EP0968280A1 - Aktivierter vitamin k-abhängiger blutfaktor und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Aktivierter vitamin k-abhängiger blutfaktor und verfahren zu dessen herstellung

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EP0968280A1
EP0968280A1 EP98913692A EP98913692A EP0968280A1 EP 0968280 A1 EP0968280 A1 EP 0968280A1 EP 98913692 A EP98913692 A EP 98913692A EP 98913692 A EP98913692 A EP 98913692A EP 0968280 A1 EP0968280 A1 EP 0968280A1
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
protease
factor
activation
blood factor
protein
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP98913692A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Peter Turecek
Günter Richter
Anton Philapitsch
Hans-Peter Schwarz
Johann Eibl
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baxter AG
Original Assignee
Baxter AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Baxter AG filed Critical Baxter AG
Publication of EP0968280A1 publication Critical patent/EP0968280A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
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    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/647—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to an activated vitamin K-dependent blood factor and a method for its production.
  • proteases occur in the human organism itself, especially in the blood plasma.
  • factor X is activated, it is a special feature that the Venom from Vipera Russelli (Russell's Viper Venom, RW) is a selective factor X activator that is also used technically to obtain factor Xa can. Since knowledge of the transmission of animal viruses to little-related animal species (prion problem), however, the use of xenogenic animal proteins as auxiliaries for the manufacture of medicines has been rejected. However, since suitable human proteases are not available in a technically sufficient amount Are available, the use of RW for preparative factor X activation is still the standard method.
  • Vipera Russelli Russell's Viper Venom, RW
  • proteolytic enzymes derived from prokaryotes from low eurkaryotes, e.g. Mushrooms, or from higher eukaryotes, e.g. Plants that can be isolated are known to have low substrate specificity. For this reason, they are mainly used for the total degradation of proteins in raw cell extracts, in order in this way to obtain other cell components, e.g. Carbohydrates or nucleic acids to separate or isolate. In addition, these proteases are also used for the sequencing and characterization of proteins by degradation to small peptides. Until now, the use of bacterial or vegetable proteases or of proteases from fungi as activators of plasma proteins or plasma protein cofactors or inhibitors from the group of prothrombin complex proteins was not known.
  • the object of the present invention is to provide a method for activating profactors in the field of blood coagulation with the aid of highly specific proteases that are not of animal origin.
  • the method according to the invention is particularly suitable for activating vitamin K-dependent blood factors. Activation of human blood factors from the groups of factor II, VII, IX, X and protein C is particularly suitable. The examples below show the advantages obtained in the activation of factor X to factor Xa- ⁇ .
  • the method according to the invention is equally suitable for obtaining naturally occurring, genetically engineered, as well as chemically or genetically modified blood factors.
  • protease used according to the invention a proteolytic enzyme from prokaryotes can be assumed.
  • the bacterial proteases should be mentioned here in particular, e.g. Thermolysin, clostripain proteases IX and X from Bacillus polymyxa and protease IX from Bacillu ⁇ thermoproteolyticus.
  • proteases from low eukaryotes e.g. Use fungi, in particular protease XXIII from the Aspergillus oricae mold, in the process according to the invention.
  • proteolytic enzymes from higher eukaryotes such as e.g. Plants.
  • proteolytic enzymes belonging to the group of cysteine proteases are suitable. Examples include: Bromelain (e.g. from pineapple comosus), Papain (e.g. from the milk juice of Carica papaya) or Ficin (e.g. from Ficus carica).
  • the proteolytic enzymes from prokaryotes, molds and plants mentioned have a low substrate specificity. It was therefore surprising to find that the use of these enzymes enables highly specific factors in blood coagulation to be activated.
  • These enzymes are either selected native enzymes, but also modified enzymes or enzyme derivatives, in particular also enzymes produced by recombinant DNA technology.
  • cysteine proteases that they can fully develop their broad protease activity under reductive conditions or in the presence of activators containing sulfhydrile groups. For this reason, SH donors are often added to the incubation buffer as effectors when incubating with these enzymes.
  • the A broad spectrum of activity of these proteases can, however, be shifted by moving from the optimal incubation conditions to suboptimal conditions, ie conditions outside the pH or temperature optimum or in the event of partial or complete absence of necessary cofactors or effectors, or in the presence of special effectors, in such a way that special substrates, such as, for example Plasma proteins, are no longer completely degraded and therefore do not lose their activity, provided that it concerns profactors to be activated. Rather, the activation is stopped at the target substrate level and the activation products are obtained as such. This is also demonstrated below for the first time using the example of the activation of factor X to factor Xa, in particular ⁇ factor Xa.
  • cysteine proteases can also be achieved by subjecting the crude enzyme preparations purified from plants to further purification measures, for example chromatography, in order to isolate those protein fractions whose protease activity shows a restricted substrate spectrum. While this measure alone may not yet be suitable for achieving the desired highly specific activators, it is suitable in conjunction with a further measure for increasing the specificity of proteases, namely by oxidation thereof, the proteases due to the contact with atmospheric oxygen be reduced in their activity and activity spectrum. It follows from this that particularly oxidized cysteine proteases are suitable for the process according to the invention, this preferably being the case with chromatographically enriched or purified cysteine proteases. It is particularly preferred that the protease has an at least two-fold increased specific blood factor activation activity compared to the crude extract from plants or cell cultures or compared to the non-specific proteolytic activity or towards the non-specific proteolytic activity.
  • the substrate spectrum can be narrowed down by adding defects to the incubation buffer of the enzymes with the substrates to be activated.
  • Heavy metal ions or alkaline earth metal ions are to be mentioned in particular as defectors.
  • the addition of calcium ions is particularly preferred here. For example, shown in the following examples that when factor X is activated with the addition of calcium ions, the activation product ⁇ -factor Xa is obtained, with other cleavage products only being produced in negligible amounts.
  • the activation reaction can proceed more intensely without the addition of calcium ions and can also be modulated with regard to the activated factor obtained.
  • ⁇ factor Xa and / or ⁇ factor Xa can also be produced according to the invention.
  • the enzymes in question here can be used in immobilized form. This will make it easy to separate the protease from the substrate, e.g. by filtration. Furthermore, the use of immobilized, i.e. enzymes bound to a solid phase the repeated use of the same. In the case of the secondary modified proteins, e.g. by oxidation, by immobilization, i.e. irreversibly fixed by a covalent binding of the enzyme to a carrier material in its conformation as it is after the conversion into a highly specific activator.
  • the method according to the invention is suitable for activating natural as well as recombinantly produced blood factors.
  • the proteolytic interface can be modified by an amino acid sequence which is then specifically recognized and cleaved by a defined protease, so that activation is only possible more or also with a protease which does not correspond to the physiological activation mechanism.
  • This specially constructed analog is, for example, an analog of a vitamin K-dependent blood factor such as factor X.
  • the region around the Arg52-Ile53 position which is the interface for factor IXa, could be replaced by another amino acid sequence.
  • the amino acids Arg52, Ile53 could be replaced by the sequence Glu-Gly, which then rules out cleavage by FIXa and activation by factor IXa, but enables proteolytic digestion with endoproteinase Glu C from Staphylococcus auraeus V8.
  • a bacterial enzyme which can be prepared in a highly pure form and does not pose a risk of contamination with an animal or human protein, can thus be used for the activation of factor X.
  • Gly-Ser can also be introduced as the cleavage sequence, which then cleaves with plant proteases, e.g. with Ficin.
  • the blood factor activated according to the invention is subjected to further purification measures in order to remove proteolytic degradation products that may have arisen in this way. Chromatographic purification processes or purification by gel filtration are particularly preferred here.
  • the invention also encompasses a pharmaceutical preparation containing a blood factor and a protease derived from plants or prokaryotes with a specificity for the blood factor.
  • the protease can also be a mammalian, in particular a human-derived protease. According to the invention, however, no coagulation factor is used as the protease.
  • plasma proteins for example also vitamin K-dependent proteins, are contained as blood factors in this pharmaceutical preparation.
