WO1998039455A1 - NOVEL GENE, GROUP OF GENES, AND NOVEL β-GLUCLOSIDASE - Google Patents

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protein
dna
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acid sequence
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Naoto Tonouchi
Naoki Tahara
Takahisa Hayashi
Takayasu Tsuchida
Hisato Yano
Fumihiro Yoshinaga
Original Assignee
Bio-Polymer Research Co., Ltd.
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)

Definitions

  • the present invention relates to a gene encoding a cellulose synthase complex derived from a casepactor, xylinam, a subspecies, a chromosome, a gene encoding a cellulase, ⁇ -glucosidase (G3ase). ), A group of genes containing those genes, and a novel G-glucosidase (G3ase) itself.
  • the direct substrate is UDP-glucose, which is linked by a protein complex on the membrane called cellulose synthase and released as cellulose outside the cell. It is known to be done. It has been reported that this complex is composed of four proteins encoded by the cellulose synthase gene operator, and they are respectively named bcs A, B, C, and D (HC Wong et al., PNAS 8 Volume 7 8 13 0-8 13 4 pages (1990)). Of these, the bcs A, B, and C genes are known to be essential for cellulose synthesis because disruption of the genes results in the loss of cellulose synthesis ability.
  • CMCase cellulase gene
  • Another gene exist upstream of the cellulose synthase gene operation (R. Standal et al., Bacteriol. Volume 6 6 5 — 67 2 pages (1994)).
  • the present inventors conducted a study to obtain a new cellulase of the cellulose synthase complex derived from the genus Acetobacter.
  • Acetobacter-xylinum ⁇ Subspecies ⁇ Schlofermens Thus, the inventors succeeded in determining the nucleotide sequences of a series of genes including the novel cellulose synthase complex gene peron and cellulase gene.
  • Examination of the nucleotide sequence of the novel gene located downstream of the novel cellulose synthase complex gene op-open revealed that the sequence ⁇ region conserved by glucosidase from various organisms (Y. Kashiwagi et al. Ment Ferment. Bioeng. 7 8 39 4 _ 398 (1994)) was well preserved, and it was confirmed that this gene is a ⁇ -glucosidase gene.
  • the present invention provides a cellulose synthase complex derived from the casepactor ⁇ xylinum 'subspecies.
  • the present invention relates to a gene encoding a protein, particularly a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 5.
  • the present invention also relates to an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 5, in which one or several amino acids are partially or partially altered by deletion, substitution, addition, or the like.
  • it relates to a gene encoding a protein having the activity of cellulose synthase.
  • the gene is not limited to the gene derived from Axactor 'Xylinum' subspecies.
  • SEQ ID NO: 1 includes the nucleotide sequences represented by bcsA, bcsB, bcsC, and bcsD. Furthermore, in consideration of the degeneracy of the genetic code, the base sequence or a part of the base sequence encoding the same amino acid sequence produced by chemical synthesis or genetic engineering techniques can be mentioned.
  • the present invention includes a gene comprising DNA which hybridizes with DNA comprising such a base sequence under stringent conditions and encodes a protein having a cellulose synthase activity.
  • the present invention relates to a gene encoding a cellulase derived from an acetate bacterium, xylinam's subspecies, or a schlofur mentans, particularly a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. Get involved.
  • the present invention also relates to a protein having a cellulase activity, which is a variant partially different from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 due to deletion, substitution, or addition of one or several amino acids.
  • a protein having a cellulase activity which is a variant partially different from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 due to deletion, substitution, or addition of one or several amino acids.
  • the gene is an A. pactor ⁇ xylinum ⁇ subspecies -It is not limited to the ones derived from the Shuklov amen.
  • nucleotide sequence of the DNA of the above gene As a specific example of the nucleotide sequence of the DNA of the above gene, the nucleotide sequence represented by CMCase in SEQ ID NO: 1 can be mentioned. Furthermore, a nucleotide sequence encoding the same amino acid sequence produced by chemical synthesis or genetic engineering technique in consideration of the degeneracy of the genetic code or a part thereof may be mentioned.
  • the present invention includes a gene comprising DNA which hybridizes with DNA comprising such a base sequence under stringent conditions and encodes a protein having cellulase activity.
  • the present invention also relates to a microorganism belonging to the genus Acetobacter, for example, A. bacterium xylinum ⁇ Subspecies ⁇ ⁇ -glucosidase (G3ase) derived from Skulov Armenus, In particular, it relates to a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • amino acid sequence of the above protein is not limited to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, but one or several amino acids may be deleted or substituted in the amino acid sequence as long as it has ⁇ -glucosidase activity. Or, a variant partially different due to addition or the like is also included in the amino acid sequence.
  • the present invention also relates to the above-mentioned gene encoding glucosidase.
  • nucleotide sequence of D ⁇ ⁇ ⁇ of the gene As a specific example of the nucleotide sequence of D ⁇ ⁇ ⁇ of the gene, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: U- ⁇ -glucosidase can be mentioned. Further, a base sequence encoding the same amino acid sequence or a part thereof which is prepared by chemical synthesis or genetic engineering technique in consideration of the degeneracy of a genetic code can also be mentioned.
  • a protein that hybridizes with DNA comprising such a base sequence under stringent conditions and has a glucosidase activity
  • the present invention also includes a gene consisting of a DNA encoding
  • BPR 201 strain as a representative example of the acetate packer in the present invention, xylinam, subspices, sucrose armenance, CAcetobacter rxyIinum subsp. Sue rofermenta ns
  • the bacterial cell was patented on February 24, 1993 at 1-3-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan (zip code: 2005) by the Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Deposited at the Microbial Depositary Center (Accession No. FERMP-1334666), and subsequently deposited on February 7, 1994 under the Budapest Treaty on the International Recognition of Deposited Microorganisms in Patent Procedures (Accession No. FERMBP—4545).
  • Acetobacter xylinum (Aceto ⁇ cter xy I inum) ATCC 236768, Acetobacter b. 3 7 6 9, Aspactor.
  • A. pasteurianus ATCC 1 0 2 4 5, Aspactor-Xylinum ATCC 1 4 8 5 1 1 1 1 4 2 and Acetpactor 'Xylinium ATCC 1 0 8 2 1 can be mentioned.
  • the present invention further relates to a gene (cellulose) encoding the cellulose synthase complex of the present invention, and a microorganism derived from a microorganism belonging to the genus Acetopax located downstream (at the 3 ′ end) thereof. It is related to a group of genes (complex genes) containing genes that encode ⁇ -glucosidase.
  • This group of genes may further include the cellulase gene and / or glucanase gene of the present invention upstream of the gene (cellulose) encoding the cellulose synthase complex.
  • the gene group may contain other structural genes and various regulatory genes such as a promoter and an operator. Each of these genes is separated by an appropriate number of base sequences.
  • the gene encoding ⁇ -glucosidase from the BPR201 strain is located downstream of the gene encoding bcsD of the cellulose synthase complex by a distance of 214 bp. ing.
