JP3322676B2 - カルシウム要求性プロトロンビン活性化酵素 - Google Patents
カルシウム要求性プロトロンビン活性化酵素Info
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- C12N9/6402—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は新規な、蛇毒由来のカルシウム要求性プロト
ロンビン活性化酵素に関する。
ロンビン活性化酵素に関する。
関連技術 生体内においては、血液は凝固系と線溶系とが一定の
バランスを保つことにより循環している。
バランスを保つことにより循環している。
血液凝固因子の一つであるプロトロンビン（第II因
子）は血液凝固の第２相において、カルシウムイオン
（Ca2+:第IV因子）存在下トロンボプラスチン（第III因
子）の作用によりトロンビンに変換され、第３相におい
てトロンビンがフィブリノーゲン（第Ｉ因子）に作用し
てフィブリンを生成させ血液凝固が完成する。
子）は血液凝固の第２相において、カルシウムイオン
（Ca2+:第IV因子）存在下トロンボプラスチン（第III因
子）の作用によりトロンビンに変換され、第３相におい
てトロンビンがフィブリノーゲン（第Ｉ因子）に作用し
てフィブリンを生成させ血液凝固が完成する。
虚血性心疾患患者や心臓人工弁置換患者に対し抗凝血
薬療法が行われており、その療法のモニタリングはプロ
トロンビン時間が測定されている。これは外因性の血液
凝固起因物質であるトロンボプラスチンを検体に加え凝
固する時間を測定し、外因性の凝固活性をみる検査で、
外因性因子（I,II,V,VII,X因子）を総合的に測定するた
めに用いれられるものである。
薬療法が行われており、その療法のモニタリングはプロ
トロンビン時間が測定されている。これは外因性の血液
凝固起因物質であるトロンボプラスチンを検体に加え凝
固する時間を測定し、外因性の凝固活性をみる検査で、
外因性因子（I,II,V,VII,X因子）を総合的に測定するた
めに用いれられるものである。
この測定に使われる試薬として現在用いられているト
ロンボプラスチンは、臓器抽出リン脂質製剤であるため
製品毎、ロット毎に感度が異なる。そのため検体中の凝
固因子量を正確に反映しておらず、経口抗凝固剤の過剰
投与による出血の頻度が高くなるというケースが多発
し、臨床上大きな問題となっている（Poller L,Progres
s in standardization in anticoagulant control.Hema
tol Rev １,225−241,1987;Latallo ZS,Thomson JM,Pol
ler L,An evaluation of chromogenic substrates in t
he contorol of oral anticoagulant therapy,Br J Hae
matol 47,307−318,1981;Poller L,Taberner DA,Dosage
and control of oral anticoagulants,An internation
al survey,Br J Haematol 51,479−485,1982）。
ロンボプラスチンは、臓器抽出リン脂質製剤であるため
製品毎、ロット毎に感度が異なる。そのため検体中の凝
固因子量を正確に反映しておらず、経口抗凝固剤の過剰
投与による出血の頻度が高くなるというケースが多発
し、臨床上大きな問題となっている（Poller L,Progres
s in standardization in anticoagulant control.Hema
tol Rev １,225−241,1987;Latallo ZS,Thomson JM,Pol
ler L,An evaluation of chromogenic substrates in t
he contorol of oral anticoagulant therapy,Br J Hae
matol 47,307−318,1981;Poller L,Taberner DA,Dosage
and control of oral anticoagulants,An internation
al survey,Br J Haematol 51,479−485,1982）。
本発明は新規なプロトロンビン活性化酵素を見いだ
し、血中プロトロンビン測定系に応用し、正確な測定試
薬を提供することにより、上記の問題点を解決し、ま
た、トロンビンが関与する疾患などへの応用を図るもの
である。
し、血中プロトロンビン測定系に応用し、正確な測定試
薬を提供することにより、上記の問題点を解決し、ま
た、トロンビンが関与する疾患などへの応用を図るもの
である。
発明の開示 今日までに、蛇毒中から分離・同定されたプロトロン
ビン活性化酵素は３つのタイプに分類される（Rosing,
J.,and Tans,G.,Toxicon,30,1515−1527,1992）。第１
グループの酵素は、血漿や外因性のコファクターから独
