AT410322B

AT410322B - Verfahren zur prozessüberwachung von biotechnologischen prozessen

Info

Publication number: AT410322B
Application number: AT0055401A
Authority: AT
Original assignee: Lendl Bernhard Dipl Ing Dr Ins; Schuster Kurt Christian Dipl I; Innovationsagentur Gmbh
Priority date: 2001-04-05
Filing date: 2001-04-05
Publication date: 2003-03-25
Also published as: WO2002082061A1; EP1373865A1; US20040096930A1; ATA5542001A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prozessüberwachung von biotechnologischen Prozes- sen unter Verwendung von Mikroorganismen.

Die Überwachung von biotechnologischen (Fermentations-) prozessen ist äusserst komplex.

Neben den im Fermentationsmedium produzierten Substanzen und deren Gehalt im Fermentati- onsmedium sind auch die Mikroorganismen und deren physiologischer Status zu überwachen. Bei einer derartigen Prozessüberwachung sollten Daten über den Fermentationsprozess, wie Ausbeu- te, Lebensfähigkeit und Stoffwechselzustand der Mikroorganismen, möglichst annähernd "real time" erfasst werden, um umgehend auf Änderungen in der Zusammensetzung des Fermentati- onsmediums bzw. im Status der Mikroorganismen reagieren zu können. Eine Prozesskontrolle der löslichen Bestandteile von Reaktionsprozessen, insbesondere von Fermentationsprozessen mittels Infrarot-Spektroskopie, wurde beispielsweise zur Messung von Substanzen, wie Glukose, Essig- säure, Milchsäure, Lactose und Galactose sowie Ethanol, beschrieben.

Es ist mit dieser Methodo- logie auch möglich, mehrere Substanzen gleichzeitig zu erfassen.

Obgleich die Infrarot-Spektroskopie von biologischen ganzen Zellen prinzipiell möglich ist (sie- he Hopkinson et al., Analyst 112 (1987), 501-505; Fayolle et al., Vibr. Spectroscopy 14 (1997), 247-252), wurde diese für eine genaue Analyse der Zellen bislang nur in getrocknetem Zustand bzw. in Deuteriumoxid in Betracht gezogen (McGovern et al., J. Biotechnol. 72 (1999), 157-167; Schuster et al., Vibr. Spectroscopy 19 (1999), 467-477 und Majara et al., J. Inst. Brew. 104 (1998), 143-146). Die ständige Überwachung von Zellen in biotechnologischen Prozessen mittels Infrarot- Spektroskopie wurde daher nicht für geeignet erachtet, und zwar methodologisch und apparativ.

Weiters wurde die Infrarot-Spektroskopie von ganzen Zellen bislang auch auf Grund des "biofou- ling"-Effekts für nicht praktikabel gehalten: im Zuge der Messung von nicht-getrockneten Fermenta- tionslösungen, die Zellen enthalten, kommt es zu Ablagerungen an den IR-Messkristallen (ATR- Kristallen). die manuell entfernt werden müssen (siehe Hopkinson et al., oben, die auch besonders die Problematik des Zerkratzens der Kristalle und der dadurch bedingten Kontamination und Arte- fakt-Erzeugung in nachfolgenden Spektra hervorgehoben haben). Diese manuelle Reinigung wird daher als zu aufwendig und für eine Routine-Analytik in der Prozessüberwachung als ungeeignet angesehen. Auf der anderen Seite erfordert die IR-Spektroskopie von Getrockneten Zellen einen enormen Zeit- und Präparationsaufwand, um die Zellen in geeigneter Form zur IR-Messung zu bringen.

So kann davon ausgegangen werden, dass alleine die Probenpräparation nicht unter 25 Minuten erfordert (siehe Majara et al., oben). Weiters ist auch kein geeignetes on-line-Equipment zur Durchführung von Prozessüberwachungen von biotechnologischen Prozessen unter Verwen- dung von Mikroorganismen, bei welchen auch die Zusammensetzung und der Zustand von Mikro- organismen überwacht werden können, erhältlich (Majara et al., oben).

