JPH02261383A

JPH02261383A - β―ガラクトシダーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片

Info

Publication number: JPH02261383A
Application number: JP1082851A
Authority: JP
Inventors: Ryuichi Takiguchi; 隆一瀧口; En Hashiba; 橋場　炎
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1989-03-31
Filing date: 1989-03-31
Publication date: 1990-10-24

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】童粟上免肌几分団本発明は、ラクトバチルス・ブルガリカス由来のβ−ガ
ラクトシダーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片に関する。

このＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに組み込んだプラスミ
ドを作製することによって、ラクトバチルス・ブルガリ
カス由来のβ−ガラク［・シダーゼを大量に生産するこ
とが可能となる。

従米Ω韮通近年、組み換えＤＮＡ実験技術を中心とする遺伝子操作
技術は急激に発展してきた。

とりわけ、組み換えＤＮＡ実験技術の基礎研究として、
発現ベクターの開発が盛んに行われており、待に、大腸
菌の系においては、種々の発現ベクターが造成されてい
る。そして、これらの発現ベクターに目的の遺伝子を含
むＤＮＡ断片を組み込むことにより、宿主での物質生産
や形質発現が行われるのである。

この組み換えＤＮＡ実験技術を用い、バシルスステアロ
サーモフィラス由来の耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝
子を発現ベクターに組み込んで組み換えＤＮＡとし、そ
の組み換えＤＮＡによって形質転換した枯草菌でバシル
ス・ステアロサーモフィラス由来の耐熱性β−ガラクト
シダーゼを生産する方法（特開昭６ｌ−８１７８８）　
、並びに高度好熱菌サーマス・アクアティカス由来の耐
熱性βガラクトシダーゼ遺伝子を発現ベクターに組み込
んで組み換えＤＮＡとし、その組み換えＤＮＡによって
形質転換した大腸菌でサーマス・アクアティカス由来の
耐熱性β−ガラクトシダーゼを生産する方法（特開昭６
２−２０８２８５）が開示されている。

β−ガラクトシダーゼは、別名ラクターゼと称する酵素
で、哺乳動物の乳中に含まれる二ｔＪｉ　Ｉ！である乳
糖のβ−１，４結合に作用してグルコースとガラクトー
スを生成したり、また、その合成作用により、乳糖にガ
ラクトースが１．６結合したオリゴ糖を生成することも
知られている。したがって、乳及び乳製品の品質の改良
や新しい用途開発を目的として、β−ガラクトシダーゼ
の利用が活発になってきている。さらに、β−ガラクト
シダーゼは酵素免疫学的測定法において、標識酵素とし
ても用いられるようになってきている。

β−ガラクトシダーゼは、植物、動物小腸、そして、酵
母、カビ、細菌などの微生物に広く分布しているが、そ
の性状は給源によって異なっている。そのなかで、乳酸
桿菌のラクトバチルス・ブルガリカスは、発酵乳の乳酸
菌スターターとして用いられており、その乳酸発酵に寄
与するβ−ガラクトシダーゼの性質などについても研究
されているが、培地や培養条件が複雑であり、酵素の分
離・精製操作も煩雑であるため、ラクトバチルス・ブル
ガリカスを用いて、β−ガラクトシダーゼを生産するこ
とは極めて困難である。しかも、組み換えＤＮＡ実験技
術を用いて、大量にラクトバチルス・ブルガリカス由来
のβ−ガラクトシダーゼを生産する試みも未だなされて
いないのが現状である。

■が”°しよ゛とする諜本発明者らは、β−ガラクトシダーゼ産生能を有する乳
酸桿菌ラクトバチルス・ブルガリカスの染色体に、制限
酵素を作用させてβ−ガラクトシダーゼ産生遺伝子を含
むＤＮＡ断片を取り出し、このＤＮＡ断片をベクターＤ
ＮＡに組み込んだプラスミドを作製することによって、
ラクトバチルス・ブルガリカス由来のβ−ガラクトシダ
ーゼを大量に生産することを可能にし、本発明をなすに
至った。

