WO1998038289A1 - β-GALACTOSIDE $G(a)-2,6-SIALYLTRANSFERASE - Google Patents

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WO1998038289A1
WO1998038289A1 PCT/JP1998/000851 JP9800851W WO9838289A1 WO 1998038289 A1 WO1998038289 A1 WO 1998038289A1 JP 9800851 W JP9800851 W JP 9800851W WO 9838289 A1 WO9838289 A1 WO 9838289A1
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WO
WIPO (PCT)
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amino acid
sequence
sialyltransferase
protein
dna
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/000851
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takeshi Yamamoto
Motoko Nakashizuka
Ichiro Terada
Original Assignee
Japan Tobacco Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Tobacco Inc. filed Critical Japan Tobacco Inc.
Priority to EP19980905722 priority Critical patent/EP0915153A4/en
Publication of WO1998038289A1 publication Critical patent/WO1998038289A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1081—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)

Definitions

  • the present invention relates to i3-galactosidic ⁇ 2,6-sialyltransferase and a novel gene encoding the same.
  • the invention further relates to genes encoding novel signal peptides.
  • glycoconjugates such as glycoproteins and glycolipids in animal cells have been revealed one after another, and the importance of sugar chains in glycoconjugates has been recognized.
  • Sialic acid is often present at the non-reducing end of the sugar chain of glycoconjugates, but this sialic acid is important given the importance of the physiological functions and biological consciousness of the sugar chain. It is thought that it has many functions.
  • its chemical synthesis especially the reaction of adding sialic acid to oligosaccharides and complex carbohydrate sugar chains, is difficult, so the method is very simple and high yield without side reactions.
  • An enzymatic method that enables synthesis at a high rate has attracted attention.
  • sialyltransferases are enzymes obtained from organs such as the submandibular gland and liver of animals such as rats, bushus and humans (Poulson et al. J. Biol. Chem. 252, 2356). -2362 (1977), Weinstein et al. J. Biol. Chem. 257_, 13835-13844 (1982), Miyagi et al. Eur. J. Biochem. 126 253-261 (1982)).
  • These enzymes derived from animals are very expensive because they are difficult to purify and cannot be obtained in large quantities, and have the problem that their stability as enzymes is poor.
  • JT0160 Photobacterium damsela JT0160 (hereinafter referred to as “JT0160” in the present specification). Sialyltransferase 0160 produced by JT 0160 (hereinafter referred to as “ST0160”) ) was purified electrophoretically to single.
  • An object of the present invention is to provide a novel gene encoding] -galactoside- ⁇ 2,6-sialyltransferase.
  • Another object of the present invention is to provide an expression vector for a / 3-galactoside- ⁇ 2,6-sialyltransferase protein containing the gene.
  • the present invention further relates to a recombinant / 3-galactosidase using the expression vector. , f "" 1 to provide a method for producing a sialyltransferase protein. It is still another object of the present invention to provide a recombinant / 3-galactoside «2,6-sialyltransferase protein produced by the above method.
  • Another object of the present invention is to provide a gene encoding a novel signal peptide.
  • FIG. 1 shows the structure of pAQI.
  • FIG. 2 shows the structure of pAQN.
  • FIG. 3 shows the construction steps from pAQN to pAQN-EHX.
  • FIG. 4 shows the construction steps from pB STC to pEB STC.
  • Figure 5 shows the construction process from 83 cho 1 ⁇ to £ 83 cho.
  • FIG. 6 shows the structure of the expression vector pEBST.
  • FIG. 7 shows the first half of the base sequence of the b st gene together with the deduced amino acid sequence.
  • FIG. 8 shows the latter half of the base sequence of the b st gene together with the deduced amino acid sequence.
  • FIG. 9 shows the growth of the E. coli MV1184 transformant (A2, B2, C2) containing the expression vector of the present invention.
  • FIG. 10 shows that the crude enzyme obtained from the six transformants in Example 211 (2) had the same activity as ST0160, and thus the enzyme was synthesized using CMP-NeuAc as the sugar donor substrate. It shows the retention time of the reaction product when the reaction was performed.
  • the present inventors have worked diligently, and as a result, use nutrient broth (manufactured by Oxoid) instead of marine broth 222 (manufactured by Defico), which is typically used as a growth medium for JTO160.
  • the inventors succeeded in extracting gene DNA from JTO160 for the first time.
  • the ST0160 protein had various difficulties, including what appears to be toxic to general host cells, but was successfully isolated at last. .
  • the ST0160 protein had the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing described later.
  • the present inventor further created an expression vector containing the obtained gene, and made it possible to express the recombinant ST0160 protein.
  • 3_galactosid ⁇ 2,6-sialyltransferase refers to sialic acid from cytidine monophosphate-sialic acid, galactose in a complex carbohydrate sugar chain or a free sugar chain. It means a protein that has the activity of transferring to the 6-position of a monosaccharide having a hydroxyl group at the 6-position carbon, which is a monosaccharide capable of forming the 6-position of the residue or a glycoconjugate.
  • the optimal ⁇ of this enzyme is in the range of 5-6, the optimal temperature is 30 and the molecular weight is 64,000 ⁇ 5,000 according to the gel filtration method.
  • the monosaccharide capable of forming a complex carbohydrate and having a hydroxyl group at the carbon at the 6-position means, for example, galactosamine, mannose, peracetylgalactosamine mannose and the like.
  • the / 3-galactoside- ⁇ 2,6-sialyltransferase encoded by the gene of the present invention was found in Photopacterium damsela J TO160. However, the same enzymes have been found to be present in Photobacterium damcella ATC C33539 and Photobacterium damsela ATCC 35083, and produce the same enzymes. It is expected that other microorganisms and organisms will be present.
  • the nucleotide sequence of the bst gene determined according to the present invention is shown in SEQ ID NO: 2 and the deduced amino acid sequence encoded by it in FIGS.
  • the gene DNA consists of 2028 base pairs in total from base numbers 1 to 2028.
  • Nucleotide numbers 1 to 3 correspond to the translation initiation genetic code
  • nucleotide numbers 2026 to 2028 correspond to the translation termination genetic code.
  • the sequence (*) of base numbers 2026 to 2028 is TAA, but may be TGA or TAG.
  • the 5 'upstream region of the structural gene described in Figs. 7 and 8 has homology with the E. coli promoter region (110 region and -35 region) and the ribosome binding region (SD sequence).
  • SD sequence ribosome binding region
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acids of the STO 160 protein.
  • the ST0160 protein is composed of a total of 675 amino acid residues, including a signal sequence consisting of 15 amino acid residues (1-15 of SEQ ID NO: 1) and an extracellular region (16-498 of SEQ ID NO: 1). You.
  • the molecular weight of the protein having the amino acid sequence deduced from the b st gene is 76.5 kDa, and the molecular weight excluding the signal sequence is 74.8 kDa. Since the molecular weight of the completely purified ST0160 protein on SDS electrophoresis is about 61 kDa (Japanese Unexamined Patent Publication No.
  • the ST0160 protein can be processed to become an active form, or It is considered that during the purification, proteases in the cells were acting.
  • the C-terminal region of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (497-6675 of SEQ ID NO: 1) has a very high homology of 60% or more with the E. coli phosphate transport system control protein. It is presumed that there are two long ⁇ -helical structures with a short turn structure in the middle between 539 and 594 residues in this region. Normally, the ⁇ -helix constitutes one unit with 18 amino acid residues, but in the case of ST0160 protein, all four amino acid residues constituting one surface are composed of hydrophobic high amino acids.
  • the ⁇ -helix continues two units, and there is also a region on the C-terminal side where amino acids with high hydrophobicity are offset. Other than this region and the signal sequence region present at the ⁇ end, a region that could bind to the membrane was not detected, and it is therefore presumed that this portion is the ST0160 membrane-bound region.
  • the membrane-bound region of cloned animal-derived sialyltransferase is considered to be a transmembrane region located at the ⁇ end, and therefore the membrane-bound mode of ST0160 protein is animal-derived. It is thought to be completely different from that of sialyltransferase.
  • the present invention relates to the membrane-bound region and / or signal of S ⁇ 0160. It is clear that a protein from which at least a part of the null rooster region has been deleted also has enzymatic activity, and such a protein, including the gene encoding it, is within the scope of the present invention.
  • / 3-galactoside_ ⁇ 2,6-sialyltransferase which has been made soluble by removing the membrane-bound region of the ST0160 protein is a preferred embodiment of the present invention and will be described in detail later.
  • the gene of the present invention can be obtained from, for example, a plaque hybrid from a gene library prepared using genomic DNA of JTO160 cultured in eutrient broth (manufactured by Oxoid). It can also be obtained using the diffusion method. Alternatively, it can be easily prepared by a PCR method using a gene library derived from a microorganism or the like as a ⁇ type based on the DNA base sequence determined by the present invention. The thus prepared 3-galactoside mono 2,6 monosialyltransferase gene can be prepared into a mutant by the following method.
  • any DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an enzyme active portion thereof is included in the scope of the present invention.
  • a variant may include conservatively substituted sequences, meaning that a particular amino acid residue may be replaced by a residue having similar physicochemical characteristics. I have.
  • conservative substitutions include substitutions between aliphatic group-containing amino acid residues, such as Ie, 'Va1, Leu or A1a mutual substitution, or Lys and Ay. Substitutions between polar group-containing amino acid residues such as between rg are included.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an enzymatically active portion thereof is modified in such a manner and has 3-galactosidase having the biological activity of i3-galactosidic ⁇ 2,6-sialyltransferase.
  • Mutants of ⁇ 2,6-sialyltransferase are also within the scope of the present invention.
  • DN ⁇ encoding the mutant protein is also included in the scope of the present invention.
  • Mutants obtained by addition, deletion or substitution of amino acid can be prepared, for example, by using D-encoding the same, for example, by site-directed mutagenesis known in the art (for example, Nucleic Acid Research, Vol. 10, No. 20, p. 6487-6500, 1982).
  • the term "one or more amino acids" refers to a number of amino acids that can be added, deleted or substituted by site-directed mutagenesis.
  • Site-directed mutagenesis uses a synthetic oligonucleotide primer complementary to the single-stranded phage DNA to be mutated, except for the specific mismatch that is the desired mutation, as follows: It can be carried out. That is, a strand complementary to a phage is synthesized using the above-mentioned synthetic oligonucleotide as a primer, and a host cell is transformed with the obtained double-stranded DNA. Cultures of the transformed bacteria are plated on agar and plaques are formed from single cells containing the phage. Then, theoretically, 50% of the new colonies contain the phage having the mutation as a single strand, and the remaining 50% have the original sequence.
  • substitution, deletion or insertion of one or more amino acids that do not cause loss of the activity in the amino acid sequence of a biologically active peptide such as an enzyme in addition to the above-described site-directed mutagenesis,
  • Other methods include treatment with a mutagen and selective cleavage of the gene, followed by removal, addition or substitution of the selected nucleotide, followed by ligation.
  • nucleotide sequences falling within the scope of the present invention include those disclosed herein under mild or severe stringency conditions; 3-galactosidase ⁇ 2,6-sialic acid transferase nucleotide sequences. Also included is an isolated DNA and RNA encoding the hybridizing and biologically active monogalactoside-2,6-sialyltransferase. Conditions for mild stringency hybridization are described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, p. 1. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989). Note the stated conditions To taste.
  • Mild stringency conditions included a pre-cleaning solution of 5XSSC, 0.5% SDS, 1. OmMEDTA (pH 8.0) and about 55T, 5XSSC. , —Includes the use of evening hybridization conditions. Harsh stringency conditions include higher temperature hybridizations and washes. At that time, the temperature and the salt concentration of the washing solution are appropriately adjusted according to various factors such as the length of the probe. Preferably, the condition is 5XS SC or less and 20 or more.
  • the present invention provides an expression vector containing a gene encoding / 3-galactosid ⁇ 2,6-sialyltransferase, and culturing host cells containing these expression vectors under conditions suitable for expression of the gene.
  • the present invention also provides a method for producing a 3-galactoside- ⁇ 2,6-sialyltransferase protein by recovering the expressed recombinant protein.
  • a mammal, a microorganism, a virus, or an insect is used in an expression vector selected according to the host cell to be used.
  • regulatory sequences include transcriptional promoters, operators, or enhancers, mRNA ribosome binding sites, and appropriate sequences that control the initiation and termination of transcription and translation.
  • Suitable host cells for expression of ⁇ -galactoside- ⁇ 2,6-sialyltransferase protein include prokaryotic cells, yeast or higher eukaryotic cells.
  • Suitable cloning and expression vectors for use in bacterial, fungal, yeast, and mammalian cell hosts are described, for example, in Pouwels b, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985).
  • Prokaryotes include gram negative or gram positive bacteria, for example, E. coli or Bacillus subtilis.
  • a prokaryotic cell such as E. coli is used as a host
  • 3) -galactoside- ⁇ 2,6-sialyltransferase protein is used to facilitate the expression of the recombinant polypeptide in prokaryotic cells. It may include a terminal methionine residue. This The N-terminal Met of can be separated from recombinant 0-galactosidic ⁇ 2,6-sialyltransferase protein after expression.
  • Expression vectors used in prokaryotic host cells generally contain one or more phenotypic selectable marker genes.
  • a phenotype selectable marker gene is, for example, a gene that confers antibiotic resistance or auxotrophy.
  • suitable expression vectors for prokaryotic host cells include commercially available plasmids such as pBR322 (ATCC 37017) or those derived therefrom. Since PBR 322 contains genes for ampicillin and tetracycline resistance, it is easy to identify transformed cells. Suitable promoters and / 3-Garakutoshido alpha 2, DNA sequences of the 6-sialyltransferase gene are inserted into the p BR 322 vector.
  • Other commercially available vectors include, for example, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) and pGEMl (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, USA).
  • Promoter sequences commonly used in expression vectors for prokaryotic host cells include the tac promoter, / 3-lactamase, lactosepromoter (Chang et al., Nature 275). : 615, 1978; and Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979).
  • Particularly useful prokaryotic host cell expression system phage AP L promoter - used evening first and c I 857 ts thermolabile repressor sequence.
  • AP L promoter in plasmid vector one available from evening have taken up one derivative Amerikan Type Culture Korekushiyon, (resides in E. coli strain JMB 9 (ATCC 37092)) plasmids PHUB2 and PPLc 28 (E. coli RPI (A In TCC 53082).
  • the present inventors have also found that the presence of the tac promoter at a position slightly away from the translation initiation codon of the bst gene (for example, for several bases) weakens the regulation of expression.
  • the distance between the promoter and the translation initiation codon can be changed as appropriate by conventional means.
  • the recombinant i3-galactoside ⁇ 2,6-sialyltransferase protein may be expressed in yeast host cells.
  • Saccharomyces eg, S. cerepiche
  • yeast vector contains the sequence of the origin of replication from the two yeast plasmids, the autonomously replicating sequence (ARS), the promoter region, the sequence for polyadenylation, the sequence for transcription termination, and It often contains the Kerr gene.
  • ARS autonomously replicating sequence
  • yeast ⁇ -factor leader sequence the secretion of recombinant (3) 1-galactosidic ⁇ 2,6-sialyltransferase protein can also be carried out.
  • Other leader sequences suitable for promoting secretion of the recombinant polypeptide from a yeast host are also known. Methods for transforming yeast are described, for example, in Hinnen et al., Pro atl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978.
  • Mammalian or insect host cell culture systems can also be used to express recombinant) 3-galactosido ⁇ 2,61-sialyltransferase protein.
  • Cell lines of mammalian origin can also be used.
  • Transcriptional and translational control sequences for mammalian host cell expression vectors can be obtained from the viral genome. Commonly used promoter sequences and enhancer sequences are derived from poliovirus, adenovirus 2 and the like.
  • Expression of structural gene sequences in mammalian host cells using SV40 viral genomes e.g., DN ⁇ sequences derived from SV40 origin, early and late promoters, enhancers, splice sites, and polyadenylation sites
  • Other genetic elements may be provided for Expression vectors for use in mammalian host cells can be constructed, for example, according to the method of Okayama and Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983).
  • One method for producing the [3] -galactosidic ⁇ 2,6-sialyltransferase protein of the present invention is to convert a / 3-galactoside- ⁇ 2,6-sialyltransferase protein. This involves culturing a host cell transformed with an expression vector containing the encoding DNA sequence under conditions in which the protein is expressed. Next, i3-galactosidase ⁇ 2,6-sialyltransferase protein is recovered from the culture medium or the cell extract depending on the expression system used.
  • the present invention provides a soluble] 3-galactosidase ⁇ 2,6-sialyltransferase protein and a gene encoding the protein.
  • Soluble 3_-galactosidic ⁇ 2,6-sialyltransferase protein contains all or part of the extracellular domain of natural / 3-galactosidic ⁇ 2,6-sialyltransferase protein, It lacks a membrane-bound region that allows the peptide to remain on the cell membrane. For example, in the case of the ST0160 protein described above, a part or all of the amino acid residues 499 to 675 can be deleted to make it soluble.
  • Soluble / 3_galactosid ⁇ 2,6-sialyltransferase protein may also contain a naturally occurring or heterologous signal peptide to promote secretion initially when synthesized. Is released from cells as soon as the galactosidase ⁇ 2,6-sialyltransferase protein is secreted.
