WO1998045713A1 - Verfahren zur bestimmung von aktivierten blutgerinnungsfaktoren in plasma und plasmaderivaten - Google Patents

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WO1998045713A1
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plasma
factor
activated
thrombin
tissue factor
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PCT/EP1998/001264
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Günter WÖBER
Beate Gesien
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Blutspendedienst Der Drk-Landesverbände Nordrhein- Und Westfalen-Lippe Gmbh
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors

Definitions

  • the invention relates to a method for determining activated blood coagulation factors in plasma and plasma derivatives.
  • Blood coagulation factors are normally enzymatically inactive proenzymes, which are converted into their biologically active form by limited proteolytic cleavage.
  • prothrombin factor II
  • thrombin factor Ha
  • Thrombin also activates factor XIII, which crosslinks fibrin into a stable clot. This physiological activation is desirable in most cases.
  • tissue factor is an integral membrane protein that binds both factor VII and factor VIII with high affinity
  • tissue factor also catalyzes the activation of factor VII to factor VIIa.
  • tissue factor a mutated form of the tissue factor is described, the amino acid sequence around that section of the
  • 2Q protein is shortened, which is responsible for the binding to the membrane.
  • the now soluble tissue factor tTF can bind factor VIII and is fully active in a coagulation test. However, he has lost the ability to auto-catalyze from factor VII to factor VIIa. Therefore you can with help
  • a coagulation test which is known and described under the name NAPPT 35 (non-activated partial prothrombine time), is prescribed as a standard test for prothrombin complex PPSB (see: HS KINGDON et al .; Potentially thrombogenic materials in factor IX concentrates; Thro b. Diath. Haemorrh. 1975; 617-631).
  • a sample amount of the plasma or plasma derivative to be examined is incubated with activated prothrombin complex and procoagulatory phospholipid vesicles, containing the latter integrated tissue factor, and the formation of thrombin is started by adding a suitable amount of Ca ions,
  • the thrombin formation is ended and the amount of thrombin formed is determined by known methods.
  • the new test method works with materials that can be produced in practically unlimited quantities and can be stored for a long time, so that tests can be carried out without delay because of the formation of a platelet suspension.
  • the new test measures thrombin formation in defibrinated plasma in the presence of activated factors.
  • the amount of thrombin formed is measured using known methods by cleaving a synthetic substrate, for example the known S 2238 (see HP Schwarz et al .; Kyoto Satellite Symposia of Xllth Congress of ISTH; Kyoto, Japan, 1989; p. 34 - abstract). The resulting color is measured photometrically.
  • a test batch contains a small amount of a n e and activated prothrombin prokoagu- latowitz phospholipid vesicles, the latter being integrated tissue factor.
  • the presence of the activated prothrombin complex is chosen because, because of the auto-catalytic nature of thrombin formation with very small amounts of activated factors, the start-up phase (lag phase) of thrombin formation would be of different lengths. It would not be precisely defined after which incubation times one would have to measure the thrombin formation.
  • the tissue factor to be used is produced from biogenic starting material, acetone dry powder in particular being extracted from the bovine brain by a detergent-containing solution.
  • the tissue factor is mixed with phosphatidylserine and phosphatidylcholine in a detergent-containing solution for incorporation into procoagulatory phospholipid vesicles and integrated into the procoagulatory phospholipid vesicles by dialysis.
  • Ancrod (venom of the snake species Ankistrodon r odostoma; Sig a Chemical Co .; Art. No. A 5042) is mixed with distilled water diluted to 10 U / ml. 1 ml of human plasma from normal donors is mixed with 10 ⁇ l of Ancrod solution, incubated for 1 hour at 37 ° C., rapidly cooled to -70 ° C., warmed again to 37 ° C. and centrifuged. The supernatant, defibrinated plasma, is stored at room temperature and must be used within 10 minutes The defibrinated plasma can also be frozen in portions and contains only negligible traces of thrombin.
  • cryogen supernatant 50 ml of normal plasma are frozen, thawed at 4 ° C. overnight and 15 min. centrifuged. The supernatant is "cryogen supernatant"; 0.5 units of heparin per ml of cryogen supernatant are added to the latter.
  • DEAE-Sephadex is allowed to swell in 1 M NaCl solution for 15 min at room temperature (21 - 24 ° C) or overnight at 4 ° C (20 mg dry matter to 2 ml solution), by repeated filtering through a nylon mesh and resuspending in an equilibration puff - he equilibrate. Heparin-binding proteins are adsorbed from the supernatant on the ion exchanger by incubation at 4 ° C. for one hour. 40 ml of cryogen supernatant are added to equilibrated DEAE-Sephadex corresponding to 20 mg dry matter. The loaded DEAE-Sephadex is filtered off and cleaned by resuspending in washing buffer.
