WO1998013524A1

WO1998013524A1 - Sondes de detection de polynucleotides et procede de detection

Info

Publication number: WO1998013524A1
Application number: PCT/JP1997/003438
Authority: WO
Inventors: Yoshihiro Sato; Akihiko Tsuji; Takayuki Suga
Original assignee: Laboratory Of Molecular Biophotonics
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-26
Publication date: 1998-04-02
Also published as: JP3194969B2; EP0971038A4; EP0971038A1; AU4321497A; US6284462B1

Description

曰月糸田ボリヌクレオチド検出用プローブ及び検出方法技術分野

本発明は、特定のポリヌクレオチド塩基配列を有する被検体（D N A R N A など）を含む検体試料に蛍光色素で標識された検出用プローブを混入して、その検体試料から発せられる蛍光を測定することにより、検体試料中の検出用ブローブが結合した被検体を検出するための、検出用プローブおよび検出方法の技術に関するものである。背景技術

試料中に存在する特定の塩基配列をもつ D N Aや R N Aを検出 .定量する方法として、検出対象となる D N Aや R N Aと特異的にハイブリダィズする「検出用プローブ」を利用する方法が広く使用されている。検出用プローブとしては、検出対象である D N Aや R N A (ターゲット核酸）の塩基配列の一部と相補的な塩基配列をもつオリゴヌクレオチド核酸を用いることが多い。

これらの方法においては、検出用プローブと夕一ゲット核酸とのハイプリッド体を形成させた後、ハイブリツド体形成にともなう変化を検出することにより、試料中に検出対象とする夕ーゲット核酸が含まれていることを確認したり、その存在量を定量する。たとえば、検出用プローブを蛍光色素で標識しておく。この蛍光標識検出用プローブ（蛍光標識オリゴヌクレオチド核酸）を試料中に加える。試料中に夕ーゲット核酸が存在すれば、蛍光標識検出用プローブは夕ーゲット核酸に結合しハイブリツド体を形成する。その後、試料中のターゲット核酸とハイブリダィズした蛍光標識検出用プローブと、未結合の蛍光標識検出用プローブを分離する操作を行うことにより、未結合の蛍光標識検出用プローブを試料中より除去する。ここで、試料の蛍光強度を測定すれば、試料中のターゲット核酸の量を定量することが可能である。

上で述べた方法では、検出用プローブを試料に添加した後に、未結合の検出用プローブを取り除く操作が必要であった。このような分離操作は実際上は繁雑であるため、プローブ添加後の、結合したプローブと未結合のプローブとの分離操作が不要であるアツセィ法（ホモジニアスアッセィ法）が、種々、試みられている。

ホモジニアスアッセィ法のひとつとして、 2種類の蛍光分子間で生じる共鳴ェネルギー移動を利用する方法がある。一般に、 2種類の蛍光分子が約 70-80 ォングストローム以内の距離にあると、蛍光分子間に相互作用が生じ（共鳴ェネルギ—移動）、蛍光スぺクトルや蛍光減衰カーブが変化する。蛍光スぺクトル上では、ドナ一（一般に、 2種類の蛍光分子のうち、吸収スペクトルが短波長側にあるもの）の蛍光強度が減少し、ァクセプ夕一（2種類の蛍光分子のうち、吸収スぺクトルが長波長側にあるもの）の蛍光強度は増大する。また、パルス励起後の蛍光減衰カーブの変化としては、ドナ一の減衰は速くなり、ァクセプ夕一の減衰は遅くなる。

この蛍光分子間の共鳴エネルギ—移動を、核酸のホモジニアスアッセィに利用することが試みられている。すなわち、 2種類の蛍光標識検出用プローブ（それそれ異なる種類の蛍光色素分子で標識されている）を用意し、これらを夕ーゲッ卜核酸に互いに隣接してハイブリダィズさせる。ハイブリッド体においては、 2 極類の蛍光色素は近い距離にあるため、エネルギー移動がおこり蛍光スぺクトルが変化する。すなわち、 2種類の蛍光標識検出用プローブとターゲット核酸とからなるハイプリッド体形成にともない蛍光スぺクトルが変化するため、蛍光スぺクトル変化を測定することによって、ターゲット核酸の検出が可能となる（Card ul lo, R丄， et al . ( 1988) Proc . atl . Acad. Sc i . USA . 85 8790-8794, EP0070685) o USP 4996143 には、蛍光スべクトル変化を測定することによって夕ーゲット核酸を検出する方法に適した蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが示されている ₍ このように、エネルギー移動による蛍光スペクトル変化を測定する方法は、核酸のホモジニアスアッセィに有効である。しかしながら、試料中の検出用プロ一ブの量（分子数）が夕一ゲッ卜核酸の量（分子数）よりも過剰になると、上述した蛍光スぺクトル変化により夕ーゲット核酸を検出する方法を使用することは、実際上、非常に困難となる。すなわち、測定される蛍光スペクトルは、少数のェネルギ一移動をおこしている蛍光色素分子からの蛍光スぺクトルと多数のェネルギー移動をおこしていない蛍光色素分子（ターゲット核酸に未結合の蛍光標識検出用プローブ）からの蛍光スペクトルの和となるため、少数のエネルギー移動をおこしている蛍光色素分子からの蛍光スぺクトルは多数のエネルギー移動をおこしていない蛍光色素分子からの蛍光スべクトルに埋没してしまい、エネルギー移動にともなう蛍光スペクトル変化を検出することは、実際上、不可能となる。生物試料での実際の測定においては、「検出用プローブの量が検出対象の核酸 (夕ーゲッ卜核酸）の量に対して過剰になること」は頻繁に生じる。例えば、試料中のターゲット核酸の量が未知のときである。また、測定感度は試料の蛍光強度に依存するため、試料中の蛍光標識検出用プローブの濃度は一定濃度以下には下げられない。したがって、ターゲット核酸の量が微量であるとき（低濃度）は、検出用プローブの量がターゲット核酸に対して過剰になる。

したがって、検出用プロ一ブが検出対象の核酸に対して過剰に存在する条件においても、検出対象核酸を精度よく検出することを可能とする方法が求められている。

一般に、蛍光分子間のエネルギー移動を検出 .測定する方法としては、蛍光スベクトル変化を測定する方法とパルス励起後の ^光強度の减袞力一ブの変化を測定する方法（時間分解法）がある。エネルギー移動をおこしている蛍光分子とェネルギー移動をおこしていない同種の蛍光分子が共存しているときに、エネルギ一移動を検出する方法としては、蛍光スペクトルの変化を測定するよりも、蛍光減衰カーブを測定する（時間分解測定法）方法が有利となることがある（Morris on, L . E . ( 1980 ) Analy. Chem. 174 10卜 120、特開平 7-229835) 。エネルギー移動によりァクセプ夕一の蛍光減衰は遅くなるが、 Morrison は、減衰の遅れが十分大きいときには、直接励起のァクセプ夕一の蛍光減衰が実質的に終了した後の時間域において蛍光強度を測定することによって、エネルギ一移動由来のァクセブ夕一からの蛍光を選択的に測定することが可能であることを示した。特開平 7-229835 は、ァクセプター蛍光波長域の蛍光減衰に加えてドナーの蛍光波長域における蛍光減衰も測定することにより、ァクセブ夕ー蛍光波長域へのドナ一由来の蛍光の混入により生じる検出のゆがみ（誤差）を補正する方法を提供している。

さらに、特開平 7-229835 には、特閧平 7-229835 の方法（蛍光分子間のエネルギ一移動を時間分解測定法により検出する一方法）を核酸のホモジニアスアッセィに適用すれば、検出用プローブが夕ーゲッ卜核酸に対して過剰に存在する条件においてもタ一ゲット核酸が検出可能であることが述べられている。しかしながら、同方法に使用する検出用プローブが満たすべき必要条件は述べられていない。発明の問示

本発明は、蛍光色素で標識された 2種類の検出用プローブが同一の被検体（夕 —ゲット核酸）に互いに隣接してハイブリダィズしてハイプリッド体を形成し、 2極類の光色素分子間にエネルギー移動が生じたときに、ァクセプ夕一としての蛍光色素の蛍光减衰が十分に遅くなるような蛍光標識検出用プローブを見い出したものである。

また、当該プローブを用いて、ターゲット核酸を高感度に検出する方法を提供する。これにより、検出用ブローブがターゲット核酸に対して過剰に存在する条件において、ターゲット核酸を高感度、高精度で検出することが可能となった。エネルギー移動を利用して、検出用プローブが夕一ゲッ卜核酸に対して過剰に存在する条件において高感度でターゲット核酸を検出可能とするためには、 2種類の蛍光標識検出用プローブと夕一ゲット核酸とから形成されるハイプリッド体において、エネルギー移動励起のァクセブ夕一の蛍光減衰が、直接励起のァクセプターの蛍光減衰よりも大きく遅れることが必要であると考えた。

2種類の蛍光標識検出用プローブとタ一ゲット核酸とから形成されるハイプリッド体において、エネルギー移動励起のァクセブターの蛍光減衰カーブの遅れの大きさは、（ 1 ) 蛍光色素分子が結合している 2つのヌクレオチド間の塩基数

( 2つの蛍光色素分子間の平均距離を規定する）、（2 ) 蛍光色素分子が結合している 2つのヌクレオチド間のハイブリッド体の構造（二本鎖または一本鎖）、

( 3 ) 蛍光色素分子が導入されるヌクレオチドの検出用プローブ上での位置、および（4 ) 蛍光色素分子の種類、に大きく依存することを見い出した。これらの知見にもとづいて、検出用プローブとして、適切な蛍光色素の組み合わせを選択し、かつ、ハイブリッド体形成時において 2種類の蛍光色素分子間の距離が適切になるように塩基間数を選択し、かつ、ハイブリッド体の蛍光色素分子間の構造が適切な設定になるようにすることによって、検出用プロ一ブが夕一ゲヅト核酸に対して過剰に存在する試料において、高感度で夕ーゲッ卜核酸を検出可能とする方法および検出用プローブを見い出すことに成功した。

蛍光スぺクトル変化を測定することによりエネルギー移動を検出するときに使用する换出用プローブの必要条件（USP 4996143 で開示されている）と、蛍光減衰カーブの変化を測定することによりェネルギー移動を検出するときに使用する検出用プローブに求められる条件（本発明）は大きく異なる。

蛍光スぺクトルの変化量 (ドナーの蛍光強度の減少 iおよびァクセプ夕ー蛍光強度の増大量）はエネルギー移動効率が大きいほど大きくなる。エネルギー移動効率は、ドナーとァクセプ夕一間の距離の 6乗に反比例するため、蛍光スぺクトル変化によりエネルギー移動を精度よく検出するためには、実試料において、ドナ一一ァクセプ夕一間の距離を可能なかぎり近づけることが望ましい。 USP 4996 143 では、核酸のハイブリッド体において実質的にエネルギー移動の検出が可能となるドナー色素ーァクセプ夕一色素間の距離（塩基数）は「2— 7塩基」であり、さらに塩基間数が少ないほどよいとしている。一方、ァクセブタ一の蛍光減衰カーブの遅れを測定することによりェネルギー移動を検出するときには、ェネルギー移動効率は中程度（5 0 %程度）が最も望ましいことがわかった。ェネルギ一移動効率が高くなるほど、ァクセブ夕一の蛍光量はより増大するが、蛍光減衰の遅れはより小さくなる。蛍光量の増大は減衰カーブの変化の検出を容易にするが、一方、減衰の遅れが小さくなることは変化の検出を困難にする。この相反する 2つの要素から、被検体の検出のためには、エネルギー移動効率が高すぎても低すぎても不適となる。すなわち、被検体の検出のためには、ハイブリッド体を形成したときのドナー色素とァクセブ夕一色素間の距離は、エネルギー移動効率が中程度となる距離（塩基間数）が最も望ましいこととなる（後述、図 2 ) 。例えば、蛍光色素として Bodipy 493/503 (ドナ一）と Cy5 (ァクセプター）の組み合わせを使用したときには、この距離は、ハイブリッド体における塩基間数として「 1 0— 1 2塩基」となる（ハイブリッド体において、色素が結合している 2つのヌクレオチド間が 2本鎖構造をとるとき。後述）。

また、実試料においては、ドナ一色素とァクセプ夕一色素間の距離が固定されていることは少なく、時間とともに揺らいでいることが多い。このようなドナ一色素—ァクセプ夕一色素間の距離の揺らぎは、色素分子の運動などによりもたらされるものであり、その揺らぎの大きさや速さは、ハイブリッド体の構造により大きく巽なる。蛍光スペクトルの変化 Sは、ドナーとァクセプ夕一問の平均距離 (平均エネルギー移動効率）により決定されるため、これまでに檢出用プローブの性質が検討されたときには、形成されるハイプリッド体における色素問の距離の揺らぎの大きさを考慮に入れる必要性は低かった。一方、蛍光減衰カーブは、一般に、 2つの色素間の距離の揺らぎや分布に依存する。実際、ハイブリッド体を形成した検出用プローブの蛍光色素分子の蛍光減衰力一ブは、ハイブリツド体の構造により規定される色素分子の運動の範囲に大きく依存することがわかつた。その結果、ハイブリッド体において蛍光色素が結合している 2つのヌクレォチド間がすべて 2本鎖構造をとるように検出用プローブを設計すること、そのとき、一方の蛍光色素の標識位置はオリゴヌクレオチドの末端とすることが、被検体の検出のためには最も望ましいことが明らかとなった。

本発明は、検出用プローブが被検体において大過剰である条件において被検体を精度よく検出することを可能とするために、エネルギー移動の時間分解測定法 (蛍光減衰カーブの変化を測定する方法）による被検体の検出に適した検出用プ口一ブを見い出したものである。