立した、プロトロンビンに働くメタロプロテアーゼであ
る。第２グループの酵素は、Gla残基を含み、ファクタ
ーVa、リン脂質、およびカルシウムイオンを要求するフ
ァクターXa様セリンプロテアーゼである。第３グループ
の酵素は、ファクターXa様catalytic subunitsとファク
ターVa様regulatory subunitsからなるハイブリッド酵
素であり、同様にリン脂質とカルシウムイオンを要求す
る。
ビン活性化酵素は３つのタイプに分類される（Rosing,
J.,and Tans,G.,Toxicon,30,1515−1527,1992）。第１
グループの酵素は、血漿や外因性のコファクターから独
立した、プロトロンビンに働くメタロプロテアーゼであ
る。第２グループの酵素は、Gla残基を含み、ファクタ
ーVa、リン脂質、およびカルシウムイオンを要求するフ
ァクターXa様セリンプロテアーゼである。第３グループ
の酵素は、ファクターXa様catalytic subunitsとファク
ターVa様regulatory subunitsからなるハイブリッド酵
素であり、同様にリン脂質とカルシウムイオンを要求す
る。
サメハダクサリ蛇（Echis carinatus）の蛇毒中には
プロトロンビンを活性化するメタロプロテアーゼが存在
することが広く知られている。（T.Morita et al.,Meth
ods Enzymol.,80,303−311,1981）。本発明者等はサメ
ハダクサリ蛇（Echis carinatus）の毒について、アッ
セイ条件を種々工夫しプロトロンビン活性化酵素をスク
リーニングした結果、今まで知られているecarinなどの
メタロプロテアーゼと異なるカルシウム要求性プロトロ
ンビン活性化酵素を２種類単離し、carinactivase−1,c
arinactivase−２と命名した（以下それぞれCA−1,CA−
２と略記する）。さらにその酵素活性について検討した
結果、従来から知られている酵素ecarinはPIVKA−II
（第II因子（プロトロンビン）の異常血液凝固因子（Pr
otein Induced by Vitamin K Absence or Antagonis
t））と正常プロトロンビンに反応するが、本発明の酵
素はPIVKA−IIには反応せず、正常プロトロンビンとの
み反応することを見出し本発明を完成するに至った。
プロトロンビンを活性化するメタロプロテアーゼが存在
することが広く知られている。（T.Morita et al.,Meth
ods Enzymol.,80,303−311,1981）。本発明者等はサメ
ハダクサリ蛇（Echis carinatus）の毒について、アッ
セイ条件を種々工夫しプロトロンビン活性化酵素をスク
リーニングした結果、今まで知られているecarinなどの
メタロプロテアーゼと異なるカルシウム要求性プロトロ
ンビン活性化酵素を２種類単離し、carinactivase−1,c
arinactivase−２と命名した（以下それぞれCA−1,CA−
２と略記する）。さらにその酵素活性について検討した
結果、従来から知られている酵素ecarinはPIVKA−II
（第II因子（プロトロンビン）の異常血液凝固因子（Pr
otein Induced by Vitamin K Absence or Antagonis
t））と正常プロトロンビンに反応するが、本発明の酵
素はPIVKA−IIには反応せず、正常プロトロンビンとの
み反応することを見出し本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、カルシウム要求性プロテアーゼで
あることを特徴とする蛇毒由来のプロトロンビン活性化
酵素であり、プロトロンビン活性化酵素がメタロプロテ
アーゼであることを特徴とする蛇毒由来のプロトロンビ
ン活性化酵素である。この酵素はSDS−PAGE分析にて分
子量約62,000または約60,000の重鎖並びに分子量約17,0
00および分子量約14,000の二本の軽鎖の三本のポリペプ
チド鎖からなる。
あることを特徴とする蛇毒由来のプロトロンビン活性化
酵素であり、プロトロンビン活性化酵素がメタロプロテ
アーゼであることを特徴とする蛇毒由来のプロトロンビ
ン活性化酵素である。この酵素はSDS−PAGE分析にて分
子量約62,000または約60,000の重鎖並びに分子量約17,0
00および分子量約14,000の二本の軽鎖の三本のポリペプ
チド鎖からなる。
この酵素は蛇毒から抽出され、例えば蛇毒としてサメ
ハダクサリ蛇（Echis carinatus）の毒を用いることに
より本発明のカルシウム要求性プロテアーゼであること
を特徴とする蛇毒由来のプロトロンビン活性化酵素を得
ることができる。
ハダクサリ蛇（Echis carinatus）の毒を用いることに
より本発明のカルシウム要求性プロテアーゼであること
を特徴とする蛇毒由来のプロトロンビン活性化酵素を得
ることができる。
また、CA−１とCA−２は分子サイズ，性状などほとん
ど同じ性質を示し、CA−１の重鎖のＮ端部アミノ酸配列
は、分子量約62,000の重鎖は配列番号１に記載の配列、