  • the pharmaceutical preparation comprises an activated vitamin K-dependent blood factor and the protease.
  • This blood factor is preferably human and native.
  • the protease in particular a purified protease, is also to be used as such, in which case the vitamin K-dependent blood factor comes from a bleeding wound.
  • the factor X activator in a pharmaceutical carrier material, for example in a dressing or in a powder or as an ointment, the effect of the coagulation activator which triggers blood coagulation can be used here.
  • Another pharmaceutical preparation also includes a blood factor which is present as a pro-protein and which contains a pro-protein-cleaving protease isolated from plants, fungi or prokaryotes or genetically engineered in cells of this species.
  • Proteases of this type with a specificity for pro-proteins are, for example, as furin (Van de Ven, WJ et al, Enzyme 45: 257-270, 1991) or Paired Basic Amino Acid Residue Cleaving Enzyme, PACE, (Rehemtulla, A et al, Biochemistry 32: 11586-11590, 1993). If the mature protein resulting from the pro-protein is particularly unstable in a pharmaceutical preparation, the mature protein can be prepared in situ by simultaneous administration of the pro-protein processing enzyme and is then available therapeutically. Furthermore, further activation with an activator protease is possible, provided the mature protein has to be converted into an active form by further proteolytic digestion.
  • a therapeutic set consisting of the stable pro-protein and the processing or activating proteolytic enzyme, therefore enables the administration of unstable proteins as active substances for the first time.
  • the invention further comprises an activated vitamin K-dependent blood factor, as is obtained by the method according to the invention.
  • the human, activated blood factor obtained according to the invention is characterized in that it is not contaminated by an animal protease.
  • the factor X was purified from a prothrombin complex factor preparation, which contained the factors FII, FIX, FX, Protein C and Protein S, and which according to the method of Brummelhui ⁇ , (Brummelhuis HGJ, Preparation of the Prothrombin Complex. In: Methods of Plasma Protein Fractionation , edited by Curling, JM, New York: Academic Press, 1980, p. 117-128). was prepared and heat-treated for virus inactivation according to EP 0 159 311. A lyophilizate containing the prothrombin complex factors was dissolved in distilled water corresponding to an activity of 50,000 U FX / 1 and adjusted to pH 7.0.
  • Calcium phosphate of a buffer 20 mmol / 1 Tris-HCl, pH 7.0, containing 10% ammonium sulfate washed by resuspending and centrifuged again each time.
  • the pellet was stirred for 1 hour at room temperature with 1 mmol / 1 sodium phosphate buffer, pH 7.0 (25 ml elution solution / g calcium phosphate used).
  • the chromatography material was loaded with 10 U FX / ml gel. Previously, the FX-containing solution was buffered by gel filtration against a buffer, 25 mmol / 1 trisodium citrate dihydrate, 100 mmol / 1 NaCl, pH 6.0. This factor X solution was
  • Fractions were collected during the elution, which were based on the content of the prothrombin complex proteins factor X, protein C, Factors IX and II were examined using standard coagulation tests.
  • the fractions containing factor X, which were poor in other prothrombin complex proteins, were combined and then immobilized via a monoclonal antibody, purified from ascites, which was directed against factor X and which was immobilized on Actigel ALD (sterogens, bioseparations, Arcadia, CA) , further cleaned.
  • the protein solution containing FX was adsorbed onto the gel with a loading of 10 U FX / ml gel.
  • This factor X preparation was freed from traces of contaminating protein, in particular monoclonal antibody bleeding from the immunoaffinity chromatography column, by adsorption on phenylsepharose high performance, Pharmacia-Biotech.
  • the FX-containing solution was adjusted to 1.8 mmol / 1 NaCl and a pH of 7.4 after the diafiltration.
  • the hydrophobic interaction chromatography gel was equilibrated in a chromatography column with 20 mmol / 1 Tris-HCl, 2 mol / 1 NaCl, 7.4 and the factor X solution set was loaded onto the column with a load of 30 U FX / ml gel.
  • the FX-containing flow from the column was collected and subsequently concentrated by ultrafiltration over a membrane with an exclusion limit of 10,000 Daltons to 1/20 of the starting volume and then against a buffer containing 20 mmol / 1 Tris-HCl, 150 mmol / 1 NaCl, pH 7.4, diafiltered.
  • the highly purified factor X solution obtained in this way had a specific activity of approximately 100 U / mg protein.
  • the chromogenic peptide substrate CH 3 OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA is hydrolyzed by factor Xa, whereby CH 3 OCO-D-CHA-Gly-Arg-OH and paranitroaniline are formed.
  • the kinetics of the increase in paranitroaniline is measured spectrophotometrically at 405 nm.
  • the increase in optical density (OD) is proportional to the content of factor Xa in the sample to be quantified.
  • ⁇ l of a sample containing factor Xa are mixed with 50 ⁇ l of dilution buffer and incubated at 37 ° C. for 90 seconds. Then 100 ⁇ l of the substrate solution are added and the increase in OD per minute at 37 ° C. at 405 nm is determined. The increase in OD must remain constant linear over the measurement period.
  • Activation of purified factor X from example 1 was carried out with the enzymes, clostripain (Calbiochem, La Jolla, CA) 10 U / ml, thermolysin (Calbiochem, La Jolla, CA) 200 U / ml, papain (Boehringer Mannheim, FRG) 400 ⁇ g / ml and ficin (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) 20 ⁇ g / ml, in a buffer containing 20 mmol / 1 Tris-HCl, 150 mmol / 1 NaCl, 5 mmol / 1 CaCl 2 , pH 7, 4, performed at 37 ° C and incubation for several hours.
  • the concentration of factor X was 3.2 U / ml.
  • samples were taken from the respective incubation mixtures and examined for factor Xa activity, as described in Example 2.
  • the results are shown in Figure 1. It was shown that an activation of factor X 12. was possible with all the enzymes used and led to the highest yield of factor Xa for thermolysin after 2 hours.
  • the activation phase which reached a maximum of between 30 minutes and 2 hours depending on the enzyme, was followed by inactivation of the resulting factor Xa. When activating ficin, a constant activation with stable factor Xa activity was demonstrated even after 19 hours.
  • Factor X activator from Vipera russellii (RW, Pentapharm AG, Basel, CH) is known from the literature as a non-plasmatic factor X activator with a high selectivity, which is commonly used for in vitro activations of factor X.
  • the activation of highly purified factor X from example 1 with RW was compared to the activation with the plant factor X activator, ficin.
  • the highly purified factor X was used in a concentration of 4 U / ml in a buffer containing 20 mmol / 1 Tris-HCl, 150 mmol / 1 NaCl, 5 mmol / 1 CaCl 2 , pH 7.4, and with either Incubate 2.7 ⁇ g / ml RW (Pentapharm AG, Basel, CH) or 20 ⁇ g / ml Ficin (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) at 37 ° C.
  • the factor X before activation the factor X after activation with RW and after activation with ficin, and subsequent blot on nitrocellulose membranes and detection with an anti-factor X-polyclonal antibody and immunostaining were analyzed by standard methods.
  • the result is shown in Figure 3. It was shown that the homogeneous factor X was split into several factor X-specific protein fragments of smaller molecular mass than the non-activated factor X before activation by both the activator RW and the activator ficin, after activation with RW a mixture of alpha- and beta factor Xa was formed, these two activation products of factor X being contained in approximately the same amount, and at least three further activation products could be identified.
  • beta factor Xa was obtained as the main product (see arrow), whereby, as in the case of activation with RW, three further activation products could also be detected, although in contrast ; for activation with RW had a larger molar mass difference to the main product beta factor Xa, so that these could be separated off by simple further methods, for example gel filtration.
