JPH05288717A - キャピラリーコーティング剤 - Google Patents

キャピラリーコーティング剤

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JPH05288717A
JPH05288717A JP4092848A JP9284892A JPH05288717A JP H05288717 A JPH05288717 A JP H05288717A JP 4092848 A JP4092848 A JP 4092848A JP 9284892 A JP9284892 A JP 9284892A JP H05288717 A JPH05288717 A JP H05288717A
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JP
Japan
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capillary
chitosan
weight
solution
molecular weight
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JP4092848A
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English (en)
Inventor
Norio Okuyama
典生 奥山
Tomonori Izumi
友則 泉
Masato Yamaguchi
正人 山口
Masanori Hashimoto
正憲 橋本
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Kurita Water Industries Ltd
Original Assignee
Kurita Water Industries Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 キャピラリー電気泳動における分離効率、再
現性、分析精度の向上に有効なキャピラリーコーティン
グ剤を提供する。 【構成】 低分子量キトサンよりなるキャピラリーコー
ティング剤。 【効果】 低分子量キトサンは、シラノール基等の官能
基の電荷を効果的に中和して、電気浸透流やタンパク質
の吸着を確実に防止する。キトサンは生分解性に優れ、
人体に安全である。容易にコーティング処理できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はキャピラリーコーティン
グ剤に係り、特に、キャピラリーゾーン電気泳動(CZ
E:Capillary Zone Electrophoresis)、等電点電気泳
動IEF:(Iso-electric Focusing )等のキャピラリ
ー電気泳動(CE:capillary elect-rophoresis)にお
ける分離効率、再現性、分析精度の向上に有効なキャピ
ラリーコーティング剤に関する。
【0002】
【従来の技術】キャピラリー内で行なう電気泳動、即
ち、キャピラリー電気泳動CEのキャピラリーとして
は、一般に内径0.1mm以下のフューズドシリカ管が
用いられている。
【0003】CEにおいて、このキャピラリー内面は、
一般にシラノール基のイオン化などにより負に帯電して
いる。電気的中性の原理から、キャピラリー内の液体は
壁面に固定された負電荷と等量の正電荷を余分に含まな
ければならない。このような正電荷の大部分は壁面の負
電荷に引き寄せられて電気二重層を形成する。キャピラ
リーの両端に電圧を印加すると、液中の正味の正電荷は
負極方向へ引っ張られる。この正電荷の移動に伴いその
周囲の液体も負極方向へ引っ張られ、電気浸透流が生じ
る。
【0004】ところでCEで行なうIEFは、ゲル中で
はなく自由溶液中で行なわれる。この場合、広いpH範
囲に等電点を持つ両性電解質の混合物であるアンフォラ
イトを用いてpH勾配をキャピラリー内に形成させる。
このpH勾配を安定させるためには、電気浸透流を完全
に抑制することが望ましい。
【0005】一方、CZEにおけるバンドの広がりの主
な要因はキャピラリー管軸方向への分子拡散であるの
で、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)と異なり
タンパク質のような高分子は一般的に狭い(シャープ
な)ピークが得られるはずであり、この点から、HPL
Cは低分子量化合物の分析に適しているのに対し、CE
はHPLCで取り扱いの難しい生体高分子に適している
と言える。
【0006】しかしながら、実際には、タンパク質のC
ZEでは、キャピラリー内面のシラノール基への試料タ
ンパク質の吸着が常に問題となり、ごくわずかな吸着で
も分離性が著しく損なわれるという問題がある。同様の
ことはIEFについてもいえる。
【0007】従来、このキャピラリー内面のシラノール
基へのタンパク質の吸着を抑える方法としては、以下に
記す3つの方法が主に採用されている。 pHをタンパク質の等電点(pI)以上に高くし
て、タンパク質及びキャピラリー内面の両方共負に帯電
させ静電反発を利用する。 pHを低くしてシラノール基のイオン化を抑え、キ
ャピラリー内面を中性にして静電的効果による吸着を防
ぐ。 キャピラリーの内面に種々のコーティングを施し、
吸着を防止する。
【0008】これらのうち、特にのコーティング法に
ついての研究が精力的になされている。従来提案されて
いるコーティング技術としては、主に化学結合型とダイ
ナミックコーティング法とがある。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】上記従来のコーティン
グ技術では、コーティング方法が煩雑である、コーティ
ング後の分析における再現性等において問題がある等の