すなわちSer Arg Lys Gln Lys Phe Asp Lys LysPhe Ile
Lys Leu Val Ile Val Val Asp His Ser Met Val Xaa L
ys Xaa Asn Asn Asp Leu Ileで、分子量約60,000の重鎖
は配列番号２に記載の配列、すなわちLys Gln Lys Phe
Asp Lys Lys Phe Ile Lys Leu Val Ile Val Val Asp Hi
s Ser Met Val Xaa Lys Xaa Asn Asn Asp Leu Ile Ala
Ileで表され、CA−１の軽鎖のＮ端部アミノ酸配列は配
列番号３に記載の配列、すなわちAsp Cys Leu Pro Gly
Trp Ser Ser His Glu Gly His Cys Tyr Lys Val Phe As
n Gln Glu Met Tyr Trp Ala Asp Ala Glu Lys Phe Cy
s、および配列番号４に記載の配列、すなわちAsp Cys L
eu Pro Asp Trp Phe His Tyr Glu Gly His Cys Tyr Arg
Val Phe Asp Glu Pro Lys Lys Trp Ala Asp Ala Glu L
ys Phe Cysで表される。また、CA−１とCA−２は分子サ
イズ、性状などほとんど同じ性質を示し、CA−１の重鎖
および軽鎖のＮ端部アミノ酸配列はそれぞれ順に配列番
号５に記載の配列、すなわちSer Arg Lys Gln Lys、配
列番号６に記載の配列、すなわちAsp Cys Leu Pro As
p、および配列番号７に記載の配列、すなわちAsp Cys L
eu Pro Glyで示される。
ど同じ性質を示し、CA−１の重鎖のＮ端部アミノ酸配列
は、分子量約62,000の重鎖は配列番号１に記載の配列、
すなわちSer Arg Lys Gln Lys Phe Asp Lys LysPhe Ile
Lys Leu Val Ile Val Val Asp His Ser Met Val Xaa L
ys Xaa Asn Asn Asp Leu Ileで、分子量約60,000の重鎖
は配列番号２に記載の配列、すなわちLys Gln Lys Phe
Asp Lys Lys Phe Ile Lys Leu Val Ile Val Val Asp Hi
s Ser Met Val Xaa Lys Xaa Asn Asn Asp Leu Ile Ala
Ileで表され、CA−１の軽鎖のＮ端部アミノ酸配列は配
列番号３に記載の配列、すなわちAsp Cys Leu Pro Gly
Trp Ser Ser His Glu Gly His Cys Tyr Lys Val Phe As
n Gln Glu Met Tyr Trp Ala Asp Ala Glu Lys Phe Cy
s、および配列番号４に記載の配列、すなわちAsp Cys L
eu Pro Asp Trp Phe His Tyr Glu Gly His Cys Tyr Arg
Val Phe Asp Glu Pro Lys Lys Trp Ala Asp Ala Glu L
ys Phe Cysで表される。また、CA−１とCA−２は分子サ
イズ、性状などほとんど同じ性質を示し、CA−１の重鎖
および軽鎖のＮ端部アミノ酸配列はそれぞれ順に配列番
号５に記載の配列、すなわちSer Arg Lys Gln Lys、配
列番号６に記載の配列、すなわちAsp Cys Leu Pro As
p、および配列番号７に記載の配列、すなわちAsp Cys L
eu Pro Glyで示される。
さらに本発明を詳細に説明する。
本発明酵素の精製は、蛇毒例えばサメハダクサリ蛇
（Echis carinatus）毒を原料として通常の蛋白質の精
製手法例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ー、分配クロマトグラフィーなどを使用することにより
行うことができる。
（Echis carinatus）毒を原料として通常の蛋白質の精
製手法例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ー、分配クロマトグラフィーなどを使用することにより
行うことができる。
例えば、蛇毒をSuperdexなどのゲル濾過クロマトグラ
フィー、次いでBlue Sepharoseなどのアフィニティクロ
マトグラフィー、次いでQ Sepharoseなどの強塩基性樹
脂クロマトグラフィーで精製することにより本発明たる
カルシウム要求性プロトロンビン活性化酵素を得ること
ができる。
フィー、次いでBlue Sepharoseなどのアフィニティクロ
マトグラフィー、次いでQ Sepharoseなどの強塩基性樹
脂クロマトグラフィーで精製することにより本発明たる
カルシウム要求性プロトロンビン活性化酵素を得ること
ができる。
特にセファロースにシバクロンブルーF3GAを固定化し
た、ブルーセファロース（Blue Sepharose）を用いて精
製することにより、容易に本発明たるカルシウム要求性