  • DEAE-Sephadex is suspended in 1 ml elution buffer and 15 min. protected at room temperature telt.
  • the solution of the partial prothrombin complex is dialyzed overnight against distilled water that has been pre-cooled to 4 ° C. and frozen in portions.
  • a suitable dilution of the PPK according to point 2 must be determined in the thrombin formation test (see point 5).
  • HEPES buffer eg 1:20, 1:40 and 1:80
  • HEPES N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N '- (2-ethanesulfonic acid
  • a suitable dilution is characterized by the linearity of the rate of cleavage of the chromogenic substrate S 2238.
  • the ready-to-use APK can be frozen in portions. With this procedure, an APK can be reproducibly produced with a factor Xa content of approximately 1% of the total amount of factor X in the preparation. Thrombin is not detectable after incubation of the APK with the chromogenic substrate S 2238.
  • Dialysis tubing cellulose membrane from Sigma (Art. No. D 9402) or Slide-A-Lyzer TM dialysis cassette from Fa.
  • Phosphatidylserine (Sigma Art. No. P 1185) Phosphatidylcholm (PC), (Sigma Art. No. P 4139).
  • Both phospholipids can contain unsaturated, but preferably saturated fatty acids;
  • Dialysis buffer in the form of 94.5 g sucrose and 0.27 g NaCl per liter dist. Water.
  • the dialysis buffer can also contain 0.5% NaN 3.
  • acetone dry powder is digested with 1 ml of the 10% octyl glucoside solution while shaking at about 30 ° C in an ultrasonic bath.
  • the insoluble material is removed by centrifugation, 20 mg of phospholipidic solution (molar ratio PC to PS 6 to 4) is dissolved per ml of supernatant and dialyzed against the dialysis buffer.
  • dialysis buffer which contains a gel for binding detergents (e.g. Biorad SM-2).
  • the detergent is removed by dialysis, and a suspension of vesicles is spontaneously formed, which contain the tissue factor integrated.
  • the vesicles obtained can be frozen in portions.
  • a suitable dilution is sought based on the blank value in the thrombin formation test (see point 5), the blank value being supposed to be a delta OD of 0.005 to 0.010.
  • HEPES / NaCl buffer 6 M HEPES, 139 M NaCl, 3.5 g albumin per 1 buffer, pH 7.35;
  • Citrate buffer 20 mM Na 3 citrate 2 H20, 125 mM NaCl, pH 7.35;
  • Plasma test for the presence of activated coagulation factors Pooled plasma, produced either from whole blood or by plasmapheresis, is treated with 1% Triton X-100 and 1% tributyl phosphate in a known manner to inactivate membrane-enveloped viruses (Neurath, AR and Horowitz, B., EP-PS
  • Chro ogenes substrate S 2238, Chro ogenix, Art. No. 41202 The content of a vial S 2238 (25 mg) is in 20 ml dist. Water dissolved; by dilution in the ratio l + i with dist. Water is made to a working dilution of 1 mM. Thrombin, 53 nkat, Chro Ogenix, Art. No. 41217, is in 1 ml of dist. Water dissolved. A buffer concentrate
  • a working buffer is made by mixing buffer concentrate (30 ml) with human serum albumin (HSA), 20% HSA (0.75 ml). This is used to mix substrate buffer containing 26 ml working buffer and 2.4 ml substrate solution.
  • HSA human serum albumin
  • thrombin formation from activated coagulation factors the values for APK and the blank value are subtracted from the measured extinction difference per minute. Using batch 9 as an example, this results in a value of 0.029.
  • a thrombin activity of 2 nkat is read off a calibration line with thrombin dilutions. If plasma samples contain heparin, this must be neutralized with protasulfate or Polybren TM (hexadimethrin bromide) before the test or preferably inactivated with heparinase.
  • Factor IXa, factor XIa and factor Xlla were obtained from Alexis, Art. No. 73510-1, 200-039-C025 and 200-042-UCO2. Defibrinated plasma was activated by incubation with thrombin (1.66 nkat, 10 min. At 37 ° C.), then the thrombin activity was increased using Pefabloc SC TM (4- (2-aminoethyl) -benzenesulfonyl fluoride hydrochloride), Boehringer Mannheim , Art. No. 1 429 868, inhibited. The amount of Pefabloc SC TM required to inhibit the thrombin activity presented was determined in a preliminary test.
  • factor IXa The manufacturer of factor IXa, factor XIa and factor Xlla only states the activity in plasma units for factor IXa, where 1 plasma unit corresponds to the amount of the factor in 1 ml of normal plasma. Using the pipetting scheme and the test procedure, it can be calculated that 0.003 plasma units of factor IXa in the test trigger a clearly measurable thrombin formation after only 5 minutes of incubation time in the thrombin formation test.