  • the present invention relates to a soluble protein from which all or part of the membrane-binding region and / or the signal peptide region has been deleted, as long as it retains the activity of / 3-galactosidic ⁇ 2,6_sialyltransferase. include.
  • the soluble 13-galactoside- ⁇ 2,6-sialyltransferase protein may include a part of the membrane-bound region or a part of the cytoplasmic region or another sequence, provided that the protein is secreted. .
  • the signal peptide that secretes the protein may be derived from the host or of a heterologous origin.
  • the amino acid sequence 1-15 of SEQ ID NO: 1 is a truncated form of J3-galactosidic ⁇ 2,6-sialyltransfer, including a soluble protein, one of the more preferred signal peptides.
  • the transfer protein can be prepared using any desired conventional technique. For example
  • the truncated DNA fragment of SEQ ID NO: 2 is digested with restriction endonuclease to form a truncated DNA fragment, which can be isolated by electrophoresis on an agarose gel.
  • digestion with a restriction endonuclease may be performed at a naturally occurring cleavage site, or may be performed on a DNA fragment of SEQ ID NO: 2 to which a linker having a predetermined restriction endonuclease cleavage site has been connected in advance.
  • the DNA sequence encoding the predetermined truncated protein fragment thus isolated can be amplified using the well-known polymerase chain reaction.
  • a stop codon may be inserted at a predetermined location using known mutagenesis techniques, for example, immediately downstream of the last amino acid codon in the extracellular region.
  • the terminal nucleotides can be removed from the DNA fragment using an enzymatic treatment (eg, Ba131 exonuclease) and replaced with a fragment having the desired specific end.
  • an enzymatic treatment eg, Ba131 exonuclease
  • a linker to be used there is a commercially available linker which can be ligated to the blunt end generated by digestion with Ba131, and which contains a restriction endonuclease cleavage site.
  • an oligonucleotide that reconstructs the N-terminus or C-terminus at a predetermined point on the recombinant protein can be synthesized and ligated to the DNA fragment.
  • This oligonucleotide may have a restriction end nuclease cleavage site upstream of the coding sequence for convenience in genetic engineering, and may have an initiation codon (ATG) at the N-terminus for expression in a particular host. May be present.
  • the soluble protein can be obtained by culturing a host cell transformed with the obtained gene and purifying the supernatant, but in order to increase the yield, it is desirable to destroy the cells.
  • a region containing a large number of corresponding amino acids with a small number of codons was selected from a predetermined amino acid sequence, and was prepared based on the nucleotide sequence deduced from the amino acid sequence. The synthesis was commissioned to Japan Bioservice.
  • JTO160 was cultured in nutrient broth (manufactured by Oxoid) for 30 ⁇ and 16 hours. The culture was centrifuged (4 for 10 minutes at 8,000 rpm), and the resulting 3 g of bacterial force was obtained using the Saito-Miura method (Preparetion of transforming).
  • Genomic DNA was purified according to deoxyribonucleic acid by Phenol treatment. Biochem. Biophys. Acta 72, 619-629 (1963)). 50 g of the purified genomic DNA was partially digested with Sau3AI, and the obtained gene fragment was ligated to a ⁇ DASH II / BamHI Yetor Kit (Stratagene). This was packaged using Gigapakll Packing Extracts (Stratagene) to prepare a gene library.
  • Eschrchia coli XL-1 Blue MRA P2
  • the cells were cultured at 37, 150 rpm in an LB medium at -150 rpm. After completion of the culture, ⁇ a culture solution 1 Omm magnesium chloride solution.
  • D. FcIL. was diluted to 0.5. To this diluted solution 600/1, 10 l of the gene library prepared as described above was added, and the mixture was shaken at 37 for 15 minutes. To this, 10 ml of LB-topagarose pre-warmed at 48 was added and stirred, and then layered on the LB-plate pre-warmed at 37. After solidification at room temperature, the cells were cultured at 37 for 8 hours.
  • SM buffer was added and allowed to stand for 15 minutes, after which the topagarose was recovered with the SM buffer by a spatula.
  • the obtained top agarose was centrifuged (4 ° C for 10 minutes at 8,000 rpm), and the centrifuged supernatant was used as the amplified gene library.
  • Probe fluorescent label The synthesized probe was fluorescently labeled using a 3′-oligolabeling kit (Amersham).
  • the repliability of the agarose gel for Southern hybridization was prepared by the following method. -Restriction digested DNA was electrophoresed on a 0.8% agarose gel using TAE buffer. After the electrophoresis, the agarose gel was immersed in a denaturing solution (0.5 M Na ⁇ H, 1.5 M NaC 1) for 15 minutes to alkali-denature the DNA in the gel. Next, the gel was immersed in a neutralizing solution (0.5 MT ris—HC 1 (pH 7.5), 1.5 M Na C I) for 5 minutes to neutralize the alkali.
  • a denaturing solution 0.5 M Na ⁇ H, 1.5 M NaC 1
  • a neutralizing solution 0.5 MT ris—HC 1 (pH 7.5), 1.5 M Na C I
  • This gel was cut with HybondN + cut to the same size as the gel, and then sandwiched between Kim Towels, left at room temperature to transfer DNA to HybondN +, and a replica of the gel was prepared.
  • the obtained replica was washed with 2XSSC buffer and left on a filter paper until it was dried at room temperature. After drying, the replica was baked at 80 for 2 hours.
  • Colony and plaque replicas for colony hybridization and plaque hybridization were prepared by the following methods.
  • Hybon dN + cut to the same size as the plate was placed, and the colonies or plaques were copied to form replicas.
  • the master plate after the replica was stored in step 4.
  • the prepared replica was left on a filter paper soaked in a denaturing solution (0.5 M Na ⁇ H, 1.5 M NaCl) for 5 minutes to alkali-denature the colonies or phages.
  • This replica was neutralized by leaving it on a filter paper immersed in a neutralizing solution (0.5 MT ris-HC1 (pH 7.5), 1.5 M NaCl) for 3 minutes, and further washed with 2XSSC buffer.
  • the treated replica was left on the filter paper until it dried at room temperature. After drying, the replica was baked at 80 for 2 hours.
  • the hybridization was carried out according to the manual of the 3 ′ oligo labeling kit (Amsham) by the following method.
  • the replica was placed in a hybridization bag, and 30 ml of the hybridization solution was placed in the bag and shaken at 43 in a thermostatic water bath for 1 hour to equilibrate. next, To this solution, a fluorescently labeled probe was added so as to have a concentration of 10 ng Zm1, and the mixture was further annealed by shaking for 43 hours in a constant temperature water bath. The following operations were performed in the bat. After the cleaning, the replica was washed with 5 ⁇ SSC containing 0.1% TritonX-100 for 5 minutes at room temperature. This operation was repeated twice. Subsequently, the plate was washed with 1 XSSC containing 0.1% TritonX-100 for 15 minutes at 43 t :. This operation was repeated twice.
  • the replica was further washed with buffer solution 1 (0.1 M Tris-HC 1 (pH 7.5), 1.5 M NaC 1) for 1 minute.
  • buffer solution 1 0.1 M Tris-HC 1 (pH 7.5), 1.5 M NaC 1
  • the replica was immersed in the blocking solution, and shaken at room temperature for 30 minutes> blocking.
  • the plate was washed with buffer solution 1 for 1 minute.
  • the plate was immersed in the antibody solution and shaken at room temperature for 30 minutes to bind the antibody.
  • the detection solution was added, and the mixture was shaken for 1 minute to emit fluorescence.
  • This replica was sandwiched between Kim towels, lightly dehydrated, and placed in a film cassette.
  • the Saran wrap was placed on top of it, and an X-ray film was placed on top of it and left for 15 minutes to expose.
  • the X-ray film was developed using Fuji Medical Film Processor (Fuji Film).
  • the plaque of interest was isolated from the plate, suspended in SM buffer (50 ⁇ l) and stored at 4.
  • the phage extracted with the SM buffer was amplified according to the gene library amplification method described above.
  • the phage DNA was purified from the amplified phage solution using a ⁇ -prep DNA purification kit (Promega) by the following method.
  • Nuclease mix 40 ⁇ 1 was added to 10 ml of the amplified phage solution, and the mixture was stirred and then left at 37 for 15 minutes to decompose the nucleic acid in the solution.
  • 4 ml of a phage precipitant was added and left on ice for 30 minutes to precipitate phage particles.
  • the resulting precipitate was collected by centrifugation (10,000 rpm for 10 minutes at 4), and suspended by adding 5001 phage buffer. This was further centrifuged (15,000 rpm for 5 minutes / 4) to remove insolubles. Add lm 1 to the obtained centrifugal supernatant. Add the purified solution of A to denature the proteins that make up the phage particles
  • the DNA extracted in the purified DNA solution was adsorbed to the resin.
  • This solution was added to the DNA purification column with a syringe, and only the resin was packed in the column. After washing the column with 2 ml of 80% isopropyl alcohol, the resin in the column was dried by centrifugation (12,000 rpm for 20 seconds at 4 ° C). The column was kept at 80 Phage DNA was eluted from the resin by centrifugation (12,000 rpm ⁇ 20 seconds ⁇ 4) with 100 1 of TE buffer added.
  • PUC 19 was cut with HindiII at 37 for 1 hour. Next, this was treated with bacterial alkaline phosphatase (BAP) at 65 for 1 hour, and precipitated with ethanol. The obtained precipitate was washed with 70% ethanol, dried with a speed bag to remove ethanol, and dissolved in sterilized water.
  • BAP bacterial alkaline phosphatase
  • the phage DNA (5 g) was cut with HindiII and subjected to agarose gel electrophoresis. After the electrophoresis, a gel fragment containing the target gene fragment to be hybridized with the probe was cut out by Southern hybridization. DNA was extracted from the cut gel fragment using Gene-I-clean (Funakoshi), and ethanol was precipitated. The resulting precipitate was washed with 70% ethanol, dried with a speed vac to remove ethanol, and dissolved in 10/1 sterile water.
  • the excised DNA (91) was mixed with pUCI9 (11) digested with HindIII and BAP-treated, and the mixture was added with Kara Ligation Kit Solution I (101), followed by stirring. Reacted overnight.
  • Transformation of E. coli MV1184 was performed by the following method.
  • E. coli MV1184 competent cells (1001) stored at -80T: were thawed in ice, plasmid DNA (10 // 1) was added thereto, and the mixture was left on ice for 30 minutes. This was treated with 42 for 1 minute and then left on ice for 3 minutes. To this was added 900/1 of LB medium kept at 37T: and shaken at 37: for 1 hour. After completion of shaking, this solution was applied to LB-ampicillin, IPTG, and X-Ga1 agar medium, and cultured at 37 for 16 hours. Preparation of plasmid DNA
  • the target colony was picked from the agar medium, inoculated into LB-ampicillin liquid medium, and cultured with shaking at 37 ° C for 16 hours. After completion of the culture, the culture was centrifuged (15,000 rpm for 10 minutes at 4) to recover the cells. Plasmid DNA was purified from the obtained cells using a QIAGEN mini-preparation kit.
  • the nucleotide sequences of the plasmid and the gene fragment inserted into the phage were analyzed.
  • a sample for nucleotide sequence analysis was prepared according to the protocol attached to the cy5 autoread sequencing kit (Pharmacia). The analysis of the nucleotide sequence was carried out using an automatic sequencing kit.
  • a sample for base sequence analysis was prepared according to the protocol attached to the Auto Cycle Sequencing Kit (Pharmacia). The nucleotide sequence was determined using an auto cycle sequencing kit.
  • a 0.5 mm long ranger gel was used as a gel for electrophoresis for nucleotide sequence analysis. The electrophoresis was performed under the electrophoresis conditions for a 0.5 wort long ranger gel attached to the sequencer.
  • the amino acid sequence of the ST0160 protein was analyzed, the JTO160 gene library 1 was searched using the probe prepared based on the amino acid sequence, and the bst gene was cloned.
  • Fully purified ST0160 1.5 ml with siliconized 5 / zg (lml) The mixture was collected in a volume tube, and 150 w 1 of a 100% TCA solution was added. This was left on ice for 20 minutes to precipitate the enzyme, and then centrifuged (4 ° C for 15 minutes at 15,500 rpm) to collect the precipitate. The obtained precipitate was washed twice with cold acetone, and dried with a speed bag. To this, 8M urea + 0.4M ammonium bicarbonate solution 251 was added, and further, 45 mM dithiothreitol solution 2.51 was added, and the mixture was incubated at 50 ° C. for 15 minutes to cut the disulfide bond in the protein.
  • the peptide obtained by digesting ST0160 with trypsin was fractionated by the following method.
  • a peptide separation system Smart System (Pharmacia) was used.
  • the peptide separation column used was RPCC 2 / C 18 SC 2.1 / 10 (Pharmacia). After adding the ST0160 trypsin digestion solution to the column, use Solution 1 (0.06% TFA 2% acetonitrile) and Solution 2 (0.052% TFA 100% acetonitrile), starting from Solution 1: 100%, and 180 minutes Then, the peptide was eluted with a concentration gradient such that the solution 2 finally became 50%, and the peptide was separated.
  • N-terminal amino acid sequence of STO 160 and amino acid sequence of peptide obtained by trypsin digestion of this enzyme that is, 9 sequences estimated to be internal amino acid sequence of this enzyme, totaling 10 partial amino acids of STO 160 The sequence was revealed.
  • the obtained amino acid sequence is shown in Table 1 below. table 1
  • sequence (d) corresponding to amino acid residues 258-270 of SEQ ID NO: 1:
  • Probe A having 5′-GCIAAITAIITIGCIGGIACIIIICCIGAIGCICCIAA-3 ′ (SEQ ID NO: 3) was prepared. It should be noted that I is inosine, which can recognize adenine, peracid and cytosine to form a pair.
  • Southern hybridization was performed on the genomic DNA of P. dmsela J T0160 digested with HindIII using the probe A prepared in d. As a result, a DNA fragment of about 2.8 kbp hybridized strongly. Therefore, the genomic DNA was digested with HindIII and subjected to agarose gel electrophoresis, a gel fragment containing a 2.8 kbp DNA fragment was cut out, and DNA was extracted from this fragment. The extracted DNA was combined with pUC19 that had been digested with HindIII and then BAP-treated. E. coli MV 1184 was transformed with the obtained plasmid. Colony hybridization of the resulting colonies was performed, but surprisingly, no colonies hybridizing with probe A were obtained.
  • plaque hybridization was performed using a probe for the genomic DNA gene library of P. dams ela JT0160. Dizziness Done. As a result, seven phages that were thought to contain the bst gene fragment were obtained. Each of these phages was amplified to prepare a phage DNA, and the resulting phage DNA digested with Hind III was subjected to Southern hybridization using probe A. — DNA fragments approximately 1.6 kbp in size were very strongly hybridized in all phages.
  • One strain was selected from the seven strains of phage, and 5 g of the phage DNA was digested with HindIII and subjected to agarose gel electrophoresis. After the electrophoresis, a gel fragment containing a DNA fragment of about 1.6 kbp in agarose gel was cut out, and DNA was extracted from the gel fragment. The extracted DNA was ligated to pUC19 which had been digested with HindIII and treated with BAP. E. coli MV 1184 was transformed with the obtained plasmid. Colony hybridization of the resulting colonies was performed using probe A, and as a result, three strongly hybridizing colonies were obtained.
  • Each of the three strains was picked from an agar medium, inoculated into LB-ampicillin liquid medium, and cultured with shaking at 37 for 16 hours. Cells were collected from the resulting culture by centrifugation, and plasmid DNA was prepared from the cells. The obtained plasmid DNA was digested with HindiII and subjected to agarose gel electrophoresis. As a result, it was confirmed that a DNA fragment of about 1.6 kbp was inserted into the plasmid purified from each strain. The Southern hybridization of the electrophoresed gel was performed using Probe A. As a result, the approximately 1.6 kbp DNA fragment was strongly hybridized. From the above results, it was considered that the bst gene fragment was contained in the DNA fragment of about 1.6 kbp inserted into these plasmids.
  • the nucleotide sequence of the approximately 1.6 kbp DNA fragment inserted into the plasmid obtained in the above g was analyzed using an ALF red DNA sequencer (the nucleotide sequence in FIGS. 7 and 8 minus 361 to 1244).
  • ALF red DNA sequencer the nucleotide sequence in FIGS. 7 and 8 minus 361 to 1244.
  • the sequence starting from the second Asn residue in the N-terminal amino acid sequence of ST0160 matches the sequence from the 17th position of the obtained ORF, and as estimated in c, the N-terminal amino acid of STO160 The sequence was found to start at the Cys residue. Further, when the hydrophobicity / hydrophilicity of the obtained ORF was analyzed, a region having extremely high hydrophobicity was present on the N-terminal side of the ORF. In addition, two positively charged Lys residues were present immediately after the first Met residue of this ORF. Since this was a typical signal sequence structure, the sequence consisting of 15 amino acid residues from this Met residue to the 16th Cys residue is the STO 160 signal sequence. It was estimated.