  • SEQ ID NO: 1 shows the genes included in this gene group, their positions on the base sequence, the distance between the genes, and the like.
  • genes and genes of the present invention are thought to encode a series of enzymes necessary for the production of cellulose in the genus Acetobacter, and the genes of the present invention are regulated by a series of promoters. It may be a single transcription unit.
  • genes and genes of the present invention can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • a gene library is prepared by a known method from the DNA of a strain of Aspecttor 'Xylinum'Subspecies'
  • a primer consisting of synthetic DNA was prepared based on the base sequence of a gene encoding a known cellulose synthase, and the gene of the present invention was subjected to PCR by using the above-mentioned gene library as type III.
  • it can also be prepared by a hybridization method using a probe DNA prepared based on the wide DNA fragment obtained by the PCR method or the base sequence thereof.
  • each gene constituting the gene group of the present invention be derived from the same microorganism (strain).
  • the genes of the present invention can also be prepared by arbitrarily linking individually prepared genes having different origins by genetic engineering techniques.
  • genes and gene groups can be incorporated into host cells such as Escherichia coli and used to produce a series of enzymes necessary for the production of cellulose by genetic engineering.
  • the present invention also relates to an expression vector such as a plasmid vector containing the above gene or gene group, and a recombinant cell such as Escherichia coli transformed with the expression vector.
  • the expression vector of the present invention may be a gene, a gene group, or, if necessary, an enhancer, a promoter, a ribosome binding sequence, a sequence encoding a signal peptide, a replication origin, and a selection marker. It can include gene sequences that code for quality.
  • a series of enzymes necessary for constructing such an expression vector, transforming a host cell, and producing cellulose using the transformed cell can be prepared by various genetic engineering methods well known to those skilled in the art.
  • the present invention also relates to the above-mentioned enzyme, which is a recombinant protein produced in this way.
  • FIG. 1 shows the position on the base sequence of each gene contained in the novel gene group of the present invention.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of the purified sample of ⁇ -glucosidase of the present invention.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of isoelectric focusing polyacrylamide gel electrophoresis of the purified sample of / 3 -glucosidase according to the present invention.
  • a DNA of BPR 201 strain was prepared by the method of Murray MG 8 Thonpson WF (Nucl. Acids Res. 8, Vol. 4 3 2 1 _ 4 3 25 (1980)). This DNA was partially digested with a restriction enzyme Sau3AI to cut it into a fragment of about 15 to 30 kbp. This fragment and the BamHI digested fragment of cosmid pHC79 (ATCC 370) were ligated with DNA ligase, and ligated with phage particles using a commercially available DMA in vitro packaging kit (Amersham). did. The particles were infected with E. coli HB101 strain (purchased from Toyobo), spread on an L medium containing ampicillin, and colonies were formed to prepare a gene library.
  • E. coli HB101 strain purchasedd from Toyobo
  • This colony was copied onto a nylon membrane (Amersham, Hybond_N +), lysed with alkali according to the attached protocol, denatured DNA, and fixed to the nylon membrane.
  • the lysate was dialyzed against 15 I of distilled water. At this time, a precipitate was formed in the dialysate. The precipitate was collected and extracted three times with 20 mM sodium acetate buffer (pH 5.5) containing 0.15 M NaCI. did. This extract contained G3ase activity. This extract was added to a 20 mM sodium acetate buffer containing 0.15 M NaCI. -CM equilibrated with (pH 5.5) —Add to Toyopearl 65 M column (Tosoichi: column size diameter 3.2 cm, length 13.3 cm) and G 3ase activity Was adsorbed. Next, the NaCI concentration was linearly gradient from 0.151 to 0.7 M.
  • the G3ase activity eluted between 0.45 and 0.55 MNaCI.
  • the obtained active fraction was concentrated with an ultrafiltration membrane (Millipore, Ultrafree 15, fractional molecular weight 5,000), and the fraction contained 0.15 M NaCI.
  • the column was added to a Toyopearl HW55S column (manufactured by Tosoh Corporation; column size 1.5 cm, length 48 cm) equilibrated with 10 mM sodium acetate buffer (PH 5.5).
  • NaCI was added to a final concentration of 1.5 M, and a 20 mM sodium acetate buffer (pH 5.5) containing 1.5 M NaCI was added.
  • the purified S / S-glucosidase (G3ase) by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) had a molecular weight of about 81,200 (Fig. 2).
  • the isoelectric point (pi) determined by isoelectric point polyacrylamide gel electrophoresis (IEF-PAGE) was about 6.0 (Fig. 3).
  • This sequence is completely identical to the sequence after the 27th R (arginine) in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) deduced from the ⁇ -g'norrecosidase (G3ase) gene shown in SEQ ID NO: 1. I did. That is, the -glucosidase (G3ase) gene had a signal sequence composed of 26 amino acid residues.
  • the stability of 8-glucosidase (G3ase) to pH was investigated.
  • ⁇ -glucosidase (G3ase) was treated with each at 30 ° C for 3 hours, and the remaining enzyme activity was determined.
  • the pH range was ⁇ ⁇ 3.6 to 0.0, and the deactivated ⁇ ⁇ was ⁇ ⁇ 3 or less and ⁇ ⁇ 8 or more.
  • the optimum pH for the activity was about 5.5.
  • the stability of glucosidase (G3ase) against temperature was examined.
  • Glucosidase (G3ase) was treated at pH 5.5 and 30 minutes at each temperature, and the remaining enzyme activity was examined.
  • the enzyme activity was stable at 30 ° C or less and lost at 50 ° C or more. Alive.
  • the optimum temperature for the activity was about 40 ° C.
  • this enzyme was antagonistically inhibited by glucon ⁇ - ⁇ -lactone and condurit to I-epoxide (Table 5). In addition, it had very low degradability against high molecular weight cellulose substrates (CMC (carboxymethylcellulose), lichenan, BC (bacterial cellulose), Avicel, and PRC (phosphate swelling cellulose)) (Table 1). 6). Table 4. K m and k of G 3 ase.
  • the figures are a percentage of the amount of glucose produced relative to the total amount of each substrate added. Represents percentage.
  • Novel genes and genes involved in cellulose synthesis were obtained from microorganisms belonging to the genus Acetobacter and their nucleotide sequences were determined. These genes and genes are useful as means for transforming microorganisms by genetic engineering and producing cellulose using the transformed bacteria.

