DE69632530T2

DE69632530T2 - Prothrombin aktivierendes enzym, das kalzium benötigt

Info

Publication number: DE69632530T2
Application number: DE69632530T
Authority: DE
Inventors: Takashi Tokorozawa-shi MORITA
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 1995-03-03
Filing date: 1996-02-29
Publication date: 2005-05-25
Anticipated expiration: 2016-03-01
Also published as: DE69632530D1; EP0814155A1; WO1996027660A1; PT814155E; EP0814155B1; EP0814155A4; US5972681A; ES2217305T3; JP3322676B2; ATE267250T1; DK0814155T3

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen calciumabhängigen Prothrombinaktivator, der aus Schlangengift stammt.
Stand der Technik
Im Körper zirkuliert das Blut in einem gewissen Gleichgewicht zwischen dem Koagulationssystem und dem fibrinolytischen System.
In der zweiten Phase der Blutverklumpung wird Prothrombin (Faktor II), welches einer der Blutkoagulationsfaktoren ist, durch Einwirkung von Thromboplastin (Faktor III) in Gegenwart von Calciumionen (Ca²⁺-Ionen: Faktor IV) umgewandelt. In der dritten Phase wird durch Thrombin auf Fibrinogen (Faktor I) eingewirkt und in Fibrinfäden verwandelt, wodurch die Blutverklumpung vollendet wird.
Eine Antikoagulationstherapie wird an Patienten verabreicht, die an ischämischen Herzerkrankungen leiden oder an Patienten mit einer Herzklappenprothese verabreicht, wobei die Prothrombinzeit zur Überwachung der Therapie gemessen wird. Die Messung der Prothrombinzeit wird durch das Messen der Dauer durchgeführt, die für die Koagulation durch Zugabe von Thromboplastin benötigt wird, welches eine exogene Substanz ist, die eine Blutverklumpung verursacht, zu einer Probe, wodurch die extrinsische Koagulations-Wirkungs-Aktivität studiert werden kann. Dieses Verfahren wird für die Gesamtmessung der extrinsischen Koagulationsfaktoren (Faktoren I, II, V, VII und X) verwendet.
Das als Reaktionsmittel für die obige Messung verwendete Thromboplastin wird aus einem Organ-extrahierten Phospholipid hergestellt, so dass es sich hinsichtlich der Empfindlichkeit je nach Produkten oder Batches unterscheidet. Der Messwert reflektiert daher nicht akkurat die Menge an Koagulationsfaktoren in der Probe, was dazu neigt, die Häufigkeit einer Hämorrhagie zu erhöhen, die durch eine übermäßige Verabreichung eines oralen Antikoagulationsmittels verursacht wird, und zu einem ernsthaften klinischen Problem geworden ist (Polier L. "Progress in standardization in anticoagulant control", Hematol. Rev. 1, 225–241 (1987); Latallo ZS, Thomson JM und Polier L, "An evaluation of chromogenic substrates in the control of oral anticoagulant therapy", Br. J. Haematol, 47, 307–318 (1981); Poller L. und Taberner DA, "Dosage and control of oral anticoagulants", An international survey, Br. J. Haematol. 51, 479–485 (1982)).
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist, das oben beschriebene Problem durch das Auffinden neuer Prothrombinaktivatoren, das Anwenden hiervon auf Messungen des Prothrombins im Blut zu überwinden und dadurch ein Reaktionsmittel für eine genaue Messung bereitzustellen. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin, das Reaktionsmittel in thrombinabhängigen Erkrankungen anzuwenden.
Offenbarung der Erfindung
Prothrombinaktivatoren, die bis heute aus Schlangengift abgetrennt wurden oder identifiziert wurden, können in drei Typen klassifiziert werden (Rosing, J. und Tans, G., Toxicon, 30, 1515–1527 (1992)). Enzyme, die zur Gruppe 1 gehören, sind Metalloproteasen, deren Wirkung auf Prothrombin von jeglichem Plasma oder exogenen Cofaktoren unabhängig ist. Solche, die zur Gruppe 2 gehören, sind Gla-haltige, Faktor Xa-artige Serinproteasen, die Faktor Va, Phospholipide und Calcium²⁺-Ionen benötigen. Solche, die zur Gruppe 3 gehören, sind Hybridenzyme, die Faktor Xa-artige katalytische Untereinheiten und Faktor Va-artige regulatorische und Faktor V-artige regulatorische Untereinheiten umfassen und ähnlich denen, die zur Gruppe 2 gehören, Phospholipide und Calcium²⁺-Ionen benötigen.