  • sequence primers Two types of sequence primers having the following were prepared. Using these primers, sequencing was performed on phage DNA that was thought to contain the bst gene fragment obtained in If. As a result, it was possible to determine the nucleotide sequence up to about 150 bp downstream of the HindIII of pBSTN on the 3 ′ side.
  • Probe B having The phage DNA was digested with HindIII, subjected to agarose gel electrophoresis, and subjected to Southern hybridization using a fluorescently labeled probe B. As a result, a gene fragment of about 1.2 kbp hybridized very strongly with probe B.
  • 5 g of the phage DNA was digested with HindIII and subjected to agarose gel electrophoresis. After the electrophoresis, a portion containing the 1.2 kbp DNA fragment in the agarose gel was cut out, and DNA was extracted from the gel. The extracted DNA was combined with pUC19 that had been digested with HindIII and then BAP-treated, and E.coli MV1184 was transformed with the obtained DNA. The colony hybridization of the resulting colony was performed using probe B, and five strongly hybridized colonies were obtained.
  • the obtained colonies were picked from an agar medium, inoculated into LB_ampicillin liquid medium, and cultured with shaking at 37 ⁇ for 16 hours.
  • the cells were collected from the resulting culture by centrifugation (4, 15,000 rpm, 30 seconds), and plasmid DNA was purified from the cells.
  • the resulting plasmid DNA was digested with Hind III and subjected to agarose gel electrophoresis.It was confirmed that the plasmid DNA purified from each colony had a DNA fragment of about 1.2 kbp inserted.
  • Southern hybridization of this agarose gel was performed using Probe B. As a result, all of the DNA fragments of about 1.2 kbp hybridized strongly with Probe B.
  • the nucleotide sequence of the approximately 1.2 kbp DNA fragment obtained in a) above was analyzed using an ALF red DNA sequencer.
  • a long ORF consisting of 262 amino acid residues from one Hind III was present.
  • a stem-and-loop structure consisting of a 10-bp stem and a 7-bp loop was present at the 3 'downstream of this ORF. From the above results, the ORF of this gene fragment was considered to be on the C-terminal side of the structural gene of the bst gene (base sequence 1239-1348 in FIGS. 7 and 8), and this plasmid was named pBSTC.
  • the sequence of Hind III existing inside this bst gene was G AAGCT: LC including the outer base, and had a palindromic structure. Most of the sequences of restriction sites and methylation sites are palindromic, and this GAAGCTTC!
  • the sequence of 8 bp was presumed to be a recognition sequence of DNA methylase of JTO160. Note that the sequence of the HindIII portion present at both ends of the bst gene is 880 and 8000, and these sites are not methylated because they are not palindromic sequences. It is thought that it was cut by nd i II.
  • restriction enzymes that recognize a 6 bp nucleotide sequence
  • they are frequently used for conducting genetic engineering research.
  • a restriction enzyme that recognizes an 8 bp sequence has been demanded.
  • the only restriction enzyme that recognizes the 8 bp sequence currently on the market is Not I.
  • many bacteria have both a DNA methylase and a restriction enzyme that recognize the same sequence as a host defense mechanism. JTO160 was considered to have a DNA methylase that recognizes an 8 bp sequence, and it was therefore presumed that this bacterium might also have a restriction enzyme that cuts this sequence.
  • JTO160 was considered to have a DNA methylase that recognizes an 8 bp sequence, and it was therefore presumed that this bacterium might also have a restriction enzyme that cuts this sequence.
  • the development of a novel restriction enzyme that recognizes this 8 bp sequence is extremely beneficial Is expected.
  • sialyltransferases mainly from animals, have been purified and cloned.
  • sialyl motifs There are two highly homologous regions in the amino acid sequence of animal-derived sialyltransferases, regardless of their origin or type, and are called sialyl motifs.
  • No highly homologous regions were found between the deduced amino acid sequence of STO16 obtained this time and the amino acid sequence of rat-derived i3-galactoside ⁇ -2,3 sialyltransferase.
  • a region having high homology with the sequence of the above-mentioned serial motif was not found.
  • a long open reading frame ( ⁇ RF) contained in a gene fragment cloned separately into pBSTN and pBSTC was obtained by using a sialyltransferase derived from Phot ob acteri urn dams ela JT 0160.
  • Encoding proves that the gene is a bst gene.
  • the gene is inserted into an expression vector, expressed in E. coli, and the gene product is analyzed.
  • the function of the region presumed to be involved in membrane binding at the C-terminus of this structural gene will be analyzed.
  • the 2.8 kbp Hind III fragment which was estimated to contain this gene in Southern hybridization, could not be inserted into pUC18, and the 1.6 kbp and 1.2 This gene was presumed to be a lethal gene for Escherichia coli, since it could be cloned as two kbp HindIII fragments.
  • PAQN obtained by modifying pAQI was used as one of the vectors on which the expression vector was prepared.
  • the structure of pAQI is shown in FIG. 1, and the structure of pAQN is shown in FIG.
  • This plasmid has a gene encoding aqualysin I (aqu I gene) between EcoR I immediately after tac promoter overnight and Hind III immediately before rrn BT1T2 .
  • the aqu I gene has 10 unique restriction enzyme sites in this plasmid, including EcoRI and HindiII, which are advantageous for genetic manipulation.
  • this plasmid has 1 ac Iq in the plasmid that controls the tac promoter, and suppresses the tac promoter more strongly than in a normal system, so it was considered suitable for the purpose of this example. .
  • the pAQI was extracted from 81 ) 2305 cultured overnight at 1.37 using the 01800 Spin Plasmid Kit (QIAGEN).
  • the pMBALl was subjected to point mutation with the following primers, AccIII, BamHI.Bglll was inserted into the EcoRI-Xbal site of the aqua lysin gene, and Xmalll and Kpnl were deleted. ( ⁇ ⁇ )
  • the EcoRI-Xbal site of ⁇ was excised and inserted into the EcoRI-Xbal site of the plasmid excised from the EcoRI-Xbal site of the aqualysin gene of pAQI ⁇ .
  • PAQN The construction of the bst gene expression plasmid pEBST was carried out using pATN, since the gene fragments contained in pBSTN and pBSTC are both HindIII fragments, as described below. The promotion was introduced downstream of Yuichi. At this time, the original promotion of the bst gene was completely removed.
  • the restriction enzyme sites of pAQN are arranged in sequence from EcoRI, BglII, Xbal, HindiII immediately after the tac promoter. , Hindi II, and XbaI.
  • the HpaI site base sequence 2201-2206 in FIGS. 7 and 8) downstream of ⁇ RF contained in pBSTC was modified to Xbal, and ⁇ RF containing the C-terminal portion was modified pAQ It was inserted into N by Xba I—Hind III.
  • an EcoR I site was inserted upstream of the Met at the N-terminus of the ORF contained in pBSTN, and the ORF containing this N-terminal portion was inserted into pAQN into which the ORF containing the C-terminal portion was inserted.
  • the plasmid was inserted with EcoRI-HindIII to complete the expression plasmid pEBST.
  • a mutant lacking the C-terminal region was also prepared in the same manner.
  • HindII I A 1.2 kbp Hindlll I fragment, which is thought to contain the C-terminal side of STO 160 inserted into pBSTC, was inserted into the HindII I of the M13m18 closing site. At this time, those having the 3 ′ end inserted in the direction of the EcoRI side (ie, Xbal side) of the cloning site were selected (pMBST C in FIG. 4).
  • pMBSTC-HX was cut with HpaI, blunted by treatment with Kleno fragment, and ligated by adding XaI linker.
  • HpaI becomes Xba I (pMBSTC-HX in Fig. 4).
  • pMB STC—HX was cut with XbaI and ligated as it was. By this treatment, an extra XbaI fragment (including the HindIII site) was excised (pMBSTC x in FIG. 4).
  • HindIII-XbaI fragment of pMBSTCAX was inserted into the HindIII-XbaI site of pAQN-EHX to generate pEBSTC.
  • leucine at ORF amino acid residue 539 using primer BST03
  • aspartic acid at position 498 was modified to a stop codon.
  • the resulting plasmids are pMBST CAC 137 and pMB STCAC 178, respectively.
  • three types of stop codons were inserted to completely terminate translation, and restriction enzyme sites were also inserted for easy confirmation of the modification (PshB I and pMB in pMBSTCAC137).
  • pMBSTCAC 137 and pMBSTCAC 178 insert the HindII-XbaI fragment into the HindIII-XbaI site of pAQN-EHX in the same manner as in the case of pMBSTCAX described above. (PEBSTCAC 137 and pEBSTCAC 178, respectively).
  • pMBSTN-E0 and pMBSTN-E7 were each cut with EcoRI and ligated as they were. By this treatment, extra EcoRI fragments (including HindiII) were cut (pMBSTN- ⁇ 0 ⁇ and pMBSTN-—7 ⁇ E in FIG. 5).
  • the expression vector pEBST was constructed by inserting the EcoRI fragment of pMBSTN— ⁇ 0 ⁇ and pBS S_ ⁇ 7 ⁇ ⁇ into the EcoRI—HindiniII site of ⁇ EBSTC (FIG. 6).
  • -E. coli MV1184 competent cells (10 1) stored in -80 were thawed on ice, and the six types of expression vectors (10 / zl) shown in Table 12 were added to the cells for 30 minutes. Leave on ice. This was treated with 42 for 1 minute and then left on ice for 3 minutes. To this, the temperature was maintained at 37, and 900 1 of 8 media were added, and shaken at 37 for 1 hour. After shaking, this solution was applied to LB-ampicillin, IPTG, and X-Ga1 agar medium, and cultured for 37 to 16 hours.
  • the obtained transformants (six types) were cultured in LB-ampicillin-IPTG liquid medium with shaking at 30: and 15 Orpm, respectively, and the growth of the cells and the sialyltransferase activity were measured.
  • the inoculation of the bacterial cells was performed by adding 0.5% of the medium to the medium with glycerol per lactose prepared by the method of (1).
  • the ampicillin concentration in the culture was 100 mg / l, and the IPTG concentration was 0.02 mM.
  • the growth of the cells was monitored by sampling the culture solution over time and measuring the absorbance at 66 Onm.
  • FIG. 9 shows the growth of each of the cells (A2, B2, C2). As shown in Fig. 9, the growth was fast in the order of C series> B series> A series. '
  • the crude enzyme from the cells collect the cells from the culture by centrifugation, suspend the cells in 20 mM cacodylate buffer (pH 5.0) containing 0.2% Triton X-100, and sonicate the cells. Then, the cells were disrupted to obtain a crude enzyme. As shown in Table 3, the enzyme production was also in the order of OB> A.
  • Xia Lil trans Blow Ichize activity is the supply substrate CMP- [4, 5, 6, 7, 8, 9- 14 C ] - metastasized from Ne UAC to Lactobacillus Ichisu a receptor substrate, [ 4, 5, 6, 7, 8, was determined by measuring the 9-14 C] one Ne UAC. Standard reaction mixture of 70 nmol CMP-[4, 5, 6, 7, 8, 9 one 14 C] -Ne u Ac (642cmp / nmol) , 1. of 25 mol lacto Ichisu, and 0. 02% T 2 OmM sodium chloride buffer containing rit on X-100 (pH 5.0)
  • the crude enzyme prepared by the method described in (2) above was partially purified using an ion-exchange column (Q-Sepharose, Pharmacia) or hydroxyapatite (manufactured by Koken Co., Ltd.), and pyridylamination was performed as a sugar acceptor substrate.
  • Enzymatic reaction was performed using CMP-NeuAc as lactose and sugar donor substrate (30 ° C, 6 hours). After the reaction was completed, the enzyme was lost by treating at 100 ° C for 2 minutes. I was alive. Thereafter, the reaction products were analyzed by HPLC.
  • eluent A 10 OmM acetate-triethylamine, pH 5.0
  • eluate B (0.5%, 10 OmM acetate-triethylamine containing n-butanol), pH5 0
  • the pyridylamino sugar chains were sequentially obtained by the linear gradient method (30-35 minutes) and 100% eluate B (35-50 minutes) of 30-100% eluate B.
  • pyridylamino sugar chains were detected by detecting fluorescence (Ex: 320 nm, Em: 40 Onm) under the conditions of a flow rate of 1 ml / min and a column temperature of 40 T :.
  • centrifugation is performed at 100,000 xg, lhr, and the protein present in the centrifuged supernatant is defined as being solubilized. Therefore, strains of the C2 series were cultured in LB-ampicillin-1 IPTG liquid medium with shaking at 30 and 15 Orpm. After completion of the culture, the cells were centrifuged, the cells were collected, and a 20 mM buffer solution was added. The cells were suspended in (pH 5.0) and sonicated to disrupt the cells to obtain a crude enzyme. The cell lysate was centrifuged at 4: 100,000 ⁇ g, lhr, the supernatant was collected, and the sialic acid transfer activity of the supernatant was measured.
  • Xia Lil trans Blow Ichize activity is the provision substrate CM P- [4, 5, 6, 7, 8, 9- 14 C ] - metastasized from Ne UAC lactose is receptive substrate, (; 4, 5 , 6, 7, 8, 9-14 C] -.
  • Ne UAC was determined by measuring the standard reaction mixture of 70 nmol CMP-[4, 5, 6, 7, 8, 9 one 14 C] -Ne u Ac (642 cmp / nmol), 1.25 jamol of lactose], and 2 ⁇ sodium cacodylate buffer solution containing 0.02% Triton X-100 (pH 5.0)
  • One unit (U) was defined as the amount of enzyme that transfers 1 mol of sialic acid to lactose in one minute under the conditions described above.
  • sialic acid transferase activity was 12.98 UZ1.
