WO1998025130A1

WO1998025130A1 - Optische sensoren unter der verwendung durchstimmbarer laserdioden

Info

Publication number: WO1998025130A1
Application number: PCT/EP1997/006788
Authority: WO
Inventors: Gunnar Brink; Henning Groll; Wolfgang Steinle
Original assignee: Biotul/Bio Instruments Gmbh
Priority date: 1996-12-07
Filing date: 1997-12-04
Publication date: 1998-06-11
Also published as: AU5753798A; DE19650899A1

Abstract

Die Erfindung betrifft Vorrichtungen zur Bio- und Chemosensorik unter Verwendung durchstimmbarer Laserdioden. Insbesondere wird die konkrete Ausführung eines Bio-Affinitätssensors gezeigt, der auf der Grundlage von Oberflächenplasmonenresonanz arbeitet. Das im Sensor verwendete Anregungslicht stammt aus einem Diodenlaser, dessen Wellenlänge durch eine Veränderung des Laserstromes, durch Temperaturveränderung oder durch Bewegung einer Short-Extended-Cavity moduliert wird. Ein Wellenlängenmeßgerät ist in der optischen Apparatur integriert, das die Resonanzverschiebung unabhängig von Modensprüngen, Intensitäts- und Polarisationsschwankungen messen kann. Der gesamte optische Strahlengang, insbesondere ein Prisma, ein Polarisator und Linsen, das Transducervolumen sowie das oben genannte Wellenlängenmeßgerät werden thermisch konstant gehalten.

Description

Optische Sensoren unter der Verwendung durchstimmbarer

Laserdioden

Beschreibung

Halbleiter-Diodenlaser sind wegen ihrer geringen Kosten, ihrer Kompaktheit, ihrer hohen Lebensdauer, ihrer Robust- heit, ihrer Durchstimmbarkeit , ihrer hohen spektralen Leistungsdichte und ihres geringen Rauschens einzigartige Lichtquellen für viele spektroskopische Anwendungen. Als spektroskopische Lichtquellen werden sie in Zukunft insbesondere die analytische Chemie, die Chemosensorik und die Biosensorik revolutionieren. Besonders interessant für diese Anwendungen sind Diodenlaser, die bei Raumtemperatur betrieben werden können, da der zu ihrem Betrieb notwendige apparative Aufwand sehr gering ist. Dies bedeutet zur Zeit eine Einschränkung des zugänglichen Wellenlängenbereiches für Di- odenlasersensoren auf das Spektrum zwischen ca. 0,6 μm - 2 μm, wenn nicht zusätzliche nicht-lineare optische Prozesse zur Frequenzkonvertierung des Laserdiodenlichtes verwendet werden. Dieser Wellenlängenbereich wird von III/V-Halblei- terverbindungslaserdioden auf der Basis der Materialien AlGaAs, InP, und InGaAs abgedeckt. Laserdioden dieser Typen sind kommerziell erhältlich. Insbesondere wenn für die Spektroskopie Laserdioden, die als Massenprodukt für andere Anwendungen - z. B. Telekommunikation, CD-Lesegeräte, Laserdrucker, Barcode-Scanner, Lichtschranken, in Zukunft Laser-Fernsehen - hergestellt werden, Verwendung finden, sind diese preiswert und breit verfügbar. Andere Laserdioden auf der Basis von Bleisalzen (PbSe, PbTe) arbeiten im infraroten Spektrum (ca. 3 μm - 30 μm) . Sie werden in der Regel bei kryogenen Temperaturen betrieben. Dies macht ihren Einsatz insbesondere in Sensoren schwierig, wenn nicht unmöglich. Eine Beschreibung der Nutzung durchstimmbarer Laserdioden für die analytische Spektroskopie findet sich in Henning Groll, Doktorarbeit (Universität Hohenheim 1995) .

