温で 2 時間反応させた洗浄液 3 0 0 fi 1 で 5 回洗浄し、さらにペルォキシダーゼ（ P 0 D ) 標識したモノクロ一ナル抗体（ C 1 1 一 1 0 ) 1 0 0 i l を添加して室温で 3分間反応させた。洗浄液 3 0 0 1 で 5 回洗浄し、基質（ 0 P D ) 溶液 1 0 0 1 を加え室温で 4 5分間反応させた後、 2 N硫酸溶液 1 0 0 1 を添加し、波長 6 3 0 nmの吸光度を対照として波長 4 9 2 nmにおける吸光度（0 D 4 9 2 ) を測定した。尚、標準血清として、パネル血清 5 0 を 1 UZmlとして、 1 % B S A を含む 1 0 mMリン酸ナトリウム緩衝液（ PH 7 . 3 ) で段階的に希釈したものについて同様に処理をおこない測定した。

図 1 4 に、標準血清として使用したパネル血清 5 0 の希釈直線を示した。試料中コア抗原が濃度依存的に測定されており、約 0 . 5 m UZmlの検出が可能であった。すなわち、本発明の極めて簡易な検体処理法とモノクローナル抗体を組み合わせて用いることにより、コア抗原を検出または定量できることが明らかとなった。

実施例 1 2 . 血清処理と測定法で認識されている分子形の解析パネル血清 1 3 の 0 . 2 5 mlを各々血清処理法で処理し、ゲル口力カラム（ S u p e r d e x 2 0 0 H R , 1 x 3 0 ) で分画し、それらのフラクション中の抗コア免疫活性を測定し、その結果を図 1 5 に示した。分子量約 2 0 〜 3 O k D a の分子を認識していると考えられ、ウィルス中のコア抗原は前述した前処理によって、ウィルス破壊および血清中に存在する抗コア抗体の不活化により、様々な相互作用から遊離されていることが示された。

実施例 1 3 . 血清試料中のコア抗原の測定法

P C R法であるアンプリコア H C Vモニタ一キット（ロッシュ社 ) を用いて H C V— R N A量が 1 0 - 1 0 ⁷ コピー/ mlと測定された血清と健常人血清を用い、前述の方法で、血清中の H C Vコア抗原の定量を行なつた。

また、標準血清として、パネル 5 0血清（ l U/mlと設定）を 1 % B S Aを含む 1 0 mMリン酸ナトリウム緩衝液（ pH 7 . 3 ) にて段階的に希釈し、同様に処理したものを用い、表 8 にその測定結果を示した。今回測定した検体のうち、健常人検体は全て検出限界以下であり、 P C R法陽性例の全てを検出できた。このときの相関性を図 1 6 に示したが、 P C R法との相関係数も 0 . 8以上となり高い相関性を示した。

表 8 . —HCV— RNA量とコァ抗原量サンプル No. RNA ( Kコピー Zml) コア抗原（mU/ml) 健常人血清 1 N. D

2 N. D

3 N. D

4 N. D

5 N. D

6 N. D

7 N. D

パネル血清 1 50 166.4

7 830 471. 1

8 26 61.5

11 240 107.4

13 1600 1426

15 25 40. 1

16 400 240.3

19 840 1369

26 87 1093

31 30 45.8

33 16 58.5

39 97 89.0

41 170 43.9

44 180 57.5

49 33 47.7

50 1000 1005

84 8.7 63.5

N. D ： Not detect 実施例 1 4 . B型肝炎ウィルス（ H B V ) コア抗原の検出

H C Vのコア抗原検出に関して述べてきたが、この処理法が他のウィルス中の構造蛋白質の検出に応用可能かどうか検討した。

H B Vコア抗原に対するモノクローナル抗体（特殊免疫研究所）を 3 〃 g Zmlとなるように 0 . l M炭酸緩衝液（pH 9 . 6 ) で希釈して、 9 6 ウェルマイク口プレートに 1 0 0 / 1 ずつ分注した。 4 °Cでー晚静置した後、りん酸緩衝液で洗浄し、 1 % B S A溶液を 3 5 0 1 ずつ分注した。室温で 2 時間静置したのち、 1 % B S A溶液を吸引除去し、反応液 2 0 0 1 を添加した。