プロトロンビン活性化酵素を分離・精製することができ
る。
た、ブルーセファロース（Blue Sepharose）を用いて精
製することにより、容易に本発明たるカルシウム要求性
プロトロンビン活性化酵素を分離・精製することができ
る。
各精製過程での分画物および精製標品のプロトロンビ
ン活性化の活性測定法は森田等の方法（T.Morita et a
l.,Methods Enzymol.,80,303−311,1981）に準じて行う
ことができる。
ン活性化の活性測定法は森田等の方法（T.Morita et a
l.,Methods Enzymol.,80,303−311,1981）に準じて行う
ことができる。
ヒトプロトロンビンを基質としてサンプルと反応させ
た後、生成したトロンビン量を合成基質を用いて測定す
ることができる。なおCa2+存在下、例えば3mMCa2+共存
下、非共存下にて測定することにより、容易に公知のプ
ロトロンビン活性化酵素と判別することができる。
た後、生成したトロンビン量を合成基質を用いて測定す
ることができる。なおCa2+存在下、例えば3mMCa2+共存
下、非共存下にて測定することにより、容易に公知のプ
ロトロンビン活性化酵素と判別することができる。
ペプチドのＮ端部アミノ酸配列は常法によりシークエ
ンサーにより解析した。
ンサーにより解析した。
本発明の酵素はPIVKA−IIに反応しないことから生体
試料中のプロトロンビン量を測定する試薬として使用す
ることができる。
試料中のプロトロンビン量を測定する試薬として使用す
ることができる。
その測定方法としては、例えば生体試料と本酵素を反
応させた後、生成したトロンビン量を測定すればよく、
トロンビン量の測定は合成基質の使用または血液凝固時
間の測定などの常法の手段を用いることができる。
応させた後、生成したトロンビン量を測定すればよく、
トロンビン量の測定は合成基質の使用または血液凝固時
間の測定などの常法の手段を用いることができる。
本発明にかかる生体試料中のプロトロンビン測定試薬
は、従来知られている方法により調製することができる
が、例えば測定対象となる凝血因子を取り除いた吸着血
漿およびカルシウムの至適量、本願発明にかかる蛇毒由
来のプロトロンビン活性化酵素などを配合して調製する
ことができる。
は、従来知られている方法により調製することができる
が、例えば測定対象となる凝血因子を取り除いた吸着血
漿およびカルシウムの至適量、本願発明にかかる蛇毒由
来のプロトロンビン活性化酵素などを配合して調製する
ことができる。
本願発明におけるプロトロンビン活性化酵素は天然に
存在する蛇毒由来のものを分離・精製して得ることがで
きるが、既知の方法で化学合成若しくは遺伝子組換の手
法により得られたものであってもよい。また、そのアミ
ノ酸配列の一箇所若しくは二箇所以上が置換、欠失、挿
入若しくは修飾されたもの、またはその構造体のアミノ
酸配列の一部であっても活性を発現するものであれば本
発明に含まれる。
存在する蛇毒由来のものを分離・精製して得ることがで
きるが、既知の方法で化学合成若しくは遺伝子組換の手
法により得られたものであってもよい。また、そのアミ
ノ酸配列の一箇所若しくは二箇所以上が置換、欠失、挿
入若しくは修飾されたもの、またはその構造体のアミノ
酸配列の一部であっても活性を発現するものであれば本
発明に含まれる。
図面の簡単な説明 図１は、Echis carinatus leucogaster毒素100mgのSu
perdex 200 pgカラム クロマトグラフィーの溶出パタ
ーンである。
perdex 200 pgカラム クロマトグラフィーの溶出パタ
ーンである。
図２は、図１で得られた活性画分のBlue−Sepharose
CL 6Bカラムクロマトグラフィーの溶出パターンであ
る。pool 1がCA−１、pool 2がCA−２、pool 3が従来の
プロトロンビン活性化酵素に相当する。
CL 6Bカラムクロマトグラフィーの溶出パターンであ
る。pool 1がCA−１、pool 2がCA−２、pool 3が従来の
プロトロンビン活性化酵素に相当する。
図３は、図２で得られたCA−１およびCA−２画分のQ
Sepharose H.P.カラムクロマトグラフィーの溶出パター
ンである。
Sepharose H.P.カラムクロマトグラフィーの溶出パター
ンである。
図４は、CA−１およびCA−２の精製標品の還元体のSD
S−PAGEの図である。分子量の大きい順に重鎖、軽鎖−
１、軽鎖−２を示す。
S−PAGEの図である。分子量の大きい順に重鎖、軽鎖−
１、軽鎖−２を示す。
図５は、CA−１およびCA−２のカルシウムイオン濃度
に対するプロトロンビン活性化作用を示す図である。
に対するプロトロンビン活性化作用を示す図である。
以下の実施例をもって本発明を具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例 実施例1.本酵素の精製方法 サメハダクサリ蛇（Echis carinatus leucogaster）
毒100mgをまず最初にSuperdex 200 pgカラム（サイズ1.