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Description

明 細 書 新規な遺伝子及び遺伝子群並びに新規な S—グルコシダ一ゼ 技術分野
本発明は、 ァセ 卜パクター ■ キシリナム ■ サブスピ一シーズ■ シュク ロフアーメ ン夕ンス由来のセルロース合成酵素複合体をコードする遺伝 子、 セルラ一ゼをコードする遺伝子、 β -グルコシダ一ゼ （ G 3 a s e ) をコードする遺伝子、 及びそれらの遺伝子を含む遺伝子群、 並びに新 規な ーグルコ シダーゼ （ G 3 a s e ) 自体に関する。 背景技術
酢酸菌におけるセルロースの生合成については、 直接の基質が U D P —グルコースであり、 それがセルロース合成酵素と呼ばれる膜上の夕ン パク複合体によつて連結されてセルロースとなって細胞外へと放出され ることが知られている。 この複合体はセルロース合成酵素遺伝子オペ口 ンにコードされる 4つのタンパクから構成されることが報告されており 、 それぞれ b c s A、 B、 C、 Dと名付けられている （H. C. Wongら、 P. N. A. S. 8 7巻 8 1 3 0 - 8 1 3 4頁 （ 1 9 9 0 ) ) 。 これらの内 、 b c s A、 B、 C遺伝子はその遺伝子を破壊するとセルロース合成能 がなくなることからセルロース合成に必須であることが知られている。 また、 b c s Dについては、 遺伝子破壊によりセルロースの構造が著し く変化することから、 これもセルロース合成に大きな役割を担っている と報告されている （に M. Saxenaら、 丄 Bacteriol. 1 7 6巻 5 7 3 5 — 5 7 5 2頁 （ 1 9 9 4 ) ) 。 また最近、 一つのセルロース生産菌から 2つめのセルロース合成遺伝子オペ口ンが得られたという報告もある （ I. M. Saxenaら、 J. Bacter iol. 1 7 7巻 5 2 7 6 — 5 2 8 3頁 （ 1 9 9 5 ) ) o
このセルロース合成酵素複合体にはコファクタ一として環状 d i 一 G M Pが必要であリ、 それを合成するサイクラーゼの遺伝子も報告されて いる （R. Tal and D. H. Gelfand、 P C T W0 9 3 / 1 1 2 4 4 ( 1
9 9 3 ) ) o
また、 このセルロース合成酵素遺伝子オペ口ンの上流にはセルラーゼ 遺伝子 （C M C a s e ) およびもう一つ別の遺伝子が存在することが報 告されている （R. Standal ら、 丄 Bacter iol. 1 7 6巻 6 6 5 — 6 7 2 頁 （ 1 9 9 4 ) ) 。
今回、 発明者らは、 新たにァセ トパクター属由来のセルロース合成酵 素複合体遺伝子才ペロンを獲得すべく研究の結果、 ァセ 卜パクター - キ シリナ厶 ■ サブスピーシーズ ■ シュクロファーメ ン夕ンスから、 新規な セルロース合成酵素複合体遺伝子才ペロン及びセルラーゼ遺伝子等を含 む一連の遺伝子群の塩基配列を決定することに成功した。 この新規なセ ルロース合成酵素複合体遺伝子オペ口ンの下流に位置する新規な遺伝子 の塩基配列を調べたところ、 種々の生物の 一グルコシダーゼで保存さ れている配列 ' 領域 （Y. Kashiwagiら、 丄 Ferment. Bioeng. 7 8巻 3 9 4 _ 3 9 8頁 （ 1 9 9 4 ) ) を良く保存しており、 この遺伝子が^— グルコシダ一ゼ遺伝子であることが確認された。
更に、 この ;8—グルコシダーゼ遺伝子がコー ドする酵素夕ンパク質を 実際に精製し、 その諸特性を検討した。 発明の開示
即ち、 本発明は、 ァセ 卜パクター ■ キシリナ厶 ' サブスピーシーズ . シュクロファーメ ン夕ンス由来のセルロース合成酵素複合体を構成する タンパク質をコー ドする遺伝子、 特に、 配列番号 ： 2〜配列番号 ： 5の いずれか一つに示されたアミノ酸配列から成る夕ンパク質をコー ドする 遺伝子に係わる。
本発明はまた、 配列番号 ： 2〜配列番号 ： 5のいずれか一つに示され たアミノ酸配列において 1 若しく は数個のアミノ酸の欠失、 置換又は付 加等によってその一部が異なる改変体であって、 セルロース合成酵素の 活性を有するタンパク質をコー ドする遺伝子に係わる。
従って、 該遺伝子はァセ 卜パクター ' キシリナム ' サブスピーシーズ ■ シュクロフアーメン夕ンス由来のものに限定される訳ではない。
上記遺伝子の D N Aの塩基配列の一具体例として、 配列番号 ： 1 に b c s A、 b c s B、 b c s C及び b c s Dで示された塩基配列を挙げる ことができる。 更に、 遺伝暗号の縮重を考慮して化学合成や遺伝子工学 的手法によつて作製される同一ァミノ酸配列をコー ドする塩基配列もし くはその一部も挙げることが出来る。
また、 かかる塩基配列から成る D N Aとス ト リ ンジ X ン トな条件下で ハイブリダィズし、 且つ、 セルロース合成酵素活性を有するタンパク質 をコー ドする D N Aから成る遺伝子も本発明に含まれる。
更に、 本発明は、 ァセ 卜パクター ■ キシリナム ' サブスピーシーズ ■ シュクロフアーメ ンタンス由来のセルラーゼをコ一ドする遺伝子、 特に 配列番号 ： 6に示されたアミノ酸配列から成る夕ンパク質をコー ドする 遺伝子に係わる。
本発明はまた、 配列番号 ： 6に示されたアミノ酸配列において 1 若し く は数個のアミノ酸の欠失、 置換又は付加等によってその一部が異なる 改変体であって、 セルラーゼ活性を有するタンパク質をコー ドする遺伝 子に係わる。
従って、 該遺伝子はァセ トパクター ■ キシリナ厶 ■ サブスピーシーズ - シュクロフアーメン夕ンス由来のものに限定される訳ではない。
上記遺伝子の D N Aの塩基配列の一具体例として、 配列番号： 1 に C M C a s eで示された塩基配列を挙げることができる。 更に、 遺伝暗号 の縮重を考慮して化学合成や遺伝子工学的手法によつて作製される同一 ァミノ酸配列をコ一ドする塩基配列もしくはその一部も挙げることが出 来る。
また、 かかる塩基配列から成る D N Aとス ト リ ンジ I ン トな条件下で ハイブリダィズし、 且つ、 セルラーゼ活性を有するタンパク質をコー ド する D N Aから成る遺伝子も本発明に含まれる。
本発明は、 又、 ァセ 卜パクター属に属する微生物、 例えば、 ァセ 卜バ クタ一 · キシ リナム ■ サブスピーシーズ ■ シュク ロフ アーメ ン夕ンス由 来の β 一グ'ルコシダーゼ （G 3 a s e ) 、 特に、 配列番号： 7に示され たアミノ酸配列から成るタンパク質に係わる。
上記タンパク質のアミノ酸配列は、 配列番号 ： 7に示されたアミノ酸 配列に限られるものではな 、 β—グルコシダーゼの活性を有する限り 、 該アミノ酸配列において 1若しく は数個のアミノ酸の欠失、 置換又は 付加等によってその一部が異なる改変体も当該ァミノ酸配列の範疇であ る ο