組換え H B Vコァ抗原をスタンダードとして用い、 B型肝炎と診断され、 H B e抗原が陽性で抗 H B e抗体が陰性である患者血清 5 例と健常人血清 1 0例を検体として用いた。検体 1 0 0 1 に、処理試薬（ 7. 5 % S D S , 0. 7 5 % C H A P S , 0. 1 5 % T r i t o n X— 1 0 0， 2 M尿素、 0. 1 Mヒスチジン、 0. 1 M トリブトファン）を 5 0 1 添加し 5 6 °Cで 3 0分間処理した。処理後、その 5 0 1 を反応液が満たされたゥエルに添加し、室温で 9 0分間反応させた。

比較（前処理無し）として、各サンプル 1 0 0 / 1 に精製水 5 0 β 1 で希釈しその 5 0 〃 1 を反応に用いた。洗浄液で 5 回洗浄後、ビォチン標識抗 H B Vコアモノクロ一ナル抗体（H B c — 2， Η Β c 一 5， H B c - 1 4等量混合）を添加し、室温で 3 0分間反応させた。洗浄液で 5 回洗浄後、ァビジン標識アル力リフォスファタ一ゼを添加し、室温で 3 0分間反応させた。

洗浄液で 5 回洗浄後、 C D P s t a r (増感剤としてェメラルド 1 I を使用）を添加し、室温で 1 5分間反応させ、その相対発光強度を測定した。段階的に希釈した組換え H B Vコア抗原の標準曲線を図 1 7 に示し、測定されたサンプル中のコア抗原量を表 9 に示した。検出限界は、 2 1 ngZmlで、コア抗原陽性と陰性を振り分けるカツトオフ値は 6 0 ngZmlとしたところ、健常人血清では、 1 0例全て前処理、無前処理どちらにおいてもコア抗原は陰性となり、 B 型肝炎患者血清においては、無前処理では検出されなかったが、前処理をおこなうことにより全例でコア抗原が陽性と判定された。

B型肝炎患者血清においては、前処理によって、ウィルス粒子の破壊および抗 H B c抗体が不活化され、検出可能になったと考えられる。以上のように、 H C Vのみならず、ゲノムとして D N Aをもつたとえば H B Vなどのウィルスの構造蛋白質を検出する際においても、この検体前処理は有用であることが確認された。 H C Vの類縁のウィルスであるフラビウィルス類、 H I Vなどのレトロウィルスにおいても同様のことが推察できることはいうまでもない。

表 9

前処理無前処理有検体番号

HRVつ ¹ァノ： tn几里暴干リ疋 HRV ァノ ί儿ΐτ /ポ里畺十 ^lりlま

(ng/ ml) (ng/ ml)

¾吊ノ人、快ィ 1平± 丄 1 < 21 陰性 < 21 陰性

9 < 21 陰性 < 21 陰性

< 21 陰性 < 21 陰性

< 21 陰性 46 陰性 0 < 21 陰性 < 21 陰性

7 < 21 陰性 47 陰性

8 < 21 陰性 < 21 陰性

9 < 21 陰性 26 陰性

10 < 21 陰性 56 陰性

HBV検体 11 < 21 陰性 98 陽性

15 < 21 陰性 94 陽性

20 < 21 陰性 780 陽性

21 < 21 陰性. 270 陽性

46 < 21 陰性 630 陽性実施例 1 5 . 抗原を前処理操作なしで効率的に検出させるための方法

H C Vパーティクルを含む検体を界面活性剤を加えた反応液に希釈し、 H C Vコア抗原の検出される効率を検討した。

なお H C Vコア抗原の検出は、 H C Vコア抗原に対するモノクロ —ナル抗体を用いたサンドイッチ酵素免疫アツセィ（ E I A) で行つた。実施例 3 で得られたモノクローナル抗体のうち、 C 1 1 — 3 と C I 1 — 7 をコア抗原を補足する抗体として用い、 C 1 1 — 1 0 及び C 1 1 一 1 4 を捕足されたコア抗原を検出するための抗体として用いた。