Die von Fayolle e al. erhaltenen Spektren wurden in einer optischen Küvette mit 38 um Schichtdicke gemessen. Eine solche Anordnung ist für eine Prozesskontrolle nicht Geeignet, da diese leicht bei der wiederholten Messung verstopft. Vor allem ist beim von Fayalle et al. beschrie- benen System die Messung der Amid-I-Bande nicht möglich.

Auch die Verunreinigungen der Messzellen mit polymerem oder organischem Material (u.a.

"bio-fouling") wird als ein wesentlicher Nachteil der Infrarot-Technologie angesehen, insbesondere, wenn die optischen Kristalle von Durchflusszellen von den Verunreinigungen irreversibel überzo- gen sind und nur durch aufwendige physikalische Reinigungsverfahren wieder von diesen Überzü- gen befreit werden können (US 5,604,132).

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Prozessüberwachung von biotechnologischen Prozessen unter Verwendung von Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen, bei welchem sowohl die löslichen Stoffe im Prozessmedium als auch die Mikroorganismen schnell, verlässlich, automatisch, gut eproduzierbar und mit hohem Informationsgehalt gemessen und überwacht werden können.

Die vorliegende Erfindung sieht daher ein Verfahren der eingangs beschriebenen Art vor, wel- ches dadurch gekennzeichnet ist, dass sowohl das Prozessmedium als auch die Mikroorganismen im Prozessmedium direkt mittels abgeschwächter (attenuierter) Totalreflexion (ATR) an einem ATR-Kristall im Infrarot-Bereich spektroskopiert werden, wobei das Prozessmedium, enthaltend die Mikroorganismen, mit dem ATR-Kristall kontaktiert wird, so dass Mikroorganismen zumindest auf einen Abstand zum ATR-Kristall, der der Eindringtiefe des evaneszenten Feldes entspricht, gelan- gen und während dieser Kontaktierung im Infrarot-Bereich spektroskopiert wird, worauf das

Prozessmedium, enthaltend die Mikroorganismen, vom ATR-Kristall entfernt wird, der ATR-Kristall gewaschen wird, und gegebenenfalls eine erneute Kontaktierung mit dem Prozessmedium,

enthal- tend Mikroorganismen, erfolgt.

Mit dem erfindungsgemässen Verfahren konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass es möglich ist, mittels Infrarot-Spektroskopie eine komplette und umfassende Prozessüberwachung von biotechnologischen Prozessen durchzuführen, wobei nicht nur eine Vielzahl von löslichen Verbindungen gemessen und überwacht werden können, sondern auch die Zusammensetzung und der Zustand der Mikroorganismen on-line und nahezu in "real time" gemessen wird. Dies kann erfindungsgemäss ohne Trocknung der Mikroorganismen durchgeführt werden, wodurch der ge- samte Prozess so schnell durchgeführt werden kann, dass er sich für eine on-line-Prozesskontrolle eignet. Die löslichen Inhaltsstoffe im Kulturmedium können dabei in an sich bekannter Weise im Infrarot-Bereich, beispielsweise in einer Durchflusszelle, spektroskopiert werden.

Die im Prozess- medium enthaltenden Mikroorganismen werden in einem speziellen Kontaktierungsschritt zumin- dest auf einen Abstand zum ATR-Kristall, der der Eindringtiefe des evaneszenten Feldes ent- spricht, herangebracht und genau während dieser Kontaktierung im Infrarot-Bereich spektrosko- piert.

Die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes ist eine insbesondere Material-, Wellenlängen-, Ein- fallswinkel- und Medien-abhängige Grösse, die z. B. in Harrick (J. Opt. Soc. Am. 55 (7) (1965,851- 857) definiert ist (Eindringtiefe = Abstand von der Oberfläche des ATR-Kristalls, bei dem die Amplitude der evaneszenten Welle auf die Hälfte des Wertes gefallen ist, welche sie an der Ober- fläche hat. ) Bei Diamant, wässerigen Lösungen und einer Wellenzahl von 1000 beträgt diese etwa 2 um.