すなわち、本発明は、特定のポリヌクレオチド塩基配列を有する被検体を検出するための 1組の検出用プローブであって、

第 1の蛍光色素分子が結合し、前記ボリヌクレオチド塩基配列の一部にハイプリダイズすることが可能な塩基配列を有するドナ一プローブと、

第 2の蛍光色素分子が結合し、前記ポリヌクレオチド塩基配列の一部にハイプリダイズすることが可能な塩基配列を有するァクセプ夕一プローブとからなり、かつ、前記ドナ一プローブと前記ァクセブ夕一プローブに基づく蛍光の減衰力一ブが、前記ドナ一プローブと前記ァクセプ夕ープローブと前記被検体とのハイブリッド体を形成する際に有意に変化する検出用プローブを提供するものである。又、本発明は、上記記载の検出用プローブであって、

前記ハイブリッド体において、前記ドナ一プローブの前記第 1の光分子が結合するヌクレオチドと、前記ァクセブタ一プロ一ブの前記第 2の蛍光分子が結合するヌクレオチド間が 2本鎖構造である、検出用プローブを提供するものである。又、本発明は、上記記載の検出用プローブであって、

前記ハイブリツド体において、前記ドナ一プローブと前記ァクセプ夕ープローブが被検体に隣り合つて逑続してハイブリダィズする、検出用プローブを提供するものである。

又、本発明は、上記記載の検出用プローブであって、

前記第 1の蛍光色素分子または前記第 2の蛍光色素分子のいずれかが、被検体上で連続してハイブリダィズする前記 1組の検出用プロ一ブの膦り合う側の末端部である、検出用プローブを提供するものである。

又、本発明は、上記記載の検出用プローブであって、

前記 1組の検出用プローブと被検体から形成されるハイプリッド体において、ドナープローブとァクセプ夕ープローブが被検体にハイプリダイズして、前記第 1 の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記第 2の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の一部が 2本鎖構造をとる、検出用プローブを提供するものである c 又、本発明は、上記記載の検出用プローブであって、

前記ハイプリッド体において、前記第 1の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記第 2の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の塩基数が 4 ~ 2 0である、検出用プローブを提供するものである。

又、本発明は、上記記載の検出用プローブであって、

前記ハイブリツド体において、前記第 1の蛍光色索分子が結合するヌクレオチドと前記第 2の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド問の塩基数が 8〜 1 6である、検出用プローブを提供するものである。

又、本発明は、上記記載の検出；?]プローブであって、

前記第 1の蛍光色素分子が、 4 , 4ージフルオロー 4—ボロー 3 a、 4 a—ジァザ— s—ィンダセン系蛍光団またはフルォロセイン系蛍光団のいずれかを有し、かつ、前記第 2の蛍光分子が、インドシァニン系蛍光回またはローダミン系蛍光団のいずれかを有する、検出用プロ一ブを提供するものである。

又、本発明は、上記記戦の検出用プローブであって、さらに、

前記第 1の蛍光色素分子が、 4 , 4—ジフルオロー 4ーボロー 3 a、 4 a—ジァザ— s—インダセン系蛍光団を有し、かつ前記第 2の蛍光分子が、インドシァニン系蛍光団を有する、検出用プローブを提供するものである。

さらには、本発明は、特定のポリヌクレオチド塩基配列を有する被検体を検出する方法であって、

( 1 ) 第 1の蛍光色素分子が結合し、前記のポリヌクレオチド塩基配列の一部にハイプリダイズすることが可能な塩基配列を有するドナーブローブと、第 2の蛍光色素分子が結合し、前記ポリヌクレオチド塩基配列の一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を有するァクセプ夕ープローブとからなる 1組の検出用プローブと、前記被検体からハイブリツド体を形成する第 1のステップと、

(2 )前記ハイブリッド体の前記第 2の蛍光色素に基づく蛍光波長域の蛍光強度の減衰カーブを測定する第 2のステップと、

(3 ) 前記 1組の検出用プローブの前記第 2の蛍光色素に基づく蛍光波長域の蛍光強度の減衰カーブを測定する第 3のステップと、

(4) 前記第 2および第 3のステップで得られる蛍光減衰カーブの比較により前記ポリヌクレオチド塩基配列の存在を検出する第 4のステップとからなる方法を提供するものである。

又、本発明は、上記記載の特定のポリヌクレオチド塩基配列を有する被検体を検出する方法であって、

前記ハイブリツド体において、前記ドナープローブの前記第 1の蛍光分子が結合するヌクレオチドと、前記ァクセプ夕ープローブの前記第 2の蛍光分子が結合するヌクレオチド間が 2本鎖栴造である、方法を提供するものである。

前記ハイブリツド体において、前記ドナ一プローブと前記ァクセプタープローブが被検体に隣り合って連続してハイプリダイズする、方法を提供するものである。又、本発明は、上記記載の特定のポリヌクレオチド塩基配列を有する被検体を検出する方法であって、前記第 1の蛍光色素分子または前記第 2の蛍光色素分子のいずれかが、被検体上で連続してハイブリダィズする前記 1組の検出用プローブの隣り合う側の末端部である、方法を提供するものである。

前記 1組の検出用プローブと被検体から形成されるハイブリヅド体において、ドナ一プローブとァクセプ夕一プローブが被検体にハイブリダィズして、前記第 1 の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記第 2の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の一部が 2本鎖構造をとる、方法を提供するものである。

前記ハイプリッド体において、前記第 1の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記第 2の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の塩基数が 4 ~ 2 0である、方法を提供するものである。

前記ハイプリッド体において、前記第 1の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記第 2の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の塩基数が 8〜 1 6である、方法を提供するものである。

又、本 ¾明は、上記記載の特定のポリヌクレオチド塩基配列を有する被検体を検出する方法であって、

前記第 1の蛍光色素分子が、 4 , 4—ジフルオロー 4ーボ口— 3 a、 4 a—ジァザ一s—ィンダセン系 ΐ!ί [光団またはフルォロセイン系 ¾光団のいずれかを苻し、かつ、前記第 2の蛍光分子が、インドシァニン系蛍光団またはローグミン系蛍光団のいずれかを有する、方法を提供するものである。

前記第 1の蛍光色素分子が、 4， 4—ジフルオロー 4ーボロー 3 a、 4 a—ジァザ— s—インダセン系蛍光団を有し、かつ前記第 2の蛍光分子が、インドシァニン系蛍光団を有する、方法を提供するものである。図面の簡単な説明

図 1 Aは、本発明に係わる検出用プローブのいくつかの形態の 1例を示すものであり、ハイブリッド体において、蛍光色素分子が結合している 2つのヌクレオチド間が 2本鎖構造をとり、また、蛍光色素分子の一方は他のプローブとの隣接部に面する末端部に標識（結合）されているものを示す。図で、ドナ一色素とァクセプ夕一色素の位置は相互に交換可能である。

図 1 Bは、本発明に係わる検出用プローブのいくつかの形態の 1例を示すものであり、ハイブリッド体において、蛍光色素分子が結合している 2つのヌクレオチド間が 2本鎖構造をとり、また、蛍光色素分子は両者ともに各プローブの中間部に標識（結合）されているものを示す。図で、ドナー色素とァクセブ夕一色素の位置は相互に交換可能である。

図 1 Cは、本発明に係わる検出用プローブのいくつかの形態の 1例を示すものであり、ハイブリッド体において、蛍光色素分子が結合している 2つのヌクレオチド間が部分的に 2本鎖構造であり、また、蛍光色素分子の一方は他のプローブとの隣接部位に面する末端部に標識されており、他方の蛍光色素分子は当該プロ一ブの中間部に標識されているものを示す。図で、ドナー色素とァクセプ夕一色素の位置は相互に交換可能である。

図 1 Dは、本発明に係わる検出用プローブのいくつかの形態の 1例を示すものであり、ハイブリッド体において、蛍光色絮分子が結合している 2つのヌクレオチド間が部分的に 2本鎖構造であり、また、蛍光色素分子は両者ともに各プローブの中間部に標識されているものを示す。図で、ドナー色素とァクセブ夕一色素の位置は相互に交換可能である。

図 1 Eは、本発明に係わる検出用プローブのいくつかの形態の 1例を示すものであり、ハイブリッド体において、蛍光色素分子が結合している 2つのヌクレオチド間が 1本鎖構造であり、また、蛍光色素分子は両者ともに他のプローブとの隣接部に面する末端部に標識されているものを示す。図で、ドナー色素とァクセプ夕一色素の位置は相互に交換可能である。

図 1 Fは、本発明に係わる検出用プローブのいくつかの形態の 1例を示すものであり、ハイブリッド体において、蛍光色素分子が結合している 2つのヌクレオチド間が二本鎖構造となるように、第 3のプローブ（蛍光非標識）を導入するものを示す。図で、ドナー色素とァクセプ夕一色素の位置は相互に交換可能である。図 2は、本発明に係わる種々の検出用プローブの、被検体（夕一ゲット D N A ) の検出の精度の比較を示した図である。検出用プローブとして、（ 1 ) 蛍光色素分子の組み合わせの種類、（2 ) ハイプリッド体における蛍光色素分子が結合している 2つのヌクレオチド間を一本鎖にしたときおよび二本鎖にしたとき、

( 3 ) ハイプリヅド体における蛍光色素分子が結合している 2つのヌクレオチド間の塩基数（図の横軸）、を変えた。これらの検出用プローブを使用して、被検体とのハイプリッド体形成によるァクセプ夕一波長域の蛍光減衰カーブの変化を測定した。図の縱軸（厶て/び^ ) は、被検体が存在しているときの蛍光減衰力 —ブと被検体が存在していないときの蛍光減衰力一ブとの識別の S / Nを相対的にあらわしたパラメ一夕である。

図 3は、本発明に f系わる検出 fflプローブおよび検出方法を使用して、被検体の存在を検出する概念図である。

図 4は、一組の検出用プロ一ブ（' 光色素分子で標識されたオリゴ D N A ) と被検体である夕一ゲヅト D N Aとを、プローブが過剰になるような稲々の比率で混合したときのァクセプター波長域の蛍光減衰カーブをあらわしたものである。検出用プローブは、ドナー蛍光色素は Bodipy493/503、ァクセプター蛍光色素は C y5、ハイブリツド体形成時におけるドナー蛍光色素が結合しているヌクレオチドとァクセブ夕一蛍光色素が結合しているヌクレオチド間は 1 2塩基離れ、その間は二本鎖になるものを使用している。ターゲット DNAとプローブの比率は、 ① 0 %、 1 %、 ③ 3 %、 ④ 5 %、 ⑤ 2 0 % (ターゲット DNA/プローブ、モル比）である。

図 5は、図 4に示された試料（一組の検出用プローブと被検体であるターゲット D N Aとを、プローブが過剰になるような種々の比率で混合したもの）における蛍光スぺクトルを示したものである。検出用プローブは、ドナー蛍光色素は Bod ipy493/503, ァクセプタ一蛍光色素は Cy5、ハイブリッド体形成時におけるドナ一蛍光色素が結合しているヌクレオチドとァクセプ夕一蛍光色素が結合しているヌクレオチド間は 1 2塩基離れ、その間は二本鎖になるものを使用している。ターゲット DNAとプローブの比率は、 ① 0 %、 ② 1 %、 ③ 3 %、 ④ 5 %、 ⑤ 2 0 % (夕一ゲッ卜 DNA/プローブ、モル比）である。

図 6 Aは、本発明に係わる検出用プローブおよび同プローブを用いた検出方法の応用例の一例を示した概念図であり、核酸の一次構造の変化のなかで、 D N Aの特定部位に他の D N A断片が組み込まれる変化を検出することに使用可能であることを示すものである。

図 6 Bは、本発明に係わる検出用ブローブおよび同プローブを用いた検出方法の応用冽の一例を示した概念図であり、核酸の一次構造の変化のなかで、 D N Aの特定部位に他の D N A断片が組み込まれる変化を検出することに使用可能であることを示すものである。

図 7は、本発明に係わる検出用プローブおよび同プローブを用いた検出方法の応用例の一例を示した概念図である。核酸の一次構造の変化のなかで、 D N Aの特定部位の方向が逆転する変化（逆位）を検出することに使用可能であることを示す。

図 8は、本発明に係わる検出用プローブおよび同プローブを用いた検出方法の応用例の一例を示した概念図である。核酸の一次構造の変化のなかで、 D N Aの特定部位が欠失する変化を検出することに使用可能であることを示す。

図 9は、検出用プローブとして以下の一組を使用したどきの蛍光減衰カーブを示す。すなわち、ドナ一蛍光色素として Bodipy493/503 、ァクセブター蛍光色素として Cy5 を使用し、かつ Bodipy493/503 はドナ一プローブの 5，末端に標識し、 Cy5 はァクセブ夕ープローブの中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリツド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間は二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の塩基間数が 4塩基（n = 4 ) になる検出用プローブを使用したときの蛍光減袞カーブ（秦）である。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 1 0は、検出用プローブとして以下の一組を使用したときの蛍光減衰カーブを示す。すなわち、ドナ一蛍光色素として Bodipy493/503 、ァクセプ夕ー蛍光色素として Cy5 を使用し、かつ Bodipy493/503 はドナ一プローブの 5' 末端に標識し、 Cy5 はァクセブ夕ープローブの中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイプリヅド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間は二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の塩基間数が 8塩 ¾ ( n = 8 ) になる検出用プロ一ブを使用したときの蛍光減衰カーブ（き）である。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 1 1は、検出用プローブとして以下の一組を使用したときの蛍光減衰カーブを示す。すなわち、ドナ一蛍光色素として Bodipy493/503 、ァクセプ夕ー光色素として Cy5 を使用し、かつ Bodipy493/503 はドナ一プローブの 5，末端に標識し、 Cy5 はァクセプ夕一プローブの中問部のヌクレオチドに標識した。また、ハイプリッド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間は二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド問の塩基間数が 1 0塩基（n二 1 0 ) になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カーブ（拳）である。 ▲ は励起光パルスをあらわす。図 1 2は、検出用プローブとして以下の一組を使用したときの蛍光減衰カーブを示す。すなわち、ドナ一蛍光色素として Bodipy493/503 、ァクセプ夕一蛍光色素として Cy5 を使用し、かつ Bodipy493/503 はドナ一プローブの 5，末端に標識し、 Cy5 はァクセプ夕一プローブの中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイプリッド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間は二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の塩基間数が 1 2塩基（n = l 2 ) になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カーブ（き）である。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 1 3は、検出用プローブとして以下の一組を使用したときの蛍光減衰カーブを示す。すなわち、ドナ一蛍光色素として Bodipy493/503 、ァクセプター蛍光色素として Cy5 を使用し、かつ Bodipy493/503 はドナープローブの 5' 末端に標識し、 Cy5 はァクセプ夕一プローブの中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイプリッド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間は二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の塩基間数が 1 4塩基（n = 1 4 ) になる検出用プロ一ブを使用したときの蛍光減衰カーブ（攀）である。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 1 4は、図 9一図 1 3に対するコントロールの蛍光減衰カーブ（參）であり、検出用プローブの蛍光减衰カーブを示す（被検体たる D N Aは含まれていない）。 ▲は励起光パルスをあらわす。

