WO1998025137A1 - Capillaire avec revetement de la paroi interne - Google Patents

Description

m 糸田 ¾ 内壁をコ一ティングしたキヤピラリー 発明の背景

産業上の利用分野

本発明は、 ポリマ一を吸着したキヤピラリ一及びその製造方法に関する, 従来技術

キヤビラリ一電気泳動 （以下 C Eと称することがある） は、 内径 1 0 0 以下のキヤピラリー内で行う電気泳動の総称である。 C Eは超高分解 能 （理論段数 1 0 0 0 0 0〜 1 0 0 0 0 0 0 0段） 、 高速分析、 微小試料 量 （数 n 1 ) 、 水系溶媒を用いる、 キヤビラリ一オンライン検出が可能な どの特徴を有している。 これらの特徴を利用して C Eは薬物、 食品、 環境 物質の測定などさまざまな分野に利用されている。 その中でも、 今後 C E によってますます発達する可能性がある分野として蛋白質分析が挙げられ る。 しかし、 キヤビラリ一の内壁には疎水性の珪素及び極性のシラノール 基が存在すると考えられ、 このため、 C Eによる蛋白質分析においては、 溶質とキヤビラリー内壁とのイオン性相互作用および疎水性相互作用のた め、 しばしばピークのテーリングあるいは溶質の壁面への不可逆的吸着が 認められる。 その解決策として内壁を親水性物質でコ一ティングしたキヤ ビラリ一が供されている。

現在知られている内壁をコ一ティ ングしたキヤビラリ一は、 いずれも安 定性に乏しい、 ロッ ト差がある、 吸着防止能不十分、 価格が高い等の多く の問題を有しており、 これらの問題を解決するための更なる技術が望ま れている。 発明の開示

本発明は、 ①キヤビラリーの内壁に正電荷を有するイオン性ポリマーと 負電荷を有するイオン性ポリマーを交互に吸着することを特徴とするキヤ ピラリー、 ②キヤピラリーの内壁に正電荷を有するイオン性ポリマーと負 電荷を有するイオン性ポリマ一を交互に吸着し、 最内層が正電荷を有する イオン性ポリマ一であることを特徴とするキヤピラリー、 ③キヤピラリー の内壁に正電荷を有するイオン性ボリマーと負電荷を有するイオン性ボリ マーを交互に吸着し、 最内層が負電荷を有するイオン性ボリマーであるこ とを特徴とするキヤビラリ一、 ④キヤビラリーの内壁に正電荷を有するィ オン性ポリマーと負電荷を有するイオン性ポリマ一を交互に吸着すること を特徴とするキヤピラリーの製造方法、 ⑤前記キヤビラリ一の製造方法に おいて、 正電荷を有するイオン性ポリマーを吸着する前に、 最初に強アル 力リ溶液でリンスすることを特徴とするキヤピラリーの製造方法である。 本発明に係るキヤビラリ一とは、 キヤビラリ一電気泳動用キヤピラリー、 ガスクロマトグラフィー · マススぺク トルメ トリーの連結に用いるキヤピ ラリー等を意味し、 さらに、 マススペク トルメ トリーのインフュージョ ン 分析、 キヤビラリ一電気泳動/マススぺク トルメ トリ一への応用も可能であ る。

キヤビラリ一の材質は、 通常は溶融石英ガラスであり、 内径は通常 5 0 ^〜： L 0 0 である。

本発明における正電荷を有するイオン性ポリマ一とは、 水又はメタノー ル、 エタノール、 ァセトニトリル等の水性有機溶媒に溶解する正電荷を 有するポリマーを意味し、 具体的にはポリプレン、 キトサン、 ジェチル アミノエチルデキストラン、 ボリエチレンイミン等を挙げることができ る。 これらの物質は通常は単独で使用されるが、 混合して用いても差支 えない。 また、 層毎に異なる物質を使用することもできる。

本発明における負電荷を有するイオン性ポリマーとは、 水又はメタノー ル、 エタノール、 ァセトニトリル等の水性有機溶媒に溶解する負電荷を有 するポリマ一を意味し、 具体的にはデキス トラン硫酸、 へパリン、 へパリ ン硫酸、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン硫酸、 ケラタン硫酸、 ポリガラク トロン酸、 アルギン酸、 テイクロン酸等を挙げることができる。 これらの 物質は通常は単独で使用されるが、 混合して用いても差支えない。 また、 層毎に異なる物質を使用することもできる。