Das Prozessmedium enthaltend die Mikroorganismen wird dann vom ATR-Kristall entfernt, der ATR-Kristall mit Waschlösungen gewaschen, worauf gegebenenfalls erneute Kontaktierungen mit den Prozessmedium enthaltenden Mikroorganismen erfolgen können.

Bevorzugterweise wird die Spektroskopie im Infrarot mit Fouriertransformierter Infrarot-Spektro- skopie (FTIR-Spektroskopie) durchgeführt, welche, wie erwähnt, bereits in der Vergangenheit zur Überwachung von biotechnologischen Prozessen, allerdings ausschliesslich im Hinblick auf gelöste Substanzen, verwendet worden ist. Die Messung mittels Infrarot-Lasern (z. B. Quantum-Kaskaden- Laser) als IR-Quelle ist ebenfalls vorteilhaft.

Erfindungsgemäss bevorzugt wird ein Diamant als ATR-Kristall im Rahmen des erfindungsge- mässen Verfahrens eingesetzt. Dieser erweist sich vor allem im Waschprozess wesentlich stabiler als herkömmliche ATR-Kristalle und ist bei der ATR-Messung von besonderem Vorteil. Bevorzug- terweise wird die ATR-Messung mittels planarem Wellenleiter als ATR-Kristall, insbesondere mit der von Braiman et al., Appl. Spectrosc. 51 (4) (1997), S. 592-597, beschriebenen Methodologie durchgeführt (vgl. auch WO 00/36442-A, US 5 980 831-A).

Bevorzugterweise wird das Prozessmedium mit einem automatischen Fliesssystem aus dem Bioreaktor, in dem der biologische Prozess durchgeführt wird, an den ATR-Kristall geführt, wobei während der Zeit, während der die Biosuspension über den ATR-Kristall strömt ("flow on"), die "grossen" Mikroorganismen-Zellen nicht in die Nähe der ATR-Oberfläche kommen und daher nicht bzw. nur unwesentlich vom Infrarotlicht erfasst werden. Diese Zellen liefern daher keinen nen- nenswerten Beitrag zu den gemessenen Spektren, so dass während der "flow on"-Phase nur die gelösten Bestandteile, wie z. B. Zucker, Alkohole, Aminosäuren, etc., quantitativ bestimmt werden, wie in Kansiz et al., Analytica Chimica Acta 21149 (2001), 1-12, beschrieben.

Hierbei wurden beispielsweise bei der Überwachung einer Aceton-Butanol-Fermentation simultan Aceton, Acetat, n-Butanol, Butyrat und Glukose in mittleren IR gemessen.

Wenn der Durchfluss nun beispielsweise abgestoppt wird, kommt es zum Absetzen der Mikro- organismen auf dem ATR-Kristall, wodurch diese nun gemessen werden können. Gegebenenfalls können dabei auch mechanische Druckkräfte ausgeübt werden, die den Annäherungsschritt der Mikroorganismen an den ATR-Kristall effizienter gestalten.

Die Annäherung der Mikroorganismen an den ATR-Kristall (und damit die temporäre Vermes- sung dieser Mikroorganismen) kann aber auch auf andere Weise erfolgen, etwa durch temporäres Aufhalten der Mikroorganismen in der Prozesslösung durch geeignete Filter und gegebenenfalls Heranbringen an den ATR-Kristall, durch Anwendung von Zentrifugalkraft, durch bioelektrisch- magnetische Anlagerungen an den ATR-Kristall, etc..

Bei der Messung der Zellen kann auch eine Variation des Einfallswinkels an der Grenzfläche ATR-Kristall/Medium, wie von Shick et al. (Appl. Spectrosc. 47 (8) (1993, s. 1237-1244) beschrie- ben, verwendet werden. Die Messung kann auch mit zwei oder mehr ATR-Kristallen, gegebenen- falls mit unterschiedlichen Einfallswinkeln, durchgeführt werden.