Es ist weitgehend bekannt (T. Morita et al., Methods Enzymol., 80, 303–311, 1981), dass Metalloproteasen, die Prothrombin aktivieren, im Gift von Echis carinatus vorhanden sind. Die vorstelligen Erfinder haben zahlreiche Vorrichtungen für Testbedingungen gefunden. Unter diesen Bedingungen haben die Erfinder Prothrombinaktivatoren im Gift von Echis carinatus gescreent und es geschafft, zwei calciumabhängige Prothrombinaktivatoren zu isolieren, die von Metalloproteasen wie beispielsweise Ecarin, welche heutzutage bekannt sind, verschieden sind. Diese zwei Aktivatoren wurden als Carinaktivase-1 und Carinaktivase-2 bezeichnet (welche nachfolgend als "CA-1" und "CA-2" abgekürzt werden). Als Ergebnis der Untersuchung ihrer Wirkung ist herausgefunden worden, dass obwohl Ecarin, welches ein Enzym ist, das heute bekannt ist, mit PIVKA-II reagiert (einem abnormalen Blutkoagulationsfaktor (Protein, das durch Vitamin K-Abwesenheit oder Antagonisten induziert wird) des Faktors II (Prothrombin)) und mit normalem Prothrombin, die Aktivatoren der vorliegenden Erfindung nicht mit PIVKA-II reagieren, sondern nur mit normalem Prothrombin, was zur Vollendung der vorliegenden Erfindung geführt hat.
Die vorliegende Erfindung stellt deswegen einen Prothrombinaktivator bereit, der aus Schlangengift stammt, welcher ein calciumabhängiger Protease-Typ ist, und genauer gesagt einen Prothrombinaktivator bereitstellt, welcher eine Metalloprotease ist. Der Aktivator umfasst nach SDS-PAGE-Analyse drei Polypeptidketten, die aus einer schweren Kette mit einem Molekulargewicht von ungefähr 62.000 oder ungefähr 60.000 und zwei leichten Ketten mit einem Molekulargewicht von ungefähr 17.000 und ungefähr 14.000 zusammengesetzt sind.
Der erfindungsgemäße Aktivator ist durch die Extraktion aus Schlangengift erhältlich. Unter Verwendung des Giftes von beispielsweise Echis carinatus als Schlangengift kann ein Prothrombinaktivator der vorliegenden Erfindung, der eine calciumabhängige Protease ist, erhalten werden.
Zusätzlich sind CA-1 und CA-2 im Hinblick auf die molekulare Größe und die enzymologischen Eigenschaften fast identisch. Was die N-terminale Aminosäuresequenz der schweren Kette von CA-1 angeht, wird die schwere Kette mit einem Molekulargewicht von ungefähr 62.000 durch die Sequenz dargestellt, die in der Sequenz Nr. 1 beschrieben ist, d. h. durch Ser Arg Lys Gln Lys Phe Asp Lys Lys Phe Ile Lys Leu Val Ile Val Val Asp His Ser Met Val Xaa Lys Xaa Asn Asn Asp Leu Ile, während die schwere Kette mit einem Molekulargewicht von ungefähr 60.000 durch die Sequenz dargestellt wird, die in der Sequenz Nr. 2 beschrieben ist, d. h. Lys Gln Lys Phe Asp Lys Lys Phe Ile Lys Leu Val Ile Val Val Asp His Ser Met Val Xaa Lys Xaa Asn Asn Asp Leu Ile Ala Ile. Die N-terminale Aminosäuresequenz der leichten Ketten von CA-1 wird durch die Sequenz dargestellt, die in der Sequenz Nr. 3 beschrieben ist, d. h. Asp Cys Leu Pro Gly Trp Ser Ser His Glu Gly His Cys Tyr Lys Val Phe Asn Gln Glu Met Tyr Trp Ala Asp Ala Glu Lys Phe Cys und durch die Sequenz, beschrieben in Sequenz Nr. 4, d. h. Asp Cys Leu Pro Asp Trp Phe His Tyr Glu Gly His Cys Tyr Arg Val Phe Asp Glu Pro Lys Lys Trp Ala Asp Ala Glu Lys Phe Cys. In einem weiteren Aspekt sind CA-1 und CA-2 fast identisch im Hinblick auf die molekulare Größe und enzymologischen Eigenschaften, und die N-terminalen Aminosäuresequenzen der schweren Kette und der leichten Ketten von CA-1 werden durch die Sequenz dargestellt, die in der Sequenz Nr. 5 beschrieben ist, d. h. Ser Arg Lys Gln Lys, die Sequenz, die in der Sequenz Nr. 6 beschrieben ist, d. h. Asp Cys Leu Pro Asp und die Sequenz, die in der Sequenz Nr. 7 beschrieben ist, d. h. Asp Cys Leu Pro Gly in dieser Reihenfolge.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend spezifischer beschrieben.