Bei den für die Spektroskopie benutzten Lasern handelt es sich in der Regel um transversal und longitudinal einmodige Dauerstrichlaser, deren Emissionswellenlänge sich mit Hilfe des Injektionsstromes und der Temperatur des Diodenlasers durchstimmen läßt. Die Wellenlänge eines Lasers läßt sich in einem Bereich von ca. 15 nm - 20 nm verstimmen, wenn seine Temperatur zwischen ca. -20°C und +60°C variiert wird. Temperaturänderung dieser Größenordnung sind mit einfachen Pel- tierkühlern leicht zu realisieren. Kommerzielle Laserdioden sind für diese, Betriebstemperaturen spezifiziert. Der Durchstimmkoeffizient beträgt ca. 0,25 nm/K. Werden Fabry-Perot-Laser verwendet, so erfolgt die Wellenlängen- durchstimmung nicht kontinuierlich über den gesamten Variationsbereich. Vielmehr werden je nach Temperatur und/oder Laserstrom verschiedene longitudinale Moden des Laserresonators mit unterschiedlichen Wellenlängen angeregt. Dabei treten Hystereseeffekte auf. Die Durchstimmbarkeit innerhalb einer Mode beträgt bis zu ca. 1 nm und hängt stark vom verwendeten Diodenlaser ab. Die Durchstimmung mit Hilfe der Lasertemperatur ist naturgemäß ein langsamer Prozeß. Raten von ca. 0,5 K/s für reproduzierbare Messungen sind möglich. Wird dagegen der Injektionsstrom zur Durchstimmung verwendet, lassen sich Durchstimmfrequenzen im kHz Bereich leicht re- alisieren. Eine Frequenzmodulation mit Frequenzen im Bereich der Emiss-ionslinienbreite einer freilaufenden Laserdiode (ca. 10 - 100 MHz) oder mehr ist möglich. Eine schnelle sprunghafte Wellenlängenänderung gestatten short-extended- cavity-Laser, die aus einer Laserdiode und einem weiteren äußeren, dicht vor der Laserdiode plazierten Rückkoppelspiegel bestehen, dessen Abstand mit Hilfe eines Piezoaktuators schnell geändert werden kann. Hier können typischer Weise 5 - 8 verschiedene longitudinale Moden des gekoppelten Resonators angewählt werden, die jeweils ca. 150 pm von einander entfernt sind. Eine kontinuierliche Durchstimmung der Laserwellenlänge über nahezu den gesamten Bereich ihres Verstärkungsprofils ist möglich, wenn Laserdioden mit einer Rückkopplung aus wellenlängendispersiven Elementen betrieben werden. Beispiele hierfür sind die Rückkopplung mit Hilfe eines Reflexionsgitters oder eines Fabry-Perot-Resonators, DFB-Laser (distributed feedback - Laser) oder DBR-Laser (distributed bragg reflection- Laser) . Bei den beiden letzteren handelt es sich um monolithische Systeme, die kommerziell erhältlich sind. Angewandt werden die beschriebenen durchstimmbaren Diodenlasersysteme in der Atomabsorptions- spektroskopie, der Fluoreszenzspektroskopie, der Resonanzionisationsspektroskopie und den verschiedenen Verfahren der Molekülspektroskopie. Andere realisierte oder in der Literatur vorgeschlagene Anwendungen und Methoden in denen Diodenlaser als spektroskopische Instrumente Verwendung finden, sind die Erzeugung von Frequenz- und Längenstandards auf der Basis atomspektroskopischer Messungen (Cs-Atomuhr) , das Laserkühlen von Atomen, aber auch die Bestimmung von Gradienten in Brechungsindices, die photoakustische Spektroskopie oder die Fourier- und Ramanspektroskopie . Diodenlaser basierte spektroskopische Detektoren wurden z. B. für die Flüssigkeitschromatographie, die Gaschromatographie oder die Kapillarelektrophorese vorgeschlagen. Bereits in unserer Patentanmeldung (DE-A4315211) haben wir vorgeschlagen, durchstimmbare Lichtquellen als eine mögliche Quelle in der Oberflächenplasmonenresonanz zu verwenden.

Oberflächenplasmonenresonanz (beschrieben z.B. in Liedberg et al., Sensors and Actuators, 4 299-304(1983) ist eine Technik, in der Veränderungen im Brechungsindex in einer Schicht in der Nachbarschaft eines an einer Oberfläche reflektierten Lichtstrahles gemessen werden, um die Eigenschaften einer Oberfläche zu charakterisieren und Änderungen an ihr zu beobachten. Diese Änderungen können zum Beispiel durch Adsorption eines Analyten aus einer Probenflüssigkeit an einer Oberfläche hervorgerufen werden. Die Beobachtung von solchen Bindungseffekten, die Bestimmung von Bindungskinetiken und die qualitative Charakterisierung von Bindungs- stärken kann als Grundlage für Immunosensoren und die pharmazeutische Wirkstoffsuche, aber auch für andere Sensorkonzepte oder für die Entwicklung von Verfahren der organischen Chemie dienen.

Zur Realisation eines Oberflächenplasmonen-Sensors wird ein Metallfilm auf ein Substrat aufgebracht, das ein dielektrisches Material mit höherem Brechungsindex als die zu vermessende Flüssigkeit ist. Üblicherweise wird hierfür ein Glasprisma verwendet. Fällt nun Licht oberhalb des Winkels für Totalreflexion auf die Grenzfläche zwischen Glasprisma und Metallfilm (Edelmetalle wie Gold und Silber) ein, dann dringt die elektromagnetische Welle einige hundert Nanometer als evanescentes Feld in das System Metall-Probenlösung ein. Geschieht dies unter geeigneten Bedingungen, dann können die freien Elektronen des Edelmetalls Energie vom evanescenten Feld aufnehmen und ein Abfall der Intensität des reflektierten Lichts tritt auf. Alternativ kann der Metallfilm auch als gitterförmiger Film aufgebracht werden, wobei dann auch auf das Prisma verzichtet werden kann (Raether, H. , "Surface plasmon on smooth and on rough surfaces and on gratings", Springer Verlag Berlin/Heidelberg) . Neben Bindungsexperimenten können andere Veränderungen der optischen Eigenschaften der Grenzfläche in einem Transducer bestimmt werden. So beeinflußt die Anwesenheit von Wasserstoff und anderen kleinen Molekülen oder Ionen die optischen Eigenschaften der plasmonentragenden Grenzschicht oder anderer an der Grenzschicht vorhandener Materialien bei anderen optischen Verfahren, so daß es ebenfalls zu einer Verschiebung der Oberflächenplasmonenresonanz oder anderer Detektorsignale kommt.