本発明に係るキヤピラリーは、 正電荷を有するイオン性ポリマーと負電 荷を有するイオン性ポリマーを交互に同回数吸着した場合には、 最内層

(泳動液に接する層） が負電荷を有するイオン性ポリマーであり、 正電荷 を有するイオン性ポリマーの吸着回数が負電荷を有するイオン性ポリマー より 1回多い場合は、 最内層が正電荷を有するイオン性ポリマ一である。 通常は、 正電荷を有するイオン性ポリマ一と負電荷を有するイオン性ポリ マーを交互に 1回づっコ一ティ ングするか 又は正電荷を有するイオン性ポ リマ一、 負電荷を有するイオン性ポリマー次いで正電荷を有するイオン性 ポリマーを交互にコーティ ングする力 両層を交互に 2 回以上コ一ティ ン グすることもできる。

本発明にかかるキヤピラリーを製造するには、 例えば、 正電荷を有する イオン性ポリマーと負電荷を有するイオン性ボリマ一が交互に 1回ずつの 場合は、 まず、 キヤピラリーを 1 N水酸化ナトリウムでリ ンス後、 水で リンスし、 次いで、 正電荷を有する低濃度のイオン性ポリマーでリンス 後、 正電荷を有する高濃度のイオン性ポリマーでリンスし、 直ちに高濃 度の負電荷を有するイオン性ポリマーでリンスすることにより製造する ことができる。

イオン性ボリマ一を 2層以上吸着したキヤビラリーは、 1 N水酸化ナ卜 リウム とそれに続く水によるリンスを行わない以外は上記手順を繰り返す ことにより製造することができる。 1 N水酸化ナトリウムによるリンスは、 水酸化力リゥム等の他の強アル力リ溶液により行うこともできる。

正電荷を有する低濃度のイオン性ポリマーの濃度とは、 イオン性ポリマ —の種類により異なり一概にいえないが、 一般には、 電気浸透流がイオン 性ポリマーの濃度に大きく依存しない濃度範囲内の低濃度を意味し、 例え ば、 ボリプレンにおいては 0 . 1〜 0 . 5 %好ましくは約 0 . 4 %である。 また、 正電荷を有する高濃度のイオン性ポリマーとは、 電気浸透流がィォ ン性ポリマーの濃度に大きく依存しない濃度範囲内の高濃度を意味し、 例 えば、 ポリプレンの場合は 3 %〜 1 0 %好ましくは 5 %〜 1 0 %である。 高濃度の負電荷を有するイオン性ポリマーの濃度とは、 溶媒に溶解しう るできるだけ高濃度が好ましいが、 一般に高濃度になると溶媒の粘度が増 大し、 リンスすることが困難になるため、 両者のバランスにより決定され、 通常 1 %〜 5 %であり、 例えば、 デキス トラン硫酸の場合は約 2 %であり、 へパリンの場合約 3 %である。 図面の簡単な説明

図 1は、 内壁未処理キヤピラリー及び内壁コートキヤビラリ一の電気浸 透流を表すグラフである。 MLは本発明に係るキヤビラリ一を意味し、 uncoatedは対照として用いたコーティ ングしていないキヤピラリーを意味 する。

図 2は、 酸性条件におけるキヤビラリ一ゾーン電気泳動を示す図である。 ML coatedは本発明に係るキヤビラリ一を意味し、 uncoatedは対照として 用いたコーティ ングしていないキヤビラリ一を意味する。 右上の図は電気 浸透流がない状態を表し、 右下図は矢印の方向に電気浸透流が流れている ことを表す。

図 3は、 酸性条件におけるミセル動電クロマトグラフィーを示す図であ る。 ML coatedは本発明に係るキヤピラリーを意味する。

図 4は、 キヤピラリー電気泳動法による トリブトファンの p K a測定を 示す図である。 ML coatedは本発明に係るキヤビラリ一を意味し、 uncoatedは対照として用いたコーティ ングしていないキヤビラリ一を意味 する。

従来用いられている内壁未処理キヤビラリ一は、 内壁にシラノール基を 有するため、 電気浸透流はシラノール基の解離に依存する。 泳動液の p H が低くなるほどシラノ一ル基の解離が抑制されて電気浸透流は小さくなり、 p H 3以下ではほぼ止 まる （図 1、 口印） 。 本発明にかかるキヤビラリ一 は、 例えばデキス トラン硫酸を最内層にコ一ティ ングした場合は泳動液の p Hに非依存的な電気浸透流を持つ （図 1、 秦印） 。 一方、 L P Aコート キヤピラリ一に代表される市販のコ一卜キヤピラリーは全ての

p Hで電気浸透流が抑制されている （図 1、 三角印） 。 したがって、 内壁 未処理キヤビラリ一及び L P Aコートキヤピラリーと本発明にかかるキヤ ピラリーの本質的な違いは、 本例においては本発明にかかるキヤピラリー が酸性条件下で、 ァノード側からカソード側へと電気浸透流が流れるこ とであり、 このため、 以下の実験例に示すような著しい効果をもたらす (図 1中、 ◊印は正電荷を有するイオン性ボリマーであるポリプレンを コ一ティ ングしたキヤビラリ一である。 なお、 キヤピラリーの有効長は