Das Waschen erfolgt erfindungsgemäss bevorzugt durch Behandlung des ATR-Kristalls mit ei- ner Base, beispielsweise mit: 1M NaOH, und darauffolgendem Spülen mit destilliertem Wasser.

Die Zugabe von Basen ermöglicht die vollständige Deprotonierung der analysierten Säuren und das Abstoppen der Stoffwechselaktivitäten. Alternativ oder in Kombination dazu können auch alternative Waschlösungen zum Einsatz kommen, beispielsweise Na2C03 (z. B. 5 %), wobei eben- falls bevorzugt Waschschritte mit destilliertem Wasser angeschlossen werden können.

Es hat sich gezeigt, dass erfindungsgemäss die Dauer eines Messzyklus von ganzen Zellen mittels Infrarot von zumindest knapp unter 30 Minuten gemäss der üblichen Methoden (Majara et al., oben), vorzugsweise auf unter 20 Minuten, besonders bevorzugt auf unter 10 Minuten, insbe- sondere auf unter 5 Minuten, verringert werden kann, so dass Überwachungspunkte des biologi- schen Prozesses in den genannten Abständen möglich sind, was für eine ausreichend genaue Prozessüberwachung ausreicht.

Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich besonders gut zur Überwachung von biotechno- logischen Prozessen unter Verwendung von einzelligen Eukaryonten, insbesondere Hefe, oder Bakterien, insbesondere E. coli, wobei das Verfahren aber auf jegliche Suspensions-(Sub- mers-)kultivierung, i.e. bei welcher Mikroorganismen oder Aggregate derselben in suspendierter Form vorliegen, prinzipiell anwendbar ist.

Besonders bevorzugte Mikroorganismen sind demgemäss rekombinante Mikroorganismen und/ oder Antibiotika-produzierende Mikroorganismen, die auf Grund ihrer Empfindlichkeit und kompli- zierten Stoffwechselvorgänge einer äusserst genauen und komplexen Prozessanalytik bedürfen.

Das erfindungsgemäss Verfahren kann vorzugsweise auch bei der Herstellung von Einzellenprotein oder zur Herstellung von Futterstoff oder Nahrungsmitteln auf Basis von Mikroorganismen verwen- det werden, sowie zur Messung von mikrobiellen Kohlehydraten.

Eine genaue Prozesskontrolle ist auch bei biotechnologischen Prozessen erforderlich, bei wel- chen in den Mikroorganismen Einschlusskörper gebildet werden. Auch diese Mikroorganismen bzw. Einschlusskörper können mittels Infrarot-Spektroskopie gut überwacht und mit den erfin- dungsgemässen Verfahren demgemäss auch in industriellem Massstab kontrolliert werden. Es ist begannt, dass die Sekundärstruktur von Proteinen mittels IR-Spektroskopie analysiert werden kann (Millot et al., Anal. Chim. Acta 295 (1994), S. 233-241 ; et al. "Infrared and Raman Spectroscopy of Biological Materials" (2000), S. 323-378 ; Eds.Gremlich et al., Marcel Dekker, New York). Gerade Einschlusskörper haben eine charakteristische Sekundärstruktur, die besonders reich an &num;-Faltblatt ist.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist im gesamten Infrarot-Bereich anwendbar, besonders be- vorzugt erfolgt die Spektroskopie jedoch im mittleren Infrarot-Bereich bei einer Wellenzahl zwi- schen 4000 und 400/cm, insbesondere zwischen 1800 und 900/cm, dem sogenannten "Finger- print"-Bereich. Aber die Messungen können selbstverständlich auch bevorzugt im nahen Infrarot durchgeführt werden, also bei Wellenlängen zwischen 2,5 m bis 750 nm.

Vorzugsweise wird die Spektroskopie von löslichen Bestandteilen im Prozessmedium vor der Spektroskopie der Mikroorganismen vorgenommen. Nach der Spektroskopie der Mikroorganismen kann bevorzugterweise der Waschschritt angeschlossen werden.