Ein entsprechender Sensor kann mit Hilfe einer Spektroskopie, die auf der Verwendung durchstimmbarer oder Multi-Wellenlängen-Laser beruht, die Änderung der optischen Eigenschaften der Oberfläche vermessen und damit die Anwesenheit eines Analyten registrieren und die vorhandene Ana- lytmenge quantifizieren:

Wie beispielsweise in Pockrand et al . , J. Chem. Phys . 77 (12) 6289-6295 (1984) und der Patentschrift WO91/01489 ausgeführt wird, gibt es zwei prinzipielle Arten, Veränderungen in der Oberflächenplasmonenresonanz festzustellen:

a) Entweder eine Veränderung der Reflektivität des eingestrahlten Lichts als eine Funktion des Reflektionswin- kels (Impulsübertrag der Photonen) b) oder Veränderung in der Reflektivität als eine Funktion der Wellenlänge

(Energie der Photonen)

Viele Anmeldungen, auch die Patentanmeldung WO94/13044, schlagen die Verwendung von durchstimmbaren Halbleiter-Laserdioden als Lichtquellen vor. Es sind jedoch keine konkreten Ausführungen bekannt, wie Oberflächenplasmonen durch durchstimmbare Laserdioden spektroskopiert werden können. Konkrete technische Vorschläge, wie ein Diodenlaser-Ober- flächenplasmonenresonanz-Spektrometer auszusehen hat wurden bisher nicht gegeben. Die Durchstimmung von Laserdioden ist in der Atomabsorptions- oder -fluoreszensspektroskopie oder der Molekülspektroskopie in Gasen bereits beschriebener Stand der Technik. Bei der Verwendung von durchstimmbaren Laserdioden in Bio- und Chemosensoren und optischen Sensoren sind einige Besonderheiten zu berücksichtigen, die sich gegenüber der Anwendung in der Atomabsorptionsspektroskopie unterscheiden:

1. Die Linie der Resonanz ist wesentlich breiter als üblich in der AAS, entsprechend ist eine genaue Bestimmung der Wellenlänge bei der Oberflächenplasmonenresonanz nur im Bereich mehrerer Picometer bis Nanometer erforderlich.

2. Die Polarisation des Lichtes in der optischen Apparatur muß insbesondere bei der Verwendung in Oberflächenplasmonenresonanz ohnedies kontrolliert werden, somit ist eine Polarisationsabhängigkeit des Lichtes z.B. bei einer Wellenlängendetektion nicht mehr eine zusätzliche Schwierigkeit .

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur optischen Untersuchung von chemischen oder biologischen Proben bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird gelöst mit den Merkmalen der Patentansprüche .

Die Verwendung durchstimmbarer Laserdioden hat in der Ober- flächenplasmonenresonanz im Gegensatz zu der Durchstimmung anderer Lichtquellen oder der gebräuchlichen Veränderung des Reflektionswinkels eine Reihe von Vorteilen. Die räumliche Messung von reflektiertem Licht unter verschiedenen Reflek- tionswinkeln bedarf einer mechanischen Apparatur zur Bewegung von Lichtquelle oder Detektordiode oder dem Einsatz einer Kamera zur Betrachtung des reflektierten Lichts unter verschiedenen Winkeln. Eine Apparatur unter Verwendung durchstimmbarer Laserdioden kann wesentlich preiswerter, aber auch wesentlich kompakter realisiert werden als die übliche Methode.

Es ist sogar eine Miniaturisierung des Oberflächenplasmonen- resonanzapparates denkbar, bei der eine miniaturisierte Sonde an einem langen Lichtleitfaserkabel befestigt wird. Die Durchstimmung der Wellenlänge erfolgt in einer separaten Einheit . Derartige Sensoren eignen sich vor allem zur Anwendung in medizinischen Kathetern, in Sonden, die in große Tiefen oder große Entfernungen transportiert werden müssen, beispielsweise zur Vermessung von Tiefseewasser in verschiedenen Meerestiefen, oder beispielsweise in Robotern in Abwasserkanälen .

Bio- und Chemosensoren basierend auf Oberflächenplasmonenresonanz können auch neue Anwendungen erschließen, falls durch den Einsatz durchstimmbarer Laserdioden eine deutliche Preisreduzierung vorgenommen werden kann.