図 1 5は、検出用プローブとして以下の一組を使用したときの' 光減衰カーブ (秦）を示す。すなわち、ドナ一^光色素として Bodipy493/503 、ァクセプ夕一蛍光色素として Cy5 を使用し、かつ Bodipy493/503 はドナープローブの 5' 末端に標識し、 Cy5 はァクセプ夕ープローブの中 f 部のヌクレオチドに標識した。ハイプリッド体において、蛍光色索が結合している 2つのヌクレオチド間は 1 0 塩基離れている（n = 1 0 ) 。ハイブリツド体において、蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間が、すべて二本鎖になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カーブ（像）である。 ▲は励起光パルスをあらわす。

図 1 6は、検出用プローブとして以下の一組を使用したときの蛍光減衰カーブ ( · ) を示す。すなわち、ドナー蛍光色素として Bodipy493/503 、ァクセブ夕 —蛍光色素として Cy5 を使用し、かつ Bodipy493/503 はドナープローブの 5' 末端に標識し、 Cy5 はァクセプ夕ープローブの中間部のヌクレオチドに標識した _c ハイプリヅド体において、蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間は 1 0 塩基離れている（n = 1 0 ) 。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間が、一本鎖となる部分が 2塩基であり二本鎖となる部分が 8塩基になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カーブ（秦）である c ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 1 7は、検出用プロ一ブとして以下の一組を使用したときの蛍光減衰カーブ (秦）を示す。すなわち、ドナー蛍光色素として Bodipy493/503 、ァクセプ夕一蛍光色素として Cy5 を使用し、かつ Bodipy493/503 はドナープローブの 5，末端に標識し、 Cy5 はァクセブ夕一プローブの中間部のヌクレオチドに標識した。ハイプリッド体において、蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間は 1 0 塩基離れている（n = 1 0 ) 。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間が、一本鎖となる部分が 4塩基であり二本鎖となる部分が 6塩基になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カーブ（攀）である。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 1 8は、検出月]プローブとして以下の一組を使用したときの蛍光減衰カーブ (· ) を示す。すなわち、ドナ一 ¾光色素として Bodipy493/503 、ァクセブ夕 —蛍光色素として Cy5 を使用し、かつ Bodipy493/503 はドナープローブの 5' 末端に標識し、 Cy5 はァクセプ夕一プローブの中問部のヌクレオチドに標識した。ハイプリッド体において、蛍光色尜が結合している 2つのヌクレオチド間は 1 0 塩基離れている（n = 1 0 ) 。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間が、一本鎖となる部分が 6塩基であり二本鎖となる部分が 4塩基になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カーブ（翁）である。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 1 9は、図 1 5—図 1 8に対するコントロールの蛍光減衰カーブであり、検出用プローブの蛍光減衰カーブ（參）をあらわす（被検体たる D N Aは含まれていない）。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 2 0は、検出用プローブとして以下の一組を使用したときの蛍光減衰カーブ (· ) を示す。ドナ一蛍光色素として Bodipy493/503 、ァクセブ夕一蛍光色素として Cy5 を使用した。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合している 2 つのヌクレオチド間は 1 0塩基離れており（n = 1 0 ) 、その間は二本鎖を形成している。ドナ一ブローブにおける Bodipy493/503 の標識位置を 5 ' 末端とした検出用プローブ（ハイプリッド体において 2つのプローブが隣接するヌクレオチドに Bodipy493/503が結合している）を使用したときの、蛍光減衰カーブ（會）である。ァクセブ夕一プローブにおける Cy5 の標識位置は n = 1 0となる位置である（中間標識）。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 2 1は、検出用プローブとして以下の一組を使用したときの蛍光減衰カーブ ( · ) を示す。ドナ一蛍光色素として Bodipy493/503 、ァクセプ夕ー蛍光色素として Cy5 を使用した。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合している 2 つのヌクレオチド間は 1 0塩基離れており（n = 1 0 ) 、その間は二本鎖を形成している。ドナ一プローブにおける Bodipy493/503 の標識位置を、ハイブリツド体における 2つのプロ一ブの切れ目の位置（ァクセブターブローブと隣接する位蹬、ドナ一プローブの 5^} 末端）から内側に 1塩 Sずれた位とした検出用プローブを使用したときの、蛍光減衰カーブ（暴）である。ァクセプ夕ープローブにおける Cy5 の標識位 iSは n = 1 0となる位である（中問標識）。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 2 2は、検出用プローブとして以下の一組を使用したときの蛍光減衰カーブ ( · ) を示す。ドナ一蛍光色素として Bodipy493/503 、ァクセプ夕ー蛍光色素として Cy5 を使用した。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合している 2 つのヌクレオチド間は 1 0塩基離れており（n = 1 0 ) 、その間は二本鎖を形成している。ドナープローブにおける Bodipy493/503 の標識位置を、ハイブリツド体における 2つのプローブの切れ目の位置（ァクセブ夕一プローブと隣接する位置、ドナープローブの 5' 末端）から内側に 2塩基ずれた位置とした検出用プローブを使用したときの、蛍光減衰カーブ（攀）である。ァクセブ夕一プローブにおける Cy5 の標識位置は n = 1 0となる位置である（中間標識）。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 2 3は、検出用プローブとして以下の一組を使用したときの蛍光減衰カーブ ( · ) を示す。ドナー蛍光色素として Bodipy493/503 、ァクセブター蛍光色素として Cy5 を使用した。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合している 2 つのヌクレオチド間は 1 0塩基離れており（n = l 0 ) 、その間は二本鎖を形成している。ドナープローブにおける Bodipy493/503 の標識位置を、ハイブリツド体における 2つのプローブの切れ目の位置（ァクセプ夕一プローブと隣接する位置、ドナ一プローブの 5' 末端）から内側に 4塩基ずれた位置とした検出用プローブを使用したときの、蛍光減衰カーブ（參）である。ァクセプタ一プローブにおける Cy5 の標識位置は n = 1 0となる位置である（中間標識）。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 2 4は、図 2 0—図 2 3に対するコントロールの' 光減衰カーブであり、検出用プローブの蛍光减袞カーブ（翁）をあらわす（被検体たる D N Aは含まれていない）。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 2 5は、検出用ブローブとして以下の一組を使用したときの ¾光減袞カーブ ( · ) である。すなわち、ドナ一光色素として Bodipy493/503 、ァクセプ夕 —蛍光色素として Cy3. 5 を使用し、かつ Bodi py493/503 はドナ一プローブの 5 ' 末端に標識し、 Cy3.5 はァクセプ夕一プローブの中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間は二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合している 2 つのヌクレオチド間の塩基間数が 8塩基（n 二 8 ) になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カーブ（参）である。 ▲' は励起光パルスをあらわす。

図 2 6は、検出用プローブとして以下の一組を使用したときの蛍光減衰カーブ

(き）である。すなわち、ドナー蛍光色素として Bodipy493/503 、ァクセプ夕一蛍光色素として Cy3.5 を使用し、かつ Bodipy493/503 はドナープローブの 5 ' 末端に標識し、 Cy3.5 はァクセブタ一プローブの中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間は二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合している 2 つのヌクレオチド間の塩基間数が 1 2塩基（n = l 2 ) になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カーブ（參）である。 ▲ は励起光パルスをあらわす。図 2 7は、検出用プロ一ブとして以下の一組を使用したときの蛍光減衰カーブ

(參）である。すなわち、ドナ一蛍光色素として Bodipy493/503 、ァクセプ夕 —蛍光色素として Cy3.5 を使用し、かつ Bodipy493/503 はドナ一プロ一ブの 5 ' 末端に標識し、 Cy3.5 はァクセプ夕一プローブの中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリッド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間は二本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合している 2 つのヌクレオチド間の塩基間数が 1 6塩基（n = l 6 ) になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カーブ（會）である。 ▲ は励起光パルスをあらわす。図 2 8は、図 2 5—図 2 7に対するコントロールの蛍光減衰カーブであり、検出用プローブの ¾光減衰カーブ（秦）をあらわす（被検体たる D N Aは含まれていない）。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 2 9は、検出用プローブとして以下の一組を使用したときの ¾光減袞カーブ (參）である。すなわち、ドナ一 ¾光色素として Bodipy493/503 、ァクセプタ —蛍光色素として Cy5 を使用し、かつ Bodipy493/503 はドナ一プローブの 5' 末端に標識し、 Cy5 はァクセブ夕一プローブの中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイプリッド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間は一本鎖を形成する。ハイブリツド体において、蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の塩基間数が 4塩基（η = 4 ) になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カーブ（像）である。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 3 0は、検出用プローブとして以下の一組を使用したときの蛍光減衰カーブ

( · ) である。すなわち、ドナ一蛍光色素として Bodipy493/503、ァクセブ夕 —蛍光色素として Cy5 を使用し、かつ Bodipy493/503 はドナ一プローブの 5' 末端に標識し、 Cy5 はァクセブ夕一プローブの中問部のヌクレオチドに標識した c また、ハイプリッド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間は一本鎖を形成する。ハイブリツド体において、蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の塩基間数が 8塩基（n = 8 ) になる検出用プローブを使用したときの蛍光减衰カーブ（鲁）である。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 3 1は、検出用プローブとして以下の一組を使用したときの蛍光減衰カーブ

( · ) である。すなわち、ドナー蛍光色素として Bodipy493/503 、ァクセブ夕 —蛍光色素として Cy5 を使用し、かつ Bodipy493/503 はドナ一プローブの 5' 末端に標識し、 Cy5 はァクセプ夕一プローブの中間部のヌクレオチドに標識したまた、ハイブリツド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間は一本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の塩基間数が 1 0塩基（n = 1 0 ) になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カーブ（翁）である。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 3 2は、検出用プローブとして以下の一組を使用したときの' 光减衰カーブ

( · ) である。すなわち、ドナー光色素として Bodipy493/503 、ァクセプ夕 —'虽光色素として Cy5 を使用し、かつ Bodipy493/503 はドナープロ一ブの 5' 末端に標識し、 Cy5 はァクセプ夕一プローブの中問部のヌクレオチドに標識したまた、ハイプリッド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド問は一本鎖を形成する。ハイブリツド体において、蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の塩基間数が 1 2塩基（n = l 2 ) になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カーブ（き）である。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 3 3は、検出用プローブとして以下の一組を使用したときの蛍光減衰カーブ

( · ) である。すなわち、ドナー蛍光色素として Bodipy493/503 、ァクセプ夕一蛍光色素として Cy5 を使用し、かつ Bodipy493/503 はドナ一プローブの 5，末端に標識し、 Cy5 はァクセプ夕一プローブの中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイプリッド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間は —本鎖を形成する。ハイブリツド体において、蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の塩基間数が 1 5塩基（n = l 5 ) になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カーブ（參）である。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 3 4は、検出用プローブとして以下の一組を使用したときの蛍光減衰カーブ

(參）である。すなわち、ドナ一蛍光色素として Bodipy493/503 、ァクセプ夕一蛍光色素として Cy5 を使用し、かつ Bodipy493/503 はドナ一プローブの 5' 末端に標識し、 Cy5 はァクセブタープローブの中間部のヌクレオチドに標識した。また、ハイブリツド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間は一本鎖を形成する。ハイブリッド体において、蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の塩基間数が 2◦塩基（n = 2 0 ) になる検出用プローブを使用したときの蛍光減衰カーブ（參）である。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 3 5は、図 2 9—図 3 4に対するコントロールの ¾光減袞カーブであり、検出用プローブの蛍光減袞力一ブ（参）をあらわす（被検体たる D N Aは含まれていない）。 ▲ は励起光パルスをあらわす。

図 3 6は、一組の検出 fflプローブ（ίίί光色絮分子で楞識されたオリゴ D N A ) と被検体である夕ーゲット R N Aとを、プローブが過剰になるような極々の比率で混合したときのァクセプ夕一波長域の ¾光減衰カーブをあらわしたものである。検出用プローブは、ドナ一蛍光色素は Bodipy493/503、ァクセプ夕ー蛍光色素は Cy5、ハイプリッド体形成時におけるドナ一蛍光色素が結合しているヌクレオチドとァクセプ夕一蛍光色素が結合しているヌクレオチド間は二本鎖、塩基間数は

12 (n= 1 2) になるものを使用している。夕一ゲット RNAとプローブの比率は、 ① 0%、 ② 2. 5%、 ③ 5%、 ④ 20% (ターゲット RNA/プローブ、モル比）である。