  • factor X was used in a concentration of 4 U / ml in a buffer containing 20 mmol / 1 Tris-HCl, 150 mmol / 1 NaCl, pH 7.4, with 2 ⁇ g ficin / ml analogously to Example 4 at 37 ° C incubated for 24 hours, using the buffer medium (1) 2 mmol / 1 CaCl 2 , (2) 1 mmol / 1 cysteine, (3) 1 mmol / 1 cysteine and 2 mmol / 1 EDTA and (4) 1 mmol / 1 cysteine and 2 mmol / 1 CaCl 2 was added. After 24 hours of incubation, the factor Xa activity was determined according to Example 2. The results are shown in Table 1.
  • the beta factor Xa obtained in this way can now easily be freed from residues of ficin still present in the mixture by conventional chromatographic purification methods. These include simple gel filtration, ion exchange chromatography or substrate affinity chromatography, for example on immobilized benzamidine, which is able to selectively bind factor Xa.
  • the free cysteine is removed by gel filtration over Sephadex G50 and with the same phosphate buffer 1 + 3 '7 further diluted. The total amount was then applied to a Mono S HR 5/5 cation exchange chromatography column, from Pharmacia, at a flow rate of 1 ml / min. It was then washed with 45 column volumes of the same phosphate buffer and then a gradient elution was carried out, the phosphate concentration being increased continuously to 185 mmol / l in the same buffer composition over 55 column volumes. The result is shown in Figure 5. The protein mixture was separated into several individual proteins by the elution. As can be seen in the elution profile from the absorption at 280 nm (protein).
  • the individual fractions were then examined for FX-activating enzyme activity using the factor Xa assay described in Example 2 and it was found that a protein peak eluting at 49 ml elution volume and a protein peak eluting between 68 and 69 ml elution volume had the highest factor X activator activity (- -x- -).
  • the fractions were examined for protease activity using an unspecific protease substrate.
  • the chromogenic protease substrate benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide hydrochloride, which under the conditions and according to the method of Eglund et al.
  • the fraction containing the highest factor X activator activity in relation to the protein content was then incubated for 15 hours at 4 ° C. under the influence of atmospheric oxygen. This enabled the factor X activator activity to be increased further in relation to the non-specific protease activity.
  • Crystallized ficin (Sigma) in crystal suspension was diluted to a concentration of 2.5 mg / ml and against a buffer containing 20 mmol / 1 Tris-HCl, 150 mmol / 1 NaCl, pH 7.4, by gel filtration over Sephadex G50 (Pharmacia) buffered.
  • a pre-activated gel Actigel ALD Superflow (Sterogenic Bioseparations, Arcadia, CA) was washed with a buffer containing 20 mmol / 1 Tris-HCl, 150 mmol / 1 NaCl, pH 7.4, and then in a ratio of 1 + 1 with the offset to be immobilized ficin-containing solution and 1/15 of the volume of the coupling solution (Sterogene Bioseparations, Arcadia, CA) incubated for 3 hours at room temperature.
  • the immobilizate was then separated off on a sintered suction filter and alternately washed excessively with a 20 mmol / 1 Tris-HCl, 150 mmol / 1 NaCl, pH 7.4, buffer and a 20 mmol / 1 Tris-HCl, 2 mmol / 1 NaCl , pH 7.4, buffer from the unbound ficin and the Coupling reagents exempt.
  • the ficin immobilizate was subsequently used to activate factor X as follows.
  • the activation was carried out in incubation mixtures containing 4 units / ml of factor X and 3 ⁇ g / ml of the activated ficin preparation in a buffer system of 20 mmol / 1 Tris-HCl, 150 mmol / 1 sodium chloride, pH 7.4 in and 10
  • Presence of calcium and manganese ions carried out.
  • the batches contained either 2 mmol / 1 calcium ions, 1 mmol / 1 manganese (II) ions or a combination of the two metal ions.
  • the batches were examined for the composition of the activation products by means of SDS polyacrylamide gel electrophoresis. The result of the electrophoretic separation was visualized using the silver staining method and the intensity of the separated bands was evaluated densitometrically. The result of this evaluation is shown in the table below.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Aktivierung eines Vitamin K-abhängigen Blutfaktors beschrieben, wobei dies durch Behandlung mit einer Protease, die von Pflanzen oder Prokaryonten abgeleitet ist, erfolgt. Ausserdem umfasst die Erfindung den erfindungsgemäss hergestellten Blutfaktor, der keine Kontamination an tierischer Protease aufweist, sowie eine pharmazeutische Präparation und ein Set zur medizinischen Anwendung.

Description

Aktivierter Vitamin K-abhängiger Blutfaktor und Verfahren zu dessen Herstellung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen aktivierten Vitamin K-abhängigen Blutfaktor sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Die komplexe Protease/Substrat-Kaskade bei der physiologischen Aktivierung von Profaktoren, insbesondere im Bereich der Blutgerinnung, erfordert hochselektive Proteasen. Diese Proteasen kommen im menschlichen Organismus selbst, insbesondere im Blutplasma, vor. Die Anwendung anderer humaner Proteasen zur Aktivierung von Profaktoren, wie z.B. der Verdauungsenzyme Trypsin und Pepsin, führt daher nicht zu einer selektiven Generierung aktivierter
Blutgerinnungsfaktoren, sondern zu einem unspezifischen Abbau des Zielsubstrates. So ist z.B. bekannt, dass der tryptische Abbau des Gerinnungsfaktor X zwar anfänglich aktiviert, aber dann durch unspezifischen Abbau zu niedrig-molekularen Peptiden führt. Aus AT-397 390 ist bekannt, dass für die Aktivierung von Prothrombin mit Hilfe eines Verdauungsenzyms besondere Verfahrensvarianten eingehalten werden müssen, um einen weiteren unspezifischen Abbau des entstehenden Thrombus zu verhindern.
Im Falle der Aktivierung von Faktor X stellt es daher eine Besonderheit dar, dass mit dem Venom aus Vipera Russelli (Russell' s Viper Venom, RW) ein selektiver Faktor X- Aktivator zur Verfügung steht, der auch technisch zur Gewinnung von Faktor Xa verwendet werden kann. Seit Kenntnis der Übertragung tierischer Viren auf wenig verwandte Tierarten (Prionenproblematik) wird jedoch die Verwendung xenogener tierischer Proteine als Hilfsstoffe für die Herstellung von Arzneimitteln abgelehnt . Da aber geeignete humane Proteasen nicht in technisch ausreichender Menge zur Verfügung stehen, ist die Verwendung von RW zur präparativen Faktor X-Aktivierung nach wie vor Standardmethode.
Von proteolytischen Enzymen, die aus Prokaryonten, aus niedrigen Eurkaryonten, wie z.B. Pilzen, oder aus höheren Eukaryonten, wie z.B. Pflanzen, isoliert werden können, ist bekannt, dass sie eine geringe Substratspezifität aufweisen. Aus diesem Grunde werden sie hauptsächlich zum Totalabbau von Proteinen in rohen Zellextrakten verwendet, um auf diese Weise andere Zellkomponenten, wie z.B. Kohlenhydrate oder Nukleinsäuren, zu trennen oder zu isolieren. Ausserdem werden diese Proteasen auch zur Sequenzierung und Charakterisierung von Proteinen auf dem Wege des Abbaus zu kleinen Peptiden eingesetzt. Bisher war die Anwendung bakterieller oder pflanzlicher Proteasen oder von Proteasen aus Pilzen als Aktivatoren von Plasmaproteinen oder Plasmaprotein-Cofaktoren oder -Inhibitoren aus der Gruppe der Prothrombin- Komplexproteine nicht bekannt .
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Aktivierung von Profaktoren im Bereich der Blutgerinnung mit Hilfe hoch-spezifischer Proteasen, die nicht tierischen Ursprungs sind, zur Verfügung zu stellen.