  • Factor VIIIa was obtained from Alexis, Art. No. 73560-1 or HF086-1. Defibrinated plasma was not am activated. The pipetting scheme and test procedure were analogous to those given in Example 2. In a direct comparison, factor VIII phospholipid vesicles with and without integrated tissue factor were examined as cofactors in the thrombin formation test. Vesicles without tissue factor were used undiluted, while vesicles with integrated tissue factor had to be prediluted by a factor of 2000. The following results were obtained in such a comparison:

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung aktivierter Gerinnungsfaktoren in Plasma oder Plasmaderivaten. Eine Probenmen ge an zu untersuchendem Plasma oder Plasmaderivat wird mit aktiviertem Prothrombinkomplex und prokoagulatorischen Phospholipidvesikeln, letztere integrierten Gewebefaktor enthaltend, inkubiert, und die Thrombinbildung wird durch Zugabe einer geeigneten Menge von Ca-Ionen in Gang gesetzt. Nach einer festgelegten Inkubationszeit wird die Thrombinbildung beendet und die Menge des gebildeten Thrombins durch bekannte Methoden bestimmt.

Description

Verf-ihren zur Bestimmung von aktivierten Blutgerinnungεfaktoren in Plasma und Plasmaderivaten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von aktivierten Blutgerinnungsfaktoren in Plasma und Plasmaderivaten .
Bei der Lagerung von Plasma bei niedrigen Temperaturen oder im Verlauf von Reinigungsverfahren können in Plasma oder Plasmaderivaten aktivierte Blutgerinnungsfaktoren entstehen. Blutgerinnungsfaktoren sind normalerweise enzymatisch inaktive Proenzyme, die durch begrenzte proteolytische Spaltung in ihre biologisch aktive Form umgewandelt werden. So entsteht beispielsweise am Schluß der Gerinnungskaskade aus Prothrom- bin (Faktor II) Thrombin (aktivierter Faktor II = Faktor Ha) , das Fibrinogen spaltet. Außerdem aktiviert Thrombin auch Faktor XIII, der Fibrin zu einem stabilen Gerinnsel vernetzt. Diese physiologische Aktivierung ist in den meisten Fällen erwünscht.
Unerwünscht ist dagegen eine artifizielle Aktivierung von Blutgerinnungsfaktoren in gelagertem Plasma oder bei der Herstellung eines gereinigten Prothrombinkomplexes aus Plasma, enthaltend Faktoren II, VII, IX, X als therapeutisch wirksame Bestandteile. Bei der Behandlung von Patienten mit umfas¬ senden Gerinnungsstörungen mit Prothrombinkomplex-Konzentraten, z.B. durch Blutverlust bei schweren Operationen, können thrombo-hämorrhagische Komplikationen als unerwünschte Nebenwirkung auftreten, deren Ursache unbekannt ist. Sicher ist, daß das Risiko solcher Komplikationen durch Gewebsthromboplas in, das nach schweren Operationen in 1 pathologisch hoher Konzentration im Kreislauf des Patienten zirkuliert, erhöht ist. Es wird auch vermutet, daß aktivierte Faktoren IX oder X in Prothrombinkomplex-Konzentraten zu einem erhöhten Thrombose-Risiko beitragen können .
5
Es werden daher Labortests an den genannten Plasmen und Plasmaderivaten durchgeführt, um die Abwesenheit aktivierter Faktoren nachzuweisen. Für Plasma ist eine Methode zur selektiven Messung von Faktor Vlla in Anwesenheit von Faktor
I Q VII bekannt (US-PS 5 472 850). In der Patentschrift ist ein Assay für einen Faktor Vlla beschrieben, der einen trunkierten (verkürzten) Gewebefaktor tTF verwendet. Der Gewebefaktor ist ein integrales Membranprotein, das sowohl Faktor VII als auch Faktor Vlla mit hoher Affinität bindet
15 und dadurch die Gerinnungskaskade auslöst. Außerdem katalysiert der Komplex aus Faktor Vlla und Gewebefaktor auch die Aktivierung von Faktor VII zu Faktor Vlla. In der Patentschrift wird eine mutierte Form des Gewebefaktors beschrieben, dessen Aminosäuresequenz um jenen Abschnitt des
2Q Proteins verkürzt ist, der für die Bindung an die Membran verantwortlich ist. Der nunmehr lösliche Gewebefaktur tTF kann Faktor Vlla binden und ist in einem Gerinnungstest voll aktiv. Er hat jedoch die Fähigkeit zur Autokatalyse von Faktor VII zu Faktor Vlla verloren. Daher kann man mit Hilfe
25 eines solchen löslichen mutierten Gewebefaktors in einem Gerinnungstest selektiv Faktor Vlla in Anwesenheit von Faktor VII in Plasma bestimmen.
