WO1996027660A1 - Enzyme activateur de prothrombine necessitant du calcium - Google Patents

Enzyme activateur de prothrombine necessitant du calcium Download PDF

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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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    • Y10S530/855—Proteins from animals other than mammals or birds
    • Y10S530/856—Snakes; venom

Definitions

  • Anticoagulant therapy is given to patients with ischemic heart disease and heart valve replacement patients, and monitoring of the therapy is measured by proto-oral time. This is a test to determine the time required for coagulation by adding to the sample exogenous blood coagulation-causing substance, ⁇ - ⁇ -omboplastin, and examining the extrinsic coagulation activity. I. X factor).
  • the prothrombin activating ability of the prothrombin activating enzyme according to the present invention was measured by the following method.

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Description

明細害
カ ルシゥ ム要求性ブロ ト ロ ン ビ ン活性化酵素 発明の分野
本発明は新規な、 坨毒由来の力ル シゥム要求性プロ ト D ン ビン活性化酵素に関 する。
関連技術
生体内においては、 血液は凝固系と線溶系とが一定のバラ ンスを保つこ とによ り循環している。
血液凝固因子の一つであるプロ ト ロ ン ビン （第 11因子） は血液凝固の第 2相に おいて、 カ ル シ ウ ム イ オ ン （ C a 2+ : 第 IV因子） 存在下 ト ロ ンボプラ ス チ ン （第 11 I因子） の作用によ り ト ロ ン ビンに変換され、 第 3相において ト o ン ビ ンがフ イ ブ リ ノ一ゲ ン （第 I因子） に作用してフ イ ブ リ ンを生成させ血液凝固が完成す る o
虚血性心疾患患者や心臓人工弁置換患者に ¾し抗凝血薬療法が行われており、 その療法のモニ タ リ ングはプロ ト 口 ン ビ ン時間が測定されている。 これは外因性 の血液凝固起因物質である ト α ンボプラ ス チ ンを検体に加え凝固する時間を则定 し、 外因性の凝固活性をみる検査で、 外因性因子（1, 1し V. V1 I. X因子）を総台的に 剮定するために用いれられるものである。
この则定に使われる試薬と して現在用いられている ト ロ ンボプラ スチ ン 、 Β 器抽出リ ン脂質製剤であるため製品毎、 ロ ッ ト毎に感度が異なる。 そのため検体 中の凝固因子量を正確に反映しておらず、 経口抗凝固剤の過剰投与による出血の 頻度が高く なるというケースが多発し、 臨床上大きな問題となっている （Pol ler
L, Progress in standardization in ant i coagulant con t rol . Heina to 1
Figure imgf000003_0001