Die vorstehende Aufgabe wird gemäss der Erfindung durch das eingangs genannte Verfahren gelöst, wobei die Aktivierung mittels einer Protease erfolgt, die von Pflanzen oder Prokaryonten abgeleitet ist.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist insbesondere zur Aktivierung von Vitamin K-abhängigen Blutfaktoren geeignet. Besonders geeignet ist die Aktivierung von humanen Blutfaktoren aus der Gruppe Faktor II, VII, IX, X und Protein C. Die nachfolgenden Beispiele zeigen die Vorteile, wie sie bei der Aktivierung von Faktor X zu Faktor Xa-ß erhalten werden. Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich gleichermassen für die Gewinnung von natürlich vorkommenden, gentechnisch hergestellten, wie auch chemisch oder gentechnisch modifizierten Blutfaktoren.
In bezug auf die erfindungsgemäss verwendete Protease kann von einem proteolytischen Enzym aus Prokaryonten ausgegangen werden. Hier sind insbesondere die bakteriellen Proteasen zu nennen, wie z.B. Thermolysin, Clostripain Proteasen IX und X aus Bacillus polymyxa und Protease IX aus Bacilluε thermoproteolyticus .
Ausserdem lassen sich auch Proteasen aus niedrigen Eukaryonten, wie z.B. Pilzen, insbesondere Protease XXIII aus dem Schimmelpilz Aspergillus oricae, bei dem erfindungsgemässen Verfahren verwenden. Im weiteren eignen sich proteolytische Enzyme aus höheren Eukaryonten, wie z.B. Pflanzen. Es sind insbesondere proteolytisch Enzyme geeignet, die der Gruppe der Cysteinproteasen angehören. Hier sind beispielsweise zu nennen: Bromelain (z.B. aus Ananas comosus) , Papain (z.B. aus dem Milchsaft von Carica papaya) oder Ficin (z.B. aus Ficus carica) . Die genannten proteolytischen Enzyme aus Prokaryonten, Schimmelpilzen und Pflanzen allerdings weisen eine geringe Substratspezifität auf. Es war daher überraschend festzustellen, dass durch Einsatz dieser Enzyme Profaktoren der Blutgerinnung hochspezifisch aktiviert werden können. Diese Enzyme sind entweder selektierte native Enzyme, aber auch modifizierte Enzyme bzw. Enzymderivate, insbesondere auch durch rekombinante DNA-Technologie hergestell te Enzyme .
Es ist insbesondere für Cysteinproteasen bekannt, dass sie unter reduktiven Bedingungen oder in Anwesenheit von Sulfhydrilgruppen enthaltenden Aktivatoren ihre breite Protease-Aktivität voll entfalten können. Aus diesem Grunde werden bei der Inkubation mit diesen Enzymen häufig SH- Donoren als Effektoren dem Inkubationspuffer zugegeben. Das breite Wirkungsspektrum dieser Proteasen kann aber durch Abgehen von den optimalen Inkubationsbedingungen hin zu suboptimalen Verhältnissen, d.h. Bedingungen abseits des pH oder TemperaturOptimums oder bei teilweisem oder vollständigem Fehlen notwendiger Cofaktoren oder Effektoren, oder in Anwesenheit besonderer Effektoren dahingehend verschoben werden, dass spezielle Substrate, wie z.B. Plasmaproteine, nicht mehr vollständig degradiert werden und somit ihre Aktivität, sofern es sich um zu aktivierende Profaktoren handelt, nicht verlieren. Vielmehr wird die Aktivierung auf der Stufe des Zielsubstrates gestoppt und es werden die Aktivierungsprodukte als solche erhalten. Auch dies wird nachfolgend am Beispiel der Aktivierung von Faktor X zu Faktor Xa, insbesondere ß-Faktor Xa, erstmalig demonstriert .
Im weiteren kann eine höhere Spezifität der Cysteinproteasen auch dadurch erreicht werden, dass man die aus Pflanzen gereinigten rohen Enzympräparationen weiteren Reinigungsmassnahmen unterwirft, z.B. einer Chromatographie, um jene Proteinfraktionen zu isolieren, deren Proteaseaktivität ein eingeschränktes Substratspektru zeigt. Während diese Massnahme allein möglicherweise noch nicht geeignet ist, um zu den gewünschten hoch-spezifischen Aktivatoren zu gelangen, eignet sie sich in Verbindung mit einer weiteren Massnahme zur Erhöhung der Spezifität von Proteasen, nämlich durch Oxidation derselben, wobei die Proteasen aufgrund des Kontaktes mit Luftsauerstoff in ihrer Aktivität und ihrem Aktivitätsspektrum reduziert werden. Daraus ergibt sich, dass für das erfindungsgemässe Verfahren besonders oxidierte Cysteinproteasen geeignet sind, wobei dies bevorzugt bei chromatographisch angereicherten bzw. gereinigten Cysteinproteasen der Fall ist. Besonders bevorzugt ist es dabei, dass die Protease eine mindestens zweifach erhöhte spezifische Blutfaktor-Aktivierungsaktivität gegenüber dem Rohextrakt aus Pflanzen oder Zellkulturen bzw. gegenüber der unspezifischen proteolytischen Aktivität bzw. gegenüber der unspezifischen proteolytischen Aktivität aufweist .
Des weiteren kann das Substratspektrum dadurch eingeengt werden, dass dem Inkubationspuffer der Enzyme mit den zu aktivierenden Substraten Defektoren zugesetzt werden. Als Defektoren sind insbesondere Schwermetallionen oder Erdalkaliionen zu nennen. Besonders bevorzugt ist hier die Zugabe von Calciumionen. So wird z.B. in den nachfolgenden Beispielen gezeigt, dass bei der Aktivierung von Faktor X unter Zusatz von Calciumionen mit hoher Ausbeute das Aktivierungsprodukt ß-Faktor Xa erhalten wird, wobei andere Spaltprodukte nur in vernachlässigender Menge entstehen.
Jedoch kann die Aktivierungsreaktion ohne Zusatz von Calciumionen verstärkt ablaufen und auch hinsichtlich des erhaltenen aktivierten Faktors moduliert werden. Bei geeigneten Versuchsanordnungen sind aber auch α-Faktor Xa und/oder ß-Faktor Xa erfindungsgemäss herzustellen.
Für eine bevorzugte technische Anwendbarkeit der hier infrage kommenden Enzyme können diese in immobilisierter Form eingesetzt werden. Dadurch wird eine einfache Abtrennung der Protease vom Substrat, z.B. durch Filtration, ermöglicht. Ausserdem gewährleistet die Anwendung von immobilisierten, d.h. an eine feste Phase gebundenen Enzymen den wiederholten Einsatz derselben. Im Falle der sekundär modifizierten Proteine, z.B. durch Oxidation, wird durch die Immobilisierung, d.h. durch eine kovalente Bindung des Enzyms an ein Trägermaterial dasselbe in seiner Konformation, wie sie nach der Umwandlung in einen hoch-spezifischen Aktivator vorliegt, irreversibel fixiert.
Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich zur Aktivierung natürlicher wie auch rekombinant hergestellter Blutfaktoren. Dabei kann bei einem Blutfaktor als Gerinnungsproenzym die proteolytische Schnittstelle durch eine Aminosäuresequenz modifiziert werden, welche dann gezielt von einer definierten Protease erkannt und gespalten wird, so daß eine Aktivierung nur mehr oder auch mit einer Protease möglich wird, welche nicht dem physiologischen Aktivierungsmechanismus entspricht. Dieses speziell konstruierte Analog ist beispielsweise ein Analog eines Vitamin-K-abhängigen Blutfaktors wie Faktor X.
Am Beispiel des Faktor X könnte die Region um die Arg52- Ile53 -Position, welche die Schnittstelle für den Faktor IXa darstellt, durch eine andere Aminosäuresequenz ausgetauscht werden. Zum Beispiel könnten die Aminosäuren Arg52, Ile53 gegen die Sequenz Glu-Gly ersetzt werden, welche dann eine Spaltung durch FIXa und eine Aktivierung durch Faktor IXa ausschließt, aber den proteolytischen Verdau mit Endoproteinase Glu C aus Staphylococcus auraeus V8 ermöglicht. Somit kann ein bakterielles Enzym, welches hochrein dargestellt werden kann und keine Kontaminationsgefahr mit einem tierischen oder humanen Protein darstellt, für die Aktivierung von Faktor X eingesetzt werden. Analog kann als Spaltsequenz auch Gly-Ser eingeführt werden, womit dann eine Spaltung mit pflanzlichen Proteasen, z.B. mit Ficin, möglich wird.