  • Thr Arg lie lie Ala Lys Arg Gin Pro Thr Ala Ser Asp Leu Arg Leu
  • Glu Ser lie Val Arg Gin Leu Met Ala His Met Met Met Glu Asp Pro Ser 610 615 620 Ser fi e Pro Asn Val Met Lys Val Met Trp Ala Al a Arg Ser lie Glu
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism Fatno terium damsela Strain: JTO 16 0
  • AAATTATCT TGAAATGAAT GATAAGGAAG GGGCGATTGA ATTACTTGAA GAGGTAACGG -336 CAAAAGCGGA TGGGGCTGTA AAAGCGGAAG CTGAGGAAGT TATTGAATAA CTAATTTTTC -276 AAATGTTCTG TTTTAAGGCG TAAACGATTG AGTCTCTTAA AGCGTACTAT GTCATCATAA -216 GGCTGGTGTG GCATAGTACG CACTTTTAAT GATCTTCATT ATTTATTACT TATTGGTATG -156 ACAGTTTGTA AATAATAATT TTTCAATTGA TATTTTTATG CTGGTATTGA ACCTGAAATC -96 AAATGAGATA TATCTCACAA AAAGCAAATG TAAACATCAT CTTAAATAGA TGAGGCAATA -36 TACTACTAAG AATTTTTTAT GTGAATGTGC TTAAT ATG AAG AAA ATA CTG ACA 18
  • Met Lys Lys lie Leu Thr
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • CTCTAGAG 8 SEQ ID NO: 9
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids Sequence: 'SEQ ID NO: 10
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid

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Description

明細書
/3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素
-. 発明の属する分野
本発明は、 i3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素およびそれをコー ドする新規遺伝子に関する。
本発明はさらに、 新規シグナルべプチドをコ一ドする遺伝子に関する。 従来の技術
近年、 動物細胞における糖タンパク質、 糖脂質などの複合糖質が有する生物活 性が次々と明らかにされ、 複合糖質における糖鎖の重要性が認識されつつある。 複合糖質の糖鎖の非還元末端に存在することの多い糖としてシアル酸が挙げられ るが、 糖鎖の持つ生理機能、 生物学的意識が重要視される中でこのシアル酸はと りわけ多くの機能を有していると考えられる。 しかしながら、 その化学合成、 特 にシアル酸をオリゴ糖、 複合糖質糖鎖などの糖鎖に付加する反応は困難であるた め、 方法が非常に簡便で、 かつ副反応を生じることなく高収率で合成を可能にす る酵素法が注目されている。
現在市販されているシアル酸転移酵素は、 ラット、 ブ夕、 ヒト等の動物の顎下 腺、 肝臓などの臓器から取得された酵素である （Poulson et al. J.Biol. Chem. 252 , 2356-2362 (1977), Weinstein et al. J. Biol. Chem. 257_, 13835-13844 (1982), Miyagi et al. Eur. J. Biochem.126 253 - 261 (1982)) 。 これらの動物由 来の酵素は精製が困難で大量に得られないため非常に高価であり、 さらには酵素 としての安定性が悪いという問題を有している。
そこで、 本発明者らは大量供給可能なシアル酸転移酵素の開発を目的として、 まずシアル酸転移酵素活性を有する細菌の探索を行った結果、 目的の活性を有す る海洋性細菌フォトバクテリゥム ダムセーラ （Photobacterium damsela) J T 0160 (以下、 本明細書中 「JT0 160」 と言う） を見いだした。 また J T 0 160の生産するシアル酸転移酵素 0160 (以下、 「ST0160」 と言う ) を電気泳動的に単一にまで精製した。 さらに、 本酵素の結合様式を解析し、 S T O 1 6 0が糖鎖中の非還元末端に存在するガラクトースの 6位に α 2— 6結合 でシアル酸を転移する /3 —ガラクトシドー α 2 , 6 —シアル酸転移酵素であるこ とを明らかにした （特開平 8— 1 5 4 6 7 3号公報) 。 これにより、 S T 0 1 6 0の生産菌である J T O 1 6 0を培養することにより、 シアル酸転移酵素を大量 に生産することが可能となった。 しかしながら、 この方法の場合、 本酵素が膜結 合型酵素であるために精製の際に界面活性剤を添加する必要があり、 精製酵素溶 液に界面活性剤が入つてしまう等の問題がある。
一方、 遺伝子工学技術の発展により、 所定のタンパク質をコードする遺伝子を 組み込んだ発現ベクターで形質転換した組換え大腸菌を用いて、 当該タンパク質 を大量に発現させることが可能となっている。 この方法を J3—ガラクトシドー α 2 , 6—シアル酸転移酵素に応用した場合、 上述したような問題を伴わないばか りでなく、 膜結合に関与する配列を欠失した可溶性の酵素、 あるいは、 基質特異 性を改変した酵素等の天然に存在しない改変体を産生することも可能となる。 さ らに、 例えば、 Τ 7プロモー夕一等の高効率のプロモ一夕一を用いれば、 菌体の 可溶性タンパク質の 5 0 %以上が所望のタンパク質となるような非常に生産性の 高い生産系の構築も可能であると期待される。 しかしながら、 生育培地であるマ リンブロスで増殖した J T O 1 6 0からは遺伝子 D N Aを抽出することができな いという問題があつたため、 3—ガラクトシドー α 2 , 6—シアル酸転移酵素を コードする遺伝子は得られていなかった。 よって本発明前は、 その必要性が高か つたにもかかわらず、 0—ガラクトシド— α 2 , 6—シアル酸転移酵素を遺伝子 工学的に利用することはできなかった。 発明の概要
本発明は、 ]3—ガラクトシド— α 2 , 6—シアル酸転移酵素をコードする新規 遺伝子を提供することを目的とする。
本発明は、 また、 前記遺伝子を含む、 /3—ガラクトシド— α 2 , 6—シアル酸 転移酵素タンパク質の発現べクタ一を提供すること目的とする。
本発明は、 さらに、 前記発現べクタ一を用いた組換え /3 —ガラクトシドーひ 2 , f""1シアル酸転移酵素タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。 本発明はさらにまた、 前記方法を用いて製造された組換え /3—ガラクトシドー « 2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質を提供することを目的とする。
本発明はまた、 新規シグナルペプチドをコードする遺伝子を提供することを目 的とする。 -- 図面の簡単な説明
図 1は、 pAQ Iの構造を示す。
図 2は、 pAQNの構造を示す。
図 3は、 p AQNから pAQN— EHXまでの構築工程を示す。
図 4は、 pB STCから pEB STCまでの構築工程を示す。
図 5は、 83丁1^から £83丁までの構築ェ程を示す。
図 6は、 発現ベクター pEBSTの構造を示す。
図 7は、 b s t遺伝子の塩基配列の前半を推定アミノ酸配列と共に示す。 図 8は、 b s t遺伝子の塩基配列の後半を推定アミノ酸配列と共に示す。 図 9は、 本発明の発現ベクターを含む E. col i MV1184 形質転換株 （A2, B2, C2) の増殖を示す。
図 1 0は、 実施例 211(2) で 6種類の形質転換体から得た粗酵素が、 ST0160と 同じ活性をもつことを確認するため、 糖供与体基質として CMP-NeuAc を用いて酵 素反応を行った際の、 反応生成物のリテンションタイムを示す。 発明の詳細な説明
本発明者らは、 鋭意研究に勤めた結果、 J TO 1 60の生育培地として、 典型 的に使用されていたマリンブロス 2 2 16 (デフィコ社製） ではなくニュートリ エンスブロス （ォキソイド社製） を用いることにより、 J TO 1 60から遺伝子 DNAを抽出することに初めて成功した。 さらにこうして抽出した DNAから S TO 1 60タンパク質をコードする遺伝子 （以下、 「b s t遺伝子」 と言う） を 単離する試みも行った。 ST0 1 60タンパク質は、 一般の宿主細胞にとって毒 性があると思われること等の種々の困難があつたが、 ついにその単離に成功した 。 当該遺伝子の塩基配列を決定して、 そのアミノ酸配列を推定した結果、 ST0 160タンパク質は、 後述の配列表において配列番号 1で表されるアミノ酸配列 を有することが判明した。
本発明者は、 さらに、 得られた遺伝子を含む発現べクタ一を作成し、 組み換え ST0160タンパク質を発現させることを可能にした。
以下、 本発明を詳細に説明する。
J3—ガラクトシド— α 2, 6—シアル酸転移酵素
本明細書において、 ")3_ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素" とは 、 シチジン 1リン酸ーシアル酸からシアル酸を、 複合糖質糖鎖若しくは遊離の糖 鎖中のガラクト一ス残基の 6位、 又は複合糖質を構成しうる単糖で 6位の炭素に 水酸基を有する単糖の 6位に転移させる活性を有するタンパク質を意味する。 限 定するわけではないが、 本酵素の至適 ρΗは 5— 6の範囲にあり、 至適温度は 3 0でで、 分子量はゲル濾過法によると 64, 000 ± 5, 000である。 ここで 、 複合糖質を構成しうる単糖で 6位の炭素に水酸基を有する単糖とは、 例えばガ ラクトサミン、 マンノース、 Ν—ァセチルガラクトサミンマンノース等を意味す る。
本発明の遺伝子によってコードされる /3—ガラクトシド— α 2, 6—シアル酸 転移酵素は、 フォトパクテリゥム ダムセーラ J TO 160中に発見された。 し かしながら、 同種の酵素が、 フォトバクテリゥム ダムセ一ラ ATC C 3353 9およびフォトバクテリゥム ダムセーラ ATCC 35083中にも存在するこ とが判明しており、 さらに、 同種の酵素を生産する他の微生物や生物が存在する ことが予想される。
ί3—ガラクトシドー α2, 6—シアル酸転移酵素遺伝子
本発明により決定された b s t遺伝子の塩基配列は、 配列番号 2並びに図 7お よび図 8にそれがコードする推定アミノ酸配列とともに示されている。 この配列 から明らかなように、 この遺伝子 DN Aは塩基番号 1から 2028の合計 202 8塩基対からなる。 塩基番号 1から 3は翻訳開始遺伝暗号に相当し、 塩基番号 2 026から 2028までは翻訳停止遺伝暗号に相当する。 この塩基番号 2026 から 2028の配列 （*) は TAAであるが、 TG Aまたは TAGでもよい。 さ らに'、'図 7および 8に記載された構造遺伝子の 5' 側上流領域には大腸菌のプロ モータ一領域 （一 10領域と— 35領域） とリボソーム結合領域 （SD配列） と 相同性の高い配列が、 また、 本構造遺伝子の 3' 側下流にはステムアンドループ 構造という典型的な夕一ミネ一夕一領域が各々確認され、 これらの領域が b s t 遺伝子の発現制御に関わる領域であると推定される。
配列番号 1は S TO 160タンパク質のアミノ酸を示したものである。 ST0 160タンパク質は、 15個のアミノ酸残基 （配列番号 1の 1— 15) からなる シグナル配列、 細胞外領域 （配列番号 1の 16— 498) を含む、 全長 675個 のアミノ酸残基で構成される。 b s t遺伝子から推定されるアミノ酸配列を有す るタンパク質の分子量は 76. 5 kDaであり、 シグナル配列を除いた分子量で も 74. 8 kDaである。 完全に精製した ST0160タンパク質の SDS電気 泳動上での分子量は約 61 kD aであることから （特開平 8— 154673号公 報） 、 ST0160タンパク質はプロセッシングを受けて活性体となるか、 また は、 精製中に菌体内のプロテアーゼの作用を受けているものと考えられる。 さらに、 配列番号 1のアミノ酸配列の C末端領域 （配列番号 1の 497— 67 5) は、 大腸菌のリン酸輸送システム制御蛋白質と 60%以上という非常に高い 相同性を有する。 この領域のうち 539残基一 594残基の部位に、 途中で短い ターン構造を持つ長い 2つの αヘリックス構造が存在すると推定される。 通常 α ヘリックスは 18個のアミノ酸残基で 1単位を構成するが、 ST0160タンパク 質の場合、 その内の一つの面を構成する 4個のアミノ酸残基がすべて疎水性の高 ぃァミノ酸で構成される αヘリックスが 2単位続いており、 さらにその C末端側 にも疎水性の高いアミノ酸残基が片寄つた領域が存在している。 この領域と Ν末 端に存在するシグナル配列領域以外には膜と結合する可能性のある領域は検出さ れず、 したがって、 この部分が ST0160の膜結合領域であると推定される。 現在、 クローニングされている動物由来のシアル酸転移酵素の膜結合領域は Ν末 端側に存在する膜貫通領域であると考えられていることから、 ST0160タン パク質の膜結合様式は動物由来のシアル酸転移酵素のものとはまったく異なるも のであると考えられる。
このような考察から、 本発明は S Τ 0160の膜結合領域および/またはシグ ナル酉列領域の少なくとも一部を削除したタンパク質も酵素活性を有することは 明らかであり、 そのようなタンパク質はそれをコ一ドする遺伝子も含めて本発明 の範囲内である。 特に、 S T 0 1 6 0タンパク質の膜結合領域を削除して可溶性 にした /3—ガラクトシド _ α 2 , 6—シアル酸転移酵素は、 本発明の好ましい態 様であり、 後に詳述する。
本発明の遺伝子は下記実施例に記載されているように、 例えば、 二ユートリエ ントブロス （ォキソイド社製） で培養した J T O 1 6 0のゲノム D NAを用いて 作成した遺伝子ライブラリ一から、 例えばプラークハイブリダィゼーシヨン法を 利用して得ることもできる。 あるいは、 本発明により決定された D NAの塩基配 列に基づいて、 微生物等由来の遺伝子ライブラリーを铸型とする P C R法により 容易に調製することもできる。 このように調製した ]3—ガラクトシド一ひ 2 , 6 一シアル酸転移酵素遺伝子は、 次に述べる方法により変異体に調製することもで さる。
1つのアミノ酸をコードするコドンは複数存在する。 従って、 配列番号 1で示 されるアミノ酸配列またはその酵素活性部分をコードするいずれの D N Aも本発 明の範囲に含まれる。
さらに、 一般に生理活性を有するぺプチドのアミノ酸配列が多少変更された場 合、 即ち、 該アミノ酸配列の中の 1又は複数のアミノ酸が置換され若しくは欠失 し、 または 1又は複数のアミノ酸が付加された場合でも該ぺプチドの生理活性が 維持される場合があることは周知の事実である。 例えば、 変異体は保存的に置換 された配列を含んでいてもよく、 これは、 特定のアミノ酸残基が類似の物理化学 的特徴を有する残基によって置き換えられていてもよいことを意味している。 保 存的置換の非限定的な例には、 I 1 e、 ' V a 1、 L e u又は A 1 a相互の置換の 如き脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、 又は L y sと A r g間の如き極性基 含有アミノ酸残基の間の置換が含まれる。 したがって、 配列番号 1で示されるァ ミノ酸配列またはその酵素活性部分において、 このような修飾が加えられ、 かつ i3—ガラクトシドー α 2 , 6—シアル酸転移酵素の生物活性を有する 3—ガラク トシドー α 2 , 6—シアル酸転移酵素の変異体も本発明の範囲内である。 さらに 、 当該変異体タンパク質をコードする D N Αも本発明の範囲に含まれる。 ノ酸の付加、 欠失または置換による変異体は、 例えばそれをコードする D ΝΑに例えば、 周知技術である部位特異的変異誘発 （例えば、 Nucleic Acid Research, Vol.10, No.20, p.6487-6500, 1982 参照） を施すことにより作成で きる。 本明細書において 「1又は複数のアミノ酸」 とは、 部位特異的変異誘発法 により付加、 欠失または置換できる程度の数のアミノ酸を意味する。
部位特異的変異誘発法は、 例えば、 所望の変異である特定の不一致の他は、 変 異を受けるべき一本鎖ファージ DN Aに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライ マ一を用いて次のように行うことができる。 即ち、 プライマ一として上記合成ォ リゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、 得られた二重鎖 D N Aで宿主細胞を形質転換する。 形質転換された細菌の培養物を寒天にプレート し、 ファージを含有する単一細胞からプラークを形成せしめる。 そうすると、 理 論的には 50%の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、 残 りの 50%が元の配列を有する。 上記所望の変異を有する DN Aと完全に一致す るものとはハイブリダイズするが、 元の鎖を有するものとはハイブリダイズしな い温度において、 得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブ とハイプリダイズさせる。 次に該プローブとハイプリダイズするプラークを拾い 、 培養し DNAを回収する。
尚、 酵素などの生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を喪失せしめない 1又は複数のアミノ酸の置換、 欠失または挿入を施す方法としては、 上記の部位 特異的変異誘発の他にも、 遺伝子を変異源で処理する方法及び遺伝子を選択的に 開裂し、 次に選択されたヌクレオチドを除去、 付加または置換し、 次いで連結す る方法もある。
さらに、 本発明の範囲内に入る塩基配列には、 温和な又は苛酷なストリンジェ ンシ一の条件下で本明細書に開示した; 3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転 移酵素塩基配列にハイブリダィズし、 かつ生物学的に活性な 一ガラクトシド— 2, 6—シアル酸転移酵素をコードする単離された DNA及び RN Aも含まれ る。 温和なストリンジエンシーによるハイブリダィゼ一シヨンの条件は、 例えば 、 Sambrookら， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol.1, p. 1. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)に記載された条件を意 味する。 Sambrookらにより定義されているように、 温和なストリンジエンシーの 条件には、 5 XS SC, 0. 5%SDS, 1. OmMEDTA (pH8. 0) の前洗 浄用溶液と約 55T， 5 XSSC, —晩のハイブリダィゼ一シヨン条件の使用が 含まれる。 苛酷なストリンジエンシーの条件には、 より高温のハイブリダィゼ一 シヨンと洗浄が含まれる。 その際、 プローブの長さ等の各種要因に応じて温度及 び洗浄溶液の塩濃度は適宜調節される。 好ましくは、 5XS SC以下で 20 以 上の範囲の条件が好ましい。