したがって、本発明は、ラクトバチルス・ブルガリカス
のβ−ガラクトシダーゼ産生遺伝子を含む、特定な塩基
配列を表わされるＤＮＡ断片を提供することを課題とす
−る。

以下本発明の詳細な説明する。

菅　を　゛するための本発明におけるβ−ガラクトシダーゼを産生ずる乳酸桿
菌ラクトバチルス・ブルガリカスの染色体ＤＮＡは、次
のようにして分離することができる。

乳酸桿菌ラクトバチルス・ブルガリカス５ＢＴＯ０３４
株を培養集菌後、ムタノリシン溶液を加え、一定時間保
温する０次いで、ＳＤＳ溶液を加えて溶菌させた後、フ
ェノールおよびクロロホルム処理によってＤＮＡを抽出
する。ＤＮＡをエタノール沈澱によって回収した後、Ｒ
Ｎａｓｅ処理し、染色体ＤＮＡを得る。

染色体ＤＮＡは、制限酵素で完全に切断した後、同じ制
限酵素で切断したベクターＤＮＡに、Ｔ４リガーゼを用
いて連結することにより、上記染色体ＤＮＡをベクター
に組み込んだプラスミドが得られる。

上記のようにして得られた組換体プラスミドを、β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子が欠損した大腸菌に形質転換する
。乳酸桿菌ラクトバチルス・ブルガリカス５ＲＴＯ０３
４株のβ−ガラクトシダーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断
片を組み込んだベクターＤＮＡを保持する大腸菌の選択
は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド（以下Ｘ−Ｇａ１と称する）およ
びアンピシリンを含む寒天平板培地で培養し、Ｘ−Ｇａ
１がβ−ガラクトシダーゼにより分解されることによっ
て青色を呈したコロニーを選択することによる。

大腸菌からのプラスミドの抽出は、次のような常法によ
って行うことができる。プラスミドを保持する大腸菌を
培養集菌する。菌体の懸濁液にリゾチーム溶液を加えて
一定時間保温した後、ＳＤＳ溶液を加えて溶菌する。塩
化ナトリウム溶液を加え、水中に一定時間放置した後、
遠心分離によって上清を得、ポリエチレングリコール６
０００を加えてＤＮＡを沈澱させ回収する。ＤＮＡを緩
衝液に溶解し、エチジウムブロマイド−塩化セシウム平
衡密度勾配超遠心にかけて、プラスミドＤＮＡを得る。

このようにして得られたプラスミドＤＮＡは、再び大腸
菌に形質転換できる。

上記のようにして得られた、β−ガラクトシダーゼ産生
遺伝子を含むＤＮＡ断片が、乳酸桿菌ラクトバチルス・
ブルガリカスの染色体ＤＮＡ由来であることはサザンブ
ロフトハイブリダイゼーシッンによって、また、β−ガ
ラクトシダーゼ活性は活性染色によって確認する。

本発明による上記β−ガラクトシダーゼ産生遺伝子を含
むＤＮＡ断片の塩基配列を下記手順により決定を行った
結果、本ＤＮＡ断片は図１に示す塩基配列で表わされる
ことにより特定し得る。

上記塩基配列決定は〔α−”’）ｄＣＴＰを用いたジデ
オキシ法により行った。

β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を塩基配
列決定用プラスミドベクターｐＵｃ１８に挿入し、段階
的欠損法によって塩基配列決定用プラスミドを作製した
。

段階的欠損法にはキロシーケンス用デレーシジンキット
　（宝酒造社製）を、また、ジデオキシ法にはＭ１３シ
ーケンシングキフト　（宝酒造社製）を用いた。なお、
方法はそれぞれのキットの使用説明書に従った。