Der Test ist jedoch relativ kompliziert durchzuführen und
30 bringt außerdem nur ein Ergebnis für das Vorhandensein des Faktors Vlla.
Als Standard-Test bei Prothrombin-Komplex PPSB ist ein Gerinnungstest vorgeschrieben, der unter der Bezeichnung NAPPT 35 (non-activated partial prothrombine time) bekannt und beschrieben ist (vergl.: H.S. KINGDON et al.; Potentially thrombogenic materials in factor IX concentrates ; Thro b. Diath. Haemorrh. 1975; 617 - 631).
Bei diesem Test wird die Gerinnungszeit von Plasma in Gegen- wart der zu untersuchenden Probe in Abwesenheit von Substanzen, wie Kaolin, die in vitro die Gerinnung in Gang setzen, gemessen. Diese Gerinnungszeit beträgt bei Abwesenheit von aktivierten Faktoren etwa 150 s; bei Anwesenheit von aktivierten Faktoren ist die Gerinnungszeit verkürzt. Dieser Test ist jedoch relativ wenig empfindlich und zeigt auch nicht in allen Fällen vorhandene aktivierte Faktoren an. Eine Kritik dieses Tests findet sich in dem Artikel von C.V. PRO SE und A.E. WILLIAMS "A Comparison of the in vitro and in vivo thrombogenic activity ..."; Thromb. Haemost. 1980, S. 81 - 86.
Es stellt sich damit die Aufgabe, einen präziseren und empfindlicheren Test zur Ermittlung der Anwesenheit von aktivierten Faktoren anzugeben, der ein breites Spektrum von aktivierten Faktoren angibt.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren mit folgenden Verfahrensschritten:
a) eine Probenmenge an zu untersuchendem Plasma oder Plasmaderivat wird mit aktiviertem Prothrombinkomplex und prokoagu- latorischen Phospholipidvesikeln, letztere integrierten Gewebefaktor enthaltend, inkubiert, und die Thrombinbildung wird durch Zugabe einer geeigneten Menge von Ca-Ionen in Gang gesetzt,
b) nach einer festgelegten Inkubationszeit von beispielsweise 5 min und 10 min wird die Thrombinbildung beendet und die Menge des gebildeten Thrombins durch bekannte Methoden bestimmt.
Bekannt ist ein Testverfahren (Y. SULTAN, F. LOYER, In Vitro Evaluation of Factor VHI-bypassing Activity ... ; j. Lab.
Clin. Med. 1993, S. 444 ff.), bei dem eine Thrombin-Bildung in Gegenwart einer mit Collagen aktivierten Blutplättchen- Suspension induziert wird. Blutplättchen müssen vor jedem Te- stansatz frisch aus Vollblut durch wiederholte Zentri- fugation präpariert, gewaschen und auf eine definierte Zellenzahl eingestellt werden. Derartige Plättchensuspensionen sind nur wenige Stunden haltbar und können nicht konserviert werden. Dies bedeutet eine kostspielige und nur von geübten Kräften ausführbare Tätigkeit, die die Anwendung diese bekannten Tests auf hochqualifizierte und bestausgestattete Laboratorien beschränkt.
Das neue Testverfahren dagegen arbeitet mit Materialien, die in praktisch unbeschränkter Menge herstellbar sind und für längere Zeit gelagert werden können, so daß Tests ohne zeitliche Verzögerung wegen des Ansatzes einer Blutplättchen- Suspension durchführbar sind.
Der neue Test mißt die Thrombinbildung in defibrinierte Plasma bei Anwesenheit aktivierter Faktoren. Die Menge des gebildeten Thrombins wird unter Anwendung bekannter Verfahren durch Spaltung eines synthetischen Substrats, beispielsweise des bekannten S 2238, gemessen (vergl. H.P. Schwarz et al.; Kyoto Satellite Symposia of Xllth Congress of ISTH; Kyoto, Japan, 1989; S. 34 - Abstract) . Die sich ergebende Färbung wird photometrisch vermessen.