Es ist bevorzugt, dass der erfindungsgemäss aktivierte Blutfaktor weiteren Reinigungsmassnahmen unterworfen wird, um auf diese Weise etwa entstandene proteolytische Abbauprodukte zu entfernen. Besonders bevorzugt sind hier chromatographische Reinigungsverfahren oder eine Reinigung durch Gelfiltration.
Die Erfindung umfasst auch eine pharmazeutische Präparation, die einen Blutfaktor und eine von Pflanzen oder Prokaryonten abgeleitete Protease mit einer Spezifität für den Blutfaktor enthält. Die Protease kann auch eine von Säugetieren, insbesondere ein von Menschen abgeleitete Protease sein. Dabei wird jedoch erfindungsgemäss als Protease kein Gerinnungsfaktor verwendet. Als Blutfaktoren sind insbesondere Plasmaproteine, z.B. auch Vitamin K-abhängige Proteine, in dieser pharmazeutsichen Präparation enthalten. Insbesondere umfasst die pharmazeutische Präparation einen aktivierten Vitamin K-abhängigen Blutfaktor und die Protease. Dieser Blutfaktor ist vorzugsweise human und nativ.
Zur topischen Anwendung zur Blutstillung ist auch die Protease, insbesondere eine gereinigte Protease, als solche einzusetzen, wobei der Vitamin K-abhängige Blutfaktor in diesem Fall aus einer blutenden Wunde stammt. Durch Aufbringen des Faktor X-Aktivators in einem pharmazeutischen Trägermaterial, z.B. in einem Verbandsstoff oder in einem Puder oder als Salbe, kann hier der die Blutgerinnung auslösende Effekt des Gerinnungsaktivators genützt werden. Eine andere pharmazeutische Zubereitung umfasst auch einen Blutfaktor, der als Pro-Protein vorliegt, und eine aus Pflanzen, Pilzen oder Prokaryonten isolierte oder in Zellen dieser Spezies gentechnisch hergestellte Pro-Proteinspaltende Protease enthält. Proteasen dieses Typs mit einer Spezifität für Pro-Proteine sind z.B. als Furin (Van de Ven, W. J. et al, Enzyme 45:257-270, 1991) oder Paired Basic Amino Acid Residue Cleaving Enzyme, PACE, (Rehemtulla, A et al, Biochemistry 32:11586-11590, 1993) bekannt. Wenn das aus dem Pro-Protein resultierende reife Protein in einer pharmazeutischen Präparation besonders labil ist, kann durch gleichzeitige Verabreichung des Pro-Protein-prozessierenden Enzyms das reife Protein in situ dargestellt werden und steht dann therapeutisch zur Verfügung. Des weiteren ist eine weitere Aktivierung mit einer Aktivatorprotease, sofern das reife Protein durch weiteren proteolytischen Verdau erst in eine aktive Form übergeführt werden muss, möglich. Ein therapeutisches Set, bestehend aus dem stabilen Pro-Protein und dem prozessierenden bzw. aktivierenden proteolytischen Enzym, ermöglicht daher erstmalig die Verabreichung auch labiler Proteine als Wirkstoffe. Im weiteren umfasst die Erfindung einen aktivierten Vitamin K-abhängigne Blutfaktor, wie er nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhalten wird. Der erfindungsgemäss erhaltene humane, aktivierte Blutfaktor zeichnet sich dadurch aus, dass er nicht durch eine tierische Protease kontaminiert ist .
Das erfindungsgemässe Verfahren wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert. Diese Beispiele betreffen die Aktivierung von Faktor X zu Faktor Xa, wobei die verschiedenen Verfahrensvarianten gemäss den Unteransprüchen Anwendung finden.
BEISPIEL 1
Herstellung des Substrates Faktor X
Die Reinigung von Faktor X erfolgte aus einem Prothrombinkomplexfaktorenpräparat, welches die Faktoren FII, FIX, FX, Protein C und Protein S enthielt, und welches nach der Methode von Brummelhuiε, (Brummelhuis HGJ, Preparation of the Prothrombincomplex. In: Methods of Plasma Protein Fractionation, edited by Curling, JM, New York: Academic Press, 1980, p. 117-128) . hergestellt und zur Virusinaktivierung nach EP 0 159 311 hitzebehandelt wurde. Ein die Prothrombinkomplexfaktoren enthaltendes Lyophiliεat wurde entsprechend einer Aktivität von 50.000 E FX/1 in destilliertem Wasser gelöst und auf pH 7,0 eingestellt. Nach Zusatz von 12 % (v/v) TWEEN 80 wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, anschliessend wurde mit destilliertem Wasser auf das 5-fache Volumen verdünnt, mit Tri-Natrium- Citrat-Dihydrat (7 g/1) versetzt und auf pH 7 , 0 eingestellt. Anschliessend wurde mit 30 g/1 Ca3(P04)2 versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde die feste Phase durch Zentrifugation abgetrennt und zweimal mit je 25 ml/g
Calciumphosphat eines Puffers 20 mmol/1 Tris-HCl, pH 7,0, enthaltend 10 % Ammoniumsulfat, durch Resuspendieren gewaschen und jeweils neuerlich abzentrifugiert . Danach wurde eine dritte Waschung mit 25 ml/g Calciumphosphat eines Puffers 20 mmol/1 Tris-HCl, enthaltend 150 mmol/1 NaCl, pH 7,0, durch neuerliches Resuspendieren und anschliessendes Abzentrifugieren vorgenommen. Zur Elution des adsorbierten Faktor X wurde das Pellet mit 1 mmol/1 Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, (25 ml Elutionslösung/g eingesetztem Calciumphosphat) 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde die feste Phase durch Zentrifugation abgetrennt und der Faktor X-enthaltende Überstand durch Chromatographie über DEAE Sepharose Fast Flow, Fa. Pharmacia, weitergereinigt. Dazu wurde eine Säule, gefüllt mit gequollenem, gewaschenem DEAE Sepharose Fast Flow-Gel, und einer Konfiguration von Säuleninnendurchmesser : Gelbetthöhe = 1 : 8,3 verwendet. Das Chromatographiematerial wurde mit 10 E FX/ml Gel beladen. Zuvor wurde die FX-haltige Lösung durch Gelfiltration gegen einen Puffer, 25 mmol/1 Tri-Natrium-Citrat-Dihydrat , 100 mmol/1 NaCl, pH 6,0, umgepuffert. Diese Faktor X-Lösung wurde
_ bei einer Flussrate von 2 ml/mm an die DEAE Sepharose Fast
Flow adsorbiert und die Säule mit einem Fluss von 2 ml/min mit dem 1,7-fachen Gelvolumen, 100 mmol/1 NaCl in 25 mmol/1 Tri-Natrium-Citrat-Dihydrat, pH 6,0, und weiters mit dem 2,6- fachen Gelvolumen, 250 mmol/1 NaCl, 25 mmol/1 Tri-Natrium- Citrat-Dihydrat, pH 6,0, nachgewaschen. Die Elution von Faktor X erfolgte mit dem 5, 2-fachen Gelvolumen eines Citratpuffers, pH 6,0, enthaltend 280 mmol/1 NaCl, pH 6,0. Bei der Elution wurden Fraktionen gesammelt, die auf den Gehalt der Prothrominkomplexproteine Faktor X, Protein C, Faktor IX und Faktor II, mit Standardgerinnungstests untersucht wurden. Die Fraktionen enthaltend Faktor X, welche arm an anderen Prothrombinkomplexproteinen waren, wurden vereinigt und anschliessend über einen, aus Ascites gereinigten monoklonalen Antikörper, welcher gegen Faktor X gerichtet war, und der an Actigel ALD (Sterogene, Bioseparations, Arcadia, CA) , immobilisiert war, weiter gereinigt. Die FX-haltige Proteinlösung wurde an das Gel adsorbiert, mit einer Beladung von 10 E FX/ml Gel. Anschliessend wurde mit dem 5-fachen Säulenvolumen eines Puffers, 20 mmol/1 Tris-HCl, pH 7,4, nachgewaschen. Die Elution erfolgte mit dem 10-fachen Säulenvolumen eines Puffers enthaltend 100 mmol 3- [ (3-Cholamido ropyl) dimethyl- ammonium] -1-propansulfonat, 25 mmol/1 NaCl, pH 10,5. Die mit diesem Puffer eluierende Proteinfraktion wurde gesammelt und anschliessend durch Ultrafiltration über eine Membran mit einer Ausschlussgrenze von 10.000 Dalton auf 1/20 des Ausgangsvolumens aufkonzentriert . Anschliessend wurde die FX- haltige Lösung gegen einen Puffer enthaltend 4 g/1 Tri- Natrium-Citrat-Dihydrat, 8 g/1 NaCl, pH 7,0, diafiltriert. Diese Faktor X-Präparation wurde von Spuren verunreinigendem Proteins, insbesondere aus der Immunaffinitäts- Chromatographiesäule ausblutendem monoklonalem Antikörper durch Adsorption an Phenylsepharose High Performance, Pharmacia-Biotech, befreit. Dazu wurde die FX-haltige Lösung nach der Diafiltration auf 1,8 mmol/1 NaCl und einen pH-Wert von 7,4 eingestellt. Das hydrophobe Interaktionschromatographiegel wurde in einer Chromatographiesäule mit 20 mmol/1 Tris-HCl, 2 mol/1 NaCl, 7,4, äquilibriert und die eingestellte Faktor X-Lösung mit einer Beladung von 30 E FX/ml Gel auf die Säule aufgetragen. ( I
Der FX-enthaltende Durchlauf aus der Säule wurde aufgefangen und anschliessend durch Ultrafiltration über eine Membran mit einer Ausschlussgrenze von 10.000 Dalton auf 1/20 des Ausgangsvolumens aufkonzentriert und dann gegen einen Puffer enthaltend 20 mmol/1 Tris-HCl, 150 mmol/1 NaCl, pH 7,4, diafiltriert. Die so gewonnene hochgereinigt Faktor X-Lösung hatte eine spezifische Aktivität von ca. 100 E/mg Protein.