組換え) 3—ガラクトシドーひ 2, 6—シアル酸転移酵素の製造
本発明は /3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素をコードする遺伝子 を含む発現ベクター、 並びにこれら発現ベクターを含有する宿主細胞を前記遺伝 子の発現に適する条件下で培養して、 発現された組換えタンパク質を回収するこ とにより組換え) 3—ガラクトシド— α 2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質を製 造する方法も提供する。
本発明の組換え i3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質を 製造するためには、 使用する宿主細胞に応じて選ばれた発現ベクターに、 哺乳動 物、 微生物、 ウィルス、 又は昆虫遺伝子等から誘導された、 適当な転写又は翻訳 調節ヌクレオチド配列に連結した /3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵 素遺伝子配列を挿入する。 調節配列の例として、 転写プロモータ一、 オペレータ 一、 又はェンハンサー、 mRNAリボソーム結合部位、 及び転写及び翻訳の開始 及び終結を制御する適切な配列が挙げられる。
β—ガラクトシド— α 2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質の発現に適する宿 主細胞には、 原核細胞、 酵母又は高等真核細胞が含まれる。 細菌、 真菌、 酵母、 及び哺乳動物細胞宿主で用いる適切なクローニング及び発現べクタ一は、 例えば 、 Pouwels b, Cloning Vectors： A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)に記載されている。
原核生物には、 グラム陰性又はグラム陽性菌、 例えば、 大腸菌又は枯草菌が含 まれる。 大腸菌のような原核細胞を宿主として使用する場合、 ）3—ガラクトシド -α 2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質は、 原核細胞内での組換えポリべプチ ドの発現を容易にするために Ν末端メチォニン残基を含むようにしてもよい。 こ の N未端 Me tは、 発現後に組換え 0—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移 酵素夕ンパク質から切り離すことができる。
原核宿主細胞内で用いる発現べクタ一は、 一般に 1又は 2以上の表現型選択可 能マーカ一遺伝子を含む。 表現型選択可能マーカー遺伝子は、 例えば、 抗生物質 耐性を付与するか又は独立栄養要求性を付与する遺伝子である。 原核宿主細胞に 適する発現べクタ一の例には、 pBR 322 (ATCC 37017) の如き巿販 のプラスミドまたはそれらから誘導されるものが含まれる。 PBR 322は、 ァ ンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有するので、 形質転換 細胞を同定するのが簡単である。 適切なプロモーター並びに /3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素遺伝子の DNA配列が、 この p BR 322ベクター 内に挿入される。 他の市販のベクタ一には、 例えば、 pKK223— 3 (スエー デン、 ウプサラの Pharmacia Fine Chemicals ) 及び pGEMl (米国、 ゥイス コンシン州、 マジソンの Promega Biotec ) が含まれる。
原核宿主細胞用の発現べクタ一に普通に用いられるプロモータ一配列には、 t a cプロモーター、 /3—ラク夕マ一ゼ （ぺニシリナ一ゼ） 、 ラクト一スプロモ一 夕一 （Chang ら， Nature 275:615, 1978 ；及び Goeddelら， Nature 281 :544, 1979) 等が含まれる。 特に有用な原核宿主細胞発現系は、 ファージ APL プロモ —夕一及び c I 857 t s不耐熱性レプレッサー配列を用いる。 APL プロモー 夕一の誘導体を取り込んでいるァメリカン ·タイプ ·カルチャー ·コレクシヨン から入手できるプラスミドベクタ一には、 プラスミド PHUB2 (大腸菌株 J M B 9 (ATCC 37092) 内に存する） 及び pPLc 28 (大腸菌 R P I (A TCC 53082) 内に存する） が含まれる。
b s t遺伝子の場合は、 後述するように、 本遺伝子全体を含む約 2. 8 kbp の H i nd I I I断片が挿入されたプラスミドを有する大腸菌を得ることができ ず、 約 1. 61?:13と約1. 2 k bの 2つの H i n d I I I断片としてクロ一ニン グされたことから、 本遺伝子から生産するタンパク質が大腸菌にとつて致死的で ある可能性がある。 よって、 本遺伝子を発現させる場合、 制御可能なプロモータ 一を使用し、 宿主が十分に増殖してから b s t遺伝子の発現が生じさせることが 好ましい。 制御可能なプロモー夕一の典型的な例は t a cプロモーターであるが 、 れに限定されるものではない。 さらに、 本発明者は t a cプロモータ一を b s t遺伝子の翻訳開始コドンに対して、 少し離れた位置に存在させることにより (例えば数塩基分） 、 発現の制御が弱くなることも見いだしている。 プロモ一夕 —と翻訳開始コドンの間の距離を適宜変化させることは慣用手段により行うこと ができる。 -- また、 組換え i3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質を酵 母宿主細胞内で発現させてもよい。 好ましくはサッカロミセス属 （例えば、 S. セレピシェ） を用いるが、 ピキア （Pichia) 又はクルイべ口ミセス
(Kluyveromyces)の如き他の酵母の属を用いてもよい。 酵母べクタ一は、 2 酵 母プラスミドからの複製起点の配列、 自律複製配列 （ARS) 、 プロモー夕一領 域、 ポリアデニル化のための配列、 転写終結のための配列、 及び選択可能なマ一 カー遺伝子を含有することが多い。 酵母 α因子リーダ一配列を用いて、 組換え) 3 一ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質の分泌を行わせること もできる。 酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適する他の リーダー配列も知られている。 酵母を形質転換する方法は、 例えば Hinnen ら， Pro atl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978に記載されている。
哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系を用いて、 組換え )3—ガラクトシドー α 2 , 6一シアル酸転移酵素夕ンパク質を発現することもできる。 哺乳動物起源の株化 細胞系も用いることができる。 哺乳動物宿主細胞発現べクタ一のための転写及び 翻訳制御配列は、 ウィルスゲノムから得ることができる。 普通に用いられるプロ モータ一配列及びェンハンサー配列は、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス 2 等から誘導される。 SV40ウィルスゲノム、 例えば、 SV40起点、 初期及び 後期プロモータ一、 ェンハンサ一、 スプライス部位、 及びポリアデニル化部位か ら誘導される DN Α配列を用いて、 哺乳動物宿主細胞内での構造遺伝子配列の発 現のための他の遺伝子要素を与えてもよい。 哺乳動物宿主細胞内で用いるための 発現ベクターは、 例えば Okayama及び Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983) の方法で構築することができる。
本発明の ]3 _ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質を産生す る 1つの方法は、 /3—ガラク卜シド— α2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質を コードする DN A配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、 当該タン パケ質が発現する条件下で培養することを含む。 次いで、 用いた発現系に応じて i3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素夕ンパク質を培養培地又は細胞 抽出液から回収する。 組換え /3—ガラクトシドーひ 2, 6—シアル酸転移酵素夕 ンパク質を精製する操作は、 用いた宿主細胞の型及び本発明のタンパク質を培養 培地中に分泌させるかどうかといつた要因に従って適宜選択されるであろう。 可溶性の 3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素
さらに、 本発明は一つの態様において、 可溶性 ]3—ガラクトシドー α 2, 6- シアル酸転移酵素タンパク質、 および当該タンパク質をコードする遺伝子を提供 する。 可溶性 3_ガラクトシドー α2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質は、 天 然の /3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質の細胞外ドメイ ンの全部又は一部を含むが、 そのポリペプチドを細胞膜上に停留させる膜結合領 域を欠くものである。 例えば、 前述した ST0160タンパク質の場合、 ァミノ 酸残基 499 - 675の一部または全部を削除して可溶性にすることができる。 また、 可溶性 /3_ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質は、 合 成された当初は分泌を促進するために天然のまたは異種起源のシグナルペプチド を含んでもよいが、 このシグナルべプチドは細胞から —ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質が分泌されるとすぐに切り離される。 膜結合領 域および/またはシグナルペプチド領域の全部または一部のいずれが削除された 可溶性タンパク質であっても、 /3—ガラクトシドー α 2, 6_シアル酸転移酵素 活性を保持する限り、 本発明に含まれる。 すなわち、 可溶性 13—ガラクトシド— α 2, 6—シアル酸転移酵素タンパク質は、 当該タンパク質が分泌されることを 条件として、 膜結合領域の一部又は細胞質領域の一部または他の配列を含んでも よい。 可溶性組換えタンパク質を宿主細胞で発現させる場合、 可溶性タンパク質 は細胞膜に結合しないので、 精製が容易となる。 また、 当該タンパク質を分泌さ せるシグナルペプチドは、 宿主由来あるいは、 異種起源のものでもよい。 配列番 号 1の 1— 15のアミノ酸配列は、 より好ましいシグナルペプチドの 1つである 可溶性タンパク質を含む、 短縮形の J3—ガラクトシドー α2, 6—シアル酸転 移酵'素タンパク質は、 所望の慣用的技術を用いて調製することができる。 例えば
、 配列番号 2の完全長ク口一ン化 D NA断片を制限ェンドヌクレアーゼによって 消化して短縮形の D N A断片を作成し、 ァガロースゲルでの電気泳動によって単 離することができる。 このとき、 制限エンドヌクレアーゼによる消化は、 天然に 存在する開裂部位において行ってもよく、 予め所定の制限エンドヌクレアーゼ開 裂部位を有するリンカ一をつないだ配列番号 2の D N A断片に対して行ってもよ レ^ こうして単離された、 所定の短縮型タンパク質断片をコードする D NA配列 は、 周知のポリメラ一ゼ連鎖反応を用いて増幅することができる。 別の方法とし て、 既知の突然変異誘発法を用いて所定の位置に、 例えば細胞外領域の最後のァ ミノ酸のコドンのすぐ下流に、 停止コドンを挿入してもよい。
さらに別の方法では、 酵素処理 （例えば、 B a 1 3 1ェキソヌクレア一ゼ） を 用いて D N A断片から末端ヌクレオチドを削除して所望の特定の末端を有する断 片に置き換えることもできる。 その場合使用するリンカ一としては、 市販品とし て、 B a 1 3 1消化により生成する平滑末端に連結することができ、 かつ、 制限 ェンドヌクレア一ゼ開裂部位を含有するものがある。
あるいは、 組換えタンパク質の所定の点に N末端又は C末端を再構築するよう なオリゴヌクレオチドを合成して、 D NA断片に結合させることもできる。 この オリゴヌクレオチドは、 遺伝子操作の便宜のためコード配列の上流に制限ェンド ヌクレア一ゼ開裂部位を有してもよく、 また、 特定の宿主での発現のため N末端 に開始コドン （AT G) が存在してもよい。
可溶性タンパク質は、 得られた遺伝子により形質転換した宿主細胞を培養して その上澄液精製して得ることができるが、 収率を高めるためには、 菌体を破壊す ることが望ましい。 以下の実施例は、 本発明の特定の態様を説明するために示したものであって、 本発明の技術的範囲を限定するものではない。 以下の実施例の各工程では以下のような方法を採用した。
ペプチドのァミノ酸配列の解析 ブ ΰティンシーケンサ一： Model 476A (パ一キンエルマ一社製） を用いて、 得 られたペプチドのァミノ酸配列を解析した。
プローブの合成
プローブは、 所定のアミノ酸配列の内、 対応するコドンの少ないアミノ酸を多 く含む領域を選定し、 そのアミノ酸配列から推定される塩基配列を基に作製した 。 なお、 合成は日本バイオサービスに依頼した。
J T 0160の遺伝子ライブラリ一の作製
J TO 160をニュ一トリエントブロス （ォキソイド社製） で 30^、 16時 間培養した。 培養液を遠心分離 （4で · 10分間 · 8, 000 r pm) し、 得ら れた 3 gの菌体力、ら Saito-Miura法 (Preparetion of transforming
deoxyribonucleic acid by Phenol treatment. Biochem. Biophys. Acta 72, 619-629 (1963) ) に従いゲノム DNAを精製した。 精製したゲノム DNA50 gを S a u 3 A Iで部分消化し、 得られた遺伝子断片を λ DASH I I/BamHI Yetor Kit (ストラタジーン社製） に連結した。 これを、 Gigapakll Packging Extracts (ストラタジーン社製） を用いてパッケージングして遺伝子ライブラ リーを調製した。
遺伝子ライブラリ一の増幅
調製した遺伝子ライブラリ一を増幅するために宿主として Eschrchia col i XL - 1 Blue MRA (P2) を用い、 LB培地で 37 、 150 r pmでー晚培養した 。 培養終了後、 培養液を 1 OmM塩化マグネシウム溶液で〇. D. fcil。 が 0. 5 となるように希釈した。 この希釈液 600 / 1に上記の通り調製した遺伝子ライ ブラリーを 10 l加え、 37 で 15分間振とうした。 これに予め 48でに保 温した LB- トップァガロース 10mlを加えて撹拌した後に、 予め 37 に保温し た LB—プレートに重層した。 これを室温で固めた後に、 37 で 8時間培養し た。 重層した LB- トップァガロース上の宿主が完全に溶菌した後に、 5m lの S M緩衝液を加え 15分間放置した後に、 トップァガロースを S M緩衝液と共にスパ —テルで回収した。 得られたトップァガロースを遠心分離 （4°C · 10分間 · 8 , 000 r pm) し、 その遠心上清を増幅遺伝子ライブラリ一とした。
プローブの蛍光標識 合成したプローブを、 3' -オリゴラベリングキット （アマシャム社製） を用い て蛍光標識した。
ハイブリダィゼ一ション
サザン八ィブリダイゼーション用のァガロースゲルのレプリ力は以下の方法で 調製した。 -- 制限酵素で消化した D N Aを T A E緩衝液を用いた 0. 8 %ァガロースゲルで 電気泳動した。 泳動後、 ァガロースゲルを変性溶液 （0. 5MNa〇H、 1. 5 MN a C 1 ) 中に 15分間浸し、 ゲル中の DNAをアルカリ変性させた。 次に、 このゲルを中和溶液 （0. 5MT r i s— HC 1 ( pH7. 5) 、 1. 5MNa C I) に 5分間浸し、 アルカリを中和した。 このゲルをゲルと同じ大きさに切つ た HybondN+ ではさみ、 さらにキムタオルではさんで室温で放置して Hy bondN+ に DNAを転写し、 ゲルのレプリカを調製した。 得られたレプリカ を 2XSSC緩衝液で洗浄し、 濾紙上、 室温で乾燥するまで放置した。 乾燥終了 後、 レプリカを 80 で 2時間べ一キングした。
コロニーハイブリダィゼ一ション、 およびプラークハイブリダィゼ一シヨン用 のコロニー、 およびプラークのレプリカは以下の方法で調製した。
適度な頻度でコロニーまたはプラークを形成させたプレート上に、 プレートと 同じ大きさに切った Hy b o n dN+ を乗せて、 コロニーまたはプラークを写し 取り、 レプリカを作製した。 なお、 レプリカ後のマスタ一プレートは 4 で保存 した。 作製したレプリカを変性溶液 （0. 5MNa〇H、 1. 5MNaC l) に 浸した濾紙上に 5分間放置して、 コロニー、 もしくはファージをアルカリ変性さ せた。 このレプリカを中和溶液 （0. 5MT r i s— HC 1 ( pH7. 5) 、 1 . 5MNaC 1) に浸した濾紙上に 3分間放置して中和し、 さらに 2XSSC緩 衝液で洗浄した。 処理したレプリカを濾紙上、 室温で乾燥するまで放置した。 乾 燥終了後、 レプリカを 80 で 2時間べ一キングした。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 3' オリゴラベリングキット （アムシャム社製） のマニュアルに従い、 以下の方法で行なった。
レプリカをハイブリバッグに入れ、 このバッグに 30mlのハイブリダィゼー シヨン溶液を入れて恒温水槽中で 43で、 1時間振とうし、 平衡化した。 次に、 この溶液に蛍光ラベルしたプローブを 10 n gZm 1となるように加え、 さらに 恒温水槽中で 43 ：、 3時間振とうし、 アニーリングした。 以下の操作はバット 内で行なった。 ァニ一リング終了後、 レプリカを 0. l%T r i t onX— 10 0を含む 5XSSCで 5分間、 室温で洗浄した。 この操作は 2回繰り返した。 引 続き 0. l%T-r i t onX— 100を含む 1 XSSCで 15分間、 43t:で洗 浄した。 この操作も 2回繰り返した。 洗浄操作終了後、 レプリカを緩衝液 1 (0 . lMTr i s -HC 1 ( pH7. 5) , 1. 5MNaC 1 ) で 1分間、 さらに 洗浄した。 次に、 ブロッキング溶液にレプリカを浸し、 室温で 30分間振とうし > ブロッキングした。 ブロッキング終了後、 緩衝液 1で 1分間洗浄した。 洗浄後 、 抗体溶液に浸し、 室温で 30分間振とうし、 抗体を結合させた。 次に、 これを緩 衝液 2 (0. 1 MT r i s -HC 1 ( ρΗ7. 5) , 0. 4MNaC l) で 5分 間洗浄した。 この操作は 4回繰り返した。 洗浄終了後、 ディテクシヨン溶液を加 えて 1分間振とうし、 蛍光を発色させた。 このレプリカをキムタオルにはさみ、 かるく水分を除き、 フィルムカセットに置いた。 その上にサランラップを置いて さらにその上に X線フィルムをのせて 15分間放置して感光した。 X線フィルム は富士メディカルフイルムプロセサ一 （富士フィルム社製） で現像した。