Anwendungsbeispiele sind:

• das Seifmonitoring von Patienten

• die Prozesskontrolle in der Biotechnologie

• die Messung der Konzentration von Umweltschadstoffen in Routineanwendungen

Für den im folgenden in seiner konkreten technischen Ausführung dargestellten Sensor sind auch andere Bio- und Chemo- sensorprinzipien als die Oberflächenplasmonenresonanz denkbar, z. B. andere Meßprinzipien zur Bestimmung der Eigenschaften einer Oberfläche, wie die totale interne Reflek- tion, die Ellipsometrie oder die Interfero etrie und andere in der Literatur, z. B. in Place et al . (1995) (Optoelectronic Immunosensors, Review of Optical Immuno Assay at Continuous Surfaces, Biosensors 1, 321 - 353) erwähnte entsprechende Verfahren. Weiterhin können auf der Messung von Fluoreszenz gründende Methoden, z. B. Fluores- zenskorrelationsspektroskopie, zur Bestimmung von biologischen Molekülen als Sensorprinzip genutzt werden. All diesen Methoden ist gemeinsam, daß zur Detektion und letztlich zur Quantifizierung der zu bestimmenden Spezies, eine spezifische biochemische Reaktion genutzt wird, deren Endprodukt zu einer spektralen Struktur führt, die mit Hilfe von durch- stimmbaren Lasern oder Multi-Wellenlängen-Lasern, eindeutig und selektiv vermessen werden kann, und die eine direkte oder indirekte - durch Kalibration oder Eichung des Sensors Aussage über die Menge des in der untersuchten Probe vorhandenen Analyten ermöglicht .

Der Fachmann wird leicht weitere Sensorkonzepte nennen können, die mit durchstimmbaren Lasern oder Multi-Wellenlängen-Lasern realisierbar sind.

Bei der Verwendung von durchstimmbaren Laserdioden zur Vermessung von Oberflächenplasmonen zeigen sich neuartige Probleme, die z.B. in der Atomabsorptions- oder Fluoreszens- spektroskopie oder der Molekülspektroskopie in Gasen nicht auftreten.

1. Der Hauptunterschied der Spektroskopie an Oberflächen zu derjenigen an freien Atomen oder an Molekülen in Gasen besteht in der wesentlich größeren spektralen Breite der zu untersuchenden Resonanzen. Während atomare Resonanzen oder Linien von Molekülen in gasförmigen, nicht extrem heißen oder unter extrem hohem Druck stehenden Atmosphären einige MHz bis einige GHz breit seien können (im sichtbaren und nah-infrarotem Spektralbereich sind das einige fm bis einige pm Wellenlänge) sind typische Ober- flächenplasmonenresonanzen in diesem Spektralbereich 10 nm bis 100 nm breit. Atomare Linien können typischerweise innerhalb einer longitudinalen Mode eines Diodenlasers vermessen werden. Dabei ist im wesentlich die Registrierung der Amplitude der Spektrallinie, weniger ihrer Struktur und Breite von Interesse in analytischen Anwendungen. Die Wellenlänge der Emission des Diodenlasers muß auf wenige Bruchteile einer atomaren Linienbreite bekannt sein und entsprechend reproduzierbar eingestellt werden können bzw. entsprechend konstant gehal- ten werden. Die notwendige Durchstimmung der Wellenlänge kann ohne weiteres mit Hilfe des Injektionsstromes ohne Modensprünge erfolgen. Die Anwendung von Techniken wie der Wellenlängenmodulationsspektroskopie oder der Frequenzmodulationsspektroskopie, die auf der Modulation der Wellenlänge mit Frequenzen zwischen kHz bis GHz beruhen, zur Bestimmung schon kleinster Veränderung der Absorption in einem Probenvolumen sind möglich. Ähnliches gilt für die Methoden der Fluoreszensspektroskopie. Die sichtbaren und nahinfraroten Dioden können ungefähr 3 bis 4 nm von der nominellen Wellenlänge innerhalb einer 20° -Temperaturänderung durchgestimmt werden. Das Tuning geschieht auf eine sprunghafte Art und Weise, beispielsweise eine glatte Durchstimmbarkeit für etwa 1/4 eines Nanometers, die durch einen Übergang (Modehopping) in der Wellenlänge zu einer anderen Mode gefolgt wird. Durchstimmung mit einer Veränderung des Injektionsstromes (ungefähr 0,01 nm pro mA) zeigt ähnliches Verhalten und in beiden Fällen beobachtet man oft eine Hysterese in den Modensprüngen.

2. Bei Adsorption einer Monolage eines Analyten verschiebt sich die Plasmonenresonanz in der Größenordnung von einigen 100 Grad beziehungsweise einigen Nanometern. Die Verschiebung ist bei Durchstimmung der Wellenlänge von der verwendeten Basiswellenlänge abhängig. So zeigen Simulationsrechnungen eine notwendige Durchstimmung von der nominalen Wellenlänge von ca. 12 nm bei 1300 nm Ba- siswellenlänge, falls man von der Adsorption einer 1 nm dicken Schicht auf der Sensoroberfläche ausgeht. Bei der Verwendung eine 780 nm Laserdiode reduziert sich diese notwendige Durchstimmung auf 5 bis 6 nm pro nm adsorbierter Schicht. Bei kleineren Wellenlängen reduziert sich entsprechend die Resonanzverschiebung. Mit Hilfe von durchstimmbaren Laserdioden kann nun lediglich ein kleiner Teil (20 % - 50 %) der gesamten Resonanz vermessen werden. 3. Aufgrund der Intensitäts- , Frequenz-, Positions-, und Polarisationsschwankungen des Laserlichtes aufgrund der Modensprünge sowie der schwierig reproduzierbaren Hysterese bei der Durchstimmung wie auch durch Alterungsprozesse der Laserdiode bringt die Durchstimmung der Laserdiode durch Strom oder Temperatur bei der Oberflä- chenplasmonenresonanz Schwierigkeiten.