E I Aは基本的には以下の条件で行つた。モノクロ一ナル抗体 C 1 1 一 3及び C 1 1 一 7 を酢酸緩衝液にそれぞれ 4 g/miとなるよう希釈した溶液をミクロタイタープレートに加え、 4 °C一夜保温した。燐酸緩衝液で洗浄し 1 % B S Aを含む燐酸緩衝液を加えることによるブロッキング操作を施した。そこに反応液 1 0 0 〃 1 、検体 1 0 0 1 を加え、撹拌後、室温で 1 . 5 時間反応させた。低濃度の界面活性剤を加えた燐酸緩衝液で洗浄することにより未反応物を除いた後、アル力リフォスファタ一ゼで標識したモノクロ一ナル抗体 C 1 1 一 1 0及び C 1 1 一 1 4を加え、室温 3 0分反応させた。反応終了後、未反応物を低濃度の界面活性剤を加えた燐酸緩衝液で洗浄することにより除き、基質液（ C D P— S t a r / e m e r a 1 d 1 1 ) を加え室温 2 0分反応後、発光量を測定した。

前記反応液中に各種界面活性剤を加えその効果を検討した。 H C Vに対する抗体の力価が検出感度以下であり、ほとんど H C Vに対する抗体を含まないと考えられる H C V抗原陽性血清を用いて、発光量の多寡によるコア抗原活性を健常人血清の発光量を 1 . 0 としたときの、それに対する反応比で表わした。その結果を表 1 0及び表 1 1 に示す。 1 0

健常人血清に対する各血清の反応比率（SZN ratio)

Νο45 No46 No 3 No 7 Nol9 無添加 15.67 1.00 1.15 1.34 1.19 メ刀 h宋千 I¹ JIA£:港 Hi竿'准 >30.0 ^ ά.\) . U 、9 0 、り 0 添加剤 HLB値 %

陰イオン性ト'デシル硫酸ナトリウム 40.0 0.5 5.42

界面活性剤 2.0 5.73

ト'デシル- N-サルコシン酸ナトリウム 0.5 12.79 2.70

1. U 125.43 7.27 3.70 6.71 バ-： 7ルォ tmi MM:ン酸 S-113 0.5 1.27

2.0 0.91

陽イオン性セチルトリメチルアンモニゥ iブロミト' 0.5 7.42 3.09 3.52 5. 3 界面活性剤 2.0 5.35

ト'デシルビリジニゥムク 0ラ 0.5 4.70 2.05 1.52 2.33

2.0 2.49

n-ト'デシルトリメチルアンモニゥム 0.5 4.43 2.41 1.63 2.67

2.0 3.77

テトラデシルアンモニゥムプ Gミ F' 0.05 ]4.69

n-ォクチルトリメチル 7ンモニゥムク αライト' 0.5 12.57 1.00 0.74 0.99

2.0 11.46

η-デシルトリ^ルアン fニゥ λク αライト' 0.5 0.88 0.80 0.72

2.0 1.12 1.08 1.41

|ifィォン性 CHAPS 0.5 29.57

界面活性剤 2.0 25.32 1.63 1.82 2.42

バ-フルォ αアルキルべタイン S- 132 0.5 1.61

(ASAHI GLASS製） 2.0 1.49

3- (F'デシルジメチルアンモニォ）-1-プ αバンスルホン酸 0.5 i

：ot： c。 t— '

2.0 卜 4.57 3.44 5.26

ト Lnトト 1：：：

1 1

健常人血清に対する各血清の反応比率（SZN ratio)

Νο45 No46 No 3 No 7 Nol9 無添加 15.67 1.00 1.15 1.34 1.19 効果判定基準 >30.0 >2.0 >2.0 >2.0 >2.0 加剤