6×60cm）にて分画した。50mM Tris−HCl緩衝液（pH8.
0）を使用し、流速1ml/分にて1mlづつ分取した溶出パタ
ーンを図１に示した。各分画についてプロトロンビン活
性化活性を測定した結果、図に示されるごとく3mMCa2+
非共存下条件（白丸表示）より3mMCa2+共存下条件（黒
丸表示）の方が活性量が多いことが確認された。Ca2+非
共存下条件で表される活性が従来から知られているプロ
トロンビン活性化酵素ecarinであるが、Ca2+共存により
別の新しい酵素が存在することが判明した。
毒100mgをまず最初にSuperdex 200 pgカラム（サイズ1.
6×60cm）にて分画した。50mM Tris−HCl緩衝液（pH8.
0）を使用し、流速1ml/分にて1mlづつ分取した溶出パタ
ーンを図１に示した。各分画についてプロトロンビン活
性化活性を測定した結果、図に示されるごとく3mMCa2+
非共存下条件（白丸表示）より3mMCa2+共存下条件（黒
丸表示）の方が活性量が多いことが確認された。Ca2+非
共存下条件で表される活性が従来から知られているプロ
トロンビン活性化酵素ecarinであるが、Ca2+共存により
別の新しい酵素が存在することが判明した。
次いでその活性画分（fr.No.30−42）を集めBlue Sep
harose CL 6Bカラム（サイズ1.0×20cm）にチャージし
た。50mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）にて最初溶出した
後、同緩衝液食塩濃度0Mから1Mの濃度勾配溶出（100ml
−100ml）を行い2mlづつ分取した。溶出パターンおよび
活性の分布は図２に示されるごとく、３カ所に活性が認
められpool 3（fr.No.60−70）が従来から知られている
ecarinであり、pool 1（fr.No.8−17）およびpool 2（f
r.No.35−44）がCa2+共存下で強い活性を発現し、それ
ぞれ、carinactivase−１（CA−１）,carinactivase−
２（CA−２）と命名した。
harose CL 6Bカラム（サイズ1.0×20cm）にチャージし
た。50mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）にて最初溶出した
後、同緩衝液食塩濃度0Mから1Mの濃度勾配溶出（100ml
−100ml）を行い2mlづつ分取した。溶出パターンおよび
活性の分布は図２に示されるごとく、３カ所に活性が認
められpool 3（fr.No.60−70）が従来から知られている
ecarinであり、pool 1（fr.No.8−17）およびpool 2（f
r.No.35−44）がCa2+共存下で強い活性を発現し、それ
ぞれ、carinactivase−１（CA−１）,carinactivase−
２（CA−２）と命名した。
次いで、上記で得られたpool 1とpool 2をQ Sepharos
e H.P.カラム（サイズ1.6×20cm）を用いて精製した。5
0mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）にてよく緩衝化したカラ
ムにサンプルをチャージした後、食塩濃度0.4M迄の濃度
勾配溶出を行った。流速1.0ml/分で2ml分取した結果は
図３に示した如く、CA−1,CA−２いずれも活性ピークと
溶出パターンが一致しシャープなピークとして確認され
純品であると推定された。
e H.P.カラム（サイズ1.6×20cm）を用いて精製した。5
0mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）にてよく緩衝化したカラ
ムにサンプルをチャージした後、食塩濃度0.4M迄の濃度
勾配溶出を行った。流速1.0ml/分で2ml分取した結果は
図３に示した如く、CA−1,CA−２いずれも活性ピークと
溶出パターンが一致しシャープなピークとして確認され
純品であると推定された。
実施例2.プロトロンビン活性化測定法 本発明にかかるプロトロンビン活性化酵素のプロトロ
ンビン活性化能の測定は次の方法により行った。
ンビン活性化能の測定は次の方法により行った。
ヒトプロトロンビン（10μM/TBS 5mM CaCl2含有）と
検体試料とを37℃で30分間反応させた後、反応液の1/10
量の100mM EDTAを添加し反応を停止する。生成したトロ
ンビン量は、VPR−pNA（Boc−Val−Pro−Arg−ｐ−nitr
oanilide）を基質としてトロンビン活性を測定した。す
なわち反応を停止した反応液90μｌ（必要に応じて希
釈）に5mM VPR−pNA,10μｌ添加、37℃にて反応させｐ
−ニトロアニリン遊離初速度をカイネティク・プレート
リーダー（生化学工業社製）にて405nmをモニターし測
定した。
検体試料とを37℃で30分間反応させた後、反応液の1/10
量の100mM EDTAを添加し反応を停止する。生成したトロ
ンビン量は、VPR−pNA（Boc−Val−Pro−Arg−ｐ−nitr
oanilide）を基質としてトロンビン活性を測定した。す
なわち反応を停止した反応液90μｌ（必要に応じて希
釈）に5mM VPR−pNA,10μｌ添加、37℃にて反応させｐ
−ニトロアニリン遊離初速度をカイネティク・プレート