4. Weitere Schwierigkeiten können temperaturabhängige Schwankungen des Brechungsindex des Substrats, beispielsweise des Glasprismas, und Temperaturschwankungen des Transducervolumens mit sich bringen.

5. Ebenso sind Homogenitätsschwankungen der Beschichtung der Sensoroberfläche auszuschließen und die Orthogonali- tät der Bindung zu maximieren.

Die vorliegende Erfindung löst diese Probleme durch die in den Ausführungsbeispielen gemachten Vorschläge und zeigt eine preiswerte und exakte Anordnung zur Vermessung von Oberflächenplasmonen mit Hilfe durchstimmbarer Laserdiodenlichtquellen.

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend anhand von Aus- führungsbeispielen und mit Bezug auf die Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform der Erfindung,

Fig. 2 eine schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform der Lichtquelle,

Fig. 3 eine schematische Darstellung einer zweiten Ausführungsform der Lichtquelle,

Fig. 4 eine schematische Darstellung einer dritten Ausführungsform einer Lichtquelle mit mehreren Laserdiodeneinheiten, Fig. 5 eine schematische Darstellung einer zweiten Ausführungsform der Erfindung.

Fig. 6 eine schematische Darstellung einer dritten Ausführungsform der Erfindung,

Fig. 7 eine schematische Darstellung einer vierten Ausführungsform der Erfindung,

Fig. 8 ein Blockschaltbild einer Detektoranordnung und

Fig. 9 eine schematische Anordnung eines optischen Aufbaues .

Ausführungsbeispiele :

Im folgenden werden einige Ausführungsbeispiele der Erfindung mit Bezug auf die Figuren erläutert.

Die Vorrichtung besteht, wie in Fig. 1 beschrieben, aus einer Lichtquelle 1, einem Transducer 2 und einem Detektor 3, Vorrichtungen wie Meßküvette, Meßzelle oder Meßkanal 4 und Auswertungselektronik 5, gegebenenfalls computergestützte Auswertung.

Die erfindungsgemäße Lichtquelle weist eine durchstimmbare Laserdiode 1 auf. Der Transducer 2 ist das Element, wo die biosensorische Reaktion (auch chemische Reaktion in Chemosensoren) stattfindet und eine Interaktion mit dem in der beschriebenen Einheit verwendeten Lichtstrahl 6 erfolgt . Die Transduceroberflache kann für die Bio- und Chemosensorik beispielsweise mit folgendem Verfahren beschichtet werden: Man beschichtet vorteilhaft die Oberfläche zunächst mit Mer- captoethanol oder Mercaptoethanolamin. Anschließend setzt man beispielsweise 1, 4-ButandiolDiglycidylether zu. Anschließend wird daran ein Hydrogel, beispielsweise Dextran oder Polyäthylenglykol gebunden. Anschließend läßt sich dieses Hydrogel mit den bekannten Verfahren der Biochemie mit Rezeptoren oder Liganden versehen. Mit einer solchen Beschichtung können Homogenitätsschwankungen der Sensoroberfläche und Schwierigkeiten mit der Orthogonalität der zu untersuchenden Bindung wirkungsvoll reduziert beziehungsweise behoben werden. Eine Beschreibung weiterer Beschich- tungsverfahren findet sich in EP 0 589 867 Bl oder in DE 42 19 159. Weitere Beschichtungen beruhen auf der Aufbringung einer dünnen Polystyrol- oder anderen KunststoffSchicht durch Spin-coating oder auf der Aufdampfung oder Aufsputte- rung eines dünnen Filmes von Glas, Silizium oder anderen Materialien, an welche anschließend dem Fachmann bekannte biochemische Ankoppelungen vorgenommen werden können. Im Detektor 3 wird das vom Transducer ausgesandte Licht aufgefangen und ausgewertet.

Fig. 2 zeigt eine Ausgestaltung der Lichtquelle, bei der eine Laserdiode in einer Laserdiodeneinheit 7 montiert ist und über ein Temperatursteuer- und Regelinstrument 11, das beispielsweise ein Peltierelement einen Temperatursensor und eine elektronische Schaltung aufweist, in seiner Temperatur beeinflußbar ist . Eine zweite Steuerungsmöglichkeit besteht über den Laserdioden- Injektionsstrom mit Hilfe einer Steuereinheit 13.

Die Einheit enthält vorteilhaft auch eine Kollimationsoptik 8, einen Polfilter 9 sowie eine Irisblende 10 im optischen Weg 6.

Fig. 3 zeigt eine andere mögliche Ausgestaltung der Lichtquelle. Hier wird die Temperatur der Laserdiodeneinheit 7 mit einer Temperatursteuer- und Regeleinheit 11 konstant gehalten und über ein bewegliches Glasplättchen 16, das in kurzem Abstand (innerhalb der Kohärenzlänge) vor der Laserdiode 15 angebracht wird und über Stellelemente, beispielsweise nach dem Galvanometerprinzip oder durch piezoelektrische Aktoren, die von einer Konstantspannungsquelle 17 und über einen Frequenzgenerator 18 versorgt werden, beweglich ist, wird eine bewegliche Veränderung der Resonatorlänge (Short Extended Cavity Laser) und so eine Durchstimmung der Wellenlänge ermöglicht.