以下実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例１）乳酸桿菌ラクトバチルス・ブルガリカス５ＢＴＯ０
３４株からの染色体ＤＮＡの調製と切断：乳酸桿菌ラクトバチルス・ブルガリカスＳＢＴ００３４
株（徽工研菌寄第１００８１号）を、１００ｍ　ｌのＭ
Ｒ３ＢＲＯＴＨ（ＤＩＦＣＯ）に接種し、３７℃で一夜
培養して集菌した。菌体をＳＴＭ緩衝液（１０ａ＋Ｍ　
トリス−マレート、１Ｍシュクロース、ｐＨ６，５）で
２回洗浄した後、２ｙａｌの同緩衝液に懸濁した。これ
にムタノリシン（５００ｕ　ｇ／ｅａ　ｌ　）を２００
μ！加え、３７℃で３０分間保温した後、トリス−３Ｄ
Ｓ（０，ＩＭ　　）リス−塩酸、０．１ＭＮａＣｌ、１
％Ｓ　Ｄ　Ｓ　、　ｐ１１９．ｏ）を３−１力■え、６
５℃で１５分間保温した。これに、フェノールを加えて
撹拌し、遠心して上層を回収し、さらにクロロホルム：
イソアミルアルコール（２４；　１）を加えて抽出した
。得られた染色体ＤＮＡｆＪ液に、２倍量の冷却エタノ
ールを加え、遠心して回収し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　
　トリス−塩酸、１ｓＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、　ｐＨ８
，０）５■ｌに溶解した。

次に、ＲＮａｓｅ（２ｍｇ／＊　ｌ　）を１００．ｃｚ
Ｚ加え、３７℃で１時間保温した後、再び２倍量の冷却
エタノルを加え、遠心して回収した。得られた染色体Ｄ
ＮＡは、２■ｌのＴＥ緩衝液に溶解した。

染色体ＤＮＡ溶液を適当量とり、これに制限酵素Ｓａｌ
　Ｉを加えて３７℃で反応させ、完全に切断した後、１
％アガロースで電気泳動し、その約３ｋｂ１０ｋｂの大
きさのＤＮＡｆｉ分を、泳動熔出、フェノル処理、クロ
ロホルム抽出、エタノール沈澱によって回収した０回収
ＤＮＡは、ＴＥ緩衝液に溶解させた。

２）ベクターＤＮＡの切断および脱燐酸化二ベクターＤ
ＮＡｐＢＲ３２９０，２μｇに対し、制限酵素Ｓａｌ　
Ｉ　１ユニツトの割合で、１０ｓ＋Ｍ　）リス−塩酸（
ｐＨ８，０）、７ｍＭ　ＭｇＣＩｇ、１５０ｍＭ　Ｎａ
Ｃ１，７ｓ＋Ｍ　２−メルカプトエタノールの反応液中
において、３７℃で１時間反応させた後、フェノール処
理、クロロホルム抽出、エタノール沈澱によつ回収した
。回収したＤＮＡは、ＴＥ緩衝液に溶解した。

５ａｌｌ切断したＤＮＡ溶液（ＤＮＡ　１　ｐｇを含む
）に、１００倍量のＢＡＰ緩衝液（０，５Ｍ　）リス−
塩酸、ｐＨ８，０）　２０μｌを加え、さらに滅菌蒸留
水を加えて全体を２００μｌにした。これに、０．５ユ
ニットの大腸菌アルカリホスファターゼを加え、６０℃
で１時間反応させた後、フェノール処理、エーテル抽出
を行った。抽出したＤＮＡ溶液に３Ｍ酢酸ナトリウムを
２５μｌを加え、エタノール沈澱に、よって回収した。

回収したＤＮＡは、ＴＥ！１街液に溶解した。

３）ベクターＤＮＡへの染色体ＤＮＡ断片の挿入：上記
ｌ）及び２）項の染色体ＤＮＡ断片とベクタＤＮＡを、
およそ３：１の割合になるように混合し、ＤＮＡライゲ
ーションキット　（宝酒造）を用いて両者を連結させる
ことにより、組換え体プラスミドを得た。連結方法は、
ライゲーションキットの説明書に従った。