Die Reinigung des Aktivators der vorliegenden Erfindung aus Schlangengift wie beispielsweise dem Gift von Echis carinatus kann durch ein gewöhnliches Reinigungsverfahren für Proteine durchgeführt werden, z. B. Ionenaustauschchromatografie, Affinitätschromatografie, Gelfiltrationschromatografie, Absorptionschromatografie, Umkehrphasenchromatografie oder Partitionschromatografie.
Der Calcium benötigende Prothrombinaktivator der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise durch Reinigen des Schlangengiftes mit Hilfe der Gelfiltrationschromatografie auf Superdex, Affinitätschromatografie auf Blue Sepharose, und dann der Chromatografie auf einem stark basischen Harz, wie beispielsweise Q-Sepharose erhalten werden.
Insbesondere kann der calciumabhängige Prothrombinaktivator der vorliegenden Erfindung leicht unter Verwendung von Blue Sepharose aufgetrennt und gereinigt werden, die durch das Immobilisieren von Civachron blue F3GA auf Sepharose erhalten wird.
Die Aktivität der Prothrombinaktivierung von Fraktionen, die in den entsprechenden Reinigungsschritten erhalten werden, und das gereinigte Zielprodukt kann in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Morita et al. (T. Morita et al., Methods Enzymol., 80, 303–311 (1981)) gemessen werden.
Nachdem menschliches Prothrombin als Substrat mit einer Probe umgesetzt wird, kann die Menge an erhaltenem Thrombin unter Verwendung eines synthetischen Substrats gemessen werden. Der erfindungsgemäße Prothrombinaktivator kann durch Messung im Vorhandensein von Calcium²⁺-Ionen leicht von bekanntem unterschieden werden, z. B. in Gegenwart von 3 mmol Calcium²⁺-Ionen, oder in Abwesenheit von Calcium²⁺-Ionen.
Die N-terminale Aminosäuresequenz eines Peptids wurde mit einem Sequenzierer in einer per se im Fachgebiet bekannten Weise analysiert.
Der erfindungsgemäße Aktivator kann als Reaktionsmittel zum Messen der Prothrombinmenge in einer Probe eines menschlichen lebenden Körpers verwendet werden, da es nicht mit PIVKA-II reagiert.
Für das obengenannte Ziel wird die Probe des lebenden Körpers mit einem Aktivator der vorliegenden Erfindung umgesetzt, und dann wird die Menge des erhaltenen Thrombins gemessen. Zur Messung der Thrombinmenge kann ein Verfahren, das in dem Fachgebiet per se bekannt ist, verwendet werden, z. B. die Verwendung eines synthetischen Substrats oder die Messung der Blutkoagulationsdauer.
Das Reagenz zum Messen von Prothrombin in der Probe des menschlichen Körpers, welches mit der vorliegenden Erfindung zusammenhängt, kann durch eine heute bekannte Methode hergestellt werden. Zum Beispiel kann das Reaktionsmittel durch Mischadsorption von Plasma, das frei ist von Koagulationsfaktoren, die gemessen werden sollen, einer optimalen Menge an Calcium und eines Prothrombinaktivators der vorliegenden Erfindung, der aus Schlangengift stammt, hergestellt werden.