Neben defibriniertem Plasma enthält ein Testansatz eine klei- ne Menge eines aktivierten Prothrombinkomplex und prokoagu- latorische Phospholipidvesikel, wobei letztere integrierten Gewebefaktor enthalten. Die Anwesenheit des aktivierten Prothrombinkomplexes ist deshalb gewählt, weil wegen der au- tokatalytischen Natur der Thrombin-Bildung bei sehr kleinen Mengen aktivierter Faktoren die Anlauf-Phase (lag-phase) der Thrombin-Bildung unterschiedlich lang wäre. Es wäre nicht genau festzulegen, nach welchen Inkubationszei¬ ten man die Thrombin-Bildung messen müßte. Legt man dagegen durch Hinzufügen einer kleinen, festgelegten Menge an akti¬ viertem Prothrombinkomplex ein "Grundrauschen" fest, wird dieses durch aktivierte Faktoren verstärkt. Man kann in die¬ sem Fall stets nach denselben Inkubationszeiten, beispielsweise nach 5 und 10 min, messen. Hervorzuheben ist, daß ins¬ besondere die Verwendung des minimal "aktivierten" Prothrom- binkomplexes in diesem Test und die Möglichkeit, aktivierte Faktoren XII, XI, iχ und VII in einem Test zu bestimmen, den besonderen Wert der Erfindung ausmachen.
Es hat sich als günstig erwiesen, wenn der Gehalt- an. EaJctαr— Xa im aktivierten Pmthrmnhin nmp] PV f-'T-wa τ_% des., g-≥≤amten Faktor X-Gehalts bei nichtmeßbarem Gehalt an Faktor Ha beträgt, da hierdurch das "Grundrauschen" am besten zu reproduzieren ist..
Der zu verwendende Gewebefaktor wird aus biogenem Ausgangsma- terial hergestellt, wobei insbesondere Acetontrockenpulver vom Rinderhirn durch eine detergenzhaltige Lösung extrahiert wird.
Der Gewebefaktor wird zum Einbau in prokoagulatorischen Phos- pholipidvesikeln in detergenzhaltiger Lösung mit Phosphati- dylserin und Phosphatidylcholin vermischt und durch Dialyse in die prokoagulatorischen Phospholipidvesikel integriert.
Ausführunαsbeispiele der Erfindung werden wie folgt erläutert:
Beispiel 1
1. Herstellung von defibriniertem Plasma
Ancrod (Gift der Schlangenart Ankistrodon r odostoma; Sig a Chemical Co.; Art. Nr. A 5042) wird mit destilliertem Wasser auf 10 U/ml verdünnt. 1 ml humanes Plasma von normalen Spendern wird mit 10 μl Ancrod-Lösung gemischt, 1 Stunde bei 37 °C inkubiert, rasch auf -70 "c abgekühlt, wieder auf 37 °C erwärmt und zentrifugiert. Der Überstand, defibrinier- tes Plasma, wird bei Raumtemperatur aufbewahrt und muß innerhalb von 10 min. verwendet werden. Das defibrinierte Plasma kann auch portioniert eingefroren werden. Es enthält nur vernachlässigbare Spuren von Thrombin.
2. Herstellung des partiellen Prothrombin-Komplexes (PPK1
Benötigte Reagentien: normales Plasma DEAE-Sephadex A 50 Elutionslösung. 30 g NaCl pro Liter dest. Wasser
Waschpuffer. 9 g Na 2HP0-1.2 H20 + 7 g NaCl pro Liter dest.
Wasser, pH auf 7,0 gestellt;
Äquilibrierungspuffer . 6 g Na 3-citrat.2 H20 + 7 g NaCl pro
Liter dest. Wasser, pH nicht verändern.
50 ml normales Plasma werden eingefroren, über Nacht bei 4 °C aufgetaut und 15 min. zentrifugiert. Der Überstand ist "Kryoüberstand" ; letzterem werden 0,5 Einheiten Heparin pro ml Kryoüberstand zugesetzt.
DEAE-Sephadex läßt man in 1 M NaCl-Lösung 15 min bei Raumtemperatur (21 - 24 °C) oder über Nacht bei 4 °C quellen (20 mg Trockenmasse zu 2 ml Lösung) , durch wiederholtes Filtrieren durch ein Nylonnetz und Resuspendieren in Äquilibrierungspuf- er äquilibrieren. Heparin-bindende Proteine werden aus dem Kryoüberstand an den Ionenaustauscher durch Inkubation bei 4 °C während einer Stunde adsorbiert. Dabei werden 40 ml Kryoüberstand zu äquilibriertem DEAE-Sephadex entsprechend 20 mg Trockenmasse gegeben. Der beladene DEAE-Sephadex wird abfil- triert und durch Resuspendieren in Waschpuffer gereinigt.
Nach erneutem Filtrieren wird DEAE-Sephadex in 1 ml Elutions- puffer suspendiert und 15 min. bei Raumtemperatur geschüt- telt .
Die Lösung des partiellen Prothrombinkomplexes wird nach Entfernung von DEAE-Sephadex über Nacht gegen auf 4 °C vorge- kühltes destilliertes Wasser dialysiert und portioniert eingefroren.