b s t遺伝子断片を含むファージの単離
目的とするプラークをプレートから単離して SM緩衝液 （50μ 1) に懸濁し 、 4でで保存した。 SM緩衝液で抽出したファ一ジは、 前述した遺伝子ライブラ リーの増幅方法に従って増幅した。
ファージ DNAの精製
増幅したファージ溶液から、 ファージ DNAを λ—プレップ DNA精製キット (プロメガ社製） を用いて、 以下の方法で精製した。
増幅したファージ溶液 10m 1に、 ヌクレア一ゼミックス 40 β 1を加えて撹 拌した後に、 37 で 15分間放置し、 溶液中の核酸を分解した。 これにファー ジ沈澱剤 4ml を加えて氷中に 30分間放置し、 ファージ粒子を沈殿させた。 生成 した沈殿を遠心分離 （10, 000 r pm' 10分間 ' 4 ） で回収し、 500 1のファージ緩衝液を加えて懸濁した。 さらに、 これを遠心分離 （15, 00 0 r pm · 5分間 · 4 ） して不溶解物を除去した。 得られた遠心上清に lm 1 の A精製溶液を加え、 ファージ粒子を構成する蛋白質を変性させてファ一ジ
DN Aを抽出すると同時に DN A精製溶液中に抽出された DN Aをレジンに吸着 させた。 この溶液をシリンジで DNA精製用カラムに添加し、 レジンのみをカラ ムにつめた。 このカラムを 2m 1の 80%イソプロピルアルコールで洗浄した後 に遠心 （12, "000 r pm · 20秒間 · 4°C) してカラム中のレジンを乾燥し た。 このカラムに、 80 に保温した TE緩衝液を 100 1加えて遠心 （12, 000 r pm · 20秒間 · 4で） し、 レジンからファージ D N Aを溶出した。 遺伝子断片のベクタ一への挿入
PUC 19を H i nd i I Iで 37で、 1時間切断した。 次に、 これを 65で 、 1時間、 バクテリアルアルカリフォスファターゼ （BAP) 処理し、 これをェ 夕ノール沈澱した。 得られた沈澱を 70%エタノールで洗浄し、 スピードバック で乾燥してエタノールを除き、 滅菌水に溶解した。
ファ一ジ DNA (5 g) を H i nd i I Iで切断し、 ァガロースゲル電気泳 動を行なった。 電気泳動後、 サザンハイブリダィゼーシヨンでプロ一ブとハイブ リダイズする目的の遺伝子断片を含むゲル断片を切り出した。 切り出したゲル断 片からジーン一クリーン （フナコシ社製） を用いて DNAを抽出し、 エタノール 沈澱した。 得られた沈澱を 70%エタノールで洗浄し、 スピードバックで乾燥し てエタノールを除き， 10 /1 の滅菌水に溶解した。
切り出した DNA (9 1 ) と、 H i n d I I Iで消化後 BAP処理した p U C I 9 (1 1 ) を混合し、 夕カラライゲーシヨンキット溶液 I (10 1) を 加え撹拌後、 16でで一晩反応した。
形質転換
E. coli MV1184の形質転換は以下の方法で行なった。
- 80T:で保存した E. coli MV1184 コンビテント細胞 （ 100 1 ) を氷中で 溶かし、 これにプラスミド DNA (10// 1) を添加し、 30分間氷中で放置した 。 これを 42 で 1分間処理し、 その後 3分間氷中に放置した。 これに、 37T:に 保温した LB培地を 900 / 1添加し、 1時間、 37 :で振とうした。 振とう終 了後、 本溶液を、 LB—アンピシリン、 I PTG、 X— G a 1寒天培地に塗布し 、 37で、 16時間培養した。 プラスミド DNAの調製
目的とするコロニーを寒天培地から釣菌し、 LB—アンピシリン液体培地に植 菌して 3 7°C、 16 時間振とう培養した。 培養終了後、 培養液を遠心分離 （15 ， 000 r pm · 10分間 ' 4で） し、 菌体を回収した。 得られた菌体から QIAGENミニプレパレ一シヨンキットを用いてプラスミド DNAを精製した。
DN A塩基配列の解析
ALFred DNAシークェンサ一を用いて、 プラスミド、 およびファージに挿 入された遺伝子断片の塩基配列を解析した。 プラスミドの場合、 塩基配列解析用 サンプルは、 c y 5オートリードシークェンシングキット （フアルマシア社製） に添付されているプロトコールに従って調製した。 また、 その塩基配列の解析は 、 ォ一トリードシークェンシングキットを用いて行なった。 ファージの場合、 塩 基配列解析用サンプルは、 オートサイクルシークェンシングキット （フアルマシ ァ社製） に添付されているプロトコ一ルに従って調製した。 また、 その塩基配列 はォートサイクルシークェンシングキットを用いて行なつた。
塩基配列解析のための電気泳動用ゲルには、 0. 5 mmロングレンジャーゲルを 用いた。 電気泳動は、 シークェンサ一に添付されてきた 0. 5醒ロングレンジャ 一ゲル用の電気泳動条件で行なった。
口 卩し
フォトバクテリゥムダムセ一ラ J TO 160は、 平成 6年 1 1月 24日付でェ 業技術院生命工学工業技術研究所に F ERMB P - 4900として寄託されてい る。 実施例 1 b s t遺伝子の単離
ST0160タンパク質のアミノ酸配列を解析し、 これに基に作製したプロ一 ブを用いて J TO 160遺伝子ライブラリ一を探査し、 b s t遺伝子をクロ一二 ングした。
I. b s t遺伝子の 5 ' 末端側断片の単離
a. ST0160タンパク質のトリプシン消化
完全精製した ST0160： 5 /z g (lml) をシリコン処理した 1. 5m l 容チ i ブに分取し、 100 %TCA溶液 150 w 1を加えた。 これを、 20分 間氷上で放置して酵素を沈殿した後に、 遠心分離 （4°C · 15分間 · 1 5, 00 0 r pm) して沈殿を回収した。 得られた沈殿を冷アセトンで 2回洗浄し、 これ をスピードバックで乾燥した。 これに 8M尿素 +0 4M重炭酸アンモニゥム溶 液 25 1を加え、 さらに 45mMジチオスレイト一ル溶液 2. 5 1を加えて 50°Cで 15分間保温して蛋白質中のジスルフィ ド結合を切断した。 次に、 溶液 を室温に戻し、 l O OmMョ- ドアセトアミド溶液 2. 5 1を加え、 室温で 1 5分間放置して切断した SH基を修飾した。 これに超純水 70 1と塩化カルシ ゥムが最終濃度 5 mMとなる様に加え、 5 Uのトリプシンを含むトリプシン溶液 10 μ 1を加えて 37t：、 24時間放置し、 トリプシン消化反応を行なった。
b. ペプチドの分離
ST0160をトリプシンで消化して得られたぺプチドを以下の方法で分取し た。
ペプチド分離システムとして、 Sma r t S y s t em (フアルマシア製） を 用いた。 ペプチド分離用カラムは RPCC2 /C18SC 2. 1/10 (フアル マシア製） を用いた。 カラムに ST0160トリプシン消化溶液を添加後、 溶液 1 (0. 06%TFA 2%ァセトニトリル） と溶液 2 (0. 052 %TFA 100%ァセトニトリル） を用いて、 溶液 1 ： 100%から開始し、 180分で 最終的に溶液 2が 50%となる様な濃度勾配でペプチドを溶出し、 分取した。
c ST 0160タンパク質のアミノ酸配列の分析
STO 160の N末端アミノ酸配列と、 本酵素をトリプシン分解して得られた ペプチドのアミノ酸配列、 すなわち本酵素の内部のアミノ酸配列と推定される 9 個の配列、 計 10個の STO 160の部分アミノ酸配列を明らかにした。 得られ たアミノ酸配列を、 以下の表 1に示す。 表 1
(a) XNSDNTSLKETVSSXXAXV (N末端配列）
(b) DYLGS S AKK (内部配列）
(c) FVSWK I VN (内部配列） 一 "(d) ANYLAGTS PDAPK (内部配列）
(e) ETVXXNSAVVVETETY (内部配列）
(f) YNWHK (内部配列）
(g) QA I S FDF VAPELK (内部配列）
(h) Qし I H I I QAK (内部配列） なお、 N末端アミノ酸配列の解析結果によると、 N末端のアミノ酸残基は解析 不能であり、 この残基が修飾を受けている、 もしくは Cy s残基である可能性が 考えられた。
d. プローブの合成
得られたアミノ酸配列の内、 配列 (d) (配列番号 1のアミノ酸残基 258— 2 70に相当） に対応するように、 以下の配列：
5' -GCIAAITAIITIGCIGGIACIIIICCIGAIGCICCIAA- 3' (配列番号 3) を有するプローブ Aを作製した。 なお、 Iはイノシンであり、 アデニン、 ゥラシ ルおよびシトシンを認識して対合を形成することが可能である。
e. ゲノム DNAのサザンハイブリダィゼーシヨン
P. d ams e l a J T 0160のゲノム DNAを H i n d I I Iで消化し たものを対象として、 dで作製したプローブ Aを用いてサザンハイブリダイゼー シヨンを行なった。 その結果、 約 2. 8 k b pの DNA断片が強くハイブリダィ ズした。 そこで、 ゲノム DNAを H i n d I I Iで消化してァガロースゲル電気 泳動を行ない、 2. 8 kb pの DNA断片を含むゲル断片を切り出し、 この断片 から DNAを抽出した。 抽出した DNAと H i n d I I Iで消化後 BAP処理し た pUC 19とを結合した。 得られたプラスミドで E. c o l i MV 1184を 形質転換した。 生じたコロニーのコロニーハイブリダィゼ一ションを行なったが 、 意外なことにプローブ Aとハイブリダィズするコロ二一は得られなかつた。
f . b s t遺伝子断片を含むと考えられるファ一ジの単離
上記 dのコロ二一ハイブリダイゼーシヨンでは目的とするコロ二一が得られな かったため、 次に、 P. d ams e l a J T 0160のゲノム D N Aの遺伝子 ライブラリ一を対象としてプローブを用いてプラークハイブリダィゼ一シヨンを 行なった。 その結果、 b s t遺伝子断片を含むと考えられるファ一ジが 7株得ら れた。 これらのファージをそれぞれ増幅してファージ DN Aを調製し、 得られた ファ一ジ DNAを H i n d I I Iで消化したものを対象として、 プローブ Aを用 いてサザンハイプリダイゼ一ションを行なった結果、— すべてのファ一ジで約 1. 6 k b pの大きさの DNA断片が非常に強くハイブリダィズした。
g. サブクローニング
7株のファージから 1株を選定し、 そのファ一ジ DN A 5 gを H i n d I I Iで消化して、 ァガロースゲル電気泳動を行なった。 電気泳動後、 ァガロースゲ ル中の約 1. 6 k b pの DN A断片を含むゲル断片を切り出し、 このゲル断片か ら DNAを抽出した。 抽出した DNAと、 H i nd i I Iで消化後 BAP処理し た pUC 19とを結合した。 得られたプラスミドで E. c o l i MV 1 184を 形質転換した。 生じたコロニーのコロニ一ハイブリダィゼ一ションをプローブ A を用いて行なった結果、 強くハイブリダィズする 3コロニーを得た。 この 3株を それぞれ寒天培地から釣菌し、 LB—アンピシリン液体培地に植菌して 37 で 16時間振とう培養した。 得られた培養液から菌体を遠心分離によって回収し、 その菌体からプラスミド DNAの調製を行なった。 得られたプラスミド DNAを H i nd i I Iで消化し、 ァガロースゲル電気泳動を行なった。 その結果、 いず れの株から精製したプラスミドにも約 1. 6 k b pの DNA断片が挿入されてい ることが確認できた。 また、 この電気泳動したゲルのサザンハイブリダィゼ一シ ヨンをプロ一ブ Aを用いて行なった結果、 この約 1. 6 kbpの DNA断片は強 くハイブリダィズした。 以上の結果から、 これらのプラスミドに挿入された約 1 . 6 kbpの DNA断片に b s t遺伝子断片が含まれると考えられた。
h. b s t遺伝子の 5' 末端側断片の塩基配列の解析
上記 gで得られたプラスミドに挿入されている約 1. 6 k b pの DNA断片の 塩基配列を、 ALF r e dDNAシークェンサ一を用いて解析した （図 7および 8の塩基配列マイナス 361から 1244) 。 得られた塩基配列をアミノ酸配列 に翻訳したところ、 片方の H i n d I I Iから数えて 396番目以降の ATG ( Me t残基） から始まり、 もう片方の H i nd I I I以降まで続く、 414個の アミノ酸残基からなる長いオープン · リーディング 'フレーム （ORF) が存在 していた。 この OR Fのアミノ酸配列と、 cで得られた ST0160のアミノ酸 配列と比較したところ、 N末端アミノ酸配列を含む 8個のアミノ酸配列が確認で きた。
以上の結果から、 得られた ORFが b s t遺伝子の 5' 末端側であると考えら れ、 このプラスミドを pBSTNと命名した。
なお、 ST0160の分子量が 60 kDaであることから、 ST0160タン パク質の C末端側の少なくとも 200アミノ酸残基をコードする、 b s t遺伝子 3 ' 末端側断片をさらにクローニングする必要が有ると考えられた。
なお、 ST0160の N末端アミノ酸配列の 2番目の As n残基から始まる配 列は得られた ORFの 17番目からの配列と一致しており、 cで推定した様に S TO 160の N末端アミノ酸配列は Cy s残基から始まることが明らかとなった 。 また、 得られた OR Fの疎水性 ·親水性を解析したところ、 本 OR Fの N末端 側には疎水性の非常に高い領域が存在していた。 さらに、 この OR Fの始めの M e t残基の直後には正電荷を持つ Ly s残基が 2残基存在していた。 これは典型 的なシグナル配列の構造であったことから、 この Me t残基から 16番目の Cy s残基の前までの 15個のアミノ酸残基からなる配列が S TO 160のシグナル 配列であると推定された。
I I. b s t遺伝子の 31 末端側断片の単離
a： b s t遺伝子の 3 ' 側下流の塩基配列の決定
pBSTNに挿入された DNA断片の塩基配列を基に、 以下の塩基配列： 5' - GGGGGGGAAACGAAAGAGTATTATG 一 3' (配列番号 4)
(配列番号 2の塩基配列 1087— 1111)
5' -ATTTTTCAAGGGGCATCCTGCTGG- 3' (配列番号 5)
(配列番号 2の塩基配列 1188— 1211)
を有する 2種類のシークェンス用プライマーを作製した。 これらのプライマーを 用い、 I. fで得られた b s t遺伝子断片を含むと考えられたファージ DNAの シークェンシングを行った。 その結果、 pBSTNの H i nd i I Iの 3' 側下 流の約 150 b pまでの塩基配列を決定することができた。
b. b s t遺伝子の 3' 末端側断片のクローニング 得ら'れた塩基配列を基にさらに、 以下の塩基配列：
5' -AAGATTTCATTTGAGGT - 3 ' (配列番号 6)
(配列番号 2の塩基配列 1270— 1286)
を有するプローブ B作製した。 ファ一ジ DNAを H i n d I I Iで消化し、 ァガ ロースゲル電気泳動を行レ ^、 蛍光標識したプローブ Bを用いてサザンハイブリダ ィゼ一シヨンを行なった。 その結果、 約 1. 2 k b pの遺伝子断片がプローブ B と非常に強くハイブリダイズした。
そこで、 ファージ DNA5 gを H i n d I I Iで消化し、 ァガロースゲル電 気泳動を行ない、 泳動後、 ァガロースゲル中の 1. 2 k b pの DNA断片を含む 部分を切り出し、 ゲルから DNAを抽出した。 抽出した DNAと、 H i nd I I Iで消化後 BAP処理した pUC 19を結合し、 得られた DNAで E. c o l i MV1 184を形質転換した。 生じたコロニーのコロニーハイブリダィゼーショ ンをプロ一ブ Bを用いて行なつたところ、 強くハイブリダィズした 5コロニーを 得た。
得られたコロニ一をそれぞれ寒天培地から釣菌し、 LB_アンピシリン液体培 地に植菌して 37^で 16時間振とう培養した。 得られた培養液から菌体をそれ ぞれ遠心分離 （4で · 15, 000 r pm · 30秒間） により回収し、 菌体から プラスミド DNAを精製した。 得られたプラスミド DNAを H i n d I I Iで消 化し、 ァガロースゲル電気泳動を行なったところ、 いずれのコロニーから精製し たプラスミド DNAにも約 1. 2 k b pの DNA断片が挿入されていることが確 認できた。 また、 このァガロースゲルのサザンハイブリダィゼ一シヨンをプロ一 ブ Bを用いて行なった結果、 この約 1. 2 k b pの DNA断片全てがプローブ B と強くハイブリダィズした。
b. b s t遺伝子断片の C末端部分の DNA塩基配列の解析
上記 aで得られた約 1. 2 k b pの DNA断片の塩基配列を、 ALF r e dD N Aシークェンサ一を用いて解析した。 得られた塩基配列をアミノ酸配列に翻訳 したところ、 片方の H i n d I I Iから 262個のアミノ酸残基からなる長い O RFが存在していた。 なお、 本 ORFの 3' 側下流には 10 b pからなるステム と 7 b pからなるループで構成されるステムアンドル一プ構造が存在していた。 以上の結果から、 本遺伝子断片の O R Fが b s t遺伝子の構造遺伝子の C末端 側 （図 7および 8の塩基配列 1239— 2348) であると考えられ、 このプラ スミドを p B S T Cと命名した。
I I I . J TO 160の持つ DNAメチル化酵素 - 上記 I bで示したとおり、 H i nd i I Iで消化した J TO 160のゲノム D NAを対象としてサザンハイブリダィゼーシヨンを行なった結果、 約 2. 8 k b pの DNA断片がプローブ Aと強くハイブリダィズした。 この大きさは、 pBS TNと pBSTCに挿入された遺伝子断片を合わせたもの、 すなわち b s t遺伝 子の全塩基配列の大きさに等しい。 これは、 b s t遺伝子内に H i n d I I I部 位 （AAGCTT) が存在するにも関わらず、 ゲノム DNAでは H i n d I I I が切断されなかったことを意味する。 その理由として、 JT0160の菌体内で ゲノム DNAがメチル化等の修飾を受けたために H i n d I I Iで切断できなか つたと考えられた。 b s t遺伝子全長の塩基配列を解明した結果、 この b s t遺 伝子の内部に存在する H i n d I I Iの配列は外側の塩基も含めて G AAGCT ： LCであり、 パリンドローム構造を持っていた。 制限酵素部位やメチル化酵素部 位の配列は、 そのほとんどがパリンドロームであり、 この GAAGCTTCと！^ う 8 b pの配列は、 J TO 160の持つ DNAメチル化酵素の認識配列であると 推測された。 なお、 b s t遺伝子の両端に存在する H i nd I I I部分の配列は 八八0じ丁丁 と八 00丁丁でぁり、 パリンドローム配列ではないためにこ れらの部位はメチル化されず、 H i nd i I Iで切断されたと考えられる。 現在、 6 bpの塩基配列を認識する制限酵素の存在が数多く知られており、 遣 伝子工学的研究を行なう際に頻繁に使用されている。 しかしながら、 特に最近は 、 より長いヒトの遺伝子を扱うことが多くなつたため、 8 bpの配列を認識する 制限酵素が要望されている。 ところが、 現在市販されている 8 b pの配列を認識 する制限酵素は No t Iのみである。 一方、 多くの細菌が、 生体防御の機構とし て同じ配列を認識する DN Aメチル化酵素と制限酵素を合わせ持つことが知られ ている。 J TO 160が 8 b pの配列を認識する DNAメチル化酵素を持つと考 えられ、 したがって本菌がこの配列を切断する制限酵素も合わせ持つ可能性が有 ると推定された。 この 8 b pの配列を認識する新規制限酵素の開発は非常に有益 であると期待される。