リーダー（生化学工業社製）にて405nmをモニターし測
定した。
実施例3.CA−１およびCA−２の分子量およびＮ端部のア
ミノ酸配列の決定 実施例１により得られたCA−１およびCA−２を還元下
SDS−PAGEにて解析した結果、図４に示す如く、分子量
約62,000または約60,000の成分（重鎖）と分子量約17,0
00および約14,000の成分（軽鎖）からなる３本のペプチ
ドから構成され、軽鎖はジスルフィド結合で結ばれてい
ることが確認された。重鎖と軽鎖の間の結合は非共有的
なものであると推測された。CA−１の各成分のＮ端部の
アミノ酸配列をペプチドシークエンサーにて解析した結
果、重鎖は配列番号１、２または５記載の配列、軽鎖は
配列番号３、４、６または７記載の配列であることが判
明した。
ミノ酸配列の決定 実施例１により得られたCA−１およびCA−２を還元下
SDS−PAGEにて解析した結果、図４に示す如く、分子量
約62,000または約60,000の成分（重鎖）と分子量約17,0
00および約14,000の成分（軽鎖）からなる３本のペプチ
ドから構成され、軽鎖はジスルフィド結合で結ばれてい
ることが確認された。重鎖と軽鎖の間の結合は非共有的
なものであると推測された。CA−１の各成分のＮ端部の
アミノ酸配列をペプチドシークエンサーにて解析した結
果、重鎖は配列番号１、２または５記載の配列、軽鎖は
配列番号３、４、６または７記載の配列であることが判
明した。
実施例4.CA−１およびCA−２のCa2+要求性 CA−１およびCA−２の精製標品について活性発現にお
けるCa2+要求性について確認した結果を図５に示した。
けるCa2+要求性について確認した結果を図５に示した。
このようにCa2+存在下にて初めて活性を発現すること
が確認された。さらに正常プロトロンビンには反応する
がPIVKA−IIには反応しないという性質も有する。
が確認された。さらに正常プロトロンビンには反応する
がPIVKA−IIには反応しないという性質も有する。
実施例5.凝血能測定 CA−１およびecarinを用いて、その凝血能を調べた。
検体血漿の一部（50μｌ）を、プロトロンビン欠損血
漿（Geroge King社製）50μｌと混合し37゜で２分間イ
ンキュベートした。凝血反応は、37゜で平衡化しておい
た、活性化因子/Ca2+（イ）1nM facter Xa,1mg/mlリン
脂質（ホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン,
3:1,W/W）を含むもの、又はロ）15mM CaCl2を含むTBSに
溶解した100nM CA−１あるいはハ）同TBSに溶解した100
nM ecarin）の混合物の一部を加えることにより開始し
た。凝血時間は、Amelung Coagulometer KC 4Aを用いて
測定した。試料中のプロトロンビン量は、標準血漿を用
いて作成した標準曲線から算出し、凝血時間の対数をプ
ロトロンビン量の対数に対してプロットした。活性化因
子の濃度は標準血漿での凝血時間が10〜15秒になるよう
に調製した。
漿（Geroge King社製）50μｌと混合し37゜で２分間イ
ンキュベートした。凝血反応は、37゜で平衡化しておい
た、活性化因子/Ca2+（イ）1nM facter Xa,1mg/mlリン
脂質（ホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン,
3:1,W/W）を含むもの、又はロ）15mM CaCl2を含むTBSに
溶解した100nM CA−１あるいはハ）同TBSに溶解した100
nM ecarin）の混合物の一部を加えることにより開始し
た。凝血時間は、Amelung Coagulometer KC 4Aを用いて
測定した。試料中のプロトロンビン量は、標準血漿を用
いて作成した標準曲線から算出し、凝血時間の対数をプ
ロトロンビン量の対数に対してプロットした。活性化因
子の濃度は標準血漿での凝血時間が10〜15秒になるよう
に調製した。
この結果ecarinは正常プロトロンビンだけでなく内因
性凝血阻害因子（PIVKA）に対しても反応するが、CA−
１は生体因子であるファクターXaと同様に、正常プロト
ロンビンには反応するが、PIVKAにほとんど感受性を示
さないことがわかった。
性凝血阻害因子（PIVKA）に対しても反応するが、CA−
１は生体因子であるファクターXaと同様に、正常プロト
ロンビンには反応するが、PIVKAにほとんど感受性を示
さないことがわかった。