3. Herstellung des aktivierten Prothrombinkomplexes f PK^
Eine geeignete Verdünnung des PPK gemäß Punkt 2 muß im Thrombin-Bildungstest (siehe Punkt 5) ermittelt werden. Hierfür wird eine Verdünnungsreihe mit HEPESpuffer hergestellt (z.B. 1:20,1:40 und 1:80; HEPES = N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N' -(2-ethansulfonsäure) ] . Jede Verdünnung wird 5 min bei 37 °C mit CaCl in einer Endkonzentration von 10 mM inkubiert.
Eine geeignete Verdünnung ist durch die Linearität der Geschwindigkeit der Spaltung des chromogenen Substrats S 2238 charakterisiert. Der gebrauchsfertige APK kann portioniert eingefroren werden. Durch diese Vorgangsweise kann reprodu- zierbar ein APK mit einem Gehalt an Faktor Xa von etwa 1 % von der Gesamtmenge Faktor X in der Präparation hergestellt werden. Thrombin ist nach Inkubation des APK mit dem chromogenen Substrat S 2238 nicht nachweisbar.
4. Herstellung von prokoagulatorischen Phospholipidvesikeln mit integriertem Gewebefaktor
Benötigte Reagentien:
Dialyseschlauch, Cellulosemembran von Sigma (Art. Nr. D 9402) oder Slide-A-Lyzer™ Dialysekassette von Fa.
Pierce;
Acetontrockenpulver vom Rinderhirn (Brain Acetone Powder,
Sigma, Art. Nr. B 0508); n-Octyl-ß-D-glucopyranosid (kurz Octylglucosid) von Fa. Ale- xis (Art. Nr. 500-001-G005) ; 100 mg/ml dest. Wasser (10% G/V
Lösung) ;
Phosphatidylserin (PS), (Sigma Art. Nr. P 1185) Phosphatidylcholm (PC), (Sigma Art. Nr. P 4139). Beide Phos- pholipide können ungesättigte, vorzugsweise jedoch gesättigte Fettsäuren enthalten; Dialysepuffer in Form von 94,5 g Saccharose und 0,27 g NaCl pro Liter dest. Wasser. Der Dialysepuffer kann auch 0,5% NaN 3 enthalten.
0,216 g Acetontrockenpulver wird mit 1 ml der l0%igen Octyl- glucosidlösung unter Schütteln bei etwa 30 °C im Ultraschall- bad digeriert. Das Unlösliche wird durch Zentrifugation entfernt, pro ml Überstand wird 20 mg Phospholipid ischung (Molverhältnis PC zu PS 6 zu 4) gelöst und gegen den Dialysepuffer dialysiert. Unter täglichem Wechsel des Dialysepuffers wird 3 Tage dialysiert, anschließend weitere 2 Tage gegen Dialysepuffer, der ein Gel zum Binden von Detergentien (z.B. Biorad SM-2) enthält. Durch Dialyse wird das Detergenz entfernt, und es entsteht spontan eine Suspension von Vesi- keln, die den Gewebefaktor integriert enthalten. Die gewonnenen Vesikel können portioniert eingefroren werden.
Bei jeder neuen Präparation wird anhand des Blindwertes im Thrombin-Bildungstest (siehe Punkt 5) eine geeignete Verdünnung gesucht, wobei der Blindwert ein Delta OD von 0,005 bis 0,010 betragen soll.
5. Thrombin-Bildungstest
Benötigte Reagentien:
HEPES/NaCl-Puffer. 6 M HEPES , 139 M NaCl, 3,5 g Albumin pro 1 Puffer, pH 7,35;
Citratpuffer: 20 mM Na 3citrat«2 H20, 125 mM NaCl, pH 7,35;
Startlösung 375 mM CaCl , Stoplösung 40 M EDTA;
APK und Vesikel (Punkt 4) mit integriertem Gewebefaktor in geeigneter Verdünnung
5.1. Test von Plasma auf die Gegenwart aktivierter Gerinnungsfaktoren Gepooltes Plasma, hergestellt entweder aus Vollblut oder durch Plasmapherese, wird zur Inaktivierung membranumhüllter Viren in bekannter Weise mit 1% Triton X-100 und 1% Tributyl- phosphat versetzt (Neurath, A. R. und Horowitz , B., EP-PS
131 740) und 4 h bei 30°C inkubiert. Die beiden Chemikalien werden anschließend in bekannter Weise durch hydrophobe Chromatographie entfernt (Bonomo, R. J. , EP-PS 366 946). Zur Vorbereitung für den Test auf vorhandene aktivierte Gerinnungs- faktoren wird eine Plasmaprobe wie in Beispiel 1 beschrieben defibriniert.
Pipettierschema
- für den Blindwert: 250 μl HEPES/NaCl-Puffer + 250 μl defi- briniertes Plasma (Punkt 1);
- für den APK: 125 μl HEPES/NaCl-Puffer + 250 μl defibrinier- tes Plasma + 125 μl APK;
- für die Plasmaprobe: 125 μl HEPES/NaCl-Puffer + 125 μl de- fibriniertes Plasma + 125 μl APK + 125 μl defibrinierte Plasmaprobe des auf aktivierte Faktoren zu untersuchenden Plasmas.