1, 22 5-241.1987： Latal lo ZS. Thomson JM, Pol ler L, An evaluation of chromogen i c s ubs t ra tes in the contorol of oral anticoagulant therapy. Br J Haema to ! 47 , 307-318, 1981： Poller L. Taberner DA. osage and control of oral ant i coagu 1 a nt s, An international survey, Br J Haematol 51, 79-485, 1982 ) 0
本発明は新規なプロ ト ロ ン ビ ン活性化酵素を見いだし、 血中プロ ト ロ ン ヒ ン则 定系に応用し、 正確な M定試薬を提供するこ とによ り、 上記の問題点を解決し、 また、 ト ロ ン ビンが関与する疾患などへの応用を図る ものである。
発明の開示
今 Bまでに、 坨毒中から分離 . 同定されたプロ ト α ン ビ ン活性化酵素は 3 つの タイ プに分類される（Rosing. J. , and Tans. G. , Tox i con, 30.1515-1527.1992 ) 0 第 1 グループの酵素は、 血漿や外因性のコ フ ァ ク タ一から独立した、 プロ ト ロ ン ビ ンに鋤く メ タ 口 プロ テアーゼであ る。 第 2 グループの酵素は、 G 1 a残基を含み、 フ ァ ク タ ー V a、 リ ン脂質、 およびカ ルシウ ムイ オ ンを要求する フ ァ ク タ 一 X a 様セ リ ンプロ テアーゼである。 第 3 グループの酵素は、 フ ァ ク タ ー X a様 cataly tic subunitsと フ ァ クター V a regulatory subuni ts 力 りなるハイ ブリ ッ ド酵 素であり、 同様に リ ン脂質とカ ル シウ ム イ オ ンを要求する。
サメ ハダクサ リ蛇 （Echis carinatus) の坨毒中にはプロ ト ロ ン ビンを活性化 する メ タ ロ ブ口テア一ゼが存在する こ とが広く知られている （T. Morita et al. , Methods Enzymol..81, 303-311.1981 ) 。 本発明者等はサ メ ハダク サ リ蛇 （Echis carinatus) の毒について、 ア ツセ ィ条件を種々工夫しプロ ト ロ ン ビ ン活性化醉 素をス ク リ ーユ ングした結果、 今まで知られている ecarinなどのメ タ ロ フ ロ テア —ゼと異なるカ ル シ ゥ ム要求性プロ ト ロ ン ビ ン活性化酵素を 2種類単離し、 cari nactivase- 1, carinactivase-2と命名した （以下それぞれ CA- 1, CA- 2と略記する） 。 さ らにその酵素活性について検討した結果、 従来から知られている酵素 ecarinは PI VKA-I I (第 11因子（ブロ ト ロ ン ビ ン）の異常血液凝固因子（Protein Induced b Vitamin K Absence or Antagonist)) と正常ブ n ト ロ ン ビ ンに反 [f、する力 本発 明の酵紫は P 1 VKA- 11には反応せず、 正常プロ ト ロ ン ビ ン と のみ反応する こ とを見 出し本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、 カ ル シ ウ ム要求性プロテアーセである こ とを特徴とする蛇 毒由来のプロ ト ロ ン ビ ン活性化酵素であり、 プロ ト ロ ン ビ ン活性化酵素がメ タ π プロテアーゼである こ とを特徴とする蛇毒由来のプ口 ト ロ ン ビ ン活性化酵素であ る。 この酵素は S D S — P A G E分析にて分子量約 62.000または約 60.000の重蹈 並びに分子量約 Π.000および分子量約 14.000の二本の軽鎖の三本のポ リ へブ チ ト 鎖からなる。