¾イオン ¾ MEGA- 10 0.5 3.38

0

Tween 20 16.7 0.5

Tween 40 15.6 0.5 1.02 0.99 1.41

Tween 80 15.0 0.5 1.33 1.23 1.10

Nonidet P- 40 13.1 0.5 43.14 3.09 2.95 4.58 ォクチルグル ^]シ F 0.5 0.90 0.60 0.97

2.0 1.92 1.20 2.63

Triton N101 13.4 0.5 1.85 1.62 2.70

L. U

Triton X100 13.5 0.5

Triton X114 12.4 0.5 2.04 1.65 2.77

2.0 1.92 2.11 2.51

Triton X305 17.3 0.5 0.94 0.97 1.08

2.0 1.30 1.24 1.87

Triton X 05 17.9 0.5 12.54 0.86 0.78 1.04

2.0 24.92 1.21 1.24 1.25 その他ベンジルジメチルフニル 7ンゥムク α ト' 0.5 ：： 5.45 1.00

2.0 7.01 1.12

：；

ェチルァミン 0.5 3.89：：：： 0.97

界面性剤 2%Fデシ - N-サル³シン酸ナトリウム

の S合 + 2%Triton X100 244.13 6.11 5.50 12.71

この結果から、 T r i t o n X I 0 0 に代表されるように、 H L B値が 1 2〜 1 4間を示す非イオン性界面活性剤の添加により、 H C V抗原陽性血清では、健常人血清と比較して発光量が増大し、検出感度が上昇することが判明した。また、同様にドデシルー N— サルコシン酸ナトリゥムゃドデシルトリメチルアンモニゥムに代表されるように、炭素数 1 0個以上の直鎖アルキル基と第 2級、第 3 級または 4級アミンを同時にその構造にもつ界面活性剤の添加により、 H C V抗原陽性血清における検出感度が上昇することも判明した。炭素数 8以下のアルキル基をもつ前記界面活性剤（ n—才クチノレトリメチルアンモニゥムクロライド）はこのような感度上昇効果は認められなかった。また、これらの 2種類の界面活性剤を混合（表 1 1では 2 % ドデシル— N—サルコシン酸ナトリゥムと 2 % T r i t o n X I 0 0を混合）添加することにより、さらに H C V抗原陽性血清における検出感度が上昇することも判明した。

実施例 1 6. H C V感染後の抗 H C V抗体出現前（ウィンドピリォド期）の検体中のコア抗原検出

巿販セ口コンヴァージョンパネル P H V 9 0 5 ( B . B . I . i n c . ) を、一次反応液中に 2 %の T r i t o n X I 0 0及び 2 %のドデシルシル N—サルコシン酸ナトリウムを添加し、実施例 1 5 に準じて測定した。ここで用いた P H V 9 0 5パネルは、観察開始後 2 1 日目（血清 N o . P H V 9 0 5 - 7 ) に抗 H C V抗体検査 (オルソ E I A. 3. 0 ) で陽転化を示したものであり、その抗体価はカットオフインデックス（ SZC O) で表され、 1 . 0以上が陽性と判定される。 H C Vコア抗原活性（発光量）は、健常人血清の発光量を 1. 0 として、それに対する反応比率（ S /N) で表した。

表 1 2 に示したように、まだ抗 H C V抗体が陽性となる前にコア抗原活性が認められ、この界面活性剤の添加により、ウィルス粒子からコア抗原性が露呈し、固相化されたモノク口ーナル抗体と反応し、検出できていることが確認された。表一 12

血清 No. 観察開始饺日数 HCV コア抗原活性 (S/ ) 抗 HCV抗体価（szco)

PHV905-1 0 5.32 0.000

4 U. UUL)

905-3 7 15.63 0.000

905-4 11 4.37 0.300

905-5 14 14.75 0.700

905-6 18 7.57 0.700

905-7 21 4.82 2.500

905-8 25 3.31 5.000

905-9 28 1.61 5.000

特許協力条約に基づく規則の第 13規則の 2 に規定する微生物への言及

寄託機関の名称：工業技術院生命工学工業技術研究所

寄託機関のあて名：日本国茨城県つくば巿東 1 丁目 1 番 3号

(郵便番号 305)