Der erfindungsgemäße Prothrombinaktivator kann durch Trennung und Reinigung eines natürlich vorkommenden Prothrombinaktivators hergestellt werden, der aus Schlangengift stammt. Es ist auch möglich, den Aktivator auf bekannte Weise durch chemische Synthese oder durch die Gen-Rekombinationstechnik zu erhalten. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die in einem oder mehrerer Teilen davon substituierten, depletierten, insertierten oder modifizierten Sequenzen oder sogar einen Teil der Aminosäuresequenz, solange sie eine Wirkung aufweist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt ein Elutionsmuster von 100 mg des Gifts von Echis carinatus leucogaster als Ergebnis der Chromatografie auf einer Säule mit Superdex 200 pg dar;
2 stellt ein Elutionsmuster der aktiven Fraktion, die in 1 erhalten wurde, als Ergebnis der Chromatografie auf einer Säule mit Blue Sepharose CL 6B, wobei Pool 1, Pool 2 und Pool 3 CA-1, CA-2 und dem konventionellen Prothrombinaktivator entsprechen;
3 stellt das Elutionsmuster der CA-1 und CA-2-Fraktionen dar, die in 2 als Ergebnis der Chromatografie auf einer Säule mit Q-Sepharose H. P. erhalten wurde;
4 stellt die SDS-PAGE der Reduktionsmittel der gereinigten Zielprodukte CA-1 und CA-2 dar.
Die schwere Kette, leichte Kette 1 und leichte Kette 2 sind gezeigt, um die Art des molekularen Gewichts zu zeigen; und
5 stellt die Prothrombin-akvitierende Wirkung von CA-1 und CA-2 auf die Calciumionenkonzentration dar.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend mit Hilfe von Beispielen in Details beschrieben, aber es sollte daran gedacht werden, dass die vorliegende Erfindung nicht durch diese begrenzt wird.
Beispiele
Beispiel 1
Verfahren zur Reinigung des erfindungsgemäßen Aktivators
Zuerst werden 100 mg des Gifts von Echis carinatus leucogaster auf einer Säule (Größe: 1,6 × 60 cm) mit Superdex 200 pg fraktioniert. In der 1 ist das Elutionsmuster von 1 ml Aliquoten gezeigt, die unter Verwendung eines 50 mmol Tris-HCl-Puffers (pH 8,0) bei einer Fließrate von 1 ml/min gesammelt wurden. Die Prothrombin-aktivierende Wirkung jeder Fraktion wurde gemessen. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass die Aktivierungsmenge unter Bedingungen größer ist, (durch einen gefüllten Kreis angegeben) bei denen 3 mmol Ca²⁺-Ionen vorhanden sind, als unter Bedingungen (angegeben durch nicht gefüllte Kreise) wo 3 mmol Ca²⁺-Ionen nicht vorhanden sind. Die Aktivität, die unter Bedingungen, in denen Ca²⁺-Ionen nicht vorhanden sind, gezeigt wird, wird durch Ecarin verursacht, welches ein konventionell bekannter Prothrombinaktivator ist. Das Vorhandensein eines anderen neuen Aktivators ist deswegen durch die Messung unter Anwesenheit von Ca²⁺-Ionen gefunden worden.
Die aktiven Fraktionen (Fr. Nr. 30–42) wurden dann zusammengefügt und einer Säule mit Blue Sepharose CL 6B (Größe: 1,0 × 20 cm) unterworfen. Nach der Elution mit dem ursprünglichen 50 mmol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) wurde eine Elution mit einem Konzentrationsgradienten (100 ml–100 ml) an NaCl in dem gleichen Puffer (0 mol bis 1 mol; 2 ml jeweils) durchgeführt. Wie in dem Elutionsmuster gezeigt, und in der Aktivitätsverteilung in der 2, wurden 3 Peaks an Aktivität erkannt: Pool 3 (Fr. Nr. 60–70) war Ecarin, das heute bekannt ist, während Pool 1 (Fr. Nr. 8–17) und Pool 2 (Fr. Nr. 35–44) in Gegenwart von Ca²⁺-Ionen eine starke Aktivität aufwiesen, welche als Carinaktivase-1 (CA-1) und Carinactivase-2 (CA-2) bezeichnet wurden.