配列表 配列番号:2 配列の長さ:30 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号:1 配列の長さ:30 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号:3 配列の長さ:30 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号:4 配列の長さ:30 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号:5 配列の長さ:5 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号:6 配列の長さ:5 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号:7 配列の長さ:5 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平６−199673（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，米国，1996年３月１日，Ｖ ｏｌ．271，Ｎｏ．９，ｐ．5200−5207 Ｔ．Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｍ ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙ（1981），Ｖｏｌ．80，ｐ．303− 311 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/48 - 9/86 C12N 15/57 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＰｕｂＭｅｄ
Claims (10)
- 【請求項１】SDS−PAGE分析にて分子量約60000の重鎖並
びに分子量約17000および分子量約14000の二本の軽鎖の
三本のポリペプチド鎖からなり、Echis族の蛇の毒由来
のメタロプロテアーゼであることを特徴とする蛇毒由来
のカルシウム要求性プロトロンビン活性化酵素。 - 【請求項２】SDS−PAGE分析にて分子量約62000の重鎖並
びに分子量約17000および分子量約14000の二本の軽鎖の
三本のポリペプチド鎖からなり、Echis族の蛇の毒由来
のメタロプロテアーゼであることを特徴とする蛇毒由来
のカルシウム要求性プロトロンビン活性化酵素。 - 【請求項３】重鎖のＮ端部アミノ酸配列が配列番号１記
載の配列であり、二本の軽鎖のＮ端部アミノ酸配列がそ
れぞれ配列番号３および配列番号４記載の配列である、
請求項１記載の蛇毒由来のカルシウム要求性プロトロン
ビン活性化酵素。 - 【請求項４】重鎖のＮ端部アミノ酸配列が配列番号２記
載の配列であり、二本の軽鎖のＮ端部アミノ酸配列がそ
れぞれ配列番号３および配列番号４記載の配列である、
請求項２記載の蛇毒由来のカルシウム要求性プロトロン
ビン活性化酵素。 - 【請求項５】重鎖のＮ端部アミノ酸配列が配列番号５記
載の配列であり、二本の軽鎖のＮ端部アミノ酸配列がそ
れぞれ配列番号６および配列番号７記載の配列である、
請求項２記載の蛇毒由来のカルシウム要求性プロトロン
ビン活性化酵素。 - 【請求項６】Echis族の蛇の毒がサメハダクサリ蛇（Ech
is carinatus）の毒である請求項１ないし５のいずれか
一項に記載の蛇毒由来のカルシウム要求性プロトロンビ
ン活性化酵素。 - 【請求項７】請求項１ないし６のいずれか一項に記載の
蛇毒由来のカルシウム要求性プロトロンビン活性化酵素
を含有してなる生体試料中のプロトロンビン測定試薬。 - 【請求項８】蛇毒由来のプロトロンビン活性化酵素がca
rinactivase−１またはcarinactivase−２のいずれか一
つまたは両方である請求項７記載の生体試料中のプロト
ロンビン測定試薬。 - 【請求項９】蛇毒をゲル濾過クロマトグラフィー、次い
でアフィニティクロマトグラフィー、次いで強塩基性樹
脂クロマトグラフィーで精製することにより得られる、
請求項１ないし６のいずれか一項に記載の蛇毒由来のカ
ルシウム要求性プロトロンビン活性化酵素。 - 【請求項１０】ブルーセファロース（Blue Sepharose）
を用いることを特徴とする請求項９記載の蛇毒由来のカ
ルシウム要求性プロトロンビン活性化酵素の分離・精製
方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4434095 | 1995-03-03 | ||
| JP7-44340 | 1996-02-22 | ||
| JP8-35207 | 1996-02-22 | ||
| JP3520796 | 1996-02-22 | ||
| PCT/JP1996/000479 WO1996027660A1 (fr) | 1995-03-03 | 1996-02-29 | Enzyme activateur de prothrombine necessitant du calcium |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3322676B2 true JP3322676B2 (ja) | 2002-09-09 |
Family
ID=26374139
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52675996A Expired - Fee Related JP3322676B2 (ja) | 1995-03-03 | 1996-02-29 | カルシウム要求性プロトロンビン活性化酵素 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5972681A (ja) |
| EP (1) | EP0814155B1 (ja) |
| JP (1) | JP3322676B2 (ja) |
| AT (1) | ATE267250T1 (ja) |