本発明はまた、 上記 —グ'ルコシダーゼをコ一ドする遺伝子に係わり
、 該遺伝子の D Ν Αの塩基配列の一具体例として、 配列番号 ： Uこ β - g l ucos i dase で示された塩基配列を挙げることができる。 更に、 遺伝暗 号の縮重を考慮して化学合成や遺伝子工学的手法によって作製される同 一アミノ酸配列をコードする塩基配列もしくはその一部も挙げることが 出来 。
また、 かかる塩基配列から成る D N Aとス ト リ ンジ I ン 卜な条件下で ハイブリダィズし、 且つ、 ーグルコシダーゼ活性を有するタンパク質 をコードする D N Aから成る遺伝子も本発明に含まれる。
本発明に於けるァセ 卜パクター ■ キシリナム ■ サブスピ一シ一ズ■ シ ュク ロフ アーメ ン夕 ンス CAcetobacte r xy I i num subsp. sue rof e rmenta ns) の代表例として B P R 2 0 0 1 株があり、 該菌体は平成 5年 2月 2 4日に日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1 番 3号 （郵便番号 3 0 5 ) の通 商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに 寄託され （受託番号 F E R M P - 1 3 4 6 6 ) 、 その後、 1 9 9 4年 2月 7日付で特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダぺス 卜条約に基づく寄託 （受託番号 F E R M B P— 4 5 4 5 ) に移管され ている。
尚、 ァセ 卜パクター属に属する微生物の他の例として、 ァセ 卜バク夕 一 ■ キシリナム （Aceto^cter xy I inum) A T C C 2 3 7 6 8 , ァセ 卜バ クタ一 . キジリナ厶 A T C C 2 3 7 6 9、 ァセ トパクター . パスッ リ ア ヌス （A. pasteur ianus) A T C C 1 0 2 4 5、 ァセ 卜パクター - キシリ ナム A T C C 1 4 8 5 1 、 ァセ 卜バク夕一 · キジリナ厶 A T C C 1 1 1 4 2及びァセ 卜パクター ' キシリナ厶 A T C C 1 0 8 2 1等を挙げるこ とができる。
本発明は、 更に、 本発明のセルロース合成酵素複合体をコー ドする遺 伝子 （才ペロ ン） 、 及びその下流 （ 3 ' 末端側） に位置するァセ トパク 夕ー属に属する微生物由来の β一グルコシダーゼをコ一ドする遺伝子を 含む遺伝子群 （複合遺伝子） に係わる。
この遺伝子群は、 セルロース合成酵素複合体をコー ドする遺伝子 （才 ペロ ン） の上流に更に本発明のセルラーゼ遺伝子及び 又はグルカナー ゼ遺伝子を含むものでも良い。 又、 該遺伝子群には、 その外の構造遺伝 子並びにプロモーター及びオペレータ一等の各種調節遺伝子が含有され ていてもよい。 これらの各遺伝子は適当な数の塩基配列によって隔てら れておリ、 例えば、 B P R 2 0 0 1 株由来の β -グルコシダーゼをコ一 ドする遺伝子はセルロース合成酵素複合体の b c s Dをコードする遺伝 子の下流に 2 1 4 bp隔てられて位置している。 このような本発明の遺伝 子群の塩基配列の一具体例を配列番号： 1 に示す。 又、 この遺伝子群に 含まれている各遺伝子、 その塩基配列上の位置及び各遺伝子間の距離等 を図 1 に示す。
尚、 配列番号 ： 1 に示された遺伝子群に於いて、 セルラーゼ遺伝子と セルロース合成酵素複合体の b c s Aをコー ドする遺伝子の間に、 もう —つの遺伝子の読み取り枠 （0 R F 2 ) が存在する。 この 0 R F 2がコ —ドするアミノ酸配列を配列番号 ： 8に示す。 このアミノ酸配列を有す るタンパク質の機能は未だ解明されていないが、 別の菌体に於いて、 同 様な位置にある遺伝子を破壊するとセルロースの生合成に支障をきたす との報告もなされており、 この 0 R F 2で示される遺伝子もセルロース の生合成に関与していることは間違いないものと思われる。
上記本発明の遺伝子及び遺伝子群は、 ァセ 卜パクター属に於けるセル ロースの生産に必要な一連の酵素をコードしているものと考えられ、 本 発明の遺伝子群は一連のプロモータ一によって調節されている一つの転 写単位である可能性がある。
本発明の遺伝子及び遺伝子群は、 当業者に公知の方法で調製すること が出来る。
例えば、 まず、 ァセ トパクター ' キシリナム ' サブスピーシーズ ' シ ュクロフアーメン夕ンスの菌株の D N Aより公知の方法で遺伝子ライブ ラリーを作成する。 一方、 既に知られているセルロース合成酵素をコー ドする遺伝子の塩基配列をもとに合成 D N Aから成るプライマーを作成 し、 上記の遺伝子ライブラリーを铸型として用いた P C R法によって本 発明の遺伝子を調製することが出来る。 また、 こうして P C R法によって得られた增幅 D N A断片又はその塩 基配列に基づいて作製したプローブ D N Aを使用したハイブリダイゼー ション法によっても調製することができる。
更に、 本明細書に開示された各遺伝子の塩基配列及びそれがコー ドす るアミノ酸配列に基づいて、 当業者であれば、 化学合成によっても本発 明の遺伝子を容易に調製することが出来る。
従って、 本発明の遺伝子群を構成する各遺伝子が同一の微生物 （菌株 ) に由来している必要はない。 それぞれに異なる由来を有し個別に調製 した各遺伝子を遺伝子工学的手法によって任意に連結して本発明の遺伝 子群を調製することもできる。
かかる遺伝子及び遺伝子群は、 大腸菌等の宿主細胞に組み込んで上記 セルロースの生産に必要な一連の酵素を遺伝子工学的に生産するために 利用することができる。
よって、 本発明は、 上記遺伝子又は遺伝子群を含有するプラスミ ドべ クタ一等の発現ベクター、 並びに該発現ベクターによって形質転換され た大腸菌等の組み換え細胞にも係わるものである。
本発明の発現ベクターは、 当該遺伝子又は遺伝子群の他に、 必要に応 じて、 更に、 ェンハンサ一、 プロモーター、 リボソーム結合配列、 シグ ナルペプチドをコードする配列、 複製開始点及び選択マーカーとなる物 質をコー ドする遺伝子配列等を含むことが出来る。
かかる発現ベクターの構築、 宿主細胞の形質転換及び該形質転換細胞 を使用したセルロースの生産に必要な一連の酵素は当業者に周知の様々 な遺伝子工学的方法によつて調製することができる。
従って、 本発明は、 こうして製造された組み換えタンパク質である上 記酵素にも係わる。 図面の簡単な説明
図 1 は、 本発明の新規な遺伝子群に含まれている各遺伝子の塩基配列 上の位置を示す。
図 2は、 本発明の β -グルコシダーゼ精製標品の S D S—ポリアクリ ルアミ ドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