図 37は、図 36に示された試料（一組の検出用プローブと被検体であるターゲット RNAとを、プローブが過剰になるような種々の比率で混合したもの）における蛍光スペクトルを示したものである。検出用プローブは、ドナー蛍光色素は Bodipy493/503、ァクセプター蛍光色素は Cy5、ハイブリッド体形成時におけるドナー蛍光色素が結合しているヌクレオチドとァクセプ夕一蛍光色素が結合しているヌクレオチド間は二本鎖、塩基間数は 1 2 (n= 1 2) になるものを使用している。ターゲット RNAとプローブの比率は、 ① 0%、 ② 2. 5°/₀、 ③ 5%、 ④ 20% (ターゲット RNA/ブローブ、モル比）である。

図 38は、一組の検出用プローブ（蛍光色素分子で標識された S—オリゴ）と被検体である夕一ゲヅト RNAとを、ブローブが過剰になるような種々の比率で混合したときのァクセプ夕一波長域の蛍光減衰カーブをあらわしたものである。検出用プローブは、ドナ一蛍光色素は Bodipy493/503、ァクセプ夕ー蛍光色素は C y5、ハイプリヅド体形成時におけるドナ一蛍光色素が結合しているヌクレオチドとァクセプ夕ー蛍光色素が結合しているヌクレオチド間は二本鎖、塩基間数は 1 0 (n= 1 0) になるものを使用している。ターゲット RNAとプローブの比率は、 ① 0%、 ② 2. 5%、 ③ 5%、 ④ 20% (ターゲット RNA/プローブ、モル比）である。発明を実施するための最良の形態

被検体

本発明に係わる検出用プローブおよび検出方法を用いて検出する被検体は、その種類、構造、長さ等において特に制限はなく、通常の核酸および核酸類似体を含む。例えば、 D N A、 R N A、合成オリゴヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド等があげられる。また、被検体は、本発明に係わる検出用プローブが実質的に特異的に結合する特定の塩基配列をもつ構造を被検体の一部として有するものを含む。このとき、被検体は、そのすべてが核酸構造を有する必要はない。したがつて、本発明に係わる検出方法の使用においては、被検体の核酸および核酸類似体のすべての塩基配列が知られている必要はなく、本発明に係わる検出用プロ一ブを特異的に結合させる特定の部分の塩基配列が知られていればよい。

被検体における上記特定部分の塩基配列を知るためには、公知の塩基配列決定方法を使用すればよい。検出用プローブ

本発明に係わる検出用プローブは、異なる種類の蛍光色素分子で標識された 2 つの蛍光標識ォリゴヌクレオチドを一組として使用するものである。

検出用プローブの骨格をなす核酸の部分については、 D N Aや R N Aに制限されるものではなく、一般に使用されている種々の核酸類似体でもよい。たとえば、りん酸エステル部をホスホロチォエー卜にしたもの（s—オリゴ）やメチルホスホネートにしたもの（M—オリゴ）、メチルホスホロチォェ一トにしたものなどがある。また、ホスホジエステル結合をアミド、スルホアミド、エチレングリコ —ル、チォフォーマルに置き換えたものなどがある。また、糖への修飾をしたものでもよい。たとえば、リボースの 2 ' 位を、 2 ' — 0—アルキル、 2 ' —0— ァリル、 2 ' -ハロゲン、 2 ' —ァミノ体に修飾したものなどである。また、ポリアミド核酸（P N A ) でもよい。

各プローブの塩基数には特に制限はない。被検体である夕ーゲッ卜核酸と安定したハイブリツド体を形成すること、被検体以外の核酸との誤認識によるハイブリツド体形成の確率が低いこと、の条件を満足すればよい。この目的のためには、通常は 1 0塩基以上あればよく、好ましくは 1 5塩基以上である。また、 2つのプローブの合計塩基数も特に制限はない。被検体の夕ーゲット核酸の特定の塩基配列部位に 2つのプローブがともにハイプリダイズすることが可能であればよい。通常、 2 0塩基以上、好ましくは 3 0塩基以上である。

本発明に係わるプローブの塩基配列は、被検体に検出用プローブが結合（ハイブリダィズ）する被検体中の特定部位の塩基配列と相補的なものとすればよい。このとき、検出用プローブが被検体中の上記特定部位に実質的にハイブリダィズするのであれば、検出用ブローブの塩基配列の一部は被検体中の上記特定部位の塩基配列と相補性をもたなくともよい。

本発明に係わるプローブは、被検体である夕一ゲット核酸とハイプリッド体を形成したときに、ァクセプ夕ー蛍光色素の蛍光減衰が大きく遅れるものである。本発明に係わるプローブは、そのために、蛍光色素の組み合わせ、ハイブリッド体における蛍光色素分子が結合しているヌクレオチド間の塩基数、ハイプリッド体における蛍光色素分子が結合しているヌクレオチド間を一本鎖とするか二本鎖とするか、ハイブリッド体における蛍光色素分子の位置、を適切に設定したものである。

一般に、ドナ一色素、ァクセプ夕一色素がそれぞれ単独で存在しているとき、パルス励起したときのそれぞれの蛍光強度の減衰は、それぞれの分子に固有の時定数（蛍光寿命）で減袞する単一指数関数であらわされる（式（ 1 ) および（ 2 )

) o

ドナ一が単独で存在しているとき（ドナ一一ァクセプ夕—問にエネルギー移動がおきていないとき）のドナ一の' 光減裒カーブ

I _d ( t ) = exp(-t/r _d ) Γ _ϋ ：ドナーの ¾光寿命（式 1 ) ァクセプ夕ー単独で存在しているとき（ドナ一一ァクセプター P にエネルギー移動がおきていないとき）のァクセブ夕一の蛍光减袞力一ブ I_a(t) = exp(-t/rJ て _a ：ァクセプ夕一の蛍光寿命（式 2) ドナーとァクセブ夕一とめ間で共鳴エネルギー移動がおこると、ドナ一の蛍光減衰は速くなり、ァクセブ夕一の蛍光減衰は遅くなる。ドナー分子とァクセブ夕一分子の間の距離が固定されているとしたときのドナ一の蛍光減衰カーブは式（3) であらわされる。ここで、蛍光寿命て _daはエネルギー移動の効率 Eにより規定される。すなわち、エネルギー移動の効率が高くなるほど、ドナ一の蛍光減衰は速くなる。

エネルギー移動をおこしているドナーの蛍光減衰カーブ i' d(t) = exp(-t/r_da) (式 3)

—方、ァクセプ夕一の蛍光減衰カーブは式（4) であらわされる。この減衰力一ブは単一指数関数ではない。

ェネルギー移動励起のァクセプタ一の蛍光減衰カーブ (式 4

上述したように、式（3) および式（4) は、ドナー分子とァクセプ夕一分子の間の距離が固定されているとしたときの減衰カーブである。ドナ一ーァクセプ夕一の距離が固定されておらず揺らいでいるときには、式（3) (4) の（エネルギ一移動時のドナーの光命）は定数ではなく、揺らぎにともなうドナ一ァクセブ夕一 R¾の距離の分布をあらわす関数が組み込まれる。

2つの蛍光色素分子間のエネルギー移動を時間分解法で測定することにより検出用プローブが夕一ゲッ卜核酸に対して過剰に存在する条件においてターゲッ卜核酸を高感度で検出するためには、式（4 ) であらわされる蛍光減衰カーブと式 ( 2 ) であらわされる蛍光減衰カーブの差を大きくすることが必要である。式 ( 4 ) の蛍光減衰カーブは、ドナーの蛍光寿命、ァクセブ夕一の蛍光寿命、エネルギー移動効率、ドナ一一ァクセブ夕一間の距離の揺らぎの大きさ、により、式 ( 2 ) はァクセブ夕一の蛍光寿命により規定されている。

したがって、蛍光色素の組み合わせ、ハイブリッド体における 2つの蛍光色素分子間の平均距離（エネルギー移動効率を主に規定する）、およびその揺らぎの大きさを相互に適切に設定すればよい。

なお、蛍光色素の組み合わせは、次の条件を満たすものが好ましい。

1 . ドナーの蛍光寿命がァクセプ夕一の蛍光寿命よりも長く、その差が大きい

2 . ドナーの励起波長において、ァクセプ夕一が励起される確率が低い。

(ドナ一の吸収極大での分子吸光係数 > >ドナーの吸収極大でのァクセプ夕一の分子吸光係数）

3 . ドナーの蛍光スぺクトルとァクセプ夕一の蛍光スぺクトルの重なりが小さい。（ァクセプターの蛍光波長域へのドナーの蛍光の混入が少ない）

上記の条件を満たす蛍光色素の組み合わせとしては、例えば、ドナー色素として Bodipy (4,4-dnluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indance) 糸色素また i フレ才レッセン系色素を使用し、これらにァクセプ夕一色素としてィンドシァニン系色素またはローダミン系色素を組み合わせたものがある。

ハイプリッド体における 2つの蛍光色素分子問の平均距離は、ハイプリッド休における 2つの逝光色尜分子 R が結合しているヌクレオチド問の塩基数により決まる。また、蛍光色素分子問の距離の揺らぎの大きさは、ハイブリッド体において 2つの蛍光色素分子が結合しているヌクレオチド問が一本鎖構造であるか二本鎖構造（図 1を参照）であるか、ハイブリッド体における' 光色素分子の位^、および蛍光色素分子とオリゴヌクレオチドとのリンカーの祸造と長さなどにより決定されると予想される。表 1は、実施例に基づき、種々の蛍光標識プローブとターゲット D N Aとのハイブリツド体において、ァクセプ夕一波長域の蛍光減衰カーブの遅れが観測された例をまとめたものである。種々の蛍光標識プローブを作製し、 '各一組のプロ一ブと夕ーゲット D N Aを混合してハイプリッド体を形成させた。ハイプリッド体を高速液体クロマトグラフィーを用いて分離し、蛍光スぺクトルおよび蛍光減衰カーブを測定した。また、各一組のプローブについて、夕一ゲッ卜 D N Aを含まない試料において蛍光スべクトルおよび蛍光减衰カーブを測定し、ハイプリッド体形成にともなう蛍光スぺクトルの変化および蛍光減衰カーブの変化（遅れ）を観察した（詳細は実施例の項参照）。

表 1 蛍光分子蛍光分子蛍光分子間蛍光スべクァクセプ夕ードナー/ 間構造の塩基数トル変化波長域の蛍光ァクセプ夕ー（n) 減衰の遅れ

B0DIPY/Cy5 1本鎖 4,8,10， 12， 15,20 +

2本鎖 4，8,10，12,14 +

B0DIPY/Cy3.5

2本鎖 8,12,16 + + +

FITC/Cy5 1本鎖 1Z, 15,20 + +

2本鎖 10,12 + + +

FITC/Cy3 1本鎖 12,15,20 +

2本鎖 10,13,15 + +

FITC/D-タ'、ミン 1本鎖 4,8,12,15,20 +

2本鎖 15 + +

「Bodipy」はモレキュラープロ一ブス社（Molecular Probes Inc . Eugene, OR, USA) の商標である。また、特にことわりのない限り、実施例の「Bodipy」は「Bodipy 493/503」である。また、 C y 3、 C y 3 . 5、 C y 5はアマ一シャム社（Amersham)の商標である。

使用したすべての種類の検出用プローブにおいて、ハイブリツド体形成による蛍光スペクトル変化が親測された。これは、ハイブリッド体形成により、ェネルギ一移動がおきることを示している。ァクセブ夕一波長域の蛍光減衰カーブの遅れの大きさは、検出用プローブの種類により大きな差が認められた。表 1の「ァクセプ夕一波長域の蛍光減衰の遅れ」の項で、 + + + +は蛍光減衰に極めて大きな遅れが生じることをあらわし、 + + +は蛍光減衰に大きな遅れが生じることを、 + +は蛍光減衰に遅れが生じることを、 +は蛍光減衰に遅れが認められることをあらわす。一は蛍光減衰に遅れが認められないことをあらわす。

蛍光色素の組み合わせとしては、 Bodipy/Cy5 が最も好ましく、次いで、 Bodip y/Cy3.5、 F ITC/Cy5 の順となる。 FITC/Cy3、 FITC/D-タ"ミンの組み合わせは、ハイブリツド体において蛍光色素間を二本鎖構造とするときには使用可能である。ドナ一色素として、 Bodipy が FITC よりも優れているのは、主に、 Bodipy の蛍光寿命（約 7ナノ秒）が FITC の蛍光寿命（約 4ナノ秒）よりも長いため、ァクセプ夕一色素の蛍光寿命（Cy5 は約 1ナノ秒、ローダミンは約 3ナノ秒）との差が大きくなることに起因すると考えられる。また、 F ITC/Cy3、 FITC/D-タ"ミンのように、ドナ一の蛍光スぺクトルとァクセブターの [光スぺクトルの分離がよくない組み合わせを用いたときには、ハイプリッド体における蛍光色素間を二本鎖 5造としたときには光減衰の遅れが生じたが、一本鎖祸造としたときには' 光減衰の遅れは認められなかった。

衷 1から Π刀らかなように、ハイブリツド体における蛍光色素問の構造を二本鎖とする方が一本鎖とするよりも、蛍光減衰に大きな遅れが生じることがわかる。ハイブリツド体において、 2つの蛍光色素が結合しているヌクレオチド間が一本鎖構造のときには、一本鎖となっている部分の分子運動の自由度は大きいため、ドナー色素とァクセプ夕一色素の相対的な空間位置は大きく揺らぐと考えられる c すなわち、 2つの色素間の距離は、時間により大きく揺らいでいる。一方、二本鎖構造の場合は、その部分の分子運動の自由度は一本鎖のときよりもはるかに制限されるため、ドナー色素とァクセプター色素間の距離の揺らぎや分布は小さくなる。実施例の結果は、ドナー色素とァクセプ夕一色素間の距離の揺らぎが小さい方が、すなわち、ハイブリッド体における 2つの蛍光色素間の構造を