In Fig. 4 wird ein Aufbau gezeigt, der mehrere Laserdiodeneinheiten 7 aufweist . Jede der Laserdiodeneinheiten arbeitet bei einer mittleren Wellenlänge λ_l7 λ₂ , ... λ_. Dabei ist die Wellenlänge jeder der Laserdiodeneinheiten veränderbar mit Hilfe einer zugehörigen Stromsteuerung I-^, I₂, ... I_n, die mit dem gemeinsamen Bezugszeichen 13 bezeichnet sind. Die einzelnen Stromregeleinheiten 13 werden von Steuereinheiten 14 angesteuert, die jeweils mit einer Frequenz f₂₁, ^22' ••• f_2n die Stromregeleinheiten ansteuern. Im gezeigten Beispiel werden die Laserdiodeneinheiten 7 mit Hilfe einer Wärme/Kühleinrichtung 19, die von einer Temperatursteuereinrichtung 11 angesteuert wird, auf einer bestimmten Temperatur gehalten. Die von den verschiedenen Laserdiodeneinheiten 7 emittierten Lichtstrahlen 6 werden von einer optischen Einrichtung 20 zusammengeführt und als ein Lichtstrahl mit den Wellenlängen λ-_j_ + λ₂ + ... + λ_n ausgegeben.

Die optische Einrichtung 20 kann beispielsweise als Wellenleitersystem 21 oder als Strahlteilerblock 22 ausgeführt sein.

Fig. 5 zeigt die Integration eines Wellenlängenmeßgeräts in den Spektrometeraufbau. Mittels zweier Strahlteiler 22 wird der von der Laserdiode 1 emittierte Lichtstrahl 6 in drei Anteile aufgeteilt, die mit drei Photodetektoren 25 analysiert werden. Der erste Detektor 25a nimmt das im Transducer 2 erzeugte Oberflächenplasmonenresonanz-Signal auf, der zweite 25b liefert ein Referenzsignal. Dieses wird genutzt um Intensitäts- bzw. Positionsschwankungen des einfallenden Laserlichts zu messen und gegebenenfalls zu beseitigen. Ein dritter Detektor 25c dient in Kombination mit einem temperaturstabilisiertem Kantenfilter 46, als Wellenlängenmeßgerät.

Das Prinzip ist für die Atomabsorptionsspektroskopie bereits beschrieben (Heßling, B., Niemax, K. , Spectrochim. acta, 45 B S. 1187, 1990), wird jedoch nicht angewandt, weil die für die Atomabsorptions- oder der Molekülspektroskopie in Gasen oder Fluoreszensspektroskopie notwendigen Anforderungen nicht erfüllt werden konnten. Bei Verwendung eines Kanten- filters ist zudem Sorge für eine konstante Polarisation des auf den Filter eingestrahlten Lichtes zu tragen. Die Anforderungen nach Kontrolle von Temperatur und Polarisation können in einem Oberflächenplasmonenresonanz-Spektrometer jedoch leicht erfüllt werden, da sowohl die Kontrolle der Polarisation des eingestrahlten Lichtes notwendig ist, als auch die Temperatur des Transducers konstant gehalten werden muß. Beide Parameter beeinflußen auch Gestalt und Position der Oberflächenplasmonenresonanz .

Die Nutzung der in kommerziellen Laserdioden in der Regel vorhandenen Detektordiode als Referenzsignal erweist sich als vorteilhaft, obwohl Polarisations- und Positionsschwankungen des Lichtstrahles von ihr nicht erfaßt werden.

In Fig. 6 wird eine Ausführung mit Lichtleitfaserkabeln dargestellt. Die Lichtquelle 1, unter Nutzung einer durchstimm- baren Laserdiode wie oben beschrieben, strahlt Licht vorzugsweise über einen Faserkoppler in eine Lichtleitfaser 27 oder ein Lichtleitfaserbündel ein und leitet das Licht unter konstantem Einfallswinkel in das Prisma 23 ein. Das an dem Metallfilm 24 reflektierte Licht gelangt durch die Lichtleitfaser 27 in den Detektor 25. Bei Verwendung eines Spiegels 29 kann das vom Transducer reflektierte Licht in die zuleitende Lichtleitfaser zurückgekoppelt werden (Fig. 7).

Fig. 8 zeigt eine mögliche Ausgestaltung des Detektors. Der Lichtstrahl 6 wird von einem Photodetektor 28 erfaßt vorverstärkt 29 und bandbreitenbegrenzt verstärkt 30. Das entstehende Signal wird durch einen Verstärker aufbereitet. In einer Einrichtung zur Datenaufzeichnung 31, beispielsweise ein x-y-Schreiber oder beispielsweise ein PC mit entsprechender Soft- und Hardware, wird das Signal ausgewertet und dargestellt .