Wie erwähnt, wird das Verfahren besonders bevorzugt so durchgeführt, dass nach der Kontak- tierung des ATR-Kristalls mit dem Prozessmedium die Bewegung des Mediums gestoppt wird, so dass die Mikroorganismen auf dem ATR-Kristall abgesetzt werden (wodurch sie ebenfalls auf einen geeigneten Abstand zum ATR-Kristall gelangen können), worauf die Spektroskopie der Mikroorganismen durchgeführt wird.

Beim erfindungsgemässen Verfahren kann im Prozessmedium, insbesondere aber auch bei den Mikroorganismen, die Sekundärstruktur von Proteinen überwacht werden. Weiters kann im Pro- zessmedium und/oder bei den Mikroorganismen auch der Gehalt von Lipiden überwacht werden.

Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens, umfassend ein mit einem automatischen Fliess- system verbundenes ATR-Element mit einem ATR-Kristall, eine mit dem ATR-Kristall verbundene

Infrarot-Spektroskopie-Einrichtung und ein über ein automatisches Fliesssystem mit dem ATR- Element verbundenes Waschsystem.

Diese Vorrichtung ist auf Grund des automatischen Fliesssystems zur IR-Kontrolle und Überwa- chung von biotechnologischen Prozessen besonders geeignet. Ein automatisches Fliesssystem ist generell eine Vorrichtung, die z. B. flüssige bzw. suspendierte Proben mittels z. B. Pumpen, Schläu- chen und Ventilen transportiert und manipuliert. Vorzugsweise ist die Infrarot-Spektroskopie- Einrichtung mit einer elektronischen Datenverarbeitungs-Anlage (IR-EDV) verbunden, womit die aufgenommenen Spektren analysiert werden können und mit der vorzugsweise Prozesseinrichtun- gen (Stellglieder), wie z.B. Zuflusseinrichtungen, Temperaturregler, pH-Regler, usw., für den Bio- reaktor, wenn sie mit der IR-EDV verbunden sind, von der IR-EDV steuerbar sind, womit eine Veränderung von Prozessparametern gesteuert werden kann.

Damit kann eine automatische Prozesskontrolle durchgeführt werden, mit der beispielsweise vorgegebene Soll-Werte durch gezielte Zusteuerung von Nährmittel und Prozesskontrollmittel in den Bioreaktor effizient und voll- automatisch überwacht, kontrolliert und gegebenenfalls korrigiert werden können. Beispielsweise können auf Grund der IR-Spektroskopie-Informationen gezielt Nährstoffe aber auch beispielsweise Expressions-Repressoren, Attenuatoren oder Induktoren (z. B. in rekombinanten Kulturen) zuge- setzt werden.

Vorzugsweise umfasst die erfindungsgemässe Vorrichtung weiters einen Bioreaktor, der gege- benenfalls mit Prozessmedium und Mikroorganismen gefüllt ist.

Über das automatische Fliesssystem kann auch eine Konditionierung des Prozessmediums vor- genommen werden oder z. B. Messung, pH-Wert-Einstellungen, temporäre Filtrierungs- oder Trennschritte, Abtrennung von Substanzen, die die Messung beeinträchtigen könnten, etc., vorge- nommen werden.

Bevorzugterweise weist das erfindungsgemässe Fliesssystem Schläuche mit einen Innendurch- messer von grösser als 0,7 mm, also grösser als die standardisierten Durchmesser (0,3, 0,5 und 0,7 mm) auf, da es bei den Schläuchen mit Standard-Durchmessern aufgrund der Mikroorgani- smen leicht zu Verstopfungen kommen kann. Vorzugsweise werden erfindungsgemäss Schläuche mit Innendurchmessern von 1 mm und darüber, insbesondere 1,2 mm und darüber, verwendet.