I V. シァリルモチーフ
現在までに、 主として動物由来のシアル酸転移酵素がいくつか精製され、 クロ —ニングされている。 動物由来のシアル酸転移酵素のアミソ酸配列中には、 その 起源、 種類を問わず、 相同性の高い領域が 2ケ所存在し、 シァリルモチーフと呼 ばれている。 その一方は、 すべてのシアル酸転移酵素の糖受容体である CM P— シアル酸の結合部位であることが明らかにされている。 今回得られた S TO 16 の推定アミノ酸配列と、 ラット由来の i3—ガラクトシド α— 2, 3シアル酸転移 酵素のアミノ酸配列には相同性の高い領域は見られなかった。 また、 前記シァリ ルモチーフの配列と相同性の高い領域も見い出せなかった。 このことは、 ST0 160の起源と、 現在までに主に動物から得られているシアル酸転移酵素と起源 が異なることを示すものと考えられる。 本酵素の基質結合部位、 特に CMP—シ アル酸の結合部位については非常に興味深く、 その解析は有益であると期待され る。 実施例 2 組換え ST0160タンパク質の発現
本実施例では、 pBSTNと pB S TCに分けてクローニングされた遺伝子断 片に含まれる長いオープンリーディングフレーム （〇RF) が、 Pho t ob a c t e r i urn d ams e l a J T 0160由来のシアル酸転移酵素 016 0 (ST0160) をコードすると遺伝子、 すなわち b s t遺伝子であることを 証明する。 そのために、 本遺伝子を発現ベクターに挿入し、 大腸菌において発現 し、 その遺伝子産物を解析する。 また、 構築した S TO 160生産系を用いて、 本構造遺伝子の C末端に存在する膜結合に関与すると推定される領域の機能を解 析する。
I. 発現プラスミドの作製
b s t遺伝子のクローニングの際に、 サザンハイブリダィゼーシヨンで本遺伝 子を含むと推定された 2. 8 k b pの H i n d I I I断片が pUC 18に揷入で きず、 1. 6 kbpと 1. 2 k b pの 2つ H i n d I I I断片としてクローニン グできたことから、 本遺伝子が大腸菌にとつて致死遺伝子であると推定された。 そ; l 、 2つに分けてクローニングされている b s t遺伝子の連結を、 制御可能 な t a cプロモー夕一の制御下で行うこととした。
発現ベクター作製の基となるベクタ一として pAQ Iを改変した pAQNを使 用した。 p AQ Iの構造を図 1に示し、 p AQNの構造を図 2に示す。 本プラス ミドは t a cプロモ一夕一の直後の E c oR Iと r r n BT 1 T 2夕一ミネ一夕 —の直前の H i n d I I I間にアクアライシン Iをコードする遺伝子 （a q u I 遺伝子） を有する。 a q u I遺伝子中には本プラスミド中でユニークな制限酵素 部位が、 Ec oR Iと H i nd i I Iを含めて 10個存在しており、 遺伝子操作 を行う際に有利である。 また、 本プラスミドは t a cプロモータ一を制御する 1 a c I q をプラスミド中に持ち、 通常の系よりも t a cプロモ一夕一をより強力 に押さえるため、 本実施例の目的に適していると考えた。
pAQ Iは、 特開平 2— 92288号にその構築方法が記載されており、 また 、 生命工学技術研究所に FERM BP 2305として寄託されている。
pAQ Iの pAQNへの改変は Mutan- K (宝酒造社製） を用い、 次の手順によ り行った。
1. 37でで1夜培養した81)2305を01八0 0 Spin Plasmid Kit (QIAGEN社） を用い、 pAQIを抽出した。
2. 卩 91を 1101と11111(]111 で切断し、 ライゲ一シヨンした。 （pAQIAXH)
3. ' pAQIAH のアクアライシン遺伝子の EcoRI- Xbal部位切り出し、 M13即 18 の EcoRI- Xbalサイ卜へ挿入した。 （pMBALl)
4. pMBALlを以下のプライマ一により、 ポイントミューテシヨン し、 ァク ァライシン遺伝子の EcoRI-Xbal部位に AccIII, BamHI.Bglll を挿入し、 さらに Xmalll, Kpnlを消去した。 （ρΜΒΑ ΔΧΗ)
AccIII揷入用 （塩基番号 141)
5' -CCTGGATGATCCGGAAGCTATCC- 3' (23 mer)
BamHI 揷入用 （塩基番号 503)
5' - TGACACCGGGATCCGCACGA- 3' (20 mer)
Bglll 挿入用 （塩基番号 966)
5' -TAGTTGCGTAGATCTCTTCGCC- 3' (22 mer) ' Xmalll消去用 （塩基番号 531)
5' - AGTTCGGCGGACGGGCCCG- 3' (19 mer)
Kpnl 消去用 （塩基番号 592号）
5' -ACGGCCACGGGACCCATGTGG- 3' (21 mer) アニーリング温度は、 65度 15分、 37度 15分で行った。
5. ρΜΒΑ ΔΧΗの EcoRI-Xbal部位を切り出し、 pAQI ΔΗのアクアライシン遺 伝子の EcoRI- Xbal部位切り出したプラスミドの EcoRI-Xbalサイ卜へ挿入した。 （ pAQN) b s t遺伝子発現プラスミド pEBSTの構築は、 pBSTNと pBSTCに 含まれる遺伝子断片がいずれも H i n d I I I断片であることから、 次に述べる とおり、 方向性を持たせてこれらの断片を pAQNの t a cプロモー夕一の下流 に揷入した。 なお、 この際に b s t遺伝子の持つ本来のプロモー夕一は完全に切 除した。
簡単に述べると、 まず、 pAQNの制限酵素部位は t acプロモ一夕一直後か ら順番に E c oR I、 Bg l I I、 Xba l, H i nd i I Iと並んでいるのを Ec oR I、 H i nd i I I、 Xb a Iの順に改変した。 次に、 pBSTCに含 まれる〇RFの下流に存在する Hp a I部位 （図 7および 8の塩基配列 2201 - 2206) を Xba lに改変し、 この C末端部分を含む〇 R Fを、 改変 pAQ Nに Xba I— H i nd I I Iで挿入した。 次に、 p B S TNに含まれる OR F の N末端に存在する Me tの上流に E c oR I部位を挿入し、 この N末端部分を 含む ORFを C末端部分を含む ORFを挿入した pAQNに E c oR I -H i n d I I Iで挿入し、 発現プラスミド pEB STを完成した。
なお、 C末端領域を欠失した変異体も同様にして作製した。
以下、 より詳細に説明する。
a. 材料
発現べクタ一作製のための材料は以下のものを使用した。
宿主： E. " c o 1 i MV 1 184,
プラスミド：
M 13mp 18 (B i o-Rad) ， M 13mp 19 (B i o— Rad) pUC 18 (宝酒造） ， pUC 19 (宝酒造）
pBSTN, p-B S T C
発現ベクター：
p AQN
試薬：和光純薬
遺伝子工学用試薬および K i t ：宝酒造
但し、 部位特異的異変 K i tは B i o— R a dのものを使用した
リンカ一：
H i n d I I Iリンカ一
5' -CCAAGCTTGG- 3' (配列番号 7) (宝酒造： 4760 A)
Xb a Iリンカー
5' — CTCTAGAG— 3' (配列番号 8) (宝酒造： 4693 A) 合成オリゴヌクレオチド：
プライマー BST 0 1
5 ' -TTATGTGAATTCGCTTAATATG- 3 ' (配列番号 9 ) プライマ一 BST02
5 ' -TTTTTATGTGAATGTGGAATTCATGAAGAAAATACTGA- 3 ' (配列番号 10 ) プライマー BST03
5 ' -CAAAACAATTACTGATTAATAGTGAATTGGCGATGTGGCAG- 3 ' (配列番号 1 1 ) プライマー BST04
5 ' -TGTTCTGTTCTGGGCTTAGTGATAAGATCTCTCGATGGAAGTTGCC- 3 '
(配列番号 12) b. 手順
JDAQNの改良 （図 3) まず： pAQNを H i nd I I Iと Xba Iで切断し、 クレノ一断片処理によ り平滑化し、 そのまま L i g a t i o nした。 この処理により、 H i n d I I I が消失し Xb a Iのみ復活した （図 3の pAQNAXH) 。 この改良工程におけ る塩基配列の変化の様子を下に示す。
TCTA-GA AAGCTT
AGATCT TTCGAA
Xba l H i n d I I I
I切断 ·平滑化 1切断 ·平滑化
TCTAG AGCTT AGATC TCGAA
1ライケーション
TCTAGAGCTT AGATCTCGAA
Xba l 次に、 pAQNAXHを Bg l I Iで切断し、 クレノー断片処理により平滑化 した。 続いて H i nd I I Iリンカ一を加えてライゲーシヨンした。 この処理に より B g 1 I I部位が H i n d I I I部位に置き換わった （図 3の p AQN— E HX) 。
pBSTCの改変と pAQN— EHXへの挿入 (図 4)
pBSTCに揷入されている STO 160の C末端側を含むと考えられている 1. 2 kbpの H i nd l l I断片を M 13m 18のクロ一ニング部位の H i n d I I Iに揷入した。 この際、 3' 末端がクローニング部位の E c oR I側 （ 即ち、 Xb a l側） の向きに揷入されているものを選択した （図 4の pMBST C) 。
次に pMBSTCを Hp a Iで切断し、 クレノ一断片処理により平滑化し、 X a Iリンカ一を加えてライゲ一ションした。 この処理により Hp a Iが Xb a Iに置き換わった （図 4の pMBSTC—HX) 。
pMB STC— HXを Xb a Iで切断し、 そのままライゲ一シヨンした。 この 処理により余分な Xb a I断片 （H i n d I I I部位を含む） が切除された （図 4の pMBSTC厶 X) 。
pMB STCAXの H i n d I I I -Xb a I断片を p AQN— EHXの H i n d I I I -Xb a I部位に挿入し、 pEBSTCを作製した。
STO 160の膜結合領域を削除した改変体の作製：なお、 S T 0160の膜 結合領域と推定されている領域 （以下、 「Mj と言う） 、 および phoUと相同 性の高い領域 （以下、 「P」 と言う） の機能および発現に及ぼす影響を解析する ことを目的として、 これらの領域を欠失した改変体も併せて作製した。
具体的には、 図 4中の p MB STCAXに対して部位特異的変異法を用い、 O RFのアミノ酸残基 539位のロイシン （プライマー BST03を使用） 、 およ び 498位のァスパラギン酸 （プライマ一 BNST04を使用） をコードする塩 基配列部分を各々終止コドンに改変した。 得られたプラスミドは各々 pMBST CAC 137および pMB STCAC 178である。 この際、 完全に翻訳を終止 するために、 3種類の終止コドンを挿入し、 さらに改変の簡易確認のために制限 酵素部位を併せて揷入した （pMBSTCAC l 37には P s hB I、 pMB S TCAC 178には Bg 1 1 1) 。
以下； pMBSTCAC 137および pMBSTCAC 178は、 上記 pMB STCAXの場合と同様にして、 H i nd i I I -Xb a I断片を p AQN— E HXの H i nd I I I -Xb a I部位に挿入し、 pEBSTを作製した （それぞ れ pEBSTCAC 137および pEBSTCAC 178) 。
p B S TNの改変と P EB S T Cへの揷入による発現ベクターの構築 (図 5) 実施例 1の I hで作製された pBSTNに挿入されている STO 160の N末 端側を含むと考えられている 1. 6 ¾:130の11 i nd I I I断片を、 Ml 3mp 19のクローニング部位の H i nd I I Iに挿入した。 この際、 N末端がクロ一 ニング部位の Ec oR I側の向きに揷入されたものを選択した （図 5の pMBS TN) 。
次に、 部位特異的変異法を用いて PBSTNの ORF開始部位の上流に E c o R I部位を揷入した。 この際、 Ec oR I部位とメチォニンをコードするコドン AT Cとの間を 0塩基としたもの （プライマ一 BST02を使用： pMBSTN -E 0) と 7塩基としたもの （プライマ一 BST01を使用： pMBSTN— E 7) の 2種類を作製した。 pMBSTN— EOをpAQNに揷入した場合、 SD 配列から AT Gまでの距離は 9塩基となり、 pMBSTN_E 7の場合には 16 塩基となる。 pMBSTN— E0で、 SD配列から ATGまでの距離を 9塩基と したのは、 その場合に発現効率が最も良くなると考えられているためである。 ま た、 pMBSTN— E7で、 前述したように b s t遺伝子が大腸菌にとって致死 遺伝子である可能性が考えられたため、 発現の程度を少し弱めたものを得るため に SD配列から AT Gまでの距離を若干大きくした。
pMBSTN— E0と pMBSTN— E 7を各々 Ec oR Iで切断し、 そのま まライゲーシヨンした。 この処理により余分な Ec oR I断片 （H i nd i I I を含む） が切断された （図 5の pMBSTN— Ε0ΔΕと pMBSTN— Ε7Δ E) 。
pMBSTN— Ε0ΔΕ、 および p B S ΤΝ_ Ε 7△ Εの E c o R I断片を ρ EBSTCの Ec oR I— H i nd i I I部位に揷入し、 発現ベクター pEBS Tを構築した （図 6)
pEBSTCAC 137および p EB STCAC 178についても同様に挿入 を行い、 以下の表 2に示す 6種類の S TO 160発現べクタ一を構築した。 表 2
pEB ST— E 0 = pBSTN— E 0 AE + pEBSTC = A2シリーズ pEBST— E7 = pBSTN— E7AE + pEBSTC = Alシリーズ pEBST-E0AM=pBSTN-E0AE+pBSTNCAC 137=B2 シリーズ
pEBST-E7AM=pBSTN-E7AE+pBSTNCAC 137=B l シリーズ
pEBST-E0AP=pBSTN-E0AE+pBSTNCAC 178=C2 シリーズ pEBST-E7 AP=pBSTN-E7 AE+pBSTNCAC l 78= 1 2 シリーズ
I I. 発現の実施例
(1) 形質転換； -および菌株の保存
- 80 で保存した E. col i MV1184 コンビテント細胞 （10 1 ) を氷中で 溶かし、 これに表一 2に示した 6種類の発現べクタ一 （1 0 /z l) を添加し、 30 分間氷中で放置した。 これを 42 で 1分間処理し、 その後 3分間氷中に放置した 。 これに、 37 に保温したし8培地を900 1添加し> 1時間， 37でで振 とうした。 振とう終了後、 本溶液を、 LB—アンピシリン、 I PTG、 X-G a 1寒天培地に塗布し、 37Τ 16時間培養した。
(2) 培養
得られた形質転換体 （6種類） を、 それぞれ LB—アンピシリン一 IPTG液体培地 で、 30 ：、 15 Orpm で振とう培養し、 菌体の増殖とシアル酸転移活性を測定 した。 なお、 菌体の接種は、 培地 0.5%量の（1) の方法で調製したグリセ口一ルス トツクを培地に添加することにより行った。 また、 培養液中のアンピシリン濃度 は 100mg/l、 IPTG濃度は 0. 02mM とした。 菌体の増殖は培養開始後、 培養 液を経時的にサンプリングして 66 Onmの吸光度を測定することによりモニタ一 した。
その結果、 A, B, C シリーズいずれの発現ベクターを含む E. col i MV1184 形質転 換株いずれも、 長いラグタイムの後に菌体の増殖が認められた。 それぞれの菌体 (A2, B2, C2) の増殖を図 9に示す。 図 9に示したように、 C シリーズ〉 Bシリーズ >Aシリーズの順番で増殖は速かった。 '
菌体からの粗酵素の調整は、 培養液から遠心分離で菌体を集めて、 0.2% Triton X- 100 を含む 20mMカコジレート緩衝液 （pH 5.0) に菌体を懸濁し、 これ を超音波処理して菌体を破砕して粗酵素とした。 表 3に示すように酵素生産量も OB>A の順であった。
シァリルトランスフェラ一ゼ活性は、 供給基質である CMP— 〔4, 5， 6, 7, 8, 9— 14C〕 — Ne uAcから受容基質であるラクト一スに転移した、 〔 4， 5, 6, 7, 8， 9— 14C〕 一 Ne uAcを測ることにより測定した。 標準 反応混合物は、 70nmolの CMP— 〔4， 5, 6, 7， 8， 9一14 C〕 —Ne u Ac (642cmp/nmol) 、 1. 25 mol のラクト一ス、 並びに 0. 02 %T r i t on X— 100を含む 2 OmM力コジレ一卜ナトリウム緩衝液 （pH5. 0)
25 l 中の酵素溶液からなる。 酵素反応は、 30 で 3分間行った。 全ての 測定は、 二重に行った。 反応後、 反応混合物を 5 mMリン酸ナトリウム緩衝液 （pH 6. 8) で 2mlに希釈し、 Dowe x l X 8 (リン酸型） のカラム （0. 5X2 cm) に充填した。 抽出物 （2ml) をシンチレーシヨンバイアルに直接集め、 計測 を行った。 抽出物中の、 受容基質に転移した 〔4, 5, 6, 7, 8， 9— 14C〕 一 Ne u Acの放射活性を液体シンチレ一シヨンカウンタ一で測定し、 転移した 〔4， 5， 6, 7， 8, 9—14 C〕 — N e u Acの量を測定した。 1単位 （U) は、 上述した条件下で 1 mo 1 のシアル酸を 1分間にラクト一スに転移する酵素 の量と定義した。 表 3
A1シリーズ 43 units/L
A2シリーズ 66 uni ts/L
B1シリーズ 74 units/L
B2シリーズ 112 units/L
C1シリーズ 91 uni ts/L
C2シリーズ 240 units/L
(3) 酵素反応生成物の同定
上記（2) に記載した方法で調製した粗酵素を、 イオン交換カラム （Q—セファ ロース， フアルマシア） 、 ハイドロキシアパタイト （高研製） で部分精製した酵 素を用いて、 糖受容体基質としてピリジルァミノ化ラクトース、 糖供与体基質と して CMP-NeuAc を用いて酵素反応を行い （30°C、 6 時間） 、 反応生成物を反応終 了後、 100°Cで 2分間処理することにより酵素を失活させた。 その後、 HPL Cで反応生成物の分析を行つた。 HPLCシステムとしては Shimazu LC-10 (島津製） 、 カラムとしては Takara PALPAK Type R (宝酒造製） を用い、 酵素を失活させた反応液 1 0 1 を、 0. 1 5 % n—ブタノ一ルを含む 1 0 OmM酢酸—トリェチルァミン （pH5. 0) で 平衡化したカラムに注入した。 ピリジルァミノ化糖鎖の溶出には溶出液 A (1 0 OmM酢酸ートリエチルァミン、 pH5. 0) 及び溶出液 B (0. 5 %、 n—ブタノ —ルを含む 1 0 OmM酢酸—トリェチルァミン、 pH5. 0) を用い、 3 0〜1 0 0 %溶出液 Bの直線濃度勾配法 （ 0〜 3 5分） 及び 1 00 %溶出液 B ( 3 5〜 5 0 分） により、 順次ピリジルァミノ化糖鎖の溶出を行い、 lml/minの流速、 40T: のカラム温度の条件下、 蛍光 （Ex ： 32 0nm、 Em： 40 Onm) を検出するこ とによりピリジルァミノ化糖鎖を検出した。