４）ＩＪｌｌｌｌｔえ体プラスミドの大腸菌への形質転
換：上記３）項の組換え体プラスミドを、大腸菌ＪＭ１
０５株のコンピテントセルに添加し、水中に３０分間放
置した後、４２℃で２分間処理した。これを、１．５■
ｌのＬＢ培地（塩化ナトリウム０．５％、トリプトン１
％、酵母エキス０．５％）に接種して、３７℃で１時間
培養した。この培養液を、アンピシリン（５０＋ｗｇム
０およびＸ−Ｇａｌ（４０ｍｇ八〇をへむＬＩ３寒天培
地に塗抹し、３７℃で一夜培養することによって、アン
ピシリン耐性の大腸菌形質転換体を得た。

５）β−ガラクトシダーゼを産生ずる大腸菌の選択：上
記４）項のようにして得られた大腸菌形質転換体のなか
から、産生じたβ−ガラクトシダーゼがＸ−Ｇａ１を分
解することにより、青色を呈したコロニーを選択した。

６）大腸菌からのプラスミドの抽出：上記５）項で得られた、β−ガラクトシダーゼを産生ず
る大腸菌形質転換体からのプラスミドの抽出は、次のよ
うな常法によった。

プラスミドを保持する大腸菌を培養集菌し、湿重量２ｇ
の菌体を、緩衝液（２５％５％シェフロース０μｌ１Ｍ
トリスー塩酸、ｐＨ８，０）　５ｎａｌに懸濁し、これ
にリソ゛チームを３液（５１１ｇ／＋ｗ　ｊ！　）１ｍ
　ｌ、０．２５Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐＨ８，０）２
■ｌおよびＲＮａｓｅ（５ｍｇ／＋ｗ　ｌ　）０．２ｍ
　１．を添加して、水中に５分間放置した。３７℃で３
分間加温した後、１０％ＳＤＳを１曽ｌ加え、３７℃で
１分間保温した。

さらに、５Ｍ　ＮａＣｌを２．５■ｌ加え、水中に３時
間放置した後、遠心分離して上層（ｃｌｅａｒｅｄ　１
ｙｓａｔｅ）を抽出した０等量の２０％ポリエチレング
リ′コーノ娑６０００溶液を加えて４℃に一夜放置し、
プラスミドを沈澱させた。

遠心分離によってプラスミドを回収し、少量のＴＥｉ街
液に熔解して、エチジウムブロマイド−塩化セシウム平
衡密度勾配超遠心にかけ、プラスミドを得た。このよう
にして得られた、乳酸桿菌ラクトバチルス・ブルガリカ
ス５ＢＴＯ０３４株由来のβ−ガラクトシダーゼ産生遺
伝子を含むＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドを、ｐＢ
ｏｌと名付け、その制限酵素地図を図２に示した。

７）サザーンブロットハイプリダイゼーション：ｐＢＧ
ｌに組み込まれた、β−ガラクトシダーゼ産生遺伝子を
含むＤＮＡ断片が、乳酸桿菌ラクトバチルス・ブルガリ
カス５ＲＴＯＯ３４の染色体ＤＮＡ由来であることを確
認するために、サザーンブロットハイブリダイゼーシッ
ンを行った。

ＤＮＡのメンブレンへの移行は常法によった。

プローブは、ビオチン−ｄＵＴＰ　（ＢＲＬ）を、また
、ハイブリダイゼーシロンはブルージーンキット（ＢＲ
Ｌ）を用い、実験方法はキットの説明書に従った。

上記サザーンブロフトハイブリダイゼーションの結果、
プローブはｐＢＧｌの５ａｌｌｌ切断物、ｐＢＧｌのＳ
ａｌ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ切断物のｐＢＧＩに組み込まれ
たＤＮＡ切断部分と、乳酸桿菌ラクトバチルス・ブルガ
リカス５ＢＴＯ０３４株の染色体ＤＮＡの制限酵素５ａ
ｌｔによる切断物におけるｐＢＧｌに組み込まれたＤＮ
Ａ断片と同じ大きさのＤＮＡ部分とにハイブリダイズし
たが、宿主菌である大腸菌ＪＭ１０５株（２）およびβ
−ガラクトシダーゼ活性をもっている大腸菌Ｈ８１０１
株（１）の染色体ＤＮＡとはハイブリダイズしなかった
。