( 1 ) 微生物の表示 H C 1 1 一 3

寄託曰 1997年 7月 4 日

寄託番号 F E RM B P - 6 0 0 2

( 2 ) 微生物の表示 H C 1 1 - 7

寄託曰 1997年 7月 4 日

寄託番号 F E R M B P— 6 0 0 3

( 3 ) 微生物の表示 H C 1 1 - 1 0

寄託日 1997年 7 月 4 日

寄託番号 F E R M B P - 6 0 0 4

( 4 ) 微生物の表示 H C 1 1 一 1 1

寄託曰 1997年 7月 4 日

寄託番号 F E RM B P - 6 0 0 5

( 5 ) 微生物の表示 H C 1 1 - 1 4

寄託曰 1997年 7月 4 日

寄託番号 F E RM B P— 6 0 0 6

6 ο

Claims

請求の範囲

1. ウィルスを含む検体を、（ 1 ) 陰イオン性界面活性剤及び、 ( 2 ) 両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤又は蛋白質変性剤のいずれかを含む処理液で処理することを特徴とするゥィルス含有検体の処理方法。

2. ウィルスを含む検体を、（ 1 ) 陰イオン性界面活性剤、（ 2

) 両イオン性界面活性剤、及び（ 3 ) 非イオン性界面活性剤又は蛋白質変性剤のいずれかを含んだ処理液で処理することを特徴とするウィルス含有検体の処理方法。

3. ウィルスを含む検体を、（ 1 ) 陰イオン性界面活性剤、（ 2 ) 両イオン性界面活性剤、（ 3 ) 非イオン性界面活性剤、及び（ 4 ) 蛋白質変性剤を含んだ処理液で処理することを特徴とするウィルス含有検体の処理方法。

4. 前記処理液が、尿素、イミダゾール環含有化合物又はインド —ル環含有化合物をさらに含有する、請求項 1〜 4のいずれか 1 項に記載の方法。

5. 前記イミダゾール環含有化合物がイミダゾ一ル、ヒスチジン、イミダゾールアクリル酸、イミダゾ一ルカルボキシァルデヒド、ィミダゾールカルボキサミド、ィミダゾ一ルジオン、イミダゾ一ルジチォ力ノレボン酸、イミダゾールジカルボン酸、イミダゾ一ルメタノール、イミダゾリジンチオン、イミダゾリドン、ヒスタミン又はィミダゾピリジンである、請求項 4 に記載の方法。

6. 前記インドール環含有化合物がトリブトファン、インドールァクリル酸、インドール、インドール酢酸、インドール酢酸ヒドラジド、インドール酢酸メチルエステル、インドール酪酸、インド一ノレァセトニトリル、インドールカルビノール、インドールカルボキシアルデヒド、インドールカノレボン酸、インドールエタノール、ィンドール乳酸、インドールメタノール、インドールプロピオン酸、インドールピルビン酸、インドリノレメチルケトン、インド一マイシン、インドールアセトン、インドメタシン、インドプロフェン、ィンドラミンである、請求項 4 に記載の方法。

7. ウィルスを含む検体を、（ 1 ) カオトロピックイオン、及び ( 2 ) 酸性化剤を含む処理液で処理することを特徴とするウィルス含有検体の処理方法。

8. ウィルスを含む検体を、（ 1 ) カオトロピックイオン、（ 2 ) 酸性化剤、及び（ 3 ) 非イオン性界面活性剤を含む処理液で処理することを特徴とするウィルス含有検体の処理方法。

9. 前記ウィルスが、ゲノム R N A又は D N Aを包む構造蛋白質と、それを取り囲む膜蛋白質又は脂質膜から構成される構造を有するウイルス粒子を形成するウィルスである請求項 1 〜 8のいずれか 1 項に記載の方法。