BEISPIEL 2
Quantitative Bestimmung von Faktor Xa
Testprinzip:
Das chromogene Peptidsubstrat CH3OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA wird durch Faktor Xa hydrolysiert , wobei CH3OCO-D-CHA-Gly-Arg-OH und Paranitroanilin entsteht. Die Kinetik der Zunahme von Paranitroanilin wird spektrophotometrisch bei 405 nm gemessen. Die Zunähme der optischen Dichte (OD) ist proportional dem Gehalt an Faktor Xa in der zu quantifizierenden Probe.
Reagenzien: Verdünnungspuffer :
3,7 g/I Tris- (hydroxymethyl) -aminomethan
2,1 g/I Imidazol
18,0 g/I NaCl
1,0 g/I Humanalbumin pH 8,4
Substratlösung :
1,3 mmol/1 CH3OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA in Verdünnungspuffer IX
Methode :
50 μl einer Faktor Xa enthaltenden Probe werden mit 50 μl Verdünnungspuf er versetzt und 90 Sekunden bei 37 °C inkubiert. Dann werden 100 μl der Substratlösung zugesetzt und die Zunahme der OD pro Minute bei 37 °C bei 405 nm bestimmt. Die Zunahme der OD muss über den Messzeitraum konstant linear bleiben.
Zur Erstellung einer Bezugskurve wird die Standardpräparation von bovinem Faktor Xa "NIBSC-Reagent 75/595" verwendet, wobei eine Ampulle nach Rekonstitution mit 1 ml A.dest. 1 E FXa enthält (s. Datasheet, National Institute for Biological Standards and Controls) .
BEISPIEL 3
Aktivierung von Faktor X
Die Aktivierung von gereinigtem Faktor X aus Beispiel 1 wurde mit den Enzymen, Clostripain (Calbiochem, La Jolla, CA) 10 E/ml, Thermolysin (Calbiochem, La Jolla, CA) 200 E/ml, Papain (Boehringer Mannheim, BRD) 400 μg/ml und Ficin (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) 20 μg/ml, in einem Puffer enthaltend 20 mmol/1 Tris-HCl, 150 mmol/1 NaCl, 5 mmol/1 CaCl2, pH 7,4, bei 37 °C und Inkubation über mehrere Stunden durchgeführt. Die Konzentration des Faktor X betrug 3,2 E/ml. Zu den Zeitpunkten 5 Minuten, 30 Minuten, 1 Stunde, 2 Stunden und 19 Stunden wurden aus den jeweiligen Inkubationsgemischen Proben genommen und auf Faktor Xa-Aktivität, wie in Beispiel 2 beschrieben, untersucht. Die Resultate sind Abbildung 1 zu entnehmen. Es zeigte sich, dass eine Aktivierung von Faktor X 12. mit allen eingesetzten Enzymen möglich war und für Thermolysin nach 2 Stunden zur höchsten Ausbeute an Faktor Xa führte. Ausser für die Inkubation mit Ficin war die Aktivierungsphase, welche je nach Enzym ein Maximum zwischen 30 Minuten und 2 Stunden erreichte, von einer Inaktivierung des entstandenen Faktor Xa gefolgt. Bei der Aktivierung von Ficin konnte eine stetige Aktivierung mit stabiler Faktor Xa- Aktivität auch nach 19 Stunden nachgewiesen werden.
BEISPIEL 4
Aktivierung von Faktor X
Vergleich Ficin und Russell 's Viper Venom
Aus der Literatur ist Faktor X-Aktivator aus Vipera russellii (RW, Pentapharm AG, Basel, CH) als ein nicht plasmatischer Faktor X-Aktivator mit einer hohen Selektivität bekannt, der für in vitro-Aktivierungen von Faktor X gängigerweise eingesetzt wird.