以上のことから、ｐＢＧｌに組み込まれたβ−ガラクト
シダーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片が、乳酸桿菌ラク
トバチルス・ブルガリカス５ＢＴＯ０３４株の染色体Ｄ
ＮＡ由来であることが明らかとなった。

８）β−ガラクトシダーゼ活性染色：ｐＢＧｌを保持する大腸菌３Ｍ１０５株が産生ずるβ−
ガラクトシダーゼが、乳酸桿菌ラクトバチルス・ブルガ
リカス５ＢＴＯ０３４株の産生ずるβ−ガラクトシダー
ゼと一致することを、活性染色によって確認した。

大腸菌３Ｍ１０５株（ｐＢｏｌを保持）、大腸菌３Ｍ１
０５株（ベクターＤＮＡｐＢＲ３２９のみを保持）、大
腸菌ＨＢ　１０１株および乳酸桿菌ラクトバチルス・ブ
ルガリカス５ＢＴＯ０３４株を培養集菌し、それぞれ１
０禦阿トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁した。

これを超音波破砕機にかけて、菌体内抽出物を回収し、
濃縮して、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行っ
た。泳動後のゲルをＸ−Ｇａ１溶液に浸漬し、活性染色
を行った。

その結果、β−ガラクトシダーゼ活性は、１．３および
４には検出されたが、ベクターＤＮＡｐＢＲ３２９のみ
を保持する大腸菌３Ｍ１０５株には、活性は検出されな
かった。

また、ｐＢＧｌを保持する大腸菌３Ｍ１０５株のβ−ガ
ラクトシダーゼ活性は、乳酸桿国ラクトバチルス・ブル
ガリカス５８１００３４株の活性と同じ泳動値で検出さ
れ、また、大腸菌Ｈ８１０１株の活性とは異なる泳動値
で検出された。

以上のことから、ｐＢＧｌを保持する大腸菌３Ｍ１０５
株が産生ずるβ−ガラクトシダーゼは、乳酸桿菌ラクト
バチルス・ブルガリカス５ＢＴＯ０３４株の産生ずるβ
−ガラクトシダーゼと一致することが確認された。

従って、本結果と、上記７）項の結果を総合すると、ｐ
ＢＧｌに組み込まれたβ−ガラクトシダーゼ産生遺伝子
を含むＤＮＡ断片は、乳酸桿菌ラクトバチルス・ブルガ
リカスＳＢＴ００３４の染色体ＤＮＡに由来するもので
あり、また、この遺伝子が産生ずるβ−ガラクトシダー
ゼは、乳酸桿菌ラクトバチルス・ブルガリカス５ＢＴＯ
０３４株が産生じているβ−ガラクトシダーゼに一致す
ると結論づけられる。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明によるラクトバチルス・ブルガリカス由
来のβ−ガラクトシダーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片
を表わす塩基配列を示したものであり、図２は、本発明
によるβ−ガラクトシダゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片
を組み込んだプラスミドの制限酵素地図を示したもので
ある。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）由来のβ−ガラク
トシダーゼ産生遺伝子を含む、添付の図１に示した塩基
配列で表わされるＤＮＡ断片。
（２）ラクトバチルス・ブルガリカスが、ラクトバチル
ス・ブルガリカスＳＢＴ００３４（微工研菌寄第１００
８１号）であることを特徴とする請求項（１）に記載の
ＤＮＡ断片。