二本鎖とする方が、蛍光減衰に大きな遅れが生じることを示している。

上記および実施例に示したように、夕ーゲット核酸とのハイブリツド体形成にともない大きな蛍光減衰の遅れを生ずる種々の一組の蛍光標識プローブが存在する。これらのプローブを用いたときの、ハイブリッド体形成にともなう蛍光減衰カーブの変化の検出の精度を定量的に比較するために以下の解析をおこなった。ハイブリッド体形成にともない（エネルギー移動により）、ァクセブ夕一の蛍光は増加するが、その増加量は各プローブごとに異なる（エネルギー移動効率に依存するため）。したがって、ハイブリッド体形成にともなう蛍光減衰カーブの変化を識別する精度は、減衰カーブの変化の大きさと蛍光の光量の変化量により決る。

各一組のプローブの評価は、ハイプリッド体を形成したプローブの蛍光減袞カ —ブとハイプリッド体を形成していないときのプローブの蛍光減袞カーブの識別の S /N (シグナル/ノイズ比）を指標として行った。

2つの ¾光減褒カーブの識別の S / Nは、以下の手順で求めた（S . A. Soper, B. L . Legender， & D . C . Wi l l iams . ( 1995 ) Analy. Chem. 67 4358- 4365 を参考にした）。

まず、ハイブリッド体を形成しているプローブの蛍光減衰カーブ、およびハイプリッド体を形成していないときのプローブ（夕一ゲット核酸が含まれていない試料）の蛍光減衰カーブそれぞれについて、パルス励起光照射後 3ナノ秒から 7 ナノ秒の時間域を用いて、減衰の速さ（蛍光寿命て）を

τ二-

' D₀: 3— 5ナノ秒の時間域における蛍光量

D 5— 7ナノ秒の時間域における蛍光量

At= 2ns

の式により求めた。また、このときの測定値のバラツキの大きさびを

σ=τχ (-ln(D₁/Do))/(l/Do + l/D₁) ^1/2

により求めた。 σは測定を同一条件で多数回行ったときの測定値の分布の標準偏差であり、蛍光量が増えるほど小さな値をとる（蛍光量が増えると、測定値のバラツキは小さくなる）。

ハイブリツド体を形成しているプローブの蛍光減衰カーブとハイブリツド体を形成していないときのプロ一ブの蛍光減衰力一ブの識別の S / Ν (シグナル/ノィズ比）は、蛍光寿命の差（Δτ) を測定値のバラツキの和（び。_r) で減じた △ て/ σ であらわされる。

ここで、 Δ =て（ハイブリッド体）一て（プローブ）

α,_τ= (σ (ハイブリッド体） ²+σ (プローブ） ²) ^1/2 表 2および図 3は結果を示したものである（衷 2および図 3の厶て/び _{Δ Γ}の値は相対値である）。

表 2

B0DIPY/CY5 ( 2本鎖)

η=4 η=8 η=10 η=12 η二 14

Δ τ/σ_Δτ 0.292 0.657 1.081 1.051 1.026

B0DIPY/CY3.5 (2本鎖）

η=8 η:12 η=16

Δて/ σ 0.449 0.733 0.760

FITC/CY5 ( 2本鎖）

η=10 η=16

0.372 0.629

B0DIPY/CY5 (1本鎖)

η=4 η=8 η二 10 η=12 η=15 η二 20

Δ τ/σ_ΔΓ 0.066 0.052 0.221 0.382 0.638 0.832

B0DIPY/CY5 (η=10, 1本鎖 /2本鎖)

6/4 4/6 2/8 0/10

Ατ/σ_Ατ 0.333 0.463 0.837 0.933

B0DIPY/CY5 (2本鎖， η二 10) B0DIPY色尜の標識位^ (Μフ"リツに体の切れ目の位^ からの塩基数）

0 1 2 4

Δτ/σ_Δτ 0.932 0.698 0.589 0.377 表 2および図 3は、 Bodipy/Cy5, Bodipy/Cy3.5, FITC/CY5 の蛍光色素の組み合わせに対して、ハイブリッド体において色素が結合している 2つのヌクレオチド間の塩基数を変えたときの、蛍光減衰カーブの変化の識別の S/Nを示している < また、表には、蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の構造の違い（一本鎖または二本鎖）による識別の S/Nへの影響をみるために、 Bodipy/Cy5 の色素の組み合わせにおいて塩基間数を 10に固定し、その間を一本鎖と二本鎖の混合構造として、一本鎖と二本鎖の比率を変えたときの S/Nの変化を示した。また、ハイブリッド体における蛍光色素の標識位置の影響をみるために、 Bodipy /Cy5 の色素の組み合わせにおいて塩基間数を 10に固定し、 Bodipy標識プロ一ブ（ドナープローブ）の Bodipy の標識位置を 5，末端（切れ目の位置 =0) から中間部へずらしたときの S / Nの変化を示した。

以上の結果から、以下のことが明らかである。

( 1 ) Bodipy/Cy5 の蛍光色素の組み合わせにおいて、 2つの蛍光色素が結合しているヌクレオチド間がハイプリッド体において二本鎖構造をとる場合は、 2つの蛍光色素の間の塩基数は 10— 12が最もよい。

(2) Bodipy/Cy5 の蛍光色素の組み合わせにおいて、 2つの蛍光色素が結合しているヌクレオチド間がハイブリツド体において一本鎖構造をとる場合は、識別の S/Nは 2つの蛍光色素の間の塩基数が増大するほどよくなる（4く nく 20 において）。 n= 20における識別の S/Nは、二本鎖構造のときと比較すると低い。

(3) Bodipy/Cy3.5 の ίίί光色素の組み合わせにおいて、 2つの ¾光色素が結合しているヌクレオチド問がハイブリッド体において二本鎖構造をとる場合は、 2 つの蛍光色素の間の塩基数に対する S/Nの依存性は、 Bodipy/Cy5 の組み合わせのときと同様の倾向を示す。しかしながら、 S/Nの値は Bodipy/Cy5 よりも低い。

(4) FITC/Cy5 の蛍光色素の組み合わせにおいて、 2つの蛍光色素が結合しているヌクレオチド間がハイプリヅド体において二本鎖構造をとる場合は、 S /N は Bodipy/Cy5よりも低い値をとる。

( 5 ) Bodipy/Cy5 の蛍光色素の組み合わせ（ハイプリッド体における 2つの蛍光色素が結合しているヌクレオチド間の塩基数、 n = 1 0 ) において、 2つの蛍光色素が結合しているヌクレオチド間の構造を一本鎖と二本鎖の混合構造としたときには、すべて二本鎖の場合が、最もよい識別の S /Nを与える。

( 6 ) Bodipy/Cy5 の蛍光色素の組み合わせ（ハイブリッド体における 2つの蛍光色素が結合しているヌクレオチド間の塩基数、 n = 1 0 ) において、 Bodipy 標識プローブ（ドナープローブ）の Bodipy の標識位置は 5，末端が最もよい。標識位置がプ口一ブの中央部へと移行するにつれて、 S /Nは低下する。

ここで（6 ) の結果は以下のように解釈される。 2つのプローブとターゲット核酸とからなるハイプリヅド体において、 2つのプローブが隣り合つているヌクレオチドのところでは、プローブ側の鎖に切れ目が生じている。そのため、ターゲッ卜核酸側の対応するホスホジエステル結合は運動の自由度が大きくなる。したがって、ハイプリッド体の水溶液中での運動にともなう 2つの蛍光色素間の距離の揺らぎの大きさは、蛍光色素がハイブリツド体の切れ目の位置に近いほど小さいと予想される。（6 ) の結果は、ドナ一プローブまたはァクセプ夕ープロ一ブのどちらか一方を、ハイプリッド体において他のプローブと向き合う側の末端に標識することが、識別の S /Nを最も増大させることを示している。

これらの結架から、本 ¾明の実施例で使用する検出用プロ一ブのなかで最適のものは、 Bodipy/Cy5 を ¾光色尜の組み合わせとして用いたもので、被検体とのハイブリツド体において Bodipy と Cy5 が結合しているヌクレオチド問が二本鎖^造を形成し、塩 ¾問数が 1 0— 1 2となる一組のものであることがわかる。このとき、 Bodipy、 Cy5 のいずれかの色素はそれぞれの検出用プローブの末端に feiililされてい d。

本発明に係わる検出用プローブにおいては、蛍光色素分子のオリゴヌクレオチドへの結合基については特に限定されないが、適当なリンカ一を介して結合することが望ましい。このとき、リンカ一があまりに短い場合は、蛍光色素分子と核酸の骨格部や塩基部との相互作用が強ぐなり、その結果として、望まれる 2つの蛍光色素分子間での共鳴エネルギー移動が十分におこらなくなる可能性がある _c また、リンカ一があまりに長い場合には、 2つの蛍光色素分子が自由に運動して、 2つの蛍光色素分子間の距離の揺らぎが大きくなりすぎる可能性が強いため好ましくない。本発明に係わる検出用プローブの好ましいリンカ一の長さとしては、テトラメチレン鎖ーデカメチレン鎖である。蛍光色素分子との結合は、公知の共有結合生成反応を用いることができる。例えば、アミド、エステル、エーテル結合等であるが、特にアミド結合が好ましい。本実施例で使用した検出用プローブは、リンカ一としてテトラメチレン鎖を使用したものである。

本発明に係わる検出用プローブに用いる蛍光色素の組み合わせのなかで、ドナ一色素として「4 , 4ージフルオロー 4ーボロー 3 a、 4 a—ジァザ一s—インダセン系蛍光団（Bodipy) 」を有するものを使用し、これにァクセブ夕一色素としてインドシァニン系蛍光団を有するものを組み合わせる例として、 Bodipy 493 /503 と Cy3、 Cy3. 5、 Cy5 を組み合わせた例を示した。波長特性の異なる他の種類の Bodipy (Molecular Probes Inc . ) および Cy5. 5、 Cy7 (Amersham) も使用可能である。例えば、「Bodipy- TMR，Cy5. 5」や「Bodipy- TR, Cy7j の組み合わせがある。これらの組み合わせは、「Bodipy 493/503 , Cy5j の組み合わせと同じく、ドナーとァクセプ夕一との蛍光穽命の差が約 7倍であり、ドナーの' i¾光スぺクトルの極大波長とァクセプ夕一の ¾光スぺクトルの極大波長が約 150 nm 離れている、という特徴を苻している。「Bodipy- TMR, Cy5.5j 「Bodipy- TR， Cy7j の組み合わせは、「Bodipy 493/503, Cy5」よりも波長が全体として、それぞれ、約 50 nm、約 100 nm 長波長側にシフ卜したものである。一般に、生体試料は、発光する物質を含有していることが多いが、これらの発光は測定に対してバックグラウンド光となり、測定の S / Nを低下させる。これらのバックグラウンド光は、一般に、長波長域になるほど発光量が減少するため、生体試料の高感度測定を行うときには、長波長域を使用する方が有利である。被検体の検出方法

本発明に係わる検出用プローブを用いた被検体の検出は、例えば次のように行うことが可能である（図 3参照）。

( 1 ) 検出用プローブを作製する。

( 2 ) 試料に検出用プローブを適当量加える。試料中に被検体が含まれていれば、検出用プローブの一部は被検体とハイプリッド体を形成する。

( 3 ) 蛍光時間分解測定が可能な測定装置を用いて、ァクセプ夕一波長域の蛍光減衰カーブを測定する。ァクセプター波長域の蛍光には、ハイブリッド体形成にもとづくエネルギー移動励起の蛍光が含まれている。

( 4 ) 検出用プローブのァクセプ夕一波長域の蛍光減衰カーブを測定する。

( 5 ) ( 3 ) で測定した蛍光減衰カーブと（4 ) で測定した蛍光減衰カーブを比較検定する。試料中に被検体が存在していれば蛍光減衰カーブは変化する。試料中に被検体が存在しない場合においては、 2つの蛍光减衰カーブに有意の差はみられない。プロ一ブ過剰条件における被検体の検出の検定

本 ¾明に係わる検出用プローブおよび検出方法は、プロ一ブが被検体に対して大過剰である条件においても、被検体の存在を髙粘度で検出可能とするものである。図 4に、検出用プローブとして、 Bodipy/Cy5 の ί¾光色索の紐み合わせを用い、ハイプリッド体における ¾光色絮が結合している 2つのヌクレオチド問が二本鎖構造をとり、その間の塩 ®数が 1 2であるものを使用したときの結果を示す c これは、検出用プローブと夕ーゲッ卜 D N Αとの濃度比を変化させたときの蛍光減衰カーブの変化を示したものである。検出用プローブの濃度を一定にし、ターゲット DN Aをモル比で 0% (夕ーゲット DN Aを加えないもの）， 1¾， 3¾, 5 % 20% となるように加えた。図 4から明らかなように、検出用プローブが夕 —ゲット核酸に対し 100倍量過剰であっても、十分に有意の差を示す蛍光減衰カーブが得られる。

図 4であらわされた蛍光減衰カーブの変化の検定を定量的に行う方法の一例を以下に示す（表 3) 。蛍光減衰カーブにおいて、パルス励起光照射後 1一 9ナノ秒の時間域の蛍光強度の値を用いて、蛍光寿命 rを求める。また、そのときの測定のバラツキの大きさ（測定を同一条件で多数回行ったときの測定値の分布の標準偏差）を求める。て-- At/diKDi/Do))