図 3は、 本発明の /3 -グルコシダ一ゼ精製標品の等電点ポリアクリル アミ ドゲル電気泳動の結果を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
実施例 1 . 遺伝子の調製及び塩基配列の決定
Murray M. G. 8 Thonpson W. F. (Nucl. Acids Res. 8巻 4 3 2 1 _ 4 3 2 5頁 （ 1 9 8 0 ) ) の方法により B P R 2 0 0 1 株の D N Aを調 製した。 この D N Aを制限酵素 S a u 3 A I で部分分解することにより 、 約 1 5 — 3 0 kbp の断片に切断した。 この断片とコスミ ド p H C 7 9 (A T C C 3 7 0 3 0 ) の B a m H I 切断断片を D N Aリガーゼによリ 連結し、 市販の DMA in vitro packaging kit (アマシャム社製） を用 いてファージ粒子とした。 この粒子を大腸菌 H B 1 0 1 株 （東洋紡よリ 購入） に感染させ、 アンピシリン含有 L培地に撒き、 コロニーを生じさ せることにより遺伝子ライブラリーを作製した。
このコロニーをナイロン膜 （アマシャ厶社製、 H y b o n d — N +) に写し取り、 添付のプロ トコールに従ってアルカリで溶菌して D N Aを 変性させナイロン膜に固定した。
—方、 公知のァセ 卜パクター ' キシリナ厶 1 3 0 6 — 3株のセル口一 ス合成遺伝子の塩基配列 （H. C. Wongら、 Pro atl. Acad. Scに USA 、 8 7巻 8 1 3 0 - 8 1 3 4頁 （ 1 9 9 0年） ） をもとに、 以下の合成 D N A 2種類を作製した。 A C C G A A T G C G T C T G A C G G T T
T G A T G A T G G T T A C G C G C A C C
この合成 D N Aをプライマーとして用い、 上記の方法によリ調製した B P R 2 0 0 1 株の D N Aを錶型として用い、 通常の条件で P C R法を 行ったところ、 セルロース合成酵素遺伝子の一部にあたる D N A断片が 増幅した。 この D N A断片をァガロースゲル電気泳動にて分離 ' 回収し 、 プローブとして用いた。
上記の D N Aが固定されたナイロン膜と、 プローブ D N Aを用いて、 E C Lラベリングキッ ト （アマシャ厶社製） を用いて添付のプロ トコ一 ルに従ってハイブリダイズさせた。 シグナルが得られたク口ーンの中よ り、 該遺伝子の全長を含む D N A断片を有するクローンを選択し、 A M 9と命名した。 この株は、 1 9 9 7年 2月 1 4日付で特許手続上の微生 物の寄託の国際的承認に関するブダぺス 卜条約に基づき、 日本国茨城県 つくば市東 1 丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 ) の通商産業省工業技術院 生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され、 受託番号 F E R M B P _ 5 8 2 2を付されている。
この A M 9株よリブラスミ ド D N Aを調製し、 そこに含まれる D N A 断片の塩基配列を決定したところ、 図 1 に示された 16.8kbp の塩基配列 が存在することが確認された。
この領域について、 タンパク質をコー ドする遺伝子を検索したところ 、 いくつかの遺伝子が見出された。 それらについて、 D N A S I S (日 立） のプログラムを用いて、 他のセルロース生産菌株の既知の配列 （セ ルラーゼと 0 R F 2については、 R. Standal ら、 丄 Bacterioし 1 7 6 巻 6 6 5 — 6 7 2頁 （ 1 9 9 4 ) ) セルロース合成酵素については、 H. C. Wongら、 P. N. に S. 、 8 7巻 8 1 3 0 — 8 1 3 4頁 （ 1 9 9 0 ) ) と比較した。 その結果、 A M 9株に組み込まれている遺伝子配列と既 知の遺伝子配列の間で、 下表に示す通りの D N A或いは夕ンパク質にお ける高い相同性を持つことを見出し、 取得した D N Aがそれぞれの遺伝 子であることが確認された。 表 1 相同性 （％)
D N A タンパク質 セルラーゼ 7 0 6 9
0 R F 2 3 8 1 9
b c s A 9 2 9 4
b c s B 6 2 5 4
b c s C 8 3 7 3
b c s D 9 6 9 9
また、 セルロース合成酵素遺伝子の下流に存在する遺伝子について、 Gen Bank Data Baseにおいてホモロジ一検索を行なったところ、 Y. Kas hi agiら、 丄 Ferment. Bioeng. 、 7 8巻 3 9 4 — 3 9 8頁 （ 1 9 9 4 ) に報告されている Cel Ivibrio gi Ivus の） 8—グルコシダーゼの遺伝子 と、 D N Aで 4 9 %、 タンパク質で 3 3 %と高い相同性を示すことを見 出し、 この遺伝子がァセ トバクターにおける β—グ'ルコシダーゼ遺伝子 であることを確認した。 尚、 ーグルコシダーゼ遺伝子の翻訳開始コ ド ンは、 D Ν Α塩基配列上におけるシャイン . ダルガノ配列 （Shine- Dal g arno sequenceゾの |ϋ置（こ基づき决定した。 以下に配列番号 ： 1 の塩基配列中の各遺伝子の位置を示す。 表 2
塩基配列 セルラーゼ遺伝子 8 6 9〜 1 8 9 4
0 R F 2遺伝子 1 8 9 1 〜 2 9 2 5
b c s A遺伝子 3 1 0 1 〜 5 3 7 1
b c s B遺伝ナ 5 3 7 3〜 7 7 8 1
b c s C這伝十 7 7 8 4〜 1 1 7 6 4
b c s D這伝ナ 1 1 7 6 4〜 1 2 2 3 4
β一グルコシダ一ゼ遺伝子 1 2 4 4 8 - 1 4 6 5 5
実施例 2. 3—グルコシダーゼ （ G 3 a s e ) の精製