こ の酵素は蛇毒から抽出され、 例えば蛇毒と してサ メ ハ ダク サ リ蛇 (Echis ca rinatus) の毒を用いる こ とによ り本発明のカ ルシウ ム要求性プロテアーゼであ るこ とを特徴とする蛇毒由来のプロ ト ロ ン ビン活性化酵素を得る こ とができ る。 また、 CA-1と CA-2は分子サイ ズ， 性状などほとんど同じ性質を示し、 CA-1の重 鎖の N端部ァ ミ ノ酸配列は、 分子量約 62.000の重鎖は配列番号 1 に記載の配列、 すなわち Ser Arg Ly s Gin し ys Phe Asp Lys Lys Phe lie Lys Leu Val I 1 e Va] Val Asp His Ser Met Val Xaa L s Xaa Asn Asn Asp Leu lieで、 分子置約 60, 00 0の重銷は配列番号 2 に記載の配列、 すなわち Lys Gin Lys Phe Asp Lys Lys Phe lie Lys Leu Val He Val Val Asp His Ser Met Val Xaa Lys Xaa Asn Asn Asp Leu He Ala lieで表され、 CA-1の軽鎮の N端部ァ ミ ノ酸配列は配列番号 3 に記 載の配歹 ϋ、 すなわち Asp Cys Leu Pro Gly Trp Ser Ser His Glu Gly His C s Ty r Lys Val Phe Asn Gin Glu Met Tyr Trp Ala Asp Ala Glu Lys Phe Cys およ び配列番号 4 に記載の 列、 すなわち Asp Cys Leu Pro Asp Trp Phe His Tyr Gl u Gly His Cys Tyr Arg Val Phe Asp Glu Pro Lys Lys Trp Ala Asp Ala Glu し y s Phe Cysで表される。 また、 CA-1と CA-2は分子サ イ ズ、 性状などほとんど同じ性 質を示し、 CA-1の重鎮および軽鎖の N端部ァ ミ ノ酸配列はそれぞれ順に配列番号 5 に記載の配列、 すなわち Ser Arg Lys Gin Lys, 配列番号 6 に記載の配列、 すなわ ち Asp Cys Leu Pro Asp, および配列番号 7 に記載の配列、 すなわち Asp Cys Leu Pro Glyで示される。
さ らに本発明を詳細に説明する。
本発明酵素の精製は、 蛇毒例えばサメ ハダクサ リ蛇 （Echis carinatus) 毒を 原料と して通常の蛋白質の精製手法例えばイ オ ン交換ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 ァ フ ィ ニテ ィ 一 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー、 ゲル濾過ク ロ マ ト グラ フ ィ ー、 吸着ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一、 逆相ク ロ マ ト グラ フ ィ ー、 分配ク ロ マ ト グラ フ ィ ーな どを使用する こ と によ り行う こ とができ る。
例えば、 蛇毒を Superdexな どのゲル濾過ク ロ マ ト グラ フ ィ ー、 次いで Blue Sep haroseな どのァ フ ィ 二テ ィ ク ロ マ ト グラ フ ィ ー、 次いで Q Sepharoseな どの強塩 基性樹脂ク 口 マ ト グラ フ ィ 一で精製する こ と によ り本発明たる カ ル シ ゥ ム要求性 プロ ト ロ ン ビ ン活性化酵素を得る こ とができ る。
特にセ フ ァ ロ ー ス に シバク ロ ンブルー F 3 G Aを固定化した、 ブルーセ フ ァ c ー ス （Blue Sepharose)を用いて精製することにより、 容易に本発明たるカルシゥ ム要求性プロ ト 口 ン ビ ン活性化酵素を分離 ' 精製するこ とができ る。
各精製過程での分画物および精製摞品のブ o ト 口 ン ビ ン活性化の活性測定法は 森田等の方法 （T.Morita et al.. Methods Enzymol ..80, 303-311.1981 ) に準じて 行う こ とができる。
ヒ ト プロ ト ロ ン ビンを基質と してサ ンブルと反応させた後、 生成した ト ロ ン ビ ン量を合成基質を用いて測定することができる。 なお Ca' +存在下、 例えば 3mMCa2 +共存下、 非共存下にて測定するこ とによ り、 容易に公知のプロ ト ロ ン ビ ン活性 化酵素と判別することができる。
ぺプチ ドの N端部ァ ミ ノ酸配列は常法により シークェ ンサ一によ り解折した。 本発明の酵素は PIVKA - IIに反応しないこ とから生体試料中のプロ ト ロ ン ビ ン量 を測定する試薬と して使用するこ とができる。