その結果 （図 1 0) 、 'いずれの粗酵素を用いて酵素反応を行った場合にも、 STO 160を酵素として反応を行つた場合と同じリテンションタイムをもつ反応生成 物のピークが検出されたことから、 6 種類の粗酵素はいずれもシアル酸をガラク トースの 6位に a 2、 6で転移していると判断した。
(4) 可溶化体酵素
一般に、 100, 000 xg, lhrで遠心分離を行い、 その遠心上清に存在するタンパ ク質は可溶化されていると定義される。 そこで、 C2シリーズの菌株を LB—アンピ シリン一 IPTG液体培地で、 30 、 1 5 Orpmで振とう培養し、 培養終了後、 遠 心分離を行い、 菌体を集め、 20mM力コジレ一卜緩衝液 （pH 5.0) に菌体を懸濁し 、 これを超音波処理して菌体を破砕して粗酵素とした。 この菌体破砕液を 4 ：、 100, 000 xg, lhrで遠心分離を行い上清を集め、 この遠心上清のシアル酸転移活 性を測定した。 その結果、 この遠心上清には、 （2) で示した酵素生産量の約 5 0 % (1 2 Ounis/L) の酵素が存在した。 一方、 Al, A2 シリーズの菌株を用いて同 様の検討を行ったところ、 界面活性剤が抽出緩衝液に含まれていない場合には、 100, 000 xg, lhrで遠心分離を行って得られた遠心上清にはほとんど酵素は存在 しなかった。 つまり、 本酵素をコードする遺伝子の C 末端側が膜結合に関与して いるものと考えられ、 この部分を欠損させたタンパク質を生産することで、 可溶 化体のシアル酸転移酵素を生産することが可能となった。 (5) C 2シリーズ形質転換体培養上清液のシァリルトランスフェラーゼ活性 前記 C 2シリーズの菌株を LB—アンピシリンー I PTG液体培地で 30 1 5 Orpmで振とう培養し、 〇D60。 が 2. 8となったとき 97 Oml分取し、 シァ リルトランスフエ-ラ一ゼ活性を測定した。
シァリルトランスフェラ一ゼ活性は、 供給基質である CM P— 〔4， 5, 6, 7， 8, 9— 14C〕 — Ne uAcから受容基質であるラクトースに転移した、 （； 4， 5, 6, 7, 8, 9— 14C〕 — Ne uAcを測ることにより測定した。 標準 反応混合物は、 70nmolの CMP— 〔4, 5, 6， 7, 8， 9一14 C〕 -Ne u Ac (642cmp/nmol) , 1. 25jamol のラク ] ス、 並びに 0. 02%Tr i t on X— 100を含む 2 ΟπιΜカコジレートナトリウム緩衝液 （pH5. 0)
25 l 中の酵素溶液からなる。 酵素反応は、 30 で 3分間行った。 全ての 測定は、 二重に行った。 反応後、 反応混合物を 5 mMリン酸ナトリウム緩衝液 （pH 6. 8) で 2mlに希釈し、 Dowe x l X8 (リン酸型） のカラム （0. 5X2 cm) に充填した。 抽出物 （2ml) をシンチレーシヨンバイアルに直接集め、 計測 を行った。 抽出物中の、 受容基質に転移した 〔4, 5, 6, 7, 8, 9— "C〕 一 Ne u Acの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定し、 転移した
〔4， 5, 6, 7, 8， 9— '4C〕 — Ne u Acの量を測定した。 1単位 （U) は、 上述した条件下で 1 mo 1 のシアル酸を 1分間にラクトースに転移する酵素 の量と定義した。
その結果、 シアル酸トランスフェラ一ゼ活性は、 12. 98UZ1であった。
9 ε
ΟΠ 501 001
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96 06 98
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115 120 125
Leu lie His He lie Gin Ala Lys Asp Glu Tyr Pro Ser Asn Gin Arg
130 135 140
Phe Val Ser Trp. Lys Arg Val Thr Val Asp Ala Asp Asn Ala Asn Lys 145 150 155 160
Leu Asn lie His Thr Tyr Pro Leu Lys Gly Asn Asn Thr Ser Pro Glu
165 170 175
Met Val Ala Ala lie Asp Glu Tyr Ala Gin Ser Lys Asn Arg Leu Asn
180 185 190 lie Glu Phe Tyr Thr Asn Thr Ala His Val Phe Asn Asn Leu Pro Pro
195 200 205
lie lie Gin Pro Leu Tyr Asn Asn Glu Lys Val Lys lie Ser His lie
210 215 220
Ser Leu Tyr Asp Asp Gly Ser Ser Glu Tyr Val Ser Leu Tyr Gin Trp 225 230 235 240
Lys Asp Thr Pro Asn Lys He Glu Thr Leu Glu Gly Glu Val Ser Leu
245 250 255
Leu Ala Asn Tyr Leu Ala Gly Thr Ser Pro Asp Ala Pro Lys Gly Met
260 265 270
Gly Asn Arg Tyr Asn Trp His Lys Leu Tyr Asp Thr Asp Tyr Tyr Phe
275 280 285
Leu Arg Glu Asp Tyr Leu Asp Val Glu Ala Asn Leu His Asp Leu Arg
290 295 300
Asp Tyr Leu Gly Ser Ser Ala Lys Gin Met Pro Trp Asp Glu Phe Ala 305 310 315 320
Lys Leu Ser Asp Ser Gin Gin Thr Leu Phe Leu Asp lie Val Gly Phe
325 330 335
Asp Lys Glu Gin Leu Gin Gin Gin Tyr Ser Gin Ser Pro Leu Pro Asn
340 345 350
Phe lie Phe Thr Gly Thr Thr Thr Trp Ala Gly Gly Glu Thr Lys Glu
355 360 365 Tyr Tyr Ala Gin Gin Gin Val Asn Val lie Asn Asn Ala lie Asn Glu
370 375 380
Thr Ser Pro Tyr Tyr Leu Gly Lys Asp Tyr Asp Leu Phe Phe Lys Gly 385 390 395 400
His Pro Ala Gly Gly Val lie Asn Asp lie lie Leu Gly Ser Phe Pro
405 410 415
Asp Met lie Asn lie Pro Ala Lys lie Ser Phe Glu Val Leu Met Met
420 425 430
Thr Asp Met Leu Pro Asp Thr Val Ala Gly lie Ala Ser Ser Leu Tyr
435 440 445
Phe Thr lie Pro Ala Asp Lys Val Asn Phe He Val Phe Thr Ser Ser
450 455 460
Asp Thr lie Thr Asp Arg Glu Glu Ala Leu Lys Ser Pro Leu Val Gin 465 470 475 480
Val Met Leu Thr Leu Gly lie Val Lys Glu Lys Asp Val Leu Phe Trp
485 490 495
Ala Asp His Lys Val Asn Ser Met Glu Val Ala He Asp Glu Ala Cys
500 505 510
Thr Arg lie lie Ala Lys Arg Gin Pro Thr Ala Ser Asp Leu Arg Leu
515 520 525
Val He Ala lie lie Lys Thr lie Thr Asp Leu Glu Arg lie Gly Asp
530 535 540
Val Ala Glu Ser He Ala Lys Val Ala Leu Glu Ser Phe Ser Asn Lys 545 550 555 560
Gin Tyr Asn Leu Leu Val Ser Leu Glu Ser Leu Gly Gin His Thr Val
565 570 575
Arg Met Leu His Glu Val Leu Asp Ala Phe Ala Arg Met Asp Val Lys
580 585 590
Ala Ala lie Glu Val Tyr Gin Glu Asp Asp Arg lie Asp Gin Glu Tyr
595 600 605
Glu Ser lie Val Arg Gin Leu Met Ala His Met Met Glu Asp Pro Ser 610 615 620 Ser fi e Pro Asn Val Met Lys Val Met Trp Ala Al a Arg Ser l ie Glu
625 630 ― 635 640
Arg Val Gly Asp Arg Cys Gin Asn l ie Cys Glu Tyr l i e l i e Tyr Phe
645 650 655
Val Lys Gly Lys Asp Val Arg His Thr Lys Pro Asp Asp Phe Gly Thr
660 665 670
Met Leu Asp
675
配列番号: 2
配列の長さ： 2709塩基対
配列の型： 核酸
鎖の数： ：本鎖
卜ポロジ一 直鎖状
配列の種類 Genomi c DNA
起源
生物名： ファトノ クテリゥムタムセ一ラ (Photobac ter ium damsela) 株名： J T O 1 6 0
配列： 配列番号 2
AAGCTTATCT TGAAATGAAT GATAAGGAAG GGGCGATTGA ATTACTTGAA GAGGTAACGG -336 CAAAAGCGGA TGGGGCTGTA AAAGCGGAAG CTGAGGAAGT TATTGAATAA CTAATTTTTC -276 AAATGTTCTG TTTTAAGGCG TAAACGATTG AGTCTCTTAA AGCGTACTAT GTCATCATAA -216 GGCTGGTGTG GCATAGTACG CACTTTTAAT GATCTTCATT ATTTATTACT TATTGGTATG -156 ACAGTTTGTA AATAATAATT TTTCAATTGA TATTTTTATG CTGGTATTGA ACCTGAAATC -96 AAATGAGATA TATCTCACAA AAAGCAAATG TAAACATCAT CTTAAATAGA TGAGGCAATA -36 TACTACTAAG AATTTTTTAT GTGAATGTGC TTAAT ATG AAG AAA ATA CTG ACA 18
Met Lys Lys l ie Leu Thr
1 5
GTT CTA TCT ATT TTT ATT CTT TCA GCG TGT AAT AGT GAC AAT ACC AGC 66 Val Leu Ser l ie Phe He Leu Ser Al a Cys Asn Ser Asp Asn Thr Ser
10 15 20 6 ε
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555 560 565
TCT TTA GAA TCT CTT GGC CAG CAT ACG GTT CGA ATG CTG CAT GAG GTG 1746 Ser Leu Glu Ser Leu Gly Gin His Thr Val Arg Met Leu Hi s Glu Val
570 575 580
TTA GAT GCG TTT GCT CGT ATG GAT GTT AAA GCC GCA ATA GAA GTG TAC 1794 Leu Asp Al a Phe Ala Arg Met Asp Val Lys Al a Al a l i e Glu Val Tyr
585 590 595
CAA GAA GAT GAT CGA ATT GAT CAA GAG TAT GAG TCG ATA GTC AGA CAG 1842 Gin Glu Asp Asp Arg l ie Asp Gin Glu Tyr Glu Ser l ie Val Arg Gin
600 605 610
CTA ATG GCC CAT ATG ATG GAA GAT CCA AGC TCA ATT CCT AAT GTA ATG 1890 Leu Met Al a His Met Met Glu Asp Pro Ser Ser He Pro Asn Val Met 615 620 625 630
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635 640 645
CAA AAC ATT TGT GAG TAC ATT ATC TAC TTT GTG AAG GGT AAA GAC GTT 1986 Gin Asn l ie Cys Glu Tyr l ie l ie Tyr Phe Val Lys Gly Lys Asp Val
650 655 660
CGC CAT ACC AAA CCA GAT GAT TTT GGT ACT ATG CTC GAT TAA 2028 Arg His Thr Lys Pro Asp Asp Phe Gly Thr Met Leu Asp STP
665 670 675
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配列の長さ： 38 配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸
配列： 配列番号: 3
GCIAAITAI I TIGCIGGIAC I I I ICCIGAI GCICCIAA 38 配列番号: 4
配列の長さ： 25
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸
配列： 配列番号: 4
GGGGGGGAAA CGAAAGAGTA TTATG 25 配列番号： 5
配列の長さ： 24
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸
配列： 配列番号: 5
ATTTTTCAAG GGGCATCCTG CTGG 24 配列番号： 6
配列の長さ： 17
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸
配列： 配列番号: 6
AAGATTTCAT TTGAGGT 17 配列番号： 7
配列の長さ： 10
配列の型： 核酸
鎖の数： 二本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： ί の核酸
配列： 配列番号: 7
CCAAGCTTGG 10 配列番号: 8
配列の長さ： 8
配列の型： 核酸
鎖の数： 二本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸
配列： 配列番号： 8
CTCTAGAG 8 配列番号： 9
配列の長さ： 22
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸
配列： 配列番号： 9
TTATGTGAAT TCGCTTAATA TG 22 配列番号： 10
配列の長さ： 38
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 配列： ' 配列番号： 10
TTTTTATGTG AATGTGGAAT TCATGAAGAA AATACTGA 38 配列番号： 1 1
配列の長さ： 41
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸
配列： 配列番号： 1 1
CAAAACAATT ACTGATTAAT AGTGAATTGG CGATGTGGCA G 41 配列番号： 12
配列の長さ： 46
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸
配列： 配列番号： 12
TGTTCTGTTC TGGGCTTAGT GATAAGATCT CTCGATGGAA GTTGCC 46

Claims

請求の範囲
1. 膜結合領域の少なくとも一部を欠損していてもよい、 組換え /3—ガラクト シド— α2, 6—シアル酸転移酵素。
2. 配列番号 Ϊの 16— 675のアミノ酸配列のうち、 499ないし 674の いずれかから 675までの部分を欠損していてもよいアミノ酸配列を有するタン パク質からなる、 請求項 1に記載の酵素。
3. 配列番号 1の 16— 675のアミノ酸配列のうち、 499から 675まで の部分を欠損したアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、 請求項 2に記載の 酵素。
4. 請求項 2または 3の酵素において、 そのアミノ酸配列に )3—ガラクトシド 一ひ 2 , 6-シアル酸転移酵素活性を失わない範囲で 1若しくは複数のアミノ酸 が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、 請 求項 2または 3の酵素。
5. 配列番号 1の 16— 498のァミノ酸配列をコ一ドする D N Aまたは配列 番号 1の 16— 498において、 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、 置換若しく は付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ] 3 _ガラクトシドー α 2, 6—シアル 酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする DN Αを含む発現べクタ一で形 質転換きれた宿主細胞を、 ]3—ガラクトシドー α 2, 6—シアル酸転移酵素の発 現を促進する条件下で培養し、 その培養物から —ガラクトシドー α 2, 6—シ アル酸転移酵素タンパク質を回収することからなる、 膜結合領域の少なくとも一 部を欠損している組換え 3—ガラクトシドーひ 2, 6—シアル酸転移酵素の製造 方法。
6. 発現べクタ一に含まれる DN Αが、 さらに、 配列番号 1の 499—X (X は、 500— 675の整数である） のアミノ酸配列をコードする DNA領域も含 む、 請求項 5の方法。
7. 発現ベクターのシグナル配列が宿主由来の DN Aである、 請求項 5または 6に記載の方法。
8. 発現べクタ一のシグナル配列が： (A) 配列番号 1の 1— 15のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする DN A 配列、 または
(B) 配列番号 1の 1一 15において、 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、 置換 若しくは付加されたァミノ酸配列からなり、 且つシグナル活性を有するぺプチド をコードする DN A配列
である、 請求項 5または 6に記載の方法。
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