Acetobacte r xyl mum subsp. sucrof ermentans B P R 2 0 0 1 株 ¾· C S L - F r u培地で内容積 3 I 、 培養液張り込み量 1 . 8 I のジャー ファーメンターで培養した。 培養温度は 3 0 °C、 培養 p Hは 5、 培養時 間は 6 8時間であった。 得られた培養液 （合計約 8， 0 0 0 ml) を遠心 分離することで培養上清 3 , 6 0 O mlを得た。 この培養上清を 6 0 %飽 和硫酸アンモニゥ厶で塩析し、 得られた沈殿を遠心分離で回収し、 3 5 2 mlの蒸留水に溶解した。 この溶解液を蒸留水 1 5 I に対して透析した 。 この際、 透析物中に沈殿が発生したので、 この沈殿を回収し、 0. 1 5 Mの N a C I を含んだ 2 0 mM酢酸ナ トリゥムバッファー （ p H 5. 5 ) で 3回抽出した。 この抽出液に G 3 a s e活性が含まれていた。 この 抽出液を 0. 1 5 Mの N a C I を含んだ 2 0 mM酢酸ナ 卜リゥ厶バッファ - ( p H 5. 5 ) で平衡化した C M— トヨパール 6 5 0 Mカラム （東ソ 一製 ： カラムサイズ直径 3. 2 cm、 長さ 1 3. 3 cm) に添加し、 G 3 a s e活性を吸着させた。 次いで、 0. 1 5 1\1から 0. 7 MまでN a C I 濃度をリニアグラジェン 卜した。 G 3 a s e活性は 0 . 4 5 〜 0. 5 5 M N a C I で溶出した。 得られた活性フラクショ ンを限外濾過膜 （ミ リポア製、 ウルトラフリー 1 5、 分画分子量 5 , 0 0 0 ) で濃縮し、 そ のフラクショ ンを 0. 1 5 Mの N a C I を含んだ 1 0 mM酢酸ナ ト リウム バッファー （ P H 5. 5 ) で平衡化した トヨパール H W 5 5 Sカラム （ 東ソー製 ； カラムサイズ直径 1 . 5 cm、 長さ 4 8 cm) に添加した。 得ら れた活性フラクシヨ ンに N a C I を最終濃度が 1 . 5 Mになるように添 加し、 1 . 5 Mの N a C I を含んだ 2 0 mM酢酸ナ ト リウムバッファー （ p H 5. 5 ) で平衡化した Butyl — トヨパール 6 5 0 Mカラム （東ソ一 製 ； カラムサイズ直径 1 . 5 cm、 長さ 4 cm) に添加し、 同バッファーで 洗浄後、 1 . 0 Mの N a C I を含んだ 2 0 mM酢酸ナ トリウムバッファー ( p H 5. 5 ) で溶出した。 この活性フラクショ ンをセフアデックス G 2 5 P D - 1 0 カラム （ファルマシア製） で 0. 1 5 Mの N a C I を含 んだ 2 0 mM酢酸ナ トリウムバッファー （ p H 5. 5 ) にバッファー交換 したものを集めて精製標品を得た。 この精製標品は S D S—ポリアク リ ルアミ ド電気泳動的に単一であった。 比活性は 8 4 O U/mg—タンパク、 精製倍率は 3 3 7倍、 回収率は培養上清の全酵素活性を 1 0 0 %とする と 5. 5 %であった。
尚、 ーグルコシダーゼ （ G 3 a s e ) の活性は次のように行った。
2 n I の酵素溶液に 2 ^ I の 1 % (w/v)のセロ ト リオース （G 3 ； 生化 学工業製） 溶液、 ならびに 2 / I の 0. 3 % (v/v)の Triton X- 100 (Si gma 製） を混合し、 3 0でで 2時間反応後、 グルコース測定キッ 卜 （GI ucose C IIテス トヮコ一 ； 和光純薬製） の反応液 3 0 0 I を添加し、 1 5分室温反応後、 5 0 5 nmの吸光度から、 グルコース量を求めた。 1 活性単位 （U ) は G 3から 1 mol のグルコースを、 3 0 °C、 2時間で 生成するのに必要な酵素量と定義した。
実施例 3. ;8—グルコ シダーゼ （G 3 a s e ) 精製標品の分子量と等電
S D S —ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法 （SDS- PAGE) による / S— グルコシダーゼ （G 3 a s e ) の精製標品の分子量は約 81， 200であった (図 2 ) 。 また、 等電点ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法 （IEF- PAGE ) による等電点 （pi) は約 6. 0であった （図 3 ) 。
実施例 4. β —グルコシダーゼ （G 3 a s e ) の N末端アミノ酸配列
S D S —ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法 （SDS- PAGE) により、 β -グルコシダーゼ （ G 3 a s e ) を分離後、 P V D F (ポリ ビニリデン ジフルオリ ド） 膜にエレク トロブロッテイ ングし、 クーマシーブリ リア ン卜ブル一で染色し、 β—グ'ルコシダーゼ （G 3 a s e ) のバン ドを可 視化した。 そのバン ドの部分を切り出したものをサンプルとし、 自動ァ ミ ノ酸シーケンサ一 （Hewlett Packard 社製、 HP G1005A)で N末端アミ ノ酸配列分析を行った。 結果は、 RHAHDGGGDQADARARQVLASMSLEDKMS (ァ ミノ酸は 1文字表記） であった。 この配列は、 配列番号： 1 に示される βーグ'ノレコシダーゼ （G 3 a s e ) 遺伝子から推定されるアミノ酸配列 (配列番号： 7 ) の 2 7番目の R (アルギニン） 以降の配列と完全に一 致した。 すなわち、 この —グルコシダーゼ （G 3 a s e ) 遺伝子には 2 6アミノ酸残基よりなるシグナル配列が存在していた。
実施例 5. p H -温度の影響
8—グルコシダーゼ （ G 3 a s e ) の p Hに対する安定性について調 ベた。 β —グルコシダーゼ （ G 3 a s e ) を各 で、 3 0 °C、 3時間 処理し、 残存する酵素活性を調べたところ、 8 0 %以上の残存活性を示 す p H域は ρ Η 3 · 6〜了 . 0であり、 失活する ρ Ηは ρ Η 3以下およ び ρ Η 8以上であった。 また、 活性の至適 p Hは約 5. 5であった。 一 方、 —グルコ シダーゼ （G 3 a s e ) の温度に対する安定性について 調べた。 —グルコシダーゼ （G 3 a s e ) を各温度で p H 5. 5、 3 0分処理し、 残存する酵素活性を調べたところ、 3 0 °C以下で安定であ リ、 5 0 °C以上で失活した。 活性の至適温度は約 4 0 °Cであった。
実施例 6. 金属イオン '化学薬剤の影響
各種金属イオンおよび化学薬剤 1 mM存在下における β —グル Ώシダー ゼ （G 3 a s e ) 活性の影響を調べた。 結果を表 3に示した。 金属ィ才 ンについては、 Hg + +イオンは若干活性は低下 （無添加を 1 0 0 %とした とき 8 5. 5 %) させたが、 その他の金属イオンは大きな影響を与えな かった。 一方、 化学薬剤においては、 N B S ( N—プロモスクシイミ ド ) は活性を完全に失活させた。 S D S (ドデシル硫酸ナ トリウム） も部 分的に失活させた （ 3 1 . 3 %) 。 一方、 S H基修飾剤である 2 — M E ( 2 —メルカプトエタノール） 、 I A A (ョー ド酢酸） 、 及び金属キレ 一卜剤である E D T A (エチレンジァミ ン四酢酸） は影響を与えなかつ
表 3. 金属 · 化学薬剤に対する影響
Compound ( 1 mM) Relative activity(%)
N o n e 1 0 0
C a C I z 1 0 0
Figure imgf000017_0001
C u S 04 1 1 5.