| DE (1) | DE69632530T2 (ja) |
| DK (1) | DK0814155T3 (ja) |
| ES (1) | ES2217305T3 (ja) |
| PT (1) | PT814155E (ja) |
| WO (1) | WO1996027660A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0975975A1 (de) * | 1997-04-09 | 2000-02-02 | Blutspendedienst der DRK-Landesverbände Nordrhein und Westfalen-Lippe GmbH | Verfahren zur bestimmung von aktivierten blutgerinnungsfaktoren in plasma und plasmaderivaten |
| US5935802A (en) * | 1998-08-10 | 1999-08-10 | Evanston Northwestern Healthcare Research Institute | Method of assaying a blood sample for prothrombin |
| EP1045250A1 (en) * | 1999-04-12 | 2000-10-18 | INSTRUMENTATION LABORATORY S.p.A. | A global test for evaluating the functionality of the thrombin/antithrombin system |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0585504A1 (en) * | 1992-09-04 | 1994-03-09 | Pentapharm A.G. | Phospholipid dependant prothrombin activator and its use in lupus anticoagulant testing |
-
1996
- 1996-02-29 EP EP96904284A patent/EP0814155B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-29 AT AT96904284T patent/ATE267250T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-02-29 US US08/894,403 patent/US5972681A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-29 PT PT96904284T patent/PT814155E/pt unknown
- 1996-02-29 ES ES96904284T patent/ES2217305T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-29 DK DK96904284T patent/DK0814155T3/da active
- 1996-02-29 JP JP52675996A patent/JP3322676B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-29 DE DE69632530T patent/DE69632530T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-29 WO PCT/JP1996/000479 patent/WO1996027660A1/ja active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，米国，１９９６年３月１日，Ｖｏｌ．２７１，Ｎｏ．９，ｐ．５２００−５２０７ |
| Ｔ．Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８１），Ｖｏｌ．８０，ｐ．３０３−３１１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE267250T1 (de) | 2004-06-15 |
| ES2217305T3 (es) | 2004-11-01 |
| DE69632530T2 (de) | 2005-05-25 |
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| DE69632530D1 (de) | 2004-06-24 |
| US5972681A (en) | 1999-10-26 |
| WO1996027660A1 (fr) | 1996-09-12 |
| EP0814155A1 (en) | 1997-12-29 |
| EP0814155B1 (en) | 2004-05-19 |
| EP0814155A4 (en) | 2002-08-07 |
| DK0814155T3 (da) | 2004-09-13 |
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