Bei der Verwendung durchstimmbarer Laserdioden in Oberflä- chenplasmonensensoren spielt der dynamische Bereich eine wesentliche Rolle. Vorzugsweise wird man zur Auswertung von Bindungsexperimenten, also -bei geringeren Konzentrationen, durchstimmbare Laserdioden anstatt konventionellen Geräten mit Winkelauswertung einsetzen. Es ist auch möglich, die Auswertung mittels durchstimmbaren Laserdioden mit einer Winkelauswertung zu kombinieren, um eine Feinmessung der Beschichtung neben der Grobmessung durchzuführen. Verwendet man die durchstimmbare Laserdiodenquelle in einer Vorrichtung ohne Winkelauswertung, so wird man aufgrund der begrenzten Durchstimmbarkeit vorzugsweise stärkere Verdünnungen der Meßflüssigkeiten vornehmen als bei Winkelauswertung oder sie bei geringeren Probenkonzentrationen verwenden.

Eine weitere Anwendung durchstimmbarer Laserdioden liegt in der parallelen Ausmessung von Probenflecken in einem bildgebenden Verfahren, wie beispielsweise der Oberflächenplasmo- nenmikroskopie (Yeatman und Ash, Electronics Letters 20 968-970 (1987)). Hier strahlt man üblicherweise über ein Glasprisma einen homogenen, monochromatischen, polarisierten, parallelen Lichtstrahl ein, der die Probe, eine Microtiterplatte mit beispielsweise 5000 Feldern in unterschiedlich selektiver Beschichtung, gleichmäßig beleuchtet oder man bewegt einen Lichtstrahl vorzugsweise durch Spiegelgalvanometer parallel über die Meßoberfläche, um so ein bildgebendes Verfahren zu ermöglichen. Setzt man in einer derartigen Vorrichtung als Lichtquelle eine durchstimmbare Laserdiodenquelle ein, so erhält man in der 3. Dimension der Messung die Oberflächenplasmonenresonanzkurve zu jedem Bildpunkt, was eine wesentlich exaktere und weniger störanfällige Auswertung der Meßergebnisse für jeden Bildpunkt ermöglicht .

In allen erwähnten Ausführungen ist das Verwenden von mindestens zwei Meßflecken im Transducer vorteilhaft, um Vergleichsmessungen zu ermöglichen. Denkbar ist auch die Anordnung von Stufen innerhalb des Meßfleckes, wie beschrieben in Sigl et al . , Sensors and Actuators, B 24-25 (1995) 756-761 . Man kann den gesamten optischen Aufbau wie in der Optik üblich durch Montage der Bauteile auf einer optischen Bank oder ähnlichen Bauteilen realisieren. Vorzugsweise wird der optische Aufbau aus einem preisgünstigen Kunststoff, beispielsweise Polycarbonat oder Polyolefin-Kunststoff (Topas) bestehen, wobei man alle Einheiten wie Linsen, Blenden, Prisma und Strahlteiler erfindungsgemäß durch Ausnehmungen im Bauteil ausführt. Fig. 9 zeigt einen möglichen Aufbau eines solchen Kunststoff-Preßlings 32. Eine Polarisation des Laserlichtstrahls 6 erfolgt vorzugsweise durch eine zweite oberflächenplasmonenaktive Metallschicht 33 in der Apparatur, an der keine bio- und chemosensorischen Reaktionen stattfinden. An der polarisierenden Metallschicht werden alle Lichtstrahlen mit p-Polarisation im Einstrahlwinkel der Plasmonenresonanz absorbiert (gedämpfte Reflektion) und nur s-polarisiertes Licht weitergestrahlt. Orthogonal zur beschriebenen Polarisatoreinheit setzt man die Oberflächen- plasmonenaktive Grenzschicht im Transducer ein, die aufgrund der beschriebenen Polarisation und der Orthogonalität nur p-polarisiertes Licht erhält. Schwierigkeiten mit Polarisationsschwankungen sind so wirkungsvoll auszuschließen. In den Preßling sind zugleich ein Strahlteiler (22) , beispielsweise ein halbdurchlässiger Spiegel, ein Kantenfilter 34 und ein Spiegel 35, der das polarisierte Laserlicht zur Meßzelle 4 mit dem Transducer umleitet, zu integrieren.

Da die Anforderungen an alle Regelungs-, Steuer- und Detek- tionselektroniken gut bekannt sind, und im wesentlichen als Digitalelektronik realisiert werden können, ist die Verwendung von benutzerdefinierten integrierten Schaltkreisen (ASIC's) hier von großem Vorteil. Die notwendigen Leistungs- elektroniken für Stromversorgung der Laserdiode, Temperierung der Laserdiode und Temperierung des Transducervolumens können auch mit herkömmlicher Elektronik realisiert werden. Versionen der Erfindung mit größtmöglichen Eingriffsmöglichkeiten für Laboranwendungen und autarke vollautomatische Systeme für Routineanwendungen können beide mit den vorgestellten Techniken realisiert werden.