2 0 c mである） 。

さらに、 正電荷を有するイオン性ボリマーと負電荷を有するイオン性ボ リマ一を複数回コ一ティ ングすることによりキヤピラリーの寿命 （耐用回 数） が顕著に増大するという著しい効果を有する。 また、 複数回コーティ ングしたキヤビラリ一は、 酸性溶液、 アルカリ性溶液及び水性有機溶媒の すべてに対して化学的安定性が向上する。 即ち、 これらの溶媒を使用して もコ一ティ ングが容易に剥離することがない。 そのうえ、 複数回コーティ ングしたキヤピラリーは理論段数が高く、 特に塩基性蛋白質の分析に顕著 な効果を発揮する。 実験例 1 ： 酸性条件下におけるキヤピラリーゾーン電気泳動

酸性条件下におけるキヤピラリーゾーン電気泳動 （capillary zone electrophoresis, 以下 C Z Eと略す） の例を図 2に示す。 泳動液は p H 2 7 5なので、 内壁未処理キヤビラリ一では電気浸透流はほぼ止まっている と考えられる。 分析試料には pH 2. 7 5で正電荷を有するキニーネ、 負 電荷を有する p— トルエンスルホン酸及び中性のフエノールを用いた。 内 壁未処理キヤピラリーを用いた C Z Eでは正電荷を有するキニーネのみが 検出された （図 2上図） 。 電気浸透流が抑制されているため中性のフエノ ール及び負電荷の p— トルエンスルホン酸は検出されなかった。 実施例 1 により得られた本発明にかかるキヤピラリーでは電気浸透流が発生するた め全てのピークが検出された （図 2下図） 。 以上より明らかなように、 本発明にかかるキヤピラリーを用いると、 従来は不可能であった酸性条 件下における正電荷、 負電荷及び中性の化合物の一斉分析が可能となつ た。 実験例 2 ： 酸性条件におけるミセル動電クロマトグラフィー

ミセル動電クロマトグラフィー （micellar e 1 ec t r oki ne t i c

chromatography, 以下 ME KCと略す） は、 泳動液中にイオン性ミセルを 加えることにより、 チャージのない化合物の分離を可能にするモードであ る。 酸性条件下における ME KCは S D Sがキヤビラリ一内壁に吸着する ため、 電気浸透流がわずかに発生する。 容量比（k')が大きい試料はァノー ド側で、 小さな試料は力ソード側で検出され、 電気浸透流と逆方向に等し い移動度を持つ試料はどちらからも検出されない。 したがって、 一斉分析 は不可能、 若しくは可能な試料についても著しく長い分析時間を必要とす る。 実施例 1により得られたキヤピラリーを用いた酸性条件下 （p H 2. 7 5)における MEKCの実験例を図 3に示す。 試料にフエノール、 3， 5— キシレノール及び 2—ナフ トールを用い分析を行ったところ、 短時間に一 斉分析が達成された。 即ち本発明にかかるキヤピラリーを用いることによ つて、 酸性条件で中性化合物の一斉分析を ME K Cにより短時間で行うこ とができた。 実験例 3 ： p K a測定

従来の内壁未処理キヤピラリーを用いた p K a測定では、 p K a値の低 い化合物の測定は困難であった。 すなわち、 内壁未処理キヤピラリーは P Hの低下とともに電気浸透流が小さくなりやがて止まつてしまうため、 試料と電気浸透流の差から移動度を求め p K aを計算するキヤビラリ一 電気泳動法は酸性領域では誤差を生じていた。 そこで、 酸性条件でも電 気浸透流が一定に発生する実施例 1によ り得られた本発明にかかるキヤ ピラリーを用いて p K a測定を行った。 試料にはトリブトファンを用い、 石浜らの値及び文献値と比較した。 結果を表 1に示す （表中、 ML coatedは本発明に係るキヤピラリーを意味し、 uncoatedは対照として用い たコーティ ングしていないキヤビラリ一を意味する） 。