1 0. 前記ウィルスが、 C型肝炎ウィルス（ H C V ) 、 D型肝炎ゥィルス、 E型肝炎ウィルス、 G型肝炎ウィルス、手足口病ウィルス、フラビウィルス（黄熱ウィルス、西ナイルウィルス、日本脳炎ゥィルス、デングウィルス）、トガウィルス（アルファウィルス、ノレピウイノレス、アルテリゥイノレス、ノレべラウイノレス）、ぺスチウィルス（ブタコレラウィルス、ゥシ下痢ウィルス）、パラミクソウィルス（パラインフルエンザウイルス 1 , 2 , 3 , 4 、ィヌジステムノ、。 —ゥイノレス、ニューカツスノレ病ゥイノレス、 R S ゥイノレス、リンダぺストウイノレス、サルノ、。ラインフルェンザゥイノレス、麻疹ウイノレス、ムンプスウィルス）、オルソクソウィルス（ヒトインフルエンザゥイノレス、トリインフルエンザウイルス、ゥマインフルエンザウィルス、ブタインフルエンザウイルス）、ラブドウィルス（狂犬病ウイノレス、水泡性口内炎ウィルス）、ピコルナウィルス（ポリオウィルス、コクサツキ一ゥイノレス、エコーゥイノレス、ゥシェンテロウイノレス、ブタエンテロウィルス、サルェンテロウィルス、マウス脳脊髄炎ウィルス、ヒトライノウィルス、ゥシライノウィルス、ゥマライノウィルス、ロ蹄疫ウィルス、 A型肝炎ウィルス）、コロナウィルス（ヒトコロナウィルス、ニヮトリ伝染性気管支炎ゥィルス、マウス肝炎ウィルス、豚伝染性胃腸炎ウィルス）、ァレナウィルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス、ラサウィルス、韓国型出血熱ウィルス）、レトロウイルス（ H T L V : ヒト成人白血病ウィルス、 H I V ：エイズウイルス、ネコ白血病肉腫ウィルス、牛白血病ウィルス、ラウス肉腫ウィルス）、レオウィルス（口夕ウィルス）、力リシウィルス（ノーウォークウィルス）、ブンャウィルス（腎症候性出血熱ゥイノレス）、フィロウイノレス（エボラゥイノレス、マールブルグウィルス）、 B型肝炎ウィルス（ H B V ) 、ボックスウィルス（ヮクシニアウィルス、アラストリウムウィルス、牛痘ウィルス、天然痘ウィルス）、パルボウイルス（ヒトパルボウイノレス、豚パルボウイノレス、牛パルボウイルス、犬パルボウイルス、ネコ白血球減少症ゥイノレス、ミンクァリュ一シャン病ゥイノレス）、ノ、⁰ポ一バウイノレス (パピローマウィルス、ポリオ一マウィルス）、アデノウイルス、ヘルぺスウィルス（単純へルぺスウィルス、サイトメガロウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、 E B ウィルス、馬へルぺスウィルス、ネコヘルぺスウィルス、マレック病ウィルス）又はアフリカ豚コレラウィルスである請求項 9 に記載の方法。

11. 前記ウィルスが C型肝炎ウィルス（H C V ) 又は B型肝炎ゥィルス（ H B V ) である、請求項 1 〜 1 0のいずれか 1 項に記載の方法。

12. 請求項 1 〜 1 0 のいずれか 1 項に記載の検体処理方法を用いて、ウィルス抗原を特異的に認識するプローブを反応させることにより、ウィルス抗原の存在を検出又は定量することを特徴とするゥィルスの測定方法。

13. H C 1 1 - 1 1 ( F E RM B P— 6 0 0 5 ) ， H C 1 1 - 1 4 ( F E RM B P - 6 0 0 6 ) ， H C 1 1 - 1 0 ( F E RM B P— 6 0 0 4 ) ， H C 1 1 - 3 ( F E RM B P— 6 0 0 2 ) 、及び H C 1 1 — 7 ( F E RM B P— 6 0 0 3 ) から成る群から選択されるハイプリドーマ細胞株。