その刺定方法と しては、 例えば生体試料と本酵素を反応させた後、 生成した ト ロ ン ビ ン量を測定すればよ く、 ト ロ ン ビ ン量の測定は台成基質の使用または血液 凝固時間の測定などの常法の手段を用いることができる。
本発明にかかる生体試料中のプロ ト ロ ン ビ ン測定試薬は、 従来知られている 方法によ り調製することができる力 ;、 例えば測定対象となる凝血因子を取り除い た吸着血漿およびカルシウ ムの至適量、 本願発明にかかる蛇毒由来のプロ ト ロ ン ビ ン活性化酵素などを配合して調製することができる。
本願発明におけるプロ ト D ン ビ ン活性化酵素は天然に存在する蛇毒由来のもの を分離 · 精製して得ることができるが、 既知の方法で化学台成若し く は jfii云子組 換の手法により得られたものであってもよい。 また、 そのア ミ ノ酸配列の一箇所 若し く は二箇所以上が置換、 欠失、 挿入若しく は修飾されたもの、 またはその構 造体のァ ミ ノ酸配列の一部であっても活性を発現する ものであれば本発明に含ま れる。
図面の簡単な説明
図 1 は、 Echis carinatus 1 eucogas ter 茶 1 OOmgの Superdex 200 pgカ ラ ム ク ロマ ト グラ フ ィ 一の溶出パター ンである。
図 2 は、 図 1 で得られた活性画分の Blue-Sepharose CL δΒカ ラ ムク ロマ ト グラ フ ィ 一の溶出パター ンである。 pool 1が CA-1、 pool 2力'CA-2、 pool 3が従来のプ ロ ト ロ ン ビ ン活性化酵素に相当する。
図 3 は、 図 2で得られた CA-1および CA-2画分の Q Sepharose H. P. カ ラ ムク ロマ ト グラ フ ィ 一の溶出パター ンである。
図 4 は、 CA-1および CA-2の精製標品の還元体の SDS-PAGEの図である。 分子量の 大きい順に重鎖、 軽鎖- 1、 軽鎖- 2を示す。
図 5は、 CA-1および CA-2のカ ル シ ウ ムィォ ン濃度に対するプロ ト ロ ン ピ ン活性 化作用を示す図である。
以下の実施例をもって本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれら実施例に 限定される ものではない。
実施例
実施例 1. 本酵素の精製方法
サメハタ'クサ リ蛇 （Echi s carinatus leucogaster) 毒 1 OOugをまず最初に Supe rdex 200 pg力 ラ ム (サ イ ズ 1.6x 60cn) にて分画した。 50mM Tr i s-HCl緩衝液（pH 8.0)を使用し、 流速 Ira 1/分にて lnilづっ分取した溶出パター ンを図 1 に示した。 各分画についてプ n ト ロ ン ビ ン活性化活性を測定した結果、 図に示されるごと く 3mMCa' +非共存下条件 （白丸表示） より 3mMCa 2'共存下条件 （黒丸表示） の方が活 性量が多いことが確認された。 Ca 非共存下条件で表される活性が従来から知ら れているプロ ト ロ ンビン活性化酵素 ecarinであるが、 Ca 共存により別の新しい 酵素が存在することが判明した。
次いでその活性画分 （ fr. No.30-42) を集め Blue Sepharose CL 6Bカ ラ ム （サ ィ ズ 1. Q X 20cm) にチ ャージした。 50inM Tris-HCl緩衝液（pH8.0)にて最初溶出し た後、 同緩衝液食塩濃度 0Mから 1Mの澳度勾配溶出（lOOml-lOOml)を行い 2mlづっ分 取した。 溶出パター ンおよび活性の分布は図 2 に示されるごと く、 3 力所に活性 が i められ pool 3 < fr. No.60-70) が従来から知られている ecar i nであり、 pool 1 ( fr. No.8-17) および pool 2 (fr. No.35-44) が Ca2 +共存下で強い活性を発現し、 それぞれ、 carinactivase- 1 (CA - l), carinactivase-2(CA - 2)と命名した c