In diesem Beispiel wurde die Aktivierung von hochgereinigtem Faktor X aus Beispiel 1 mit RW im Vergleich zur Aktivierung mit dem pflanzlichen Faktor X-Aktivator, Ficin, untersucht. Zu diesem Zweck wurde der hochgereinigte Faktor X in einer Konzentration von 4 E/ml in einem Puffer enthaltend 20 mmol/1 Tris-HCl, 150 mmol/1 NaCl, 5 mmol/1 CaCl2, pH 7,4, eingesetzt und mit entweder 2,7 μg/ml RW (Pentapharm AG, Basel, CH) oder 20 μg/ml Ficin (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) bei 37 °C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden innerhalb von 22 Stunden aus den Inkubationsgemischen Proben entnommen und, wie in Beispiel 2 beschrieben, auf Faktor X- Aktivität untersucht. Das Ergebnis der Untersuchung ist in Abbildung 2 dargestellt. Es zeigte sich, dass die Inkubation von Faktor X mit dem Faktor X-Aktivator aus Ficin zu einer Faktor Xa-Aktivität führte, welche mit der, die durch Inkubation mit RW erreicht werden konnte, vergleichbar war. Die Aktivierungsprodukte des Faktor X, die nach Inkubation mit den beiden Aktivatoren nach 22 Stunden erreicht werden konnten, wurden auch durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese in Gradientengelen 8 - 18 % unter nicht reduzierenden Bedingungen untersucht. Dazu wurde nach elektrophoretischer Auftrennung der Faktor X vor Aktivierung, der Faktor X nach Aktivierung mit RW und nach Aktivierung mit Ficin, und nachfolgendem Blot auf Nitrocellulose- Membranen und Detektion mit einem anti-Faktor X-polyklonalen Antikörper und Immunfärbung nach Standardmethoden analysiert. Das Resultat ist Abbildung 3 zu entnehmen. Es zeigte sich, dass der homogene Faktor X vor Aktivierung sowohl durch den Aktivator RW als auch den Aktivator Ficin in mehrere Faktor X-spezifische Proteinfragmente kleinerer Molekülmasse als des nicht aktivierten Faktor X gespalten wurde, wobei nach Aktivierung mit RW ein Gemisch aus alpha- und beta-Faktor Xa entstand, wobei diese beiden Aktivierungsprodukte des Faktor X in etwa gleicher Menge enthalten waren, und noch mindestens drei weitere Aktivierungsprodukte identifiziert werden konnten. Dagegen zeigte die Aktivierung durch Ficin, dass als Hauptprodukt beta-Faktor Xa gewonnen wurde (siehe Pfeil) , wobei wie bei der Aktivierung mit RW auch drei weitere Aktivierungsprodukte nachgewiesen werden konnten, die allerdings im Gegensatz; zur Aktivierung mit RW einen grosseren Molmasseunterεchied zum Hauptprodukt beta-Faktor Xa aufwiesen, sodass diese durch einfache weitere Methoden, z.B. Gelfiltration, abgetrennt werden konnten. BEISPIEL 5
Einfluss von Effektoren auf die Faktor X-Aktivierung mit
Ficin
Die in der Literatur angegebenen Inkubationsbedingungen für den proteolytischen Abbau mit Ficin weisen Puffersysteme auf, die zumeist Cystein als SH-Reagens und -Aktivator für die Protease enthalten. Ferner ist auch der Zusatz eines Metall- ionenkomplexbildners, z.B. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) , beschrieben, weil bekannt ist, dass solche SH- abhängige Proteasen, insbesondere durch Schwermetallionen inaktiviert werden. In diesem Beispiel wurde Faktor X in einer Konzentration von 4 E/ml in einem Puffer enthaltend 20 mmol/1 Tris-HCl, 150 mmol/1 NaCl, pH 7,4, mit 2 μg Ficin/ml analog zu Beispiel 4 bei 37 °C 24 Stunden inkubiert, wobei dem Puffermedium (1) 2 mmol/1 CaCl2, (2) 1 mmol/1 Cystein, (3) 1 mmol/1 Cystein und 2 mmol/1 EDTA und (4) 1 mmol/1 Cystein und 2 mmol/1 CaCl2 zugesetzt wurde. Nach 24 Stunden Inkubation wurde die Faktor Xa-Aktivität gemäss Beispiel 2 bestimmt. Die Resultate sind Tabelle 1 zu entnehmen.
Tabelle 1: Faktor X-Aktivierung mit Ficin, Einfluss von Effektoren Es zeigte sich, dass durch den Zusatz von Calciumchlorid eine deutlich höhere Ausbeute an Faktor Xa erreicht werden konnte, während unter Standardbedingungen (Cystein ± EDTA) nur geringere Faktor X-Ausbeuten realisiert werden konnten. Die Ansätze wurden wie oben beschrieben auch mittels SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf die Zusammensetzung der Aktivierungsprodukte untersucht. Das Ergebnis der elektrophoretischen Untersuchung nach Färbung der Proteine nach der Silberfärbemethode als auch nach spezifischer Immunfärbung mit einem anti-Faktor X-Antikörper ist Abbildung 4 zu entnehmen. Es zeigte sich, dass der Zusatz von Calciumionen zum Inkubationsmedium zu einem deutlich höheren Anteil an beta-Faktor Xa unter den Faktor X-Spaltprodukten führt. Der so gewonnene beta-Faktor Xa kann nun leicht durch konventionelle chromatographische Reinigungsmethoden vom im Gemisch noch enthaltenen Resten an Ficin befreit werden. Dazu zählen einfache Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie oder Substrataffinitätschromatographie, beispielsweise an immobilisiertem Benzamidin, welches in der Lage ist, Faktor Xa selektiv zu binden.
BEISPIEL 6
Isolierung des Faktor X-Aktivators aus Pflanzenlatex
10 mg eines pulverisierten Latex aus Ficus glabrata enthaltend 2 mg Protein wurden in 2,5 ml eines 5 mmol/1 Natriumphosphatpuffers enthaltend 1 mmol/1 EDTA, pH 5,5, suspendiert und mit 100 μl 50 mmol/1 Cystein-Lösung zur
Aktivierung der Cysteinprotease versetzt. Anschliessend wurde
_ durch Gelflltration über Sephadex G50 das freie Cystein entfernt und mit dem gleichen Phosphatpuffer 1 + 3 '7 weiterverdünnt . Die Gesamtmenge wurde nun auf eine Mono S HR 5/5 Kationenaustausch-Chromatographiesäule, Fa. Pharmacia, bei einer Flussrate von 1 ml/min aufgetragen. Anschliessend wurde mit 45 Säulenvolumina des gleichen Phosphatpuffers nachgewaschen und anschliessend eine Gradientenelution durchgeführt, wobei die Phosphatkonzentration auf 185 mmol/1 in derselben Pufferzusammensetzung über 55 Säulenvolumina kontinuierlich erhöht wurde. Das Resultat ist Abbildung 5 zu entnehmen. Durch die Elution wurde das Proteingemisch in mehrere Einzelproteine aufgetrennt. Wie im Elutionsprofil an der Absorption bei 280 nm ( Protein) erkennbar ist.
Anschliessend wurden die einzelnen Fraktionen mit dem in Beispiel 2 beschriebenen Faktor Xa-Assay auf FX-aktivierende Enzymaktivität untersucht und es zeigte sich, dass ein Proteinpeak, der bei 49 ml Elutionsvolumen eluierte, und ein Proteinpeak, der zwischen 68 und 69 ml Elutionsvolumen eluierte, die höchste Faktor X-Aktivator-Aktivität (- -x- -) aufwies . Analog wurden die Fraktionen mit einem unspezifischen Proteasesubstrat auf Proteaseaktivität untersucht. Dazu wurde das chromogene Proteasesubstrat, Benzoyl-DL-arginin-p-nitroanilid-hydrochlorid, welches unter den Bedingungen und nach der Methode von Eglund et al . , Biochemistry 7: 163-175 (1968), in einem photometrischen Test eingesetzt wurde, verwendet. Wie aus Abbildung 5 zu erkennen war, konnte nennenswerte Proteaseaktivität (Δ) sowohl im Säulendurchlauf als auch in allen weiteren Fraktionen gefunden werden, wobei auch hier die Peaks bei Elutionsvolumen 49 ml und Elutionsvolumen 68-69 ml die stärksten Aktivitäten aufwiesen. Daneben wurden aber auch noch in den Proteinfraktionen bei Elutionsvolumen 53 ml und 74-83 ml nennenswerte Proteaseaktivitäten festgestellt. Bemerkenswert war, dass in der Fraktion, die bei 68-69 ml von der Säule eluierte, die Faktor X-Aktivatoraktivität deutlich höher war als die unspezifische Proteaseaktivität, was auf eine Abtrennung des Faktor X-Aktivators aus dem rohen Pflanzenextrakt zurückzuführen war. Die Fraktion enthaltend die höchste Faktor X-Aktivatoraktivität in Bezug auf den Proteingehalt wurde anschliessend 15 Stunden bei 4 °C unter der Einwirkung von Luftsauerstoff inkubiert. Dadurch konnte die Faktor X-Aktivator-Aktivität im Verhältnis zur unspezifischen Proteaseaktivität weiter gesteigert werden.