欠点があった。また、ポリアミン等のコーティング剤は
人体に対し毒性があり、安全なコーティング剤が望まれ
ていた。
【0010】また、前述の如く、IEFでは、キャピラ
リー内面のシラノール基に起因する電気浸透流を完全に
制御することが分離性能の面で望ましい。この点からも
シラノール基による電気浸透流を防止する良好なコーテ
ィング剤が望まれている。
【0011】本願発明は上記従来の問題点を解決し、キ
ャピラリー内面に容易にコーティングすることができ、
キャピラリー内面のシラノール基等を確実にコーティン
グして電荷を中和し、CZEやIEF等における分離性
能を大幅に改善することができ、しかも、人体に悪影響
がなく安全性の高いキャピラリーコーティング剤を提供
することを目的とする。
【0012】
【課題を解決するための手段】本発明のキャピラリーコ
ーティング剤は、低分子量キトサンを含むことを特徴と
する。
【0013】以下に本発明を詳細に説明する。
【0014】本発明のキャピラリーコーティング剤の有
効成分である低分子量キトサンの分子量は特に制限され
ないが、低分子量のものほど溶解性が良い。
【0015】また、溶液として用いる場合の濃度につい
ても特に限定されないが、過度に低濃度であるとコーテ
ィング効率が悪く、逆に過度に高濃度のものは粘性が高
く、キャピラリー内への注入が困難となる。
【0016】本発明において、低分子量キトサンの望ま
しい分子量は5000〜100000、望ましくは10
000〜50000、また、コロイド当量としては3〜
7meq/g−キトサン程度が好ましい。溶液とした場
合の望ましい濃度範囲は0.01〜1(重量/体積)%
である。
【0017】本発明のキャピラリーコーティング剤は、
例えば、低分子量キトサンを上記濃度範囲にて、0.0
05〜0.2N程度の希塩酸等の酸性溶液に溶解し、溶
液として提供される。このようなキトサン溶液よりなる
本発明のキャピラリーコーティング剤によれば、これを
適当な方法でキャピラリー内に注入し、所定時間流通さ
せた後、キャピラリーを加熱乾燥することにより、容易
にコーティング処理することができる。
【0018】なお、キトサンはpHが酸性側の溶液と接
すると液側への溶解が始まるので、本発明のキャピラリ
ーコーティング剤を用いてコーティング処理したキャピ
ラリーをCE分析に使用する場合、用いる緩衝液(バッ
ファ)のpHは7以上とするのが好ましい。
【0019】以下に低分子量キトサンの製法についてよ
り詳細に説明する。キトサンは、エビやカニの外殻など
に存在するキチンを、希塩酸による脱炭酸カルシウム、
及び、希アルカリにより脱蛋白質を行ない、次いで、濃
厚アルカリによる脱アセチル化を行なって得ることがで
きる。
【0020】本発明に用いる低分子量キトサンは、キチ
ンを脱アセチル化して得られるキトサンを化学的処理
(酸加熱分解等)又は酵素による分解によって低分子量
化して得られるものであるが、原料キチンの種類、キト
サンの製造方法、キトサンの低分子量化方法については
特に限定されるものではない。
【0021】なお、キトサンの分子量はゲル・パーミエ
ーション・クロマトグラフィーにより求めたもので、ポ
リエチレングリコール相当の重量平均分子量である。こ
れは固有粘度(30℃、0.2N酢酸+0.1N酢酸ナ
トリウム)にすると、0.03〜5(dl/g−キトサ
ン)である。
【0022】本発明に用いる低分子量キトサンの具体的
な製造法の一例を以下に示す。紅ずわいガニから常法に
よりキトサンを得、このキトサン粉末を水に懸濁させ7
0℃、pH8にて過酸化水素水を添加することにより低
分子量化する。この場合、得られる低分子量キトサンの
分子量は過酸化水素水の添加量によって調整できる。こ
のように低分子量化した後、キトサン粉末を濾過、洗浄
し、その後、乾燥して低分子キトサン試料を得る。
【0023】こうして得られた低分子量キトサンの溶液
をキャピラリー内に注入して流通させた後乾燥するなど
の方法により、容易にキャピラリー内面をコーティング
処理することができる。
【0024】キャピラリーへの低分子量キトサン溶液の
供給は、シリンジ等で行ない、注入後キャピラリーを加
熱すればコーティング処理が履行される。このような操
作を4〜5回繰り返し行ない、コーティング層を複層化
することにより、安定な低分子量キトサンの被覆層が得
られ、好ましい。
【0025】
【作用】キャピラリー内面にコーティングされた低分子
量キトサンは、シラノール基の電荷を効果的に中和し
て、シラノール基に起因する電気浸透流やシラノール基
へのタンパク質の吸着を確実に防止することができる。
【0026】しかも、キトサンは、生分解性に優れ、人
体への毒性が殆どなく、安全性、取り扱い性に優れる。
【0027】なお、本発明のキャピラリーコーティング
剤は、フューズドシリカ管のような内面にシラノール基
を有するキャピラリーに限らず、キトサンで電荷が中和
されることにより、分離効率、分析効率が向上するよう
な官能基を有する材質よりなるキャピラリーであれば、
どのようなものであっても有効に使用することができ
る。
【0028】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的
に説明する。
【0029】実施例1低分子量キトサンの製造 天然のカニ、エビから抽出したキチンを脱アセチル化
し、キトサンを得た。次に、前述の如く、過酸化水素等
を用いて、キトサンを低分子量化し、精製した。得られ
た低分子量キトサンの物性を表1に示す。
【0030】
【表1】
【0031】低分子量キトサン溶液の調製 得られた低分子量キトサン溶液を希塩酸で溶解し、精製
水で0.1(重量/体積)%の低分子量キトサン溶液
(pH2)を調製した。
【0032】コーティング処理 上記低分子量キトサン溶液を下記仕様のキャピラリー
(フューズドシリカ管)に、シリンジを用いて注入し、