14. H C 1 1 - 1 1 ( F E RM B P - 6 0 0 5 ) , H C 1 1 - 1 4 ( F E RM B P— 6 0 0 6 ) ， H C 1 1 - 1 0 ( F E RM B P— 6 0 0 4 ) ， H C 1 1 - 3 ( F E RM B P - 6 0 0 2 ) ， H C 1 1 - 7 ( F E RM B P— 6 0 0 3 ) から成る群から選択されるハイプリドーマによって産生されるモノクロ一ナル抗体。

15. 請求項 1 2 に記載の免疫測定方法に用いるための、陰イオン性界面活性剤を含んで成る、検体中のゥィルスの有無を判別するキット、定量するキット又は診断薬。

16. 請求項 1 2 に記載の免疫測定方法に用いるための、請求項 1 4 に記載のモノクローナル抗体を含んでなる、検体中のウィルスの有無を判別するキット、定量するキット又は診断薬。

17. 請求項 1 2 に記載の免疫測定方法に用いるための、カオトロピック剤を含んで成る、検体中のウィルスの有無を判別するキット、定量するキット又は診断薬。

18. 請求項 1 2 に記載の免疫測定方法に用いるための、ハイプリドーマ H C 1 1 — 1 4 ( F E RM B P - 6 0 0 6 ) ， H C 1 1 - 1 0 (F E RM B P— 6 0 0 4 ) または H C 1 1 — 1 1 ( F E R M B P - 6 0 0 5 ) により生産されるモノクローナル抗体を含んでなる、検体中の H C Vの有無を判別するキット、定量するキット又は診断薬。

1 9. 尿素、イミダゾール環含有化合物又はインドール環含有化合物をさらに含んで成る請求項 1 5〜 1 7 のいずれか 1 項に記載の診断ャッ卜

20. 前記ィミダゾ一ル環含有化合物がィミダゾール、ヒスチジン、イミダゾ一ルアクリル酸、イミダゾ一ルカルボキシァルデヒド、ィミダゾ一ルカルボキサミド、イミダゾ一ルジオン、イミダゾ一ルジチォカルボン酸、イミダゾ一ルジカルボン酸、イミダゾールメタノール、イミダゾリジンチオン、イミダゾリドン、ヒスタミン又はイミダゾピリジンである、請求項 1 9 に記載の診断キット。

2 1 . 前記インド一ル環含有化合物がトリブトファン、インドールアクリル酸、インドール、インドール酢酸、インドール酢酸ヒドラジド、インドール酢酸メチルエステル、インドール酪酸、インドーノレァセトニトリノレ、インドールカノレビノール、インド一ルカルボキシアルデヒド、インドールカルボン酸、インドールエタノール、ィンドール乳酸、インドールメタノール、インドールプロピオン酸、インドールピルビン酸、インドリノレメチルケトン、インド一マイシン、インドールアセトン、インドメタシン、インドプロフェン、ィンドラミン酸である、請求項 1 9 に記載の診断キット。

22. ウィルスの測定方法において、炭素原子数 1 0個以上のアルキル基と第 2、第 3 もしくは第 4級ァミンとを有する界面活性剤又は 1 2〜 1 4 の親水疎水比（H L B ) を有する非ィォン界面活性剤、あるいはこの両者の存在下で、ウィルス抗原を、そのプローブとの結合により測定することを特徴とする方法。

23. 前記アルキル基と第 2、第 3 もしくは第 4級ァミンとを有する界面活性剤が、炭素原子数 1 0〜 2 0個のアルキル基と第 3級又は第 4級アミンとを有する界面活性剤である、請求項 2 2 に記載の方法。

24. 前記第 3級又は第 4級ァミン界面活性剤が、ドデシルー N— サルコシン酸、セチルもしくはドデシルトリメチルアンモニゥム塩 3 — ( ドデシルジメチルアンモニォ）一 1 —プンスルホン酸、ドデシルピリミジゥム塩、又はデカノィルー N —メチルグルカミド（M E G A— 1 0 ) である、請求項 2 2又は 2 3 に記載の方法。