次いで、 上記で得られた pool 1と pool 2を 0 Sepharose H. P. カ ラ ム （サ イ ズ 1. 6x 20cm) を用いて精製した。 50mM Tr i s- HC 1緩衝液（pH8.0 )にてよ く緩衝化した カ ラ ムにサ ンブルをチ ャー ジ した後、 食塩 ¾度 0.4M迄の濃度勾配溶出を行つた。 流速 1. Onil/分で 21111分取した結果は図 3 に示した如く、 CA-1. CA-2いずれも活性ビ 一ク と溶出パタ一ンが一致し シャーブな ビーク と して確認され純品である と推定 された。
卖施例 2. プロ ト ロ ン ビ ン活性化測定法
本発明にかかるプロ ト ロ ン ビン活性化酵素のプロ ト ロ ン ビン活性化能の測定は 次の方法によ り行った。
ヒ ト プロ ト ロ ン ビ ン （ 10/ M/TBS 5BM CaCl 2 含有） と検体試料とを 37。Cで 30分 間反応させた後、 反応液の 1/10量の 100mM EDTAを添加し反応を停止する。 生成し た 卜 ロ ン ビ ン量は、 VPR-pNA (Boc-Val-Pro-Arg-p-ni troani 1 ide) を基質と して ト ロ ン ビ ン活性を刺定した。 すなわち反応を停止した反応液 90 1 (必要に応じ て希釈） に 5raM VPR-pNA. 10 u 1 添加、 37°Cにて反応させ p-二 ト ロア二 リ ン遊離 初速度を力 イ ネ テ イ ク ' ブ レー ト リ ー ダー （生化学工業社製） にて 405nmをモ 二 タ一し測定した。
荬施例 3. CA-1および CA-2の分子量および N端部のァ ミ ノ酸配列の決定 実施例 1 によ り得られた CA-1および CA-2を還元下 SDS-PAGEにて解析した结果、 図 4 に示す如く、 分子置約 62.000または約 60.000の成分（重銷）と分子量約】 7. 000 および約 14.000の成分（軽鎖）からなる 3本のべプチ ドから構成され、 軽鎖は ジ ス ルフ ィ ド結台で結ばれている こ とが確認された。 重鎖と軽銷の間の結台は非共有 的な ものである と推測された。 CA-1の各成分の N端部のァ ミ ノ酸 列をぺプチ ド シーク ェ ンサ—にて解析した結果、 重鎖は配列番号 1、 2 または 5記載の配列、 軽鎖は配列番号 3、 4、 6 または 7 記載の配列であるこ とが判明した。
卖施例 4 . CA- 1および CA-2の Ca2†要求性
CA- 1および CA-2の精製標品について活性発現における Ca2 +要求性について確 ¾ した結果を図 5 に示した。
このよ う に Ca 存在下にて初めて活性を発現するこ とが確認された。 さ ら に正 常プロ ト ロ ン ビ ンには反応するが P I V K A — I I には反応しないとい う性質も 有する。
実施例 5. 凝血能測定. CA-1および ecarinを用いて、 その凝血能を調べた。
検体血漿の一部（50 i Uを、 プロ ト ロ ン ビ ン欠損血？ » (Geroge King社製） 50 1 と混合し 37° で 2分間イ ンキュベー ト した。 凝血反応は、 37° で平衡化しておい た、 活性化因子/ Cai+(ィ） InM facter Xa. lng/nl リ ン脂質（ホ ス フ ァ チ ジルコ リ ン/ホ ス フ ァ チ ジルセ リ ン， 3:1.W/W)を含むもの、 又は n)15mM CaCl,を含む TBSに 溶解した 100nM CA-1 あるいは Λ)同 TBSに溶解した ΙΟΟηΜ ecar i n)の混合物の一部 を加えることにより開始した。 凝血時間は、 Amelung Coagu 1 omet er KC 4Aを用い て測定した。 試料中のプロ ト ロンビ ン量は、 標準血漿を用いて作成した標準曲線 から算出し、 凝血時間の対数をプロ ト 口 ン ビ ン量の対数に対してプロ ッ ト した。 活性化因子の濃度は標準血漿での凝血時間が 10〜15秒になるように調製した。 この結果 ecarinは正常ブ口 ト ロ ン ビ ンだけでなく内因性凝血阻害因子 I VKA ) に対しても反応するが、 CA-1は生体因子であるフ ァ ク タ ー Xaと同様に、 正常プロ ト ロ ン ビ ンには反応する力 ϊ、 PIVKAにほとんど感受性を示さないこ とがわかった £ Ε列表
配列番号 ： 1
配列の長さ ： 3 0
配列の型 ： ア ミ ノ酸
ト ポ ロ ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ぺプチ ド
配列