Die so erhaltenen Pool 1 und Pool 2 wurden dann unter Verwendung einer Q-Sepharose H. P.-Säule gereinigt (Größe: 1,6 × 20 cm). Die Probe wurde in die gut mit 50 mmol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) gepufferte Säule gegeben, gefolgt von einer Elution mit einem Konzentrationsgradienten an NaCl bis zu 0,4 mol. Das Eluat wurde 2 ml-weise bei einer Fließrate von 1,0 ml/min fraktioniert. Als Ergebnis wurde vermutet, dass, wie in 3 gezeigt, jedes der CA-1 und CA-2 ein reines Produkt ist, wie aus dem Wirkungsgipfel beurteilt wurde, der mit dem Elutionspeak übereinstimmt, und der Peak-Wert ist scharf.
Beispiel 2
Untersuchung der Prothrombinaktivierung
Die Prothrombin-aktivierende Wirkung des erfindungsgemäßen Prothrombinaktivators wurde mit dem folgenden Verfahren untersucht.
Menschliches Prothrombin (10 μM/TBS, enthaltend 5 mmol CaCl₂) und eine Probe, die zu untersuchen war, wurden bei 37°C für 30 Minuten umgesetzt. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 100 mmol EDTA in einer Menge von einem Zehntel des Reaktionsgemisches hinzugegeben, wodurch die Reaktion beendet wurde. Die Menge an Thrombin, die erzeugt wurde, wurde durch das Messen der Aktivität des erhaltenen Thrombins mit VPR-pNA (Boc-Val-Pro-Arg-p-Nitroanilid) als Substrat quantifiziert. Spezifischer beschrieben wurden 10 μl 5 mmol VPR-pNA zu 90 μl des Reaktionsgemisches hinzugegeben (verdünnt wie erforderlich), dessen Reaktion bereits vollendet war, und sie wurden bei 37°C umgesetzt. Die ursprüngliche Geschwindigkeit der p-Nitroanilinfreisetzung wurde durch das Überwachen bei 405 nm mit einem kinetischen Plattenlesegerät (hergestellt von Seikagaku Kogyo Co., Ltd.) überwacht.
Beispiel 3
Bestimmung des Molekulargemichts und der N-terminalen Aminosäuresequenzen von CA-1 und CA-2
Unter reduzierenden Bedingungen wurden CA-1 und CA-2, die im Beispiel 1 erhalten wurden, mit SDS-PAGE analysiert. Wie in 4 gezeigt, wurde bestätigt, dass jedes hiervon aus drei Peptiden besteht, d. h., einer Komponente (schwere Kette) mit einem Molekulargewicht von ungefähr 62.000 oder ungefähr 60.000 und Komponenten (leichten Ketten) mit Molekulargewichten von ungefähr 17.000 und ungefähr 14.000, und dass die leichten Ketten durch eine Disulfidbindung verbunden sind.
Es ist vermutet worden, dass die Bindung zwischen der schweren Kette und den leichten Ketten nicht kovalente Bindungen sind. Als Ergebnis von Analysen der N-terminalen Aminosäuresequenz jeder Komponente von CA-1 mit Hilfe eines Peptidsequenziergerätes ist gefunden worden, dass die schwere Kette eine Sequenz hat, die in der Sequenz Nr. 1, 2 oder 5 beschrieben ist, und die leichte Kette eine Sequenz hat, die in der Sequenz Nr. 3, 4, 6 oder 7 beschrieben ist.
Beispiel 4
Ca²⁺-Ionen benötigende Eigenschaft von CA-1 und CA-2
Die Ca²⁺-Ionen benötigende Eigenschaft der gereinigten Zielprodukte CA-1 und CA-2 bei der Ausübung der Aktivität wurde bestätigt. Die Ergebnisse werden in 5 gezeigt.
Wie in 5 gezeigt, wurde bestätigt, dass sie ihre Aktivität nur ausüben, wenn Ca²⁺-Ionen vorhanden sind. Zusätzlich haben sie die Eigenschaft, dass sie nur mit normalem Prothrombin reagieren, aber nicht mit PIVKA-II reagieren.
Beispiel 5
Messung der Blutverklumpungsfähigkeit
Die Blutverklumpungsfähigkeit von jeweils CA-1 und Ecarin wurde untersucht.