Beschriftung / Numerierung

1 : Lichtquelle

2 Transducer

3: Detektor

4 Meßzelle

5 Auswerteelektronik

6 Lichtstrahl

7 Laserdiodeneinheit

8 Kollimationsoptik

9 Filter

10 Lochblende

11 Temperatur-Kontrolle

12 Temperatur-Modulation

13 Strom-Kontrolle

14 S trom-Modulation

15 Laserdiode ohne kapselndes Gehäuse, auf Wärmesenke und Grundplatte montiert

16 bewegliches Glasplättchen ("short extended cavity laser") 17 Konstantspannungsquelle 18 Generator zur Modulation der Position des Glasplättchens 19 Wärmesenke mit Peltierelement 20 Lichtmischer ("beamcombiner") 21 Wellenleiteroptik ("waveguide-chip") 22 halbdurchlässige Spiegel ("beamsplitter") 23 Prisma 24 Metallfilm mit sensitiver Schicht 25 Detektor 26 Polfilter 27 Lichtleitfaser 28 Photodetektor 29 Verstärker, I/U-Wandler 30 bandbreitenbegrenzter Verstärker bei Modulationsfrequenz f2 31 Einrichtung zur Datenaufzeichnung 32 Kunststoff-Preßling 33 Metallschicht 34 Kantenfilter (33) 35 Spiegel

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e

1. Vorrichtung zur optischen Untersuchung von chemischen oder biologischen Proben mit : einer Lichtquelle zum Aussenden eines Anregungslichts an einen optischen Transducer (2) mit einer Meßkammer (4) , indem eine Resonanz auftritt, und einem Detektor zum Empfangen des Ausgangslichts von dem optischen Transducer (2) dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle einen durchstimmbaren Diodenlaser (1) aufweist und die Wellenlänge des Anregungslichts über einen Abstimmbereich veränderbar ist, der kleiner ist als die Resonanz, vorzugsweise 20 % bis 50 % der Resonanz .

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenlänge des Anregungslichts durch eine Veränderung des Laserstromes und/oder durch eine Veränderung der Temperatur und/oder durch Bewegen einer Short- Extended-Cavity moduliert wird.

3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Einrichtung zur Bestimmung der Wellenlänge vorgesehen ist, die vorzugsweise ein Kantenfilter (46) ist, wobei mit Hilfe eines Strahlteilers (22) ein Anteil des von der Lichtquelle abgegebenen

Lichts durch das Kantenfilter (46) auf einen Fotodetektor (25c) geleitet wird, wobei die relative Änderung der Transmission durch das Kantenfilter (46) zur relativen Bestimmung der eingesetzten Lichtwellenlänge verwendet wird.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenlänge unabhängig von Modensprüngen, Intensitäts- und Polarisationsschwankungen gemessen wird.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch eine Einrichtung zur Steuerung der Temperatur des optischen Transducers (2) und/oder der Einrichtung zur Bestimmung der Wellenlänge und/oder weiterer Komponenten des optischen Strahlengangs, wobei vorzugsweise die Temperatur konstant gehalten wird.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein weiterer Strahlteiler (22) vorgesehen ist, der einen Anteil des von der Lichtquelle abgegebenen Lichts abzweigt und auf einen dritten Photodetektor (25b) leitet, der ein Referenzsignal liefert.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Laserdiode (15) in einer Short- Extended-Cavity angeordnet ist, die einen Rückkoppelspiegel (16) aufweist, der im kurzen Abstand vor einer Ausgangsfacette der Laserdiode angebracht ist und über Stellelemente beweglich ist, wobei eine bewegliche Veränderung der Resonatorlänge eine sprunghafte Durchstimmung der Wellenlänge ermöglicht.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Stellelemente piezoelektrische Aktoren aufweisen, die von einer Konstantspannungsquelle (17) und vorzugsweise zusätzlich über einen Frequenzgenerator (18) versorgt werden.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch ein Polarisator (9) , der das von der Lichtquelle ausgegebene Licht polarisiert, und wobei die Lichtquelle vorzugsweise eine Kollimationsoptik (8) und/oder eine Irisblende (10) aufweist.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß in den optischen Transducer (23) das Licht über eine Lichtleitfaser (27) eingekoppelt wird und über eine Lichtleitfaser (27) ausgekoppelt und zu einem Detektor (25) geleitet wird.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der optische Transducer (23) an einer im Winkel zu einer Sensorfläche gegenüberliegenden Fläche einen Spiegel (29) aufweist, und über eine Lichtleitfaser (27) das Licht eingekoppelt und das von dem Spiegel reflektierte Licht ausgekoppelt wird.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Komponenten vorzugsweise einstückig aus einem Kunststoff wie Polycarbonat oder Polyolefinkunststoff besteht.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, gekennzeichnet durch eine optische Einrichtung zur Veränderung des Einfallwinkels und/oder des Ausfallwinkels eines Lichtstrahls (6) in bezug auf den optischen Transducer

(2) .

14. Vorrichtung insbesondere nach Anspruch 13 , gekennzeichnet durch die Kombination mit einer Einrichtung zur Winkelauswertung, wobei vorzugsweise eine Grobmessung mit Hilfe der Winkelauswertung und eine anschließende Feinmessung mit Hilfe der Veränderung der Wellenlänge durchführbar ist .