Obgleich normalerweise bei der IR-Spektroskopie mittels ATR-Kristallen ein geringes Detekti- onsvolumen (= Totvolumen des ATR-Elements; Messvolumen, das sich auf dem ATR-Kristall befindet) erwünscht ist (geringere Probenmenge, genauere Messung, Hintanhaltung von Verdün- nungen, etc. ), hat es sich bei der erfindungsgemässen Vorrichtung als günstig erwiesen, das Totvo- lumen des ATR-Elements grösser als die üblichen 5 l vorzusehen. Bei der Erfindungsgemässen Vorrichtung ist daher vorzugsweise ein Totvolumen von mehr als 5 l, noch bevorzugter 10 l oder mehr, insbesondere 20 l oder mehr, vorgesehen.

Die Infrarot-Spektroskopie-Einrichtung ist bevorzugterweise ein FTIR-Spektrometer, das sich besonders gut zur optimalen Gewinnung von Infrarotspektren mit ATR-Kristallen eignet. IR- Messung mittels Lasern (z.B. Quantum-Kaskaden-Laser) ist ebenfalls vorteilhaft.

Vorzugsweise ist der ATR-Kristall horizontal gegenüber dem zu messenden bzw. vorbeiflie- &num;enden Prozessmedium positioniert, so dass das Prozessmedium über den ATR-Kristall geleitet werden kann. Beim Abstoppen des Flusses können dann die Mikroorganismen bedingt durch die Schwerkraft einfach auf dem ATR-Kristall sedimentieren und dort gemessen werden. Beispielswei- se kann aber auch der ATR-Kristall mit einer Auffangvorrichtung für Mikroorganismen, z. B. einem aufklappbaren Filter, verbunden werden, der -wenn die Mikroorganismen gemessen werden sollen - aufklappt und die "eingefangenen" Mikroorganismen auf den ATR-Kristall positioniert.

Weiters ist es möglich, durch geeignete elektrische Ladungsinduktion die Mikroorganismen an den ATR-Kristall heranzubringen. Dies kann z. B. durch ein äusseres elektrisches Feld realisiert werden, wie bei der "Free-Flow"-Elektrophorese (Raymond et al., Anal. Chem. 68,(15) (1996), S.

2515-2522), oder aber auch durch Aufbringen einer geladenen Oberfläche auf den ATR-Kristall, z. B. durch eine Schicht von poly-L-Lysin.

Vorzugsweise können auf dem ATR-Kristall auch Substanzen vorgesehen werden, die den Waschvorgang günstig beeinflussen oder die Anhaftung von Mikroorganismen beeinflussen, ins- besondere werden dabei Monolayer dieser Substanzen vorgesehen.

Vorzugsweise ist das ATR-Element als Durchflusszelle ausgeführt, so dass die Messung von löslichen Bestandteilen/Zellen durch Kombination von "flow on" mit "Stopp"-Schritten aufgenom-

men werden kann.

Der ATR-Kristall ist, wie schon oben erwähnt, vorzugsweise ein Diamant, der sich auf Grund seiner Härteeigenschaften und der dadurch bedingten erleichterten Wartung besonders gut für ein derartiges Verfahren eignet. Ebenfalls bevorzugt sind Kristalle aus Germanium, Silizium oder Kristalle vergleichbarer Härte.

Vorzugsweise ist die erfindungsgemässe Vorrichtung mit einer Anhaltevorrichtung zum Stoppen des Flusses des Prozessmediums ausgestattet, die trotz Stoppens eine IR-Messung erlaubt.

Die Erfindung wird an Hand der nachfolgenden Beispiele sowie der Zeichnungsfiguren, auf die sie selbstverständlich nicht eingeschränkt ist, näher erläutert.