Ein Teil (50 μl) an Plasma, das zu untersuchen war, wurde mit 50 μl Prothrombin-freiem Plasma (hergestellt von George King Inc.) gemischt und wurde bei 37°C für 2 Minuten inkubiert. Die Verklumpungsreaktion wurde durch die Zugabe eines Teils des Gemischs aus Aktivator/Ca²⁺ (enthaltend (i) 1 nmol Faktor Xa plus 1 mg/ml Phospholipide [Phosphatidylcholin/Phosphatidylserin; 3 : 1, w/w] oder (ii) 100 nmol CA-1, gelöst in TBS, enthaltend 15 mmol CaCl₂ oder (iii) 100 nmol Ecarin, gelöst im gleichen TBS gestartet, welche bei 37°C äquilibriert worden sind. Die Zeit, die für die Verklumpungsbildung benötigt wurde, wurde in einem Amelung-Koagulometer KC4A gemessen. Die Menge an Prothrombin in der Probe wurde durch Bezugnahme auf eine Standardkurve bestimmt, die mit normalem Plasma hergestellt worden ist; der Logarithmus der Verklumpungszeit wurde gegen den Logarithmus der Menge an Prothrombin aufgetragen. Die Konzentrationen an Aktivatoren wurden eingestellt, um eine Verklumpungszeit von 10 bis 15 s mit normalem Plasma zu ergeben.
Als Ergebnis ist herausgefunden worden, dass Ecarin nicht nur mit normalem Prothrombin reagiert, sondern auch mit endogenem Blutverklümpungsinhibitor (PIVKA), während CA-1 mit normalem Prothrombin, ähnlich wie Faktor Xa reagiert, aber keine Reaktion mit PIVKA zeigt.
SEQUENZLISTE

Claims

Prothrombin-aktivierendes Enzym, das aus Schlangengift stammt, welches Calcium zur Umwandlung von Prothrombin zu Thrombin benötigt, umfassend drei Polypeptidketten, die aus einer schweren Kette mit einem Molekulargewicht von 60.000 oder 62.000, und zwei leichten Ketten mit Molekulargewichten von 17.000 bzw. 14.000 zusammengesetzt sind, wie mittels SDS-PAGE analysiert.
Aktivator gemäss Anspruch 1, welcher eine Metalloprotease ist.
Aktivator gemäss Anspruch 1 oder 2, wobei die schwere Kette eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweist, wie in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 beschrieben, und die zwei leichten Ketten N-terminale Aminosäuresequenzen aufweisen, wie in SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 4 beschrieben.
Aktivator gemäss Anspruch 1 oder 3, wobei die schwere Kette eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweist, wie in SEQ ID NO: 5 beschrieben, und die zwei leichten Ketten N-terminale Aminosäuresequenzen aufweisen, wie in SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 7 beschrieben.
Aktivator gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Schlangengift das von Echis carinatus ist.
Aktivator gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Aminosäuresequenz teilweise substituiert, deletiert, insertiert oder modifiziert wurde, vorausgesetzt, dass der Aktivator seine Aktivität zum Umwandeln des Prothrombins zu Thrombin beibehält.
Aktivator gemäss Ansprüchen 1 bis 6, welcher ein rekombinantes Polypeptid ist.
Reagens zum Messen von Prothrombin in einer biologischen Probe, umfassend ein Enzym, wie in den Ansprüchen 1 bis 7 beschrieben.
Verfahren zur Trennung und Reinigung eines Prothrombinaktivators aus Schlangengift, wie in den Ansprüchen 1 bis 7 beschrieben, umfassend die Schritte der Reinigung des Schlangengifts mittels Gelfiltrationschromatografie, Affinitätschromatografie und dann Chromatografie auf einem starken basischen Harz.
Verfahren gemäss Anspruch 9 zur Trennung und Reinigung des Prothrombinaktivators gemäss Anspruch 1, umfassend die Schritte der Reinigung eines Schlangengifts mittels Gelfiltrationschromatografie, Affinitätschromatografie und dann Chromatografie auf einem stark basischen Harz.
Verfahren gemäss Anspruch 9 zur Trennung und Reinigung des Prothrombinaktivators gemäss Anspruch 1, umfassend die Schritte der Reinigung eines Schlangengifts von Echis carinatus mittels Gelfiltrationschromatografie, Affinitätschromatografie und dann Chromatografie auf einem starken basischen Harz.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 9 bis 11, umfassend die Verwendung von Blue Sepharose^®.