Ly s Gin し ys Phe Asp L s L s Phe lie Lys Leu Va 1 lie Va 1 Va 1 Asp His Ser
1 5 10 15
Met Va 1 Xaa L s Xaa Asn Asn Asp Leu lie Ala lie
20 25 30
配列番号 ： 2
配列の長さ ： 3 0
配列の型 ： ァ ミ ノ酸
ト ボ α ジー ： 直銷状
配列の種類 ： ぺブチ ド 配列
Ser Arg Lys Gin Lys Phe Asp Lys Lys Phe lie Lys Leu Val lie Val Val Asp
1 5 10 15
His Ser Met Val Xaa Lys Xaa Asn Asn Asp Leu lie
20 25 30
配列番号 ： 3
列の長さ ： 3 0
配列の型 ： ア ミ ノ酸
ト ポ ロ ジー ： 直鎮状
配列の種類 ： ぺブチ ド
配列
Asp Cys Leu Pro Gly Trp Ser Ser His Gl u Gly His Cys Tyr Lys Val Phe Asn 1 5 10 15
Gin Gl u Met Tyr Trp Ala Asp Ala Glu Lys Phe Cys
20 25 30
列番号 ： 4
配列の長さ ： 3 0
配列の型 ： ア ミ ノ酸
トボ口 ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： ペプチ ド
配列
Asp Cys Leu Pro Asp Trp Phe His Tyr Glu Gly His C s Tyr Arg Val Phe Asp 1 5 10 15
Glu Pro Lys Lys Trp Ala Asp Ala Glu Lys Phe Cys
20 25 30
配列番号 ： 5
配列の長さ ： 5
配列の型 ： ア ミ ノ酸
ト ポ ロ ジー ： 直銷状 配列の種類 ： ぺプチ ド 配列
Ser Arg し ys Gin Ly s
1 5 配列番号 ： 6
E列の長さ ： 5 配列の型 ： ア ミ ノ酸 ト ポ ロ ジー ： 直鎮状 ΒΞ列の種類 ： ぺプチ ド 配列
Asp Cy s Leu Pro Asp
1 5 配列番号 ： 7
配列の長さ ： 5 配列の型 ： ア ミ ノ酸 トポ ロ ジ一 ： 直鎮状 配列の種類 ： ぺプチ ド 配列
Asp Cy s Leu Pro Gl y 1 5

Claims

請求の範囲
1 、 カ ル シ ウ ム要求性である こ とを特徴とする蛇毒由来のブ α ト 3 ン ビ ン活性 化酵素。
2、 プロ ト ロ ン ビン活性化酵素がメ タ 口プロテアーゼであるこ とを特徴とする S青求項 1 記載の蛇毒由来の力ル シゥ ム要求性プロ ト ロ ン ビ ン活性化酵素。
3、 S D S — P A G E分析にて分子量約 6 0 0 0 0 の重鎮並びに分子量約 1 7 0 0 0 および分子量約 1 4 0 0 0 の二本の軽銷の三本のポ リ ぺプチ ド銷からなる 請求項 1 または 2記載の蛇毒由来のカ ル シゥ ム要求性プロ ト ロ ン ビ ン活性化酵素。
4、 S D S — P A G E分析にて分子量約 6 2 0 0 0 の重鎖並びに分子量約 1 7 0 0 0 および分子量約 1 4 0 0 0 の二本の軽銷の三本のポ リ べプチ ド銷からなる 請求項 1 または 2記載の蛇毒由来のカ ル シ ウ ム要求性プロ ト ロ ン ビ ン活性化酵素。
5、 重銷の N端部ア ミ ノ酸配列が配列番号 1 記載の配列であり、 二本の軽鎖の N端部ァ ミ ノ酸配列がそれぞれ配列番号 3 および配列番号 4記載の配列である請 求項 1 ない し 3記載の蛇毒由来の力 ル シ ゥ ム要求性プロ ト ロ ン ビ ン活性化醉素。
6、 重鎖の N端部ア ミ ノ酸配列が配列番号 2記載の配列であり、 二本の軽鎖の N端部ァ ミ ノ酸配列がそれぞれ配列番号 3 および配列番号 4 Ϊ己載の配列である請 求項 1， 2 または 4 記載の蛇毒由来の力 ル シゥ ム要求性プロ ト ロ ン ビ ン活性化酵 素。
7 、 重鎖の N端部ア ミ ノ酸配列が配列番号 53=己載の配列であり、 二本の軽鑌の N端部ァ ミ ノ酸配列がそれぞれ配列番号 6 および配列番号 7 記載の配列である請 求項 1 または 4記載の蛇毒由来の力 ル シ ゥ ム要求性プロ ト ロ ン ビ ン活性化酵素。