25. 前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンイソォクチルフヱ二ルェ一テル、又はポリオキシエチレンノニルフヱニルェ —テルである請求項 2 3 2 4のいずれか 1 項に記載の方法。

26. 前記ウィルス抗原のためのプローブが、ウィルス抗原に対する抗体である、請求項 2 2 2 5 のいずれか 1 項に記載の方法。

27. 前記ウィルスが、ゲノム R N A又は D N Aを包む構造蛋白質と、それを取り囲む膜蛋白質又は脂質膜から構成される構造を有するウイルス粒子を形成するゥィルスである請求項 2 2 2 6のいずれか 1 項に記載の方法。

28. 前記ウィルスが、 C型肝炎ウィルス（H C V ) D型肝炎ゥィルス、 E型肝炎ウィルス、 G型肝炎ウィルス、手足口病ウィルス、フラビウィルス（黄熱ウィルス、西ナイルウィルス、日本脳炎ゥイノレス、デングゥイノレス）、トガウイノレス（アルファゥイノレス、ノレビウィルス、アルテリウィルス、ノレベラウィルス）、ぺスチウィルス（ブタコレラゥイノレス、ゥシ下痢ゥイノレス） °ラミクソウイノレス（パラインフルエンザウイルス 1 2 3 , 4 、ィヌジステム —ゥイノレス、ニューカッスル病ゥイノレス、 R S ゥイノレス、リンダべストウィルス、サルパラインフルエンザウイルス、麻疹ウィルス、ムンプスウィルス）、オノレソクソウィルス（ヒトインフルエンザゥィルス、トリインフルエンザウイルス、ゥマインフルエンザウイノレス、ブタインフルエンザゥイノレス）、ラブドウィルス（狂犬病ウイノレス、水泡性口内炎ウィルス）、ピコルナウィルス（ポリオウィルス、コクサツキ一ゥイノレス、エコーゥイノレス、ゥシェンテロウイノレス、ブタエンテロウィルス、サルェンテロウィルス、マウス脳脊髄炎ウィルス、ヒトライノウィルス、ゥシライノウィルス、ゥマライノウィルス、ロ蹄疫ウィルス、 A型肝炎ウィルス）、コロナウィルス（ヒ卜コロナウィルス、ニヮトリ伝染性気管支炎ウィルス、マウス肝炎ウィルス、豚伝染性胃腸炎ウィルス）ァレナウィルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス、ラサウィルス、韓国型出血熱ウィルス）、レトロウイルス（H T L V : ヒ卜成人白血病ゥィルス、 H I V ：エイズウイルス、ネコ白血病肉腫ウィルス、牛白血病ウィルス、ラウス肉腫ウィルス）、レオウィルス（ロタウィルス）、力リシウィルス（ノーウォークウィルス）、ブンャウィルス（腎症候性出血熱ゥイノレス）、フイロウィルス（エボラゥイノレス、マールブルグウィルス）、 B型肝炎ウィルス（ H B V ) 、ボックスウィルス（ヮクシニアウィルス、アラストリウムウィルス、牛痘ウィルス、天然痘ウィルス）、パルボウイルス（ヒトパルボウイノレス、豚パルボウィルス、牛パルボウイルス、犬パルボウイルス、ネコ白血球減少症ゥイノレス、ミンクァリュ一シャン病ゥイノレス）ポ 'ウィルス、°ピロ一マウィルス、ポリオ一マウィルス）、アデノウイルス、ヘルぺスウィルス（単純へルぺスウィルス、サイトメガロウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、 E B ウィルス、馬へルぺスウィルス、ネコヘルぺスゥイノレス、マレック病ゥイノレス）又はアフリカ豚コレラウィルスである請求項 2 7 に記載の方法。

29. 前記ウィルスが C型肝炎ウィルス（ H C V ) 又は B型肝炎ゥィルス（ H B V ) である、請求項 2 2〜 2 8のいずれか 1 項に記載の方法。