H g C I 2 8 5.
E D T A 1 0 0
N B S 0
1 A A 1 2 6 5
S D S 3 1 3
2 M E 1 0 6
実施例 7. 3—グルコシダーゼ （G 3 a s e ) の基質特異性
セ口才リゴ糖 （セロビオース （G 2 ) 、 セ口 ト リオース （G 3 ) 、 セ ロテ トラオース （G 4 ) 、 セロペン夕オース （G 5 ) 、 セ口へキサ才一 ス （G 6 ) ) を基質として、 各基質に対する反応速度パラメ一夕 （ミカ エリス定数 K m 、 分子活性 k。 ） を測定した。 結果を表 4に示した。 β —グルコシダーゼ （ G 3 a s e ) は G 2を基質としたときの K m が他の 基質に比べ非常に大きく、 k。 は非常に小さいことがわかる。 すなわち 、 ーグルコシダーゼ （G 3 a s e ) は他のセ口才リ ゴ糖の分解力に比 ベ G 2の分解力が非常に小さいことがわかる。 また、 本酵素は、 glucon ο - δ - lactone および condu r i to I— epox i deにより拮抗的に阻害さ れた （表 5 ) 。 さらに、 高分子のセルロース基質 （C M C (カルボキシ メチルセルロース） 、 リケナン、 B C (バクテリ アセルロース） 、 アビ セル、 P R C (リ ン酸膨潤セルロース） ） に対しては分解力が非常に小 さかった （表 6 ) 。 表 4. G 3 a s eの Km 、 k。
Subst rate Km (mM) k。 （sec—')
G 2 2 2 1 . 7 5 3 8
G 3 3. 7 3 2 9 8
G 4 2. 7 0 3 6 9
G 5 1 . 4 9 3 2 1
G 6 1 . 3 1 3 1 0
表 5. 阻害物質定数
Inhibi tor Ki (mM) Type
G I ucono — δ — lactone 0 6 Compet i t i ve Condur i to I— ^ epoxide 0 0 Compet i t i ve
表 6. セルロース基質との反応性
Subst rate G 3 a s e
Reaction time
2 hi 2 4 hi
C M C 0 0. 1
し i chenan 0 0. 2
B C 0 0
Av i ce I 0 0
P R C 0. 1 0. 2
Ce I I ob i ose 0. 4 5. 2
Ce I I ot r iose 1 3. 1 1 7. 5
Ce I I ohexaose 2 4. 3 2 8. 2
数値は添加した各基質の全量に対する生成したグルコースの量のパー センテージを表わす。 産業上の利用可能性
ァセ 卜パクター属に属する微生物からセルロース合成に関与する新規 な遺伝子及び遺伝子群を取得し、 その塩基配列を決定した。 これらの遺 伝子及び遺伝子群は、 遺伝子工学的に微生物を形質転換させ、 該形質転 換菌を利用してセルロースを生産させる手段として有用である。
〔配列表〕
配列番号： 1
GGATCCACTGGCGCGGCGCATCACGGCGCGGCTGGTGCTGGGGCACCCCTGAACACAAAT 60
GCGGGGCGTGCGTGATTCTTTGOTGCATGCCCCCGCAACATCGCCTAGAAGGCGGCTAC 120 CGGCCTTTTGTCCCGnCGTCTAGAGGCCTAGGACACTGCCCTCTCACGGCGGCAACAGG 180
GGTTCGAATCCCCTACGGGACGCCAGCCAGTTCTGGCTGAATAAAAGACTGACTGATGAA 240
MCCCGCCGCMGGCGGGTTTTTCGTATGTACTTCGTm TTATAAATATCTTTGACCA 300
G GCCTGTCTGCGCTATGGCMGGC CTTTAT TATAnAATATATAATAAAAGCATC 360 mTATACTGCGGTCTGCCCGTCTGCTAAAAAGCA GATCCAGATCAATCGCGTCTGAA 420
ATTTAA ATATTTTCCGTCTn MTTTTGCAAAAGATGACACCAGTAGTGMCGGCGA 480
TCGT TGCCATATTTCTCTTCTTTMTTTCC TAGGM ATCMCGGTTTTTACAGAGG 540
GCCAmGCCCCTGCGTGACAAA TGC CTTTTTCTTCCCTGTAGCCAGnGTGGCGC 600
TGGTGGCGGTTTCGCCGCTGGGGGGAGAGACGTTATGCTCCTTTTCAGTMTAAAGTCTG 660
TCCCGGMTGGTCGCCTTCGACTTGCAGGATGGAGGAGTTTCCGATTMGGCGTCATGGC 720
GTGGCAGGGTATTGAGGGCGCATCAGGCGTTCGGCCAGACACTGGCGTGGGTTCAGACTT 780
CnGAGGGTGTGGTGGTAGATGCTGTOGATTTTATGAAGCTGCAAAAACATGTATCCGG 840
GATGGGGCGTCGCTCCmCTGTCCGTCATGGCTGTGGCTGGCAGCT TCCCATGCTTTC 900
CMCase
CTCCGGCGCTGAAGCTGATGATGCCATTGGCATCAACCCGCAGATCGCCCAGCAGTGGGC 960
CATmCCGGGAC GTATTTTCATCCCAACGGGCGCATCATCGATACGGGCAATAGCGG 1020
CGAATCCCACAGCGAGGGGCAGGGCTACGGCATGCTCTTTTCCGCTGCGGCGGGCGACCA 1080 GGCGGCGTOGAGGTAATCTGGGTCTGGGCGCGCACCAACCTGCAGCACAAGGATGACGC 1140
CCTGTTCTCCTGGCGnACCTTGACGGGCACAAACCGCCCGTGGCCGACAAGAACAACGC 1200
AACCGACGGGGACCTGCTCA GCCCTCGCCCTGGHTGGGCCGGCMGCGATGGMGCG 1260
CGCCGACTATATOAGGACGCCATGAACATCTATGGCGACGTGCTGAAACTCATGACGAA 1320
GTCCGTCGGCCCCTACACGGTGCTGCTGCCGGGCGCTGTCGGGTTTCTCACCAAGGATAC 1380
GGTCACGCTGAACCTGTCCTATTACGTCATGCCCTCCCTCATGCAGGCCTTTGCGCTCAC 1440
GGGTGATGCGAAGTGGACAAAGGTGATGGGCGACGGGCTGCAGATCATCGCCAAGGGACG 1500
ATTCGGTGAATGGAAGCTCCCGCCGGACTGGCTGTCGATCAACCTGCATACCAACGCOT 1560
CTCCATTGCCAAGGGCTGGCCGCCGCGC CTCGTATGATGCGATTCGCGTGCCGCTCTA 1620
CTTGTOTGGGCGCATATGCTGACCCCGGAACTGCTGGCGGATTTCAGCCGGTOTGGAA 1680
CCAmTGGCGCATCCGCCCTGCCGGGCTGGGmATCTGACCAACGGCGCGCGnCGCC 1740
CTATAATGCGCCGCCGGGCTATCTGGCGGTGGCGTCATGCACGGGCCTGGCCTCGGCGGG 1800
TGAACTGCCCACGCTCGATCATGCGCCCGACTACTATTCGGCCGCGTTGACGATGCTGGC 1860
CTATATCGCCCGGAACCAGGGAGATGGGATGTGAGCACACCTGAAAAGGAAGCAGGAACG 1920