8、 蛇毒がサ メ ハダクサ リ蛇 （Echis carinatus) の毒である請求項 1 ない し 6 記載の蛇毒由来の力 ル シ ゥ ム要求性プ ロ ト ロ ン ビ ン活性化酵素。
9、 ア ミ ノ酸配列の一部が置換、 欠失、 挿入または修飾された請求項 1 ない し 8記載の蛇毒由来のカ ル シ ウ ム要求性プロ ト ロ ン ビ ン活性化酵素。
1 0、 遣伝子組換の手法によ り得られた 青求項 1 ないし 9記載の蛇毒由来の力 ル シ ゥ ム要求性プロ ト ロ ン ビ ン活性化酵素。
1 1 、 カ ル シ ウ ム要求性である こ とを特徴とする蛇毒由来のプ D ト π ン ビ ン活性 化酵素を含有してなる生体試料中のプロ ト 口 ン ビ ン刺定試薬。
1 2、 坨毒由来のプロ ト ロ ン ビン活性化酵素がメ タ ロプロテアーゼである こ とを 特徴とする請求項 1 1記載のプロ ト ロ ン ビ ン測定試薬。
1 3、 蛇毒由来のプロ ト ロ ン ビン活性化酵素が carinactivase-1また は carinact ivase-2のいずれか一つまたは両方である請求項 1 1 記載の生体試料 中のプロ ト 口 ン ビ ン測定試薬。
1 4、 坨毒をゲル慮過ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 次いでァフ ィ 二テ イ ク 口マ ト グラ フ ィ一、 次いで強塩基性樹脂ク ロマ ト グラ フ ィ 一で精製する こ とによ り得られる蛇 毒由来のカ ル シゥ ム要求性プロ ト ロ ン ビ ン活性化酵素。
1 5、 プロ ト ロ ン ビン活性化酵素がメ タ 口プロテア一ゼである ί青求項 1 4記載の 坨毒由来の力 ル シゥム要求性プロ ト 口 ン ビ ン活性化酵素。
1 6、 蛇毒がサ メ ハダクサ リ蛇 (Echis carinatus) の毒である請求項 1 4 または 1 5記載の蛇毒由来の力 ル シ ゥ ム要求性プ π ト 口 ン ビ ン活性化酵素。
1 7、 ブルーセ フ ァ ロ ー ス （Blue Sepharose) を用いる こ とを特徴とする蛇毒由 来の力 ル シゥ ム要求性プロ ト ロ ン ビ ン活性化酵素の分離 · 精製方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0975975A1 (de) * 1997-04-09 2000-02-02 Blutspendedienst der DRK-Landesverbände Nordrhein und Westfalen-Lippe GmbH Verfahren zur bestimmung von aktivierten blutgerinnungsfaktoren in plasma und plasmaderivaten
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06199673A (ja) * 1992-09-04 1994-07-19 Pentapharm Ag リン脂質依存性プロトロンビン活性剤、その製造方法、凝血試験法および凝血試験キット

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
THROMB. HAEMOSTASIS, Vol. 57, No. 3, (1987), SPEIJER H., "Platelet Procoagulant Properties Studied with Snake Venom Prothrombin Activators", p. 349-355. *
THROMB. RES., Vol. 8, No. 5, PIRKLE H., "Thrombin-Like Enzymes of Snake Venoms Actions on Prothrombin", p. 619-627. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5935802A (en) * 1998-08-10 1999-08-10 Evanston Northwestern Healthcare Research Institute Method of assaying a blood sample for prothrombin

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