10ベッド流し続けた。その後、100〜110℃のブ
ロックヒーター内を通して加熱したN2 ガスをキャピラ
リー内に1時間流通させて乾燥した。この低分子量キト
サン溶液の注入、乾燥を5回繰り返した。
【0033】
【表2】
【0034】電気浸透流の試験(IEF) 上記コーティング処理済のキャピラリー(キトサンコー
トタイプ)を装着したベックマンP/ACE SYST
EM2000全自動キャピラリー電気泳動システムを用
い、オンカラム検出法で紫外吸収(200nm)を測定
した。電解液としては100mMホウ酸バッファー(p
H9.2)を使用し、20.0KV、30℃で電気泳動
を行なった。試料の1%メシチルオキサイドはガス圧を
用い、0.1分間注入した。結果を図1に示す。
【0035】また、キャピラリーとして、コーティング
処理を施していないもの(ノンコートタイプ)を用い、
上記と同様にして測定を行なった。結果を図2に示す。
【0036】図1,2より、次のことが明らかである。
即ち、図2のノンコートタイプがピークトップで約2.
9分なのに対し、図1のキトサンコートタイプは約3.
3分であり、電気浸透流が抑制されていることがわか
る。
【0037】タンパク質の吸着試験(IEF) 上記と同様のキャピラリー(キトサンコートタイプ、ノ
ンコートタイプ)及び装置を用い、試料タンパクとして
ミオグロビンを用いて実験を行なった。なお、紫外吸収
の波長は280nmとした。実験手順を以下に示す。
【0038】i) 2%アンホリン(登録商標)(pH
3.5〜10)を含む溶液にミオグロビンを溶解させ、
0.75mg/mlの溶液を調製し、ガス圧を用いキャ
ピラリーに0.1分間注入した。 ii) アノードに10mM H3 PO4 溶液、カソード
に20mM NaOH溶液を用い、12.0KV、30
℃で3分間フォーカシングを行なった。 iii) アノードに10mM H3 PO4 溶液、カソード
に20mM NaOH/80mM NaCl溶液を用
い、12.0KV、30℃で30分間泳動させた。
【0039】結果を図3(キトサンコートタイプ)、図
4(ノンコートタイプ)に示す。図3,4より次のこと
が明らかである。即ち、図3のキトサンコートタイプの
ミオグロビンのピークトップは、図4のノンコートタイ
プの約6.5分から約7.3分になり、ピークもシャー
プになっている。キトサンのコーティングによりシラノ
ール基へのタンパク質の吸着がなくなり、電気浸透流も
抑制されたことがわかる。
【0040】なお、以上の実験は、いずれも、低分子量
キトサンサンプルNo.Bを用いて行なったものである
が、他のサンプルNo.A,Cを用いた場合にも同様の
結果が得られた。
【0041】
【発明の効果】以上詳述した通り、本発明のキャピラリ
ーコーティング剤によれば、キャピラリー電気泳動法に
おける分離効率の阻害要因となる、キャピラリー内面の
シラノール基等の官能基の電荷を効果的に中和して、高
い分離効率、良好な再現性のもとに高精度な分析を行な
うことが可能とされる。
【0042】しかも、本発明のキャピラリーコーティン
グ剤は、コーティングの方法が簡便である上に、安全
性、取り扱い性にも優れ、工業的に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図1】キトサンコートタイプのキャピラリーによるメ
シチルオキサイドのIEF測定結果を示すグラフであ
る。
【図2】ノンコートタイプのキャピラリーによるメシチ
ルオキサイドのIEF測定結果を示すグラフである。
【図3】キトサンコートタイプのキャピラリーによるミ
オグロビンのIEF測定結果を示すグラフである。
【図4】ノンコートタイプのキャピラリーによるミオグ
ロビンのIEF測定結果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 橋本 正憲 東京都新宿区西新宿3丁目4番7号 栗田 工業株式会社内

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 低分子量キトサンを含むことを特徴とす
    るキャピラリーコーティング剤。
JP4092848A 1992-04-13 1992-04-13 キャピラリーコーティング剤 Pending JPH05288717A (ja)

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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998025137A1 (fr) * 1996-12-03 1998-06-11 Eisai Co., Ltd. Capillaire avec revetement de la paroi interne
JP2003501658A (ja) * 1999-06-08 2003-01-14 ベックマン コールター インコーポレイテッド 減じられた電気浸透流を有する表面
US7799195B2 (en) * 2005-09-02 2010-09-21 Vladislav Dolnik Neutral polysaccharide wall coating for electrophoretic separations in capillaries and microchannels
JP2013532818A (ja) * 2010-07-23 2013-08-19 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 流体構成要素の表面を親水化するための方法およびそのような構成要素を含有する部品
CN103808786A (zh) * 2014-02-27 2014-05-21 福州大学 一种抑制蛋白吸附的毛细管涂层的制备方法

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