Es zeigen:
Fig. 1:die Prozessführung und Wachstumskurve einer Backhefeproduktion; Fig. 2 : Verlauf der Speicherstoff-Bildung in dieser Fermentation; Fig. 3 : einIR-Spektrum von getrockneter Backhefe, normiert auf Amid (Protein); Fig. 4 : 2. Ableitung von Fig. 3, Vektor-normiert ; Fig. 5 : reiner Zellkomponenten; Fig. 6 : Spektrenon-line (in vivo), Backhefe-Fermentation mit ATR-Technik aufgenommen ;
Fig. 7 und 8: Spektren der Mikroorganismen "on-line" (in vivo) erfindungsgemäss; und
Fig. 9 und 10: FTIR-Spektren von Zellen (Chlostridium) im getrockneten Zustand. Fig. 9 zeigt die Analyse von unterschiedlichen Sekundärstrukturen in den Proteinen getrockneter
Zellen.

Beispiele:
Die Leistungsfähigkeit des entwickelten Verfahrens wurde an Hand einer Hefefermentation gezeigt :
Zunächst wurde eine Hefekultur während etwa 15 Stunden in C-limitiertem Wachstum gehalten und anschliessend in einer N-limitierten Reifungsphase. Während der C-Iimitierten Wachstumsphase kommt es zu keiner Einlagerung von Speicherkohlehydraten in den Hefezellen. Diese tritt erst dann auf, wenn auf N-limitiertes Wachstum umgeschaltet wird. Fig. 2 zeigt die Ergebnisse von Referenzanalysen (HPLC, nass-chemisch).

Dieser biotechnologische Prozess wurde zweimal durchgeführt : beim ersten biotechnologischen Prozess (gemäss dem Stand der Technik) wurden Proben manuell entnommen, getrocknet und spektroskopiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 und 4 gezeigt. Man sieht deutlich, dass erst in der N-limitierten Phase Kohlehydrate aufgenommen werden. Die Information im mittleren Infrarot ermöglicht auch, zwischen unterschiedlichen Zuckern zu unterscheiden. Die Abfolge der Speicherstoffbildung von zuerst Glycogen, dann Trehalose konnte durch externe Referenzanalyse (Fig. 2) und Referenzspektren reiner Zellkomponenten (Fig. 5) bestätigt werden.

Beim zweiten biotechnologischen Prozess wurde das erfindungsgemässe Verfahren angewendet. Die während der "stopped-flow"-Zeit gemessenen Spektren der Mikroorganismen sind jenen der im getrockneten Zustand aufgenommenen sehr ähnlich (Fig. 6,7 und 8). Der Vergleich der zweiten Ableitungen zeigt deutlich, dass die on-line aufgenommenen Spektren praktisch die gleiche Information enthalten, wie jene von den getrockneten Mikroorganismen (siehe Fig. 4 und 8).

Diese Experimente belegen somit die Funktionstüchtigkeit des erfindungsgemässen Verfahrens.