Jedem Ansatz werden 50 μl Citratpuffer , 140 μl HEPES/ NaCl-Puffer und 10 μl Phospholipidsuspension, hergestellt nach Punkt 4, zugesetzt und 5 min bei 37 °C inkubiert. Mit 10 μl CaCl 2-Lösung wird die Reaktion gestartet, nach 5 min und 10 min wird je 50 μl der Mischung zu 50 μl einer vorgelegten EDTA-Lösung (EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure) zugesetzt, um dadurch die Thrombinbildung anzuhalten.
6. Test auf Thro binaktivität
Das Verfahren ist an sich bekannt und wird als "Kit" geliefert. Es wird hier nur der Vollständigkeit halber referiert,
Benötigte Reagentien:
Chro ogenes Substrat S 2238, Fa. Chro ogenix, Art. Nr. 41202. Der Inhalt eines Fläschchens S 2238 (25 mg) wird in 20 ml dest. Wasser gelöst; durch Verdünnen im Verhältnis l+i mit dest. Wasser wird eine Arbeitsverdünnung von 1 mM hergestellt. Thrombin, 53 nkat, Fa. Chro ogenix, Art. Nr. 41217, wird in l ml dest. Wasser gelöst. Ein Pufferkonzentrat aus
500 mM Tris, 75 mM EDTA, 10 % G/V PEG 6000, pH 8,4, wird mit dest. Wasser 1:10 verdünnt. Ein Arbeitspuffer wird durch Mischen von Pufferkonzentrat (30 ml) mit humanem Serum-Albumin (HSA), 20 % HSA (0,75 ml) hergestellt. Daraus wird Sub- stratpuffer gemischt, der 26 ml Arbeitspuffer und 2,4 ml Substratlösung enthält.
20 μl der unter Punkt 5.1 "Pipettierschema" genannten Probenmengen werden jeweils mit 500 μl Substratpuffer, der auf 37 "c vorgewärmt ist, gemischt. Die Extinktion wird in Minutenabständen gemessen. Zur Kontrolle der Linearität der Substratspaltung werden 5 Extinktionszyklen ä 1 min bei 405 nm gemessen. Eine Eichgerade wird mit Verdünnungen von Thrombin mit Arbeitspuffer im Bereich von 5,3 bis 0,53 nkat erstellt.
Mit virusinaktivierten Plasmaproben, hergestellt wie in
Punkt 5, wurden folgende Ergebnisse erhalten:
1,2,3... verschiedene Produktionschargen von virusinakti- viertem Plasma
B* APK 1 2 3 4
0,003 0,028 0,036 0,035 0,035 0,033
10
0,041 0,038 0,057 0,045 0,060 0,051
B* Blindwert Die angegeben Zahlen sind Extinktionsänderungen pro Minute und wurden nach einer Inkubation von 10 min beim Thrombinbildungstest erhalten. Der Meßpunkt mit 5 min Inkubation lieferte keine oder sehr geringe Extinktionsänderungen.
Zur Auswertung auf Thrombinbildung aus aktivierten Gerin- nungsfaktoren werden von der gemessenen Extinktionsdifferenz pro Minute die Werte für APK und der Blindwert subtrahiert. Am Beispiel der Charge 9 ergibt dies einen Wert von 0,029. An einer Eichgerade mit Thrombinverdünnungen wird eine Throm- binaktivität von 2 nkat abgelesen. Sofern Plasmaproben Heparin enthalten, muß dieses vor dem Test mit Prota insulfat oder Polybren™ (Hexadimethrinbro- mid) neutralisiert oder vorzugsweise mit Heparinase inaktiviert werden.
Beispiel 2 - Nachweis von aktiviertem Faktor IX . Faktor XI und Faktor XII
Faktor IXa, Faktor XIa und Faktor Xlla wurden von Fa. Alexis, Art. Nr. 73510-1, 200-039-C025 und 200-042-UCO2 bezogen. Defibriniertes Plasma wurde durch Inkubation mit Throm- bin (1,66 nkat, 10 min. bei 37 °C) aktiviert, anschließend wurde die Thrombinaktivität mit Pefabloc SC™ (4-(2-Aminoä- thyl)-benzolsulfonylfluorid Hydrochlorid) , Boehringer Mannheim, Art. Nr. 1 429 868, inhibiert. In einem Vorversuch wurde die zur Inhibition der vorgelegten Thrombinaktivität benötigte Menge Pefabloc SC™ ermittelt.