Do: 1一 5ナノ秒の時間域における蛍光量

Br. 5— 9ナノ秒の時間域における蛍光量

At= 4ns

。=て x (-InCD./DoJJ/d/Do + l/D,) ^1/2

2つの蛍光減衰カーブの差（ここでは、ターゲット核酸が含まれていない試料 (コントロール）の減衰カーブとの差）の検定は、 Δて/び _ΔΓをパラメ一夕として行う。

·_· * 、

Δて光寿命の差）二て (夕一ゲット DNAを含む試料）一て (コントロール） σ 二 (び（ターゲット DNAを含む試料） ²+び（コントロール） ²) ^1/2

Δて/ σ_Δτは 2つの蛍光減衰カーブの差の識別の S/Nをあらわしており、その値が大きいほど高精度でターゲット D Ν Αの存在の検定が可能であることを意味している。表 3 プローブ： B0DIPY/CY5 ( 2本鎖， n=12)

被検体 DNA/プローブ： 3¾ 5¾ 20¾ 厶て/ £7_ΔΓ 7.09 12.10 17.14 36.02

蛍光スぺク卜ル測定による被検体の検出法との比較

蛍光減衰カーブの測定にもとづく本方法は、従来の蛍光スぺクトル変化の測定にもとづく方法と比較して、検出用プロ一ブ過剰の条件での被検体の検出におレヽて、数十倍以上の高い検定精度をもつ。図 5は、図 4と同じ試料の蛍光スぺク卜ル変化を示したものである。

蛍光スべクトルの変化の大きさは、 Bodipy 493/503 の蛍光の極大波長（517 n m) での蛍光強度（I d) と Cy5 の蛍光の極大波長（667 nm) での蛍光強度（I a) との比率 I a/I d、または Bodipy の蛍光の波長域（例えば 510-560 nm) での蛍光強度と Cy5の蛍光強度の波長域（例えば 650-700 nm) での蛍光強度の比率、によりあらわすことができる。このとき、 2つの蛍光スペクトルの差の識別の S/Nは ΔΙ/σ_ΔΙであらわされる。

Δ I二し / （ターゲット DNAを含む試料）一し/ （コン卜ロール）

び二（σ (ターゲット DNAを含む試料）² +σ (コントロール）²) ^1/2

び = (I_a / ） χ(1 /し + 1/I_a) ^1/2 表 4 プローブ： B0DIPY/CY5' (2本鎖， η=12)

被検体 DNA/プローブ： 1% 3% 5% 20%

Δ (υΐ,) σ_Δτ, ビーク比 0.18 0.51 0.78 3.05

Δ (υΐ,) σ_Δτ, 積分比 1.08 3.16 4.45 16.83

表 3と表 4の数値の比較から、蛍光減衰カーブを利用する検出方法（時間分解法）力蛍光スペクトルを用いる方法と比べて、検出用プローブが被検体に対して過剰に存在する試料においては大きな優位性をもつことがわかる。特に、被検体に対して検出用プローブがより過剰になるにしたがって、時間分解法の優位性がより大きくなることがわかる。被検体が R ΝΑであるときにも本検出用ブローブぉよび本検出方法は適用可能である。

図 36は、本発明に係わる種々の検出用プロ一ブおよび検出方法を用いて； N Αを検出した一例である。被検体が DN Aである図 4の結果と同様に、検出用プローブが被検体である RN Aに対して過剰に存在している試料においても、 RN Aの存在量に対応して蛍光減衰カーブが遅くなつていくことがわかる（詳細は実施例の項参照）。検出 fflプローブのォリゴヌクレオチド部がホスホロチォェ一卜型ォリゴヌクレオチドである場合にも本検出用プローブおよび本検出方法は苻効である。

図 38は、ホスホロチォェ一卜型オリゴヌクレオチド（S—オリゴ）を検出用プローブとして用い、 RNAを検出した一例を示す。図 4、図 36の結果と同様に、検出用プロ一ブが被検体である R N Aに対して過剰に存在している試料においても、 R N Aの存在量に対応して蛍光減衰カーブが遅くなつていくことがわかる（詳細は実施例め項参照）。本発明に係わるプローブの応用

本発明に係わる検出用プローブおよびこれを用いた検出方法が検出可能とするものは、被検体たる核酸の検出に限定されるものではない。例えば、核酸の一次構造上の変化（核酸の組込み、逆位、欠失など）を高感度で精度よく検出することも可能である。

例えば、 D N Aの特定部位への他の D N A断片の組み込みを検出するときには、図 6 Aに示されるように、 D N A上で 2つのプローブがハイブリダィズする位置を、 D N A断片が組み込まれる部位の両側とする。 D N A断片が組み込まれていないときには、 2つのプローブは隣接してハイブリダイズしているためエネルギ —移動がおきるが、組み込みがおこると 2つのプローブは離れた部位にハイプリダイズすることになるためエネルギー移動効率が低下し、蛍光減衰カーブが変化する。また、図 6 Bに示されるように、一方のプローブとして、組み込まれる D N A断片にハイプリダイズするものを使用すると、組み込みがおきると 2つのプローブが隣接してハイブリダィズし、エネルギー移動がおきる。 D N Aの特定部位への他の D N A断片の組み込みは、遺伝子のクローニングの操作において、ベク夕一に目的の D N A断片を組み込むときなどに利用されるが、本発明に係わる検出用プローブおよび検出方法を使/]]すれば、試料に検出川プロ一ブを加えた後に、来結合プロ一ブの分離や洗净の操作.を必要としないで、組み込みがおこなわれていることを簡便に検出することが可能である。

また、外来遗伝子をべクタ一に組み込むときに、その方向性が問, となることがある。図 7に示されるように、組み込む D N A断片の一方の端に一方のブローブがハイブリダィズするように設定すると、ある方向に組み込まれたとき（図 7 上、順方向とする）にはエネルギー移動がおこり、逆の方向に組み込まれたとき

(図 7下、逆方向）にはエネルギー移動がおこらない。

また、ある大きさの DNA断片が取り除かれることがある（欠失）。ある種の遺伝子疾患では、特定の部位の DN A断片の欠失が遺伝子病の原因となっている c また、細胞の核のなかにおいて、スプライシング反応によりメッセンジャー RN Aがつくられるときには、特定部位の RN A断片（イントロン）が取り除かれている。図 8に示されるように、取り除かれる核酸の断片に一方のプローブがハイブリダイズするように設定すれば、これらの反応を検出することが可能である。実施例

1. 検出用プローブ

種々の蛍光色素で標識された種々のオリゴ DN Aを合成し、これらを被検体である DN Aにハイブリダィズさせた。ハイブリッド体を分離精製した後、蛍光スべクトルおよび蛍光減衰カーブを測定した。

( 1 ) プローブの合成

以下の塩基配列をもつオリゴ DN Aを、 DNA/RN Aシンセサイザー（Perk in Elmer: Model 394 または Perseptive: Model 18909) を用いて、 ?シァノエチルアミグイ卜法により合成した。 1 ： 5' - GCTATGACCATGXTTAC - 3'

N 2 ： 5' -GCTATGACCAXGATTAC-3'

N 3 ： 5' -GCTATGACXATGATTAC-3'

4 ： 5' - GCTATGAXCATGATTAC - 3'

N 5 ： 5' -GCTATGXCCATGATTAC-3'

N 6 ： 5 ' -GCTAXGACCATGATTAC-3 '

N 7 ： 5 ' -GCXATGACCATGATTAC-3' 上記プローブ N 1— N 7で、 Xは Uni-Link AminoModif ier (CLONTECH Laborato ries Inc. Code No.CL5190-l) を示す。

N 8 ： 5' -AXCGCGCAATTAACCC-3⁵

N 9 ： 5 ' -AGXGCGCAATTAACCC-3⁵

N 10 : 5' -AGCGXGCAATTAACCC-3'

上記ブローブ N 8— N 10で、 Xは Uni-Link AminoModif ierを示す。

N i l : 5' -XAGCGCGCAATTAACCC- 3'

上記プローブ N i lで、 Xは、 6— （トリフルォロアセチルァミノ）へキシルー (2—シァノエチル）一（N、 N—ジイソプロビル） —ホスホロアミダイト（T F A cへキサノールァミンリン力一、パーキンエルマ一ジャパン： Cat No.40080 8) を示す。

N 12 ： 5 ' -XCCATGATTAC- 3'

N 13 ： 5' -XG AC C AT GATT AC- 3⁵

14 ： 5⁵ -XTGACCATGATTAC- 3'

N 15 ： 5 ' -XTATGACCATGATTAC-3'

N 1 6 ： 5' -XGCTATGACCATGATTAC- 3'

N 1 7 : 5' -GCTATGACCATGATT ACX- 3'

上記プローブ N 12— N 17で、 Xは、 T FA cへキサノ一ルァミンリンカ一を示す。

それそれ得られた反応物を、イオン交換高速液体クロマトグラフで分離し、主ビークを分取した。イオン交換高速液体クロマトグラフに用いた条件は、柬ソ一社製カラム、 TSK— GEL DE AE- 2 WS ( 4. 6 mm内径 x 25 Omm 全長）を使用し、流速 0.8ml/分、温度 40度、移動相は HCOOHNH,勾配一 20 %CH3CNであり、 260 nmの吸収で検出した。 HCOOHNt^勾配は、 A液： 0.2M H COOHNH₄、 B液： 1 M H C 00 H N H の 2つの溶液の混合比を変えることで作成した。 B液の比率： 35%— 85 %/20分の勾配を使用した。

分取した液を脱塩した後、凍結乾燥した。

(オリゴ DNAの Bodipy 493/503標識）

オリゴ DNA (N8、 N9、 N 10、 N 1 1 ) を Bodipy 493/503色素で標識した。

N H S b (N-Hydroxysulfosuccinimide, Sodium Salt) 2.5mgを 30〃1 の滅菌水に、 E D A C(l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 5 m gを 50〃 1の滅菌水にそれぞれ溶解した。これらと、 Bodipy 493/503 プロピオン酸 lmgを 50 に溶解したものを混合し、室温で 30分間反応させた。得られた溶液を、乾固したオリゴ DNAを 0.5M Na₂C0₃/NaH CO ₃緩衝液（pH 9.3 ) 300〃 1に溶解したものと混合し、遮光して一晩反応させた。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した後、逆相高速液体クロマトグラフにより反応物を精製した。逆相高速液体クロマトグラフに用いた条件は、資生堂社製カラム、 CAP CELL PAKC 18 ( 6 mm内径 x 250 m m全長）を使用し、流速 lmlZ分、温度 40度、移動相は C H _n C N勾配一 5 mMTEAA、であり、 260 nmの吸収で検出した。 CH,，CN勾配は、 A液： 5 %CHaCN, B液： 40% CH₃CNの 2つの溶液の混合比を変えることで作成した。 B液の比率： 30%— 80%/20分の勾配を使用した。分取したビークの吸収スべクトルを測定し、 260 nmの吸収と蛍光色素の吸収（493 nm) を確認した。これらを^結乾炔して保存した。

BP 0 (N 1 1の Bodipy493/503標識体）： 5' -XAGCGCGCAATTA AC C C- 3 '

BP 1 (N 8の Bodipy493/503 標識体）： 5， — AXCGCGCAATTAA CCC- 3 ' BP 2 (N 9の Bodipy493/503標識体）： 5，一 AGXGCGCAATTA AC C C- 3 '

BP 4 (N 10の Bodipy493/503標識体）：5， - AG C GXG C AAT T AA C C C- 3 '

上記で Xは、リンカ一を介して Bodipy 493/503 が結合したものである。 (オリゴ DNAの F I TC標識）

オリゴ DNA (Nl l、 N 12、 N 13、 N 14、 N 15、 N 17) を FI TC (fluorescein isothiocyanate) (Molecular Probes) 色素で標識した。

FI TC 1.5mgを DMF 150〃 1に溶解した。これを、乾固したオリゴ DNAを0.5M Na₂C〇₃/NaHC〇₃緩衝液（pH 9.3 ) 300〃 1に溶解した溶液と混合し、遮光して一晩反応させた。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した後、逆相高速液体クロマトグラフにより反応物を精製した。逆相高速液体クロマトグラフに用いた条件は、資生堂社製カラム、 CAPCELL PAKC 18 (6 mm内径 X 25 Omm全長）を使用し、流速 1 m 1 /分、温度

40度、移動相は CH₃CN勾配— 5mMTEAA、であり、 260 nmの吸収で検出した。 CH₃CN勾配は、 A液： 5%CHnCN、 B液： 40% CH^CN の 2つの溶液の混合比を変えることで作成した。 B液の比率： 15%— 65%/ 20分の勾配を使用した。分取したピークの吸収スペクトルを測定し、 260 η mの吸収と蛍光色尜の吸収（495 nm) を確認した。これらを凍結乾燥して保存した。

5 F (N 11の F I T C標識体）： 5' —XAGCGCGCAATTAACC C- 3 '

5 F 10 (N 12の F I T C標識体）： 5' — XCCATGATTAC— 3' 5 F 12 ( 13の F I T C標識体）： 5， — X 3⁵

5 F 13 (N 14の F I T C標識体）： 5' - X T G A C C A T G A T T A C —3,

5 F 15 (N 15の: F I T C標識体）： 5' - X T A T G A C C A T G A T T AC- 3 '

3 F (N 17の F I T C標識体）： 5，一 GCTATGACCATGATTA CX- 3 '

上記で Xは、リンカ一を介して F I TCが結合したものである。 (オリゴ DNAの XRITC標識）

オリゴ DNA (N 11) を XRITC (rhodamine X isothiocyanate) (Mol ecular Probes)色素で標識した。

XRI TC 1.5mgを DMF 150 〃 1に溶解した。これを、乾固したオリゴ DNAを 0.5M Na₂C〇₃/NaHC0₃緩衝液（pH9.3) 300 μ.1 に溶解した溶液と混合し、遮光して一晩反応させた。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した後、逆相高速液体クロマトグラフにより反応物を精製した。逆相高速液体クロマトグラフに用いた条件は、資生堂社製カラム、 CAPCEL L P AK C 18 (6 mm内径 X 250mm全長）を使用し、流速 1 m 1 /分、温度 40度、移動相は CH₃CN勾配一 5mMT E AA、であり、 260 nmの吸収で検出した。 CHaCN勾配は、 A液： S CHnCN B液： 40% CH₃ CNの 2つの溶液の混合比を変えることで作成した。 B液の比率： 30%— 80 %/20分の勾配を使用した。分取したビークの吸収スぺクトルを測定し、 26 0 nmの吸収と蛍光色素の吸収（ 570 nm) を fit認した。これらを凍結乾燥して保存した。