CMCaseORF2
CAGGTGAATATCGACAACCAGCAGGATGTCGACCGTATGCTGACGGATGGCTACGGTATC 1980
AGCAGTGCAGGTTTTCACTACCGCCCTTTCAAGCAGAAGCGCCCGCCCAGGCCAGAAGTC 2040
AGGCACGACGAGTCTGGCGCAGAGCAGGCCGCAGCAGCCGAGCACGCTCCTGCCGCTGAA 2100
GAAGCATCGCAGCATTTCGTTTOTCCTACGATGATACCTATTCCACCCCGGCAGCGCCT 2160 GAGGCTGCGCCTGnGAGGCAGCAGAACAGCCGCAGCACTACGGGGAAACAGCCTACACG 2220
CCTGCCGCGCATGATGCCTATGCCGCACAGCCGGAGCCGGAACAGGCCGCGCCCGAGCCT 2280
TATC^GCGCATGACGATACGCCCGCAGCCGAACCCGAGACCTATGCCGCCACGCACGCC 2340
GAAACCGTAACGGTTCCGGAATATGCGGCCGCCCCTCAGCCAGTTGCGACCCCCGTGCCG 2400
CCGCAGCCCGCGCCCGTGGCCCCGGnGnGCTGCCGTGGCGCAGCCGGTCAGGCAGGAG 2460
CGGCCCTCATTGTCGCCAGTGACGCCCCCCAAACCTGCGGTGTCTOOTCATGGCGCCC 2520
CGTCCTGCCCCGGCmTGGCTCGGCTTCAGCCACGCCCCCCATCGCAGCAGAGGACTGG 2580
GCCCCCGTGCCCAAGGCCCAGCAGCAGCGTGGGCAGCGTTTGACAGGGCCAGGCTOTTT 2640
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CTTTGTTTCATCTGCGAACTGACCGGTGGGAGCGCCGAGACCAGTATCGAGACATCGGAG 16440
AnGGCTGGTTTGCAGCCGACAGCCTGCCTACCGACTTGTCGCTTGGGCGCGTGCTGCCC 16500
CATCAGCTGACCCGCATGTTAGAACATGCCGCCAACCCCGACCTGCCCAGGGATTTTGAT 16560
TAAAATCGTTTAAAGACMTGTAnGGTGAAAGCAGGAAAGGTTnTGGGTGTCGCCTTT 16620
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CGGGCGCTGTGCATGCAGGCCATTGAAAAACCGACCGGGATTTCCATATCCAATACAAAT 16740
TGTAACCTGATGCAGTGCAACAGACAGACTGGATAAGCCATGACCGAACAGACCACCACG 16800
ACCCCACCCGAAGCCACGGGCGAACAGCATGAAnC
配列番号： 2
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配列番号： 5
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§己列番号： 6
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配列番号： 7
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Claims

請 求 の 範 囲
1. ァセ 卜パクター ' キシリナ厶 ■サブスピーシーズ ' シュクロファー メンタンス由来のセルロース合成酵素複合体を構成する夕ンパク質をコ 一ドする遺伝子。
2. 以下の （ a ) 又は （b ) のタンパク質をコー ドする遺伝子。
( a ) 配列番号： 2〜配列番号 ： 5のいずれか一つに示されたアミノ酸 配列から成るタンパク質。
( b) アミノ酸配列 （ a ) において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、 且つセルロース合成 酵素活性を有するタンパク質。
3. 以下の （ a ) 又は （b ) の D N Aから成る遺伝子。
( a ) 配列番号： 1 に於いて b c s A、 b c s B、 b c s C又は b c s
Dで示された塩基配列から成る D N A。
( b ) ( a ) の塩基配列から成る D N Aとス ト リ ンジ： i:ン 卜な条件下で ハイブリダィズし、 且つ、 セルロース合成酵素活性を有するタン パク質をコードする D N A。
4. ァセ トバク夕一■ キシリナム · サブスピーシーズ . シュクロファー メ ン夕ンス由来のセルラーゼをコ一ドする遺伝子。
5. 以下の （ a ) 又は （b ) のタンパク質をコー ドする遺伝子。
( a ) 配列番号： 6に示されたアミノ酸配列から成るタンパク質。
( b ) アミノ酸配列 （ a ) において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、 且つセルラーゼ活性 を有する夕ンパク質。
6. 以下の （ a ) 又は （b) の D N Aから成る遺伝子。
( a ) 配列番号： 1 に於いて C M C a s eで示された塩基配列から成る D N A。
( b) ( a ) の塩基配列から成る D N Aとス トリ ンジ Iン卜な条件下で ハイブリダィズし、 且つ、 セルラーゼ活性を有するタンパク質を コ一ドする D N A。
7. ァセ トバクター属に属する微生物由来の 一グルコシダーゼをコ一 ドする遺伝子。
8. 以下の （ a ) 又は （ b) のタンパク質をコー ドする遺伝子。
( a ) 配列番号： 7に示されたアミノ酸配列から成るタンパク質。
( b) アミノ酸配列 （ a ) において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、 且つ ーグルコシダ ーゼ活性を有するタンパク質。
9. 以下の （ a ) 又は （ b ) の D N Aから成る遺伝子。
( a ) 配列番号： 1 に於いて 3—glucosidase で示された塩基配列から 成る D N A。
( b) ( a ) の塩基配列から成る D N Aとス ト リ ンジ I ン 卜な条件下で ハイブリダィズし、 且つ、 —グルコシダーゼ活性を有するタン パク質をコ一ドする D N A。
1 0. 請求項 1 、 2又は 3に記載の遺伝子、 及びその下流 （ 3 ' 末端側 ) に位置する請求項 7、 8又は 9に記載の遺伝子を含む遺伝子群。
1 1 . 請求項 1 、 2又は 3に記載の遺伝子の上流に請求項 4、 5又は 6 に記載の遺伝子及びノ又はグルカナーゼ遺伝子を含む請求項 1 0記載の 這伝子群。
1 2. ァセ 卜パクター属に属する微生物由来の ーグルコシダーゼ。
1 3. 以下の （ a ) 又は （ b) のタンパク質である ーグルコシダーゼ
( a ) 配列番号： 7に示されたアミノ酸配列から成るタンパク質。 ( b) アミノ酸配列 （ a ) において 1 若しく は数個のアミノ酸が欠失、 置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、 且つ —グルコシダ ーゼ活性を有するタンパク質。
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