表 1

C E法による T r pの p K a値の比較

T r pの p K a値

ML coated 2. 3 8

uncoated (石浜測定値） 2. 3 1

文献値 2. 3 8

表より明らかなように、 本発明を用いた測定値は文献値とよく一致した,

P H 3. 1 0におけるエレク ト口フエログラムを図 4に示す。 内壁未処理 キヤピラリ一では電気浸透流が 2 0分過ぎに検出されたのに対し （図 4上 図） 、 本発明にかかるキヤビラリ一では 4分以内に検出された （図 4下 図） 。 また、 本発明にかかるキヤビラリ一は ρ H3.10以下においても電気 浸透流のピークがほぼ同じ時間に再現よく検出されるため、 より低い p K a値を持つ化合物の； K a測定をより正確に行うことができると考えられ る。 また、 図 4から明らかなように、 本発明にかかるキヤビラリ一は酸性 条件における分析時間の短縮も可能にした。 実験例 3 ： 実施例 2により得られたキヤビラリ一を用いて連続分析にお ける耐 久性試験を行った。 P H 3における電気浸透流を測定することによ り評価したところ、 対照に用いたポリプレンを 1層コ一ティ ングしたキヤピ ラリーは約 2 0回で コーティ ングが剥離したのに対し、 実施例 2によるキ ャビラリ一は 5 9 3回安定 であった。 これは、 キヤビラリー内壁のシラノ —ル基とボリプレンのイオン的な相互作用よりも、 へパリン分画とポリブ レンとのイオン的相互作用の方が強いためと考えられる。 実施例

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、 本発明がこれに 限定されるわけではない。

実施例 1

はじめにキヤビラリー内壁の汚れを除去し、 シラノール基を完全に解離 させるため、 キヤビラリ一電気泳動装置（Be c kman P/ACE 2 1 00)のリンス機 能を用いて 1 N N a O Hで 3 0分間、 次いで水で 1 5分間リンスした。 次 に、 0 . 4 %ポリプレン水溶液で 3 0分間リ ンスし、 ー晚放置した。 ー晚 放置後、 マーカー （ホルムアミ ド希釈液） を用いて電気浸透流（e o)が逆転 していることを確認し、 5 %ポリブレン水溶液を 5分間リンスした後直ち に 2 %デキス トラン硫酸水溶液を 1 0分間リンスすることによって本発明 に係るキヤピラリーを製造した。

実施例 2

はじめにキヤビラリ一内壁の汚れを除去し、 シラノ一ル基を完全に解離 させるため、 キヤピラリー電気泳動装置 （Beckman P/ACE 2100) のリン ス機能を用いて INNaOHで 3 0分間、 次いで水で 1 5分間リンスした。 次 に、 1 0 %ポリブ レン水溶液、 3 %へパリン分画 III (ヮコ一株式会社 より購入） 水溶液、 1 0 %ポリプレン水溶液の順に 1 5分間リンスして 本発明に係るキヤピラリーを製造した。

Claims

求 の 囲

1 . キヤビラリーの内壁に正電荷を有するイオン性ポリマーと負電荷を 有するイオン性ポリマーを交互に吸着することを特徴とするキヤピラリー,

2 . キヤピラリーの内壁に正電荷を有するイオン性ボリマーと負電荷を 有するイオン性ポリマーを交互に吸着し、 最内層が正電荷を有するイオン 性ポリマーであることを特徴とするキヤビラリ一。

3 . キヤピラリーの内壁に正電荷を有するイオン性ボリマーと負電荷を 有するイオン性ポリマ一を交互に吸着し、 最内層が負電荷を有するイオン 性ポリマ一であることを特徴とするキヤビラリ一。

4 . 正電荷を有するイオン性ポリマーがポリプレン、 キトサン、 ジェチ ルアミノエチルデキス トラン又はポリエチレンイミンである請求項 1〜 3 いずれか 1項記載のキヤビラリ一。

5 . 負電荷を有するイオン性ポリマーがデキス トラン硫酸、 へパリン、 へパリン硫酸、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン硫酸、 ケラタン硫酸、 ポリ ガラク トロン酸、 アルギン酸又はテイク口ン酸である請求項 1〜 3いずれ か 1項記載のキヤピラリー。

6 . キヤピラリーの内壁に正電荷を有するイオン性ボリマーと負電荷を 有するイオン性ポリマーを交互に吸着することを特徴とするキヤビラリ一 の製造方法。

7 . 請求項 6におけるキヤピラリーの製造方法において、 正電荷を有す るイオン性ポリマーを吸着する前に、 最初に強アル力リ溶液でリンスする ことを特徴とするキヤビラリーの製造方法。