Pipettierschema:
- Blindwert: 250 μl HEPES/NaCl-Puffer + 250 μl defi- briniertes Plasma;
- APK: 125 μl APK + 125 μl HEPES/NaCl-Puffer + 250 μl defibriniertes Plasma;
- Faktor IXa, 10 μl einer Lösung mit 0,2 Plasmaein- heiten oder 10 μl Faktor XIa oder 10 μl Faktor Xlla + 125 μl APK + 115 μl HEPES/NaCl-Puffer + 250 μl de- fibriniertes Plasma.
Anschließend wird jedem Ansatz 50 μl Citratpuffer , 140 μl HEPES/NaCl-Puffer und 10 μl Phospholipidsuspension, hergestellt nach Beispiel 1, Punkt 4, zugesetzt und 5 min bei 37 °C inkubiert. Mit 10 μl CaCl 2-Lösung wird die Reaktion ge- startet, nach 5 min und 10 min wird je 50 μl der Mischung zu 50 μl einer vorgelegten EDTA-Lösung zugesetzt, um dadurch die Thrombinbildung zu stoppen.
B* APK F IXa F XIa F Xlla Inkubationszeit im Thrombin- +APK +ApK +ApK bildungstest
0 , 003 0 , 006 0 , 130 0 , 034 0 , 052 5 min.
0,022 0,039 0,112 0,083 0,088 10 min,
* Blindwert
Der Hersteller von Faktor IXa, Faktor XIa und Faktor Xlla gibt lediglich bei Faktor IXa die Aktivität in Plasmaeinheiten an, wobei 1 Plasmaeinheit der Menge des Faktors in 1 ml Normalplasma entspricht. Anhand des Pipettierschemas und der Testdurchführung läßt sich errechnen, daß 0,003 Plasmaein- heiten Faktor IXa im Test bereits nach 5 min Inkubationszeit im Thrombinbildungstest eine deutlich meßbare Thrombinbildung auslösen.
Beispiel 3 - Nachweis von aktiviertem Faktor VII
Faktor Vlla wurde von der Fa. Alexis, Art. Nr. 73560-1 oder HF086-1 bezogen. Defibriniertes Plasma wurde nicht mit Throm- bin aktiviert. Pipettierschema und Testdurchführung waren analog wie in Beispiel 2 angegeben. Im direkten Vergleich wurden bei Faktor Vlla Phospholipidvesikel mit und ohne integrierten Gewebefaktor als Kofaktor im Thrombinbildungstest untersucht. Vesikel ohne Gewebefaktor wurden unverdünnt eingesetzt, während Vesikel mit integriertem Gewebefaktor um den Faktor 2000 vorverdünnt werden mußten. In einem solchen Vergleich wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
B* APK F Vlla Inkubationszeit im Thrombin- +ApK bildungstest
Vesikel ohne Gewebefaktor 0,003 0,026 0,035 10 min,
Vesikel mit Gewebefaktor 0,015 0,039 0,061 10 min.
* Blindwert
In beiden Versuchsreihen befanden sich 0,002 Plasmaeinheiten Faktor Vlla im Test. In einer Versuchsreihe mit Vesikeln mit integriertem Gewebefaktor waren noch 0,001 Plasmaeinheiten Faktor Vlla deutlich nachweisbar.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung aktivierter Gerinnungsfaktoren in Plasma oder Plasmaderivaten, mit folgenden Verfahrensschritten:
10 a) eine Probenmenge an zu untersuchendem Plasma oder Plasmaderivat wird mit aktiviertem Prothrombinkomplex und prokoagulatorischen Phospholipidvesikeln, letztere integrierten Gewebefaktor enthaltend, inkubiert, und die Thrombinbildung wird durch Zugabe einer geeigneten Menge von Ca-Ionen in Gang gesetzt,
b) nach einer festgelegten Inkubationszeit von beispielsweise 5 min und 10 min wird die Thrombinbildung beendet und
20 die Menge des gebildeten Thrombins durch bekannte Methoden bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt an Faktor Xa im aktivierten
25 Prothrombinkomplex etwa 1% des gesamten Faktor X-Gehalts bei nichtmeßbarem Gehalt an Faktor Ha beträgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß der Gewebefaktor aus biogene gg Ausgangsmaterial hergestellt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Gewebefaktor mit einer detergenzhaltigen Lösung aus Acetontrockenpulver vom Rinderhirn extrahiert wird.
35
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Gewebefaktor in prokoagulatorische Phosp olipidvesikel integriert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4 und 5 , dadurch gekennzeichnet, daß der Gewebefaktor in detergenzhaltiger Lösung mit Phosphatidylserin und Phosphatidylcholm vermischt wird und durch Dialyse in die prokoagulatorischen Phospholipidvesikel integriert wird.
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