5 R 16 (N 1 1の XR I T C標識体）： 5' — XAGCGCGCAATTAA C C C一 3 '

上記で Xは、リンカ一を介して XR I T Cが結合したものである。

(オリゴ DNAの Cy 3標識）

オリゴ DNA (N 1 1) を Cy 3色素で標識した。

1チューブの Cy3色素（Amersham、 FluoroLink Cat. No. PA23001) を 100 1の滅菌水に溶解した。これを、乾固したオリゴ DNAを 0.5M Na₂CO ₃/NaHC0₃緩衝液（pH 9.3) 200 1に溶解した溶液と混合し、遮光して一晩反応させた。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した後、逆相高速液体クロマ卜グラフにより反応物を精製した。逆相高速液体クロマトグラフに用いた条件は、資生堂社製カラム、 CAP CELL PAKC 18 ( 6 mm内径 x 250 mm全長）を使用し、流速 1 m 1 /分、温度 40度、移動相は CH₃C N勾配— 5mMTEAA、であり、 260 nmの吸収で検出した。 CH₃CN勾配は、 A液： 5%CH₃CN、 B液： 40% C H ₃ C Nの 2つの溶液の混合比を変えることで作成した。 B液の比率： 15%— 60%/20分の勾配を使用した c 分取したビークの吸収スぺクトルを測定し、 260 nmの吸収と蛍光色素の吸収 ( 550 nm) を確認した。これらを凍結乾燥して保存した。

5 C y 3 (N i lの Cy 3標識体）： 5 ' -XAGCGCGCAATTAAC C C一 3 '

上記で Xは、リンカ一を介して Cy 3が結合したものである。 (オリゴ DNAの Cy 3.5標識）

オリゴ DNA (N3、 N6、 N 16) を C y 3.5色索で標識した。

1チューブの C y 3.5色素 (Amersham, FluoroLink Cat. No. PA23501) を 1 00〃 1の滅菌水に溶解した。これを、乾固したオリゴ DN Aを 0.5 M Na, C0₃/NaHC0₃緩衝液（pH 9.3) 200 〃 1に溶解した溶液と混合し、遮光して一晩反応させた。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した後、逆相高速液体ク口マトグラフにより反応物を精製した。逆相高速液体クロマトグラフに用いた条件は、資生堂社製カラム、 CAPCELL PAKC 18 (6mm 内径 X 25 Omm全長）を使用し、流速 1 m 1 /分、温度 40度、移動相は CH 3〇1\1勾配ー 5111^1丁£八八、であり、 260 nmの吸収で検出した。 CH₃CN 勾配は、 A液： 5%CH₃CN、 B液： 40% C H ₃ C Nの 2つの溶液の混合比を変えることで作成した。 B液の比率： 15%— 60%/20分の勾配を使用した。分取したピークの吸収スペクトルを測定し、 260 nmの吸収と蛍光色素の吸収（58 1 nm) を確認した。これらを凍結乾燥して保存した。

Cy 358 (N3の Cy 3.5標識体）： 5，一 G C T A T G A C X A T G A TT A C- 3 '

Cy 35 1 2 (N6の Cy3.5標識体）： 5 ' — GCTAXGACCATG AT T A C- 3 '

Cy 35 1 6 (N 16の Cy 3.5標識体）： 5' - X G C T A T G A C C A T GATTAC-3'

上記で Xは、リンカ一を介して Cy 3.5が結合したものである。

(オリゴ DNAの Cy 5標識）

オリゴ DNA (N l、 N2、 N3、 N4、 N5、 N6、 N7、 I K N 17) を Cy 5色素で標識した。

1チューブの Cy 5色絮 (Amersham, FluoroLink Cat. o. PA25001) を 100 〃 1の滅菌水に溶解した。これを、乾固したオリゴ DNAを 0.5 M Na,C0 /NaHCOa緩衝液（pH 9.3 ) 200 〃 1に溶解した溶液と混合し、遮光して一晩反応させた。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した後、逆相高速液体クロマトグラフにより反応物を精製した。逆相高速液体クロマ卜グラフに用いた条件は、資生堂社製カラム、 CAPCELL PAKC 18 ( 6 mm内径 X 25 Omm全長）を使用し、流速 l m l/分、温度 40度、移動相は CH₃C N勾配— 5mMTEAA、であり、 260 nmめ吸収で検出した。 CH₃CN勾配は、 A液： 5%CH₃CN、 B液： 40% C H ₃ C Nの 2つの溶液の混合比を変えることで作成した。 B液の比率： 15%— 60%/20分の勾配を使用した _c 分取したピークの吸収スべクトルを測定し、 260 nmの吸収と蛍光色素の吸収 ( 649 nm) を確認した。これらを凍結乾燥して保存した。

Cy 54 (N 1の Cy 5標識体）： 5 ' -GCTATGACCATGXTTA C- 3 '

Cy 56 (N2のCy 5標識体）： 5 ' -GCTATGACCAXGATTA C一 3 ,

Cy 58 (N3の Cy 5標識体）： 5 ' -GCTATGACXATGATTA C— 3，

Cy 59 (N4の Cy 5標識体）： 5 ' 一 GCTATGAXCATGATT A C- 3 '

Cy 5 10 (N 5の Cy 5標識体） 5 ' -GCTATGXCCATGATT AC- 3 '

Cy 5 1 2 (N 6の Cy 5標識体） 5 ' 一 GCTAXGACCATGATT AC- 3⁵

Cy 5 14 (N7の Cy 5標識休） 5 ' -GCXATGACCATGATT AC- 3 '

5 Cy 5 (N 1 1の Cy 5標識体） 5 ' -XAGCGCGCAATTAAC C C一 3 '

3 Cy 5 (N 17の Cy 5標識体） 5 ' 一 G C TAT G AC CAT GAT T ACX- 3 ' 上記で Xは、リンカ一を介して Cy 5が結合したものである。 (2) 被検体 DN Aの合成

以下の塩基配列をもつオリゴ DN Aを、 DNA/RN Aシンセサイザ— （Perk in Elmer: Model 39 または Perseptive: Model 18909) を用いて、 ^シァノエチルアミダイト法により合成した。

TO : 5 ' -GGGTTAATTGCGCGCTGTAATCATGGTCA T AG C- 3⁵

T 2 ： 5 ' -GGGTTAATTGCGCGCTTGGTAATCATGGT CATAGC- 3'

T4 ： 5 ' -GGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATG GT CAT AG C- 3 '

T 6 ： 5 ' -GGGTTAATTGCGCGCTTGGCAAGTAATCA TGGT CAT AGC— 3'

T 8 ： 5 ' -GGGTTAATTGCGCGCTTGGCAAAAGTAAT CATGGT C AT AG C - 3 '

AATCATGGTCATAGC-3'

T 12 : 5 ' -GGGTTAATTGCGCGCTTGGCAAAAAAAA GTAATCATGGTCATAGC-3'

T 1 5 : 5 ' -GGGTTAATTGCGCGCTTGGCAAAAAAAA AAAGTAATCATGGTCATAGC-3'

T 20 ： 5' -GGGTTAATTGCGCGCTTGGCAAAAAAAA AAAAAAAAGTAATCATGGTCATAGC— 3 ' それぞれ得られた反応物を、イオン交換高速液体クロマ卜グラフで分離し、主ビークを分取した。イオン交換高速液体クロマトグラフに用いた条件は、東ソ一社製カラム、 TSK— GEL DEAE-2WS ( 4.6 mm内径 x 250 mm 全長）を使用し、流速 0.8ml/分、温度 40度、移動相は HC〇OHNH₄勾配— 20%CH₃CNであり、 260 nmの吸収で検出した。 HCOOHNH₄勾配は、 A液： 0.2M HCOOHNH₄、 B液： 1M HC〇OHNH₄の 2つの溶液の混合比を変えることで作成した。 B液の比率： 35%— 85%/20分の勾配を使用した。

分取した液を脱塩した後、凍結乾燥して保存した。

(3) 検出用プローブと被検体 DNAとのハイブリッド体の形成、および高速液体クロマトグラフによるハイプリッド体の分離

ドナ一プローブとァクセプ夕—プローブからなる一組の検出用プローブ 40 pm ol (ドナ一ブローブ、ァクセプ夕一プローブ各々 40 pmol) と被検体 DNA 40 pmol とを、 10mM Tris-HCl pH7.4, 140 mM NaCl 10 中で室温で 5分間混合して、ハイブリダィゼ一シヨンさせた。その後、イオン交換高速液体クロマトグラフ（イオン交換 H PLC) により、ハイブリッド体を分離した。イオン交換高速液体クロマトグラフに用いた条件は、柬ソ一社製カラム、 TSK— GEL D EAE— NPRを使用し、流速 lml/分、室温、移動相は N a C 1勾配一 20 mMTr i s— HC1 (pH9.5)であり、 260 nmの吸収および蛍光強度

(励起波長：ドナー色素の吸収極大の波畏、光検出の波畏：ァクセプター色素の蛍光の極大波長）で検出した。 NaC l勾配は、 A液： 20mMTr i s—H C 1 (pH9,5) 、 B液： 20mMTr i s—HC l (pH9.5) 、 1 M N a C 1の 2つの溶液の混合比を変えることで作成し、以下に示す条件を使用した。

0— 2分 B液の比率 25%— 45%のグラジェント 2— 12分 B液の比率 45 %— 55%のグラジェント

12— 13分 B液の比率 55%— 100%のグラジェントクロマトグラフにおいて、強い蛍光があらわれるビークをハイプリヅド体のビークと同定した（エネルギー移動がおきたときにのみ強い蛍光が親測される）。強い蛍光をもつビークは、個々のブローブの流出位置よりも、クロマトグラフ上で長い保持時間をもつ位置に流出した。

取得した H PLC分画の蛍光スぺクトルを測定し（蛍光分光光度計：日立製作所、 F— 4500) 、エネルギー移動がおきていることを確認した。

(4) ハイブリツド体の蛍光減衰カーブの測定

高速液体クロマトグラフで分離精製したハイプリッド体の蛍光減衰カーブを測定した。

ピコ秒蛍光寿命測定装置 C 4780 (浜松ホトニクス）

励起光源

1 アルゴンレーザー励起チタンサファイアレーザー（スぺクトラフイジックス）

アルゴンイオンレーザ一モデル 2080

モードロックチタンサファイアレーザー TSUNAMI

フリークエンシーダブラー/パルスセレクタ一モデル 3980 2 窒素一色素レーザー（レーザ一ホトニクス）

窒素レーザ一モデル LN 1200

色素 COUMAR I N307

(a) ドナー蛍光色素を Bodipy 493/503、ァクセプ夕ー蛍光色素を Cy5 とし、ハイプリッド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の構造を二本鎖とし、ハイブリッド体における蛍光色素間の塩基数（n) を n = 4、 8、 10、 1 2、 14、としたときの、ァクセブ夕一の蛍光波長域（650— 700 nm) の蛍光減衰カーブ。

Bodipy 493/503 はドナ一プローブにおいて 5，末端の位置に、 Cy 5はァクセブ夕一プローブにおいて中間部に標識されている。

高速液体クロマトグラフ（HPLC) によるハイブリッド体の分離 '精製ドナ -フ。 Π-フ、、ァクセフ。タ-フ。 D-フ、' 被検体 DNA HPL Cでの溶出時間（分） BP O C y 54 T O 5.89 - 6.40

BP 0 Cy 58 T O 5.82 - 6.14

BP O Cy 5 1 0 T O 5.90- 6.23

BP O Cy 5 1 2 T O 5.97 - 6.40

BP O Cy 5 14 T O 6.03- 6.49 ハイプリッド体の蛍光減衰カーブ

ハイブリッド体 2つの蛍光色素の塩基間数（n) 蛍光減衰カーブ

BP 0/C y 54/T 0 n = 4 図 9

BP 0/Cy 58/T 0 n = 8 図 1 0

BP 0/Cy 5 10/T 0 n= 1 0 図 1 1

BP 0/Cy 5 1 2/T 0 n= 1 2 図 12

BP 0/C y 5 14/T 0 n= 14 図 1 3

BP 0/Cy 5 10 ( 2種類のプローブを混合したもの）図 14 励起光：チタンサファイアレーザ一 480 nm (図 9—図 13)

窒素一色素レーザー 490 nm (図 1 4)

蛍光の測定波長域： 650 - 700 nm

「B P 0/C y 5 1 0」は、 B P 0 40 pmol と C y 5 1 0 40 pmol を、 20 mM Tris-HCl pH7.4、 0.5M NaClヽ 200 に溶かした試料である。 (b) ドナ一蛍光色素を Bodipy 493/503、ァクセブ夕ー蛍光色素を C y 5とし、ハイブリッド体における蛍光色素間の塩基数（_n) を n= 10とし、ハイブリツド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の構造を二本鎖と一本鎖の混合としたときの、ァクセブ夕一の蛍光波長域（ 650— 700 nm) の蛍光減衰カーブ。 Bodipy 493/503はドナ一プローブにおいて 5 ' 末端の位置に、 Cy 5はァクセプタープローブにおいて中間部に標識されている。