Wie die Figuren 9 und 10 zeigen, ist aus den Spektren auch Information über die Sekundärstruktur von Proteinen sowie über den Anstieg/Abnahme von Lipiden, RNA, und dgl., ableitbar. Das erfi ndungsgemässe Verfahren bzw. die erfindungsgemässe Vorrichtung kann zur Prozessüberwachung/ Steuerung von jeglichen Kultivierungsprozessen von Suspensionskulturen eingesetzt werden. Es ist auch in der Lage, die Degeneration von Mikroorganismen on-line zu erkennen. Industriell besonders bevorzugte Einsatzgebiete für das erfindungsgemässe Verfahren sind die Herstellung von rekombinanten Proteinen, insbesondere von Proteinen, die intrazellulär gebildet werden, besonders bei Bildung von Einschlusskörpern (inclusion bodies), die Herstellung von Antibiotika, die Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten, aber auch im Bereich der Grundlagenforschung an Bioprozessen.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Prozessüberwachung von biotechnologischen Prozessen unter Verwendung von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl das Prozessmedium als auch die Mikroorganismen im Prozessmedium direkt mittels attenuierter Totalreflexion (ATR) an einem ATR-Kristall im Infrarot-Bereich spektroskopiert werden, wobei das Pro- zessmedium, enthaltend die Mikroorganismen, mit dem ATR-Kristall kontaktiert wird, so dass Mikroorganismen zumindest auf einen Abstand zum ATR-Kristall, der der Eindringtie- fe des evaneszenten Feldes entspricht, gelangen, und während dieser Kontaktierung im Infrarot-Bereich spektroskopiert wird, worauf das Prozessmedium, enthaltend die Mikroor- ganismen, vom ATR-Kristall entfernt wird, der ATR-Kristall gewaschen wird, und gegebe- nenfalls eine erneute Kontaktierung mit dem Prozessmedium, enthaltend Mikroorganis- men, erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Spektroskopie im Infrarot mit Fourier-transformierter Infrarot-Spektroskopie (FTIR-Spektroskopie) erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Diamant-ATR- Kristall eingesetzt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Pro- zessmedium mit einem automatischen Fliesssystem aus dem Bioreaktor, in dem der bio- technologische Prozess durchgeführt wird, an den ATR-Kristall geführt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Waschen eine Behandlung des ATR-Kristalls mit einer Base umfasst.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Spektro- skopie im Abstand von zumindest 20 Minuten, vorzugsweise von zumindest 10 Minuten, insbesondere von zumindest 5 Minuten, durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroor- ganismen einzellige Eukaryonten, insbesondere Hefe, oder Bakterien, insbesondere E. coli, verwendet werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Spektro- skopie bei einer Wellenzahl von 400 bis 4000/cm erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Spektro- skopie von löslichen Bestandteilen im Prozessmedium vor der Spektroskopie der Mikroor- ganismen vorgenommen wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Kontaktierung des ATR-Kristalls mit dem Prozessmedium die Bewegung des Mediums ge- stoppt wird, so dass die Mikroorganismen auf dem ATR-Kristall abgesetzt werden, worauf die Spektroskopie der Mikroorganismen durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroor- ganismen rekombinante Mikroorganismen und/oder Antibiotika-produzierende Mikroorga- nismen verwendet werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der bio- technologische Prozess unter Bildung von Einschlusskörpern in den Mikroorganismen durchgeführt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass im Pro- zessmedium die Sekundärstruktur von Proteinen überwacht wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass im Pro- zessmedium der Gehalt von Lipiden überwacht wird.
15. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14, um- fassend ein mit einem automatischen Fliesssystem verbundenes ATR-Element mit einem ATR-Kristall, eine mit dem ATR-Kristall verbundene Infrarot-Spektroskopie-Einrichtung und ein über ein automatisches Fliesssystem mit dem ATR-Element verbundenes Waschsy- stem.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Infrarot-Spektroskopie- Einrichtung mit einer elektronischen Datenverarbeitungs-Anlage (IR-EDV) verbunden ist, womit die aufgenommenen Spektren analysiert werden können. <Desc/Clms Page number 7>
17. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung weiters einen Bioreaktor, gegebenenfalls gefüllt mit Prozessmedium, enthaltend Mikroor- ganismen, umfasst.
18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die IR-EDV mit Prozess- steuerungs-Emrichtungen zum Bioreaktor verbunden ist, welche von der IR-EDV steuerbar sind.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Infra- rot-Spektroskopie-Einrichtung ein FTIR-Spektrometer ist.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der ATR- Kristall horizontal gegenüber dem Prozessmedium positioniert ist, so dass das Prozess- medium über den ATR-Kristall geleitet werden kann.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das ATR-Element als Durchfluss-Zelle ausgeführt ist.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass der ATR- Kristall ein Diamant ist.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das automatische Fliesssystem Schläuche mit einem Innendurchmesser von mehr als 0,7 mm, vorzugsweise 1,0 mm oder mehr, insbesondere 1,2 mm oder mehr, umfasst.
24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das ATR-Element ein Totvolumen von mehr als 5 l, vorzugsweise 10 l oder mehr, insbeson- dere 20 l oder mehr, aufweist.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die infra- rot-Spektroskopie-Einnchtung einen Laser als IR-Quelle umfasst.