BEISPIEL 7
Immobilisierung von pflanzlichem Faktor X-Aktivator
Kristallisiertes Ficin ( Fa. Sigma) in Kristallsuspension wurde auf eine Konzentration von 2,5 mg/ml verdünnt und gegen einen Puffer enthaltend 20 mmol/1 Tris-HCl, 150 mmol/1 NaCl, pH 7,4, durch Gelflltration über Sephadex G50 (Pharmacia) umgepuffert. Ein voraktiviertes Gel, Actigel ALD Superflow (Sterogene Bioseparations, Arcadia, CA) , wurde mit einem Puffer enthaltend 20 mmol/1 Tris-HCl, 150 mmol/1 NaCl, pH 7,4, gewaschen und anschliessend im Verhältnis 1 + 1 mit der zu immobilisierenden Ficin enthaltenden Lösung versetzt und mit 1/15 des Volumens an Kopplungslösung (Sterogene Bioseparations, Arcadia, CA) 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschliessend wurde das Immobilisat auf einer Sinternutsche abgetrennt und durch exzessives Waschen abwechselnd mit einem 20 mmol/1 Tris-HCl, 150 mmol/1 NaCl, pH 7,4, Puffer und einem 20 mmol/1 Tris-HCl, 2 mmol/1 NaCl, pH 7,4, Puffer vom nicht gebundenem Ficin und den Kopplungsreagenzien befreit. Das Ficinimmobilisat wurde nachfolgend zur Aktivierung von Faktor X wie folgt eingesetzt .
Hochgereinigter Faktor X aus Beispiel 1 wurde in einem Puffer enthaltend 20 mmol/1 Tris-HCl, 150 mmol/1 NaCl, pH 7,4, auf 2 E FX/ml eingestellt und mit 10 μl/ml feuchtem Ficinimmobilisat versetzt. Anschliessend wurde 60 Minuten bei 37 °C unter ständiger Durchmischung inkubiert und danach die Faktor Xa-Aktivität wie in Beispiel 2 beschrieben, gemessen. Dabei konnte eine Faktor Xa-Aktivität von 4 E/ml festgestellt werden. Daraus kann abgeleitet werden, dass Ficin auch in an eine feste Phase gebundener Form die Faktor X-Aktivator- Aktivität behält und daher als Immobilisat zur Darstellung von Faktor Xa geeignet ist.
BEISPIEL 8
Eine technische Ficin-Präparation aus Ficus glabrata Latex wurde nach den Bedingungen und der Methode von Englund et al . , Biochemistry 7:163-175 (1986) gereinigt, wobei jene Fraktionen gesammelt wurden, welche die höchste spezifische Faktor X-Aktivatoraktivität, verglichen mit der unspezifischen Proteaseaktivität gegen Benzoyl-DL-arginin-p- nitroanilid-hydrochlorid, aufwiesen. Die aus der chromatographischen Reinigung anfallende Präparation wurde einer 15-minutigen Aktivierung mit 10 mM Cystein bei 37°C unterworfen, und das Aktivierungsgemisch anschließend durch eine Gruppentrennung mittels Gelfiltration über Sephadex® G- 25 Superfine vom überschüssigen Aktivator befreit. Die Aktivierung wurde in Inkubationsgemischen enthaltend 4 Einheiten/ml Faktor X und 3 μg/ml der aktivierten Ficinpräparation in einem Puffersystem von 20 mmol/1 Tris-HCl, 150 mmol/1 Natriumchlorid, pH 7,4 in Ab- und 10
Anwesenheit von Calcium- und Manganionen durchgeführt. Die Ansätze enthielten entweder 2 mmol/1 Calcium-Ionen, 1 mmol/1 Mangan (II) -ionen oder eine Kombination der beiden Metallionen. Nach 5 h Inkubation bei 37°C wurden die Ansätze mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf die Zusammensetzung der Aktivierungsprodukte untersucht . Das Ergebnis der elektrophoretischen Trennung wurde nach der Silberfärbemethode sichtbar gemacht und die Intensität der aufgetrennten Banden densitometrisch ausgewertet . Das Ergebnis dieser Auswertung ist der nachstehenden Tabelle zu entnehmen.
Es zeigte sich, daß die Aktivierung durch die gereinigte, aktivierte Ficinpräparation ohne Zusatz der beiden Metallionen zu einem verstärkten Abbau des gebildeten Faktor Xa führt. Der Zusatz von wahlweise Ca2+- bzw. Mn2+- Ionen verringert die Entstehung von verschiedenen Spaltprodukten, während die Kombination beider Ionen das Verhältnis zwischen aktiviertem Faktor X und dessen Degradationsprodukten nahezu umkehrte .
Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß die Aktivierung unter Zusatz von Ca2+ und Mn2+-Ionen einen aktivierten Faktor X ergibt, der nach dem Aktivierungsvorgang keinem weiteren Degradationsprozeß unterworfen ist. Um diesen Nachweis zu erbringen, wurde ein Aktivierungsansatz analog zu den zuvor angeführten Bedingungen unter Zusatz von 2 mmol/1 Calciumionen und 1 mmol/1 Mangan (II) -Ionen durchgeführt, bei dem zu aι bestimmten Zeitpunkten aus dem Inkubationsgemisch Proben gezogen wurden, um die Aktivierungskinetik zu erfassen. Es wurden die Aktivität von Faktor Xa gemäß Beispiel 2 bestimmt sowie der Anteil degradierter Spaltprodukte von Faktor Xa ermittelt, analog zu der oben beschriebenen Methodik. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in folgender Tabelle zusammengefaßt :
Die weitere Reinigung des gewonnenen Faktor Xa kann nun gemäß Beispiel 5 erfolgen.

Claims

$1Patentansprüche
1. Verfahren zur Aktivierung eines Vitamin K-abhängigen Blutfaktors durch Behandlung mit einer Protease, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease von Pflanzen, Pilzen oder Prokaryonten abgeleitet ist .
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Blutfaktor aus der Gruppe der humanen Faktoren II, VII, IX, X und Protein C ausgewählt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass nach Aktivierung von humanem Faktor X der Faktor Xa-ß gewonnen wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease ausgewählt ist aus der Gruppe Ficin, Bromelain, Papain, Thermolysin und Clostripain.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung unter Bedingungen durchgeführt wird, die für die Protease suboptimal sind.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease eine oxidierte Cysteinprotease ist.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease chromatographisch gereinigt ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease eine mindestens 2-fach erhöhte spezifische Blutfaktor-Aktivierungsaktivität gegenüber dem Rohextrakt aus Pflanzen oder Zellkulturen aufweist .
9. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivierung in Gegenwart von Defektoren durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivierung in Gegenwart von Schwermetallionen oder Erdalkaliionen durchgeführt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivierung in Gegenwart von Calciumionen erfolgt .
12. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis
11, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease an einem festen Träger immobilisiert ist.
13. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis
12, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt ist .
14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinanter Blutfaktor aktiviert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß ein Blutfaktor-Analog mit einer proteolytischen Schnittstelle spezifisch für die Protease aktiviert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die proteolytische Schnittstelle modifiziert ist und die Aktivierung mit der Protease vorgenommen wird, welche nicht dem physiologischen Aktivierungsmechanismus entspricht.
17. Pharmazeutische Präparation enthaltend einen Blutfaktor und eine für den Blufaktor spezifische Protease, vorzugsweise eine von Pflanzen, Pilzen oder Prokaryonten abgeleitete Protease.
18. Pharmazeutische Präparaton nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Blutfaktor ein Plasmaprotein, vorzugsweise ein Vitamin K-abhängiges Protein, insbesondere ein aktiviertes Vitamin K-abhängiges Protein ist.
19. Pharmazeutische Präparation, enthaltend eine für einen Blutfaktor spezifische Protease, insbesondere eine gereinigte Protease, dadurch gekennzeichnet, dass sie zur topischen Anwendung formuliert ist und die Protease vorzugsweise von Pflanzen, Pilzen oder Prokaryonten abgeleitet ist.
20. Set zur medizinischen Anwendung, enthaltend a) ein proteolytisches Enzym, insbesondere ein von Pflanzen, Pilzen oder Prokaryonten abgeleitetes Enzym, mit einer Spezifität für eine Proform eines Proteins, und b) die Proform eines Proteins.
21. Aktivierter Vitamin K-abhängiger Blutfaktor, dadurch gekennzeichnet, dass er gemäss dem Verfahren der Ansprüche 1 bis 16 gewonnen wurde.
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