高速液体クロマトグラフ（HPLC) によるハイブリッド体の分離 ·精製ドナ -フ。 D-フ" ァクセフ。タ -フ。 D-フ" 被検体 DNA HPLCでの溶出時間（分）

BP 0 Cy 5 10 TO 6.0 1 -6.5 1

BP 0 Cy 58 T 2 5.63 - 6.24

BP 0 Cy 56 T 4 5.55 - 6.24

BPO Cy 54 T 6 5.99 - 6.42 ハイプリッド体の蛍光減衰カーブ

ハイプリッド体一本鎖構造をとる塩基数（gap) 蛍光減衰カーブ

B P 0/C y 5 10/T 0 0 図 1 5 B P 0/C y 58/Τ 2 2 図 1 6 Β Ρ 0/Cy 56/Τ 4 4 図 17 BP 0/Cy 54/Τ 6 6 図 18 BP 0/Cy 5 10 ( 2極類のプローブを混合したもの）図 19

励起光：チタンサファイアレーザー 480 nm (図 19)

窒素—色素レーザー 490nm (図 1 5—図 18) 蛍光の測定波長域： 650— 700 nm

「B P 0/Cy 510」は、 B P 0 40 pmol と Cy 5 10 40 pmol を、 20 mM Tris-HCl pH9.5、 0.5M NaCK 200 μ.\ に溶かした試料である。 (c) ドナー蛍光色素を Bodipy 493/503、ァクセプ夕—蛍光色素を C y 5とし、ハイブリッド体における蛍光色素間の塩基数（n) を n= 10とし、ハイブリッド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の構造を二本鎖とし、ハイブリツド体において一方の蛍光色素（ここでは Bodipy 493/503) の標識位置がハイブリツド体における「切れ目（2つのプローブが隣り合う部位）」の位置に対して、 0 (プローブの末端部位）、 1、 2、 4塩基離れた位置になるときのァクセプ夕一の蛍光波長域（ 650— 700 nm) の蛍光減衰カーブ。 Bo dipy 493/503 はドナ一プローブにおいて 5，末端の位置（BP 0) または中間部（BP 1、 BP 2、 BP 4) に、 C y 5はァクセブ夕一プローブにおいて中間部に標識されている。

高速液体クロマトグラフ（HPLC) によるハイプリッド体の分離 '精製ドナ-フ。 D-フ、' ァクセフ。タ -フ。 D-フ" 被検体 DNA HPLCでの溶出時間（分） B P 0 C y 5 10 T O 6.0 1 - 6.51

BP 1 C y 59 T O 5.52- 6.12

B P 2 C y 58 T O 5.45- 5.99

B P 4 Cy 56 T O 5.46- 5.9 1 ハイブリッド体の蛍光減衰カーブ

ハイプリッド体切れ目の位 Sからの塩基数蛍光減衰カーブ BP 0/C y 5 10/T 0 0 図 20 BP 1/Cy 59/T 0 1 図 2 1 BP 2/Cy 58/T 0 2 図 22 BP 4/Cy 56/T 0 4 図 23

BP 0/Cy 5 10 ( 2種類のブローブを混合したもの）図 24 励起光：チタンサファイアレーザー 48011111 (図24) 窒素一色素レーザー 490 nm (図 20—図 23)

蛍光の測定波長域： 650— 700 nm

BPO/Cy 510 は、 BP 0 40 pmol と C y 510 40 pmol を、 20 #1 Tris-HCl ρΗ9·5、 0.5Μ NaCl、 200 u に溶かした試料である。

(d) ドナー蛍光色素を Bodipy 493/503、ァクセブ夕—蛍光色素を C y 3.5とし、ハイプリッド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の構造を二本鎖とし、ハイブリッド体における蛍光色素間の塩基数（n) を n=8、 12、 16、としたときの、ァクセプ夕一の蛍光波長域（ 600— 650 nm) の蛍光減衰カーブ。高速液体クロマトグラフ（HPLC) によるハイプリッド体の分離 '精製ドナ -フ。 Π-フ、、ァクセフ。タ -フ。 D-フ '、被検体 DNA HPLCでの溶出時間（分） BP O C y 358 TO 5.56- 5.93

BP 0 Cy 35 12 TO 5.74- 6.35

BP O Cy 35 16 TO 5.65- 5.85 ハイブリッド体の蛍光減衰カーブ

ハイブリツド体 2つの蛍光色素の塩基間数（n) 蛍光減衰カーブ

BP 0/Cy 358/T 0 η = 4 図 25

BP 0/Cy 3512/Τ 0 η= 12 図 26

BP 0/Cy 3516/Τ 0 η= 1 6 図 27

BP O/Cy 35 1 2 ( 2種類のプローブを混合したもの）図 28 励起光：チタンサファイアレーザ一 480nm

蛍光の測定波長域： 600— 650 nm

「BP 0/Cy 3512j は、 BP 0 40 pmol と Cy 3512 40 pmol を、 20 mM Tris-HCl pH9.5、 0.5M NaCK 200 に溶かした試料である。

(e) ドナー蛍光色素を F I TC、ァクセプ夕—蛍光色素を Cy 5とし、ハイブリヅド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の構造を二本鎖とし、ハイプリッド体における蛍光色素間の塩基数（n) を] = 10、 12としたときの、ァクセプ夕一の蛍光波長域（ 650— 700 nm) の蛍光減衰カーブ _c 高速液体クロマトグラフ（HPLC) によるハイプリヅド体の分離 '精製ト"ナ -フ。 D-フ" ァクセフ。タ- 7°D -フ" 被検体 DNA HPLCでの溶出時間（分）

5 F 10 5 C y 5 T O 8.12- 8.89

5 F 12 5 C y 5 T O 6.27- 6.73 ハイプリッド体の蛍光減衰カーブ

ハイブリッド体、 5 F 10/5 C y 5/T 0、 5 F 12 / 5 C y 5 /T 0の蛍光減衰カーブを測定した。また、コントロールとして「5 F 10 40 pmol と 5 Cy 5 40 pmolを、 20 mM Tris-HCl ρΗ9·5、 0.5Μ NaCK 200 μ.\ に溶かした試料」の蛍光减衰カーブを測定した。ハイブリツド体形成にともなう蛍光減衰カーブの遅れは認められるが顕著ではない（図示はされていない）。

励起光：窒素一色素レーザー 490 nm

蛍光の測定波長域： 650— 700 nm

(f ) ドナ一蛍光色素を F I T C、ァクセプター' il光色素を Cy 5とし、ハイブリッド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド [¾の郴造を一本鎖とし、ハイブリッド体における蛍光色素間の塩基数（n) を n= 12、 1 5、 2 0としたときの、ァクセプ夕一の蛍光波長域（ 650— 700 nm) の蛍光減衰カーブ。高速液体クロマトグラフ（HPLC) によるハイプリッド体の分離 '精製ドナ -フ。 D-フ" ァクセフ。タ -フ。 D-フ、' 被検体 DNA HPI での溶出時間（分） 5 F 3 Cy 5 T 1 2 8.96 - 9.52

5 F 3 C y 5 T 15 8.76 - 9.49

5 F 3 Cy 5 T 20 8.87 - 9.26 ハイブリツド体の蛍光減衰カーブ

ハイブリッド体、 5 F/3 Cy 5/T 12、 5 F/3 Cy 5/T 15, 5 F/ 3 Cy 5/T 20, の蛍光減衰カーブを測定した。また、コントロールとして「 5 F 40 pinol と 3 C y 5 40 piol を、 20 mM Tris-HCl pH9.5、 0.5M NaCK 2 00 μ.\ に溶かした試料」の蛍光減衰カーブを測定した。ハイブリツド体形成にともなう蛍光減衰カーブの遅れはあまり認められなかった（図示はされていない）。

励起光：チタンサファイアレーザー 480nm

蛍光の測定波長域： 650— 700 nm

(g) ドナー蛍光色素を F I T C、ァクセプ夕ー蛍光色素を Cy3とし、ハイブリッド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の構造を一本鎖とし、ハイブリッド体における蛍光色素間の塩 S数（n) を n= 12、 15、 2 0としたときの、ァクセブ夕一の蛍光波長域（ 580— 63 Onm) の蛍光减衰カーブ。高速液体ク口マトグラフ（ H P L C ) によるハイブリツド体の分離 ·精製ドナ -フ。 ϋ-フ" ァクセフ。タ -フ。 D-フ " 被検体 DNA HPLCでの溶出時間（分） 3 F 5 Cy 3 T 12 7.45 - 8.29

3 F 5 Cy 3 T 1 5 7.22 - 8.47 3 F 5 Cy 3 T 20 7.18 -8.07 ハイプリッド体の蛍光減衰カーブ

ハイブリッド体、 3 F/5 Cy3/T 12、 3 F/5 Cy 3/T 15_S 3 F/ 5 Cy 3/T 20, の蛍光減衰カーブを測定した。また、コントロールとして「3 F 40 pmol と 5 C y 3 40 pmol を、 20 mM Tris-HCl pH9.5、 0.5M NaCK 2 00 il に溶かした試料」の蛍光減衰カーブを測定した。ハイプリッド体形成にともなう蛍光減衰カーブの遅れはあまり認められなかった（図示はされていなレ、）。

励起光：チタンサファイアレーザ一 480nm

蛍光の測定波長域： 580— 630nm

(h) ドナー蛍光色素を F I T C、ァクセプ夕ー蛍光色素を Cy 3とし、ハイブリッド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の構造を二本鎖とし、ハイブリッド体における蛍光色素間の塩基数（n) を n= 10、 13、 1 5、としたときの、ァクセプ夕一の蛍光波長域（ 580— 630 nm) の蛍光減衰カーブ。高速液体クロマトグラフ（HPLC) によるハイブリッド体の分離 ·精製ドナ一プローブァクセブ夕ープローブ被検体 DNA HPLCでの溶出時間（分） 5 F 1 0 5 C y 3 T O 7.54 - 7.75

5 F 13 5 Cy 3 T O 7.23-7.45

5 F 1 5 5 Cy 3 T O 7.24-7.76 ハイプリッド体の蛍光減衰カーブ

ハイブリッド体、 5 F 1 0/5 Cy 3/T 0、 5 F/5 Cy 3/T 0, 5 F 1 5/5 Cy 3/T0、の蛍光減衰カーブを測定した。また、コントロールとして「5 F 10 40pmol と 5 Cy 3 40 pmol を、 20 mM Tris-HCl pH9.5、 0.5M NaCL 200 l に溶かした試料」の蛍光减衰カーブを測定した。ハイブリッド体形成にともなう蛍光減衰カーブの遅れはあまり認められなかった（図示はされていない。

励起光：チタンサファイアレーザ一 480nm

蛍光の測定波長域： 580— 630 nm

(i) ドナ一蛍光色素を F I TC、ァクセプ夕—蛍光色素を XRI TCとし、ノヽィプリッド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の構造を二本鎖とし、ハイブリッド体における蛍光色素間の塩基数（n) を n= 15としたときの、ァクセプ夕一の蛍光波長域（ 600— 650 nm) の蛍光減衰カーブ。高速液体クロマトグラフ（HPLC) によるハイブリッド体の分離 .精製ドナ一プローブァクセブ夕—プローブ被検体 DNA HPLCの溶出時間（分） 5 F 15 5 R 16 TO 6.75-7.53 ハイブリッド体の蛍光減衰カーブハイブリッド体、 5F 15/5R 16/T0 の蛍光減衰カーブを測定した。また、コントロールとして「5F 15 40 pmol と 5R 16 40 pmol を、 20 mM Tris-HCl pH9.5、 0.5M NaCK 200 μ.\ に溶かした試料」の蛍光減衰カーブを測定した。ハイブリツド体形成にともなう蛍光減衰カーブの遅れはあまり認められなかった（図示はされていない）。

励起光：チタンサファイアレーザ一 480nm

蛍光の測定波長域： 600 - 650nm

( j ) ドナー蛍光色素を F I T C；、ァクセプター蛍光色紫を XR I T Cとし、ノヽイブリッド体における蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間の構造を一本鎖とし、ハイブリッド体における蛍光色素間の塩基数（n) を n = 4、 8、 1 2、 15、 20、としたときの、ァクセプ夕一の蛍光波長域（600— 650η m) の蛍光減衰カーブ。この試料については、高速液体クロマトグラフで分離することなく、プローブと被検体 DN Aを混合した試料において、蛍光減衰カーブを測定した。また、コントロールとして「3 F 40 pmol と 5R 16 40 pmol を、 20 mM Tris-HCl pH9. 5、 0.5M NaCl、 200 1に溶かした試料」の蛍光減衰カーブを測定した。ハイブリツド体形成にともなう蛍光減衰カーブの遅れはあまり認められなかった（図示はされていない）。

励起光：チタンサファイアレーザー 480nm

蛍光の測定波長域： 600— 650 nm ドナ一プローブァクセブ夕一プローブ被検体 DNA

3 F 5 R 16 T 4

3 F 5 R 16 T 8

3 F 5 R 16 T 12

3 F 5 R 16 T 1 5

3 F 5 R 16 T 20

(k) ドナ一蛍光色素を Bodipy 493/503、ァクセプター ¾光色素を C y 5とし、ハイプリッド体における迸光色絮が結合している 2つのヌクレオチド問の構造を —本鎖とし、ハイブリッド体における蛍光色索問の塩基数（n) を n = 4、 8、

10、 12、 15、 20、としたときの、ァクセプターの ίϊί:光波長域（ 650— 700 nm) の蛍光減袞カーブ。

Bodipy 493/503 はドナープローブにおいて 5 ' 末端の位置に、 Cy 5はァクセブ夕一プローブにおいて 3 ' 末端に標識されている。高速液体クロマ卜グラフ（HPLC) によるハイプリッド体の分離 '精製ドナ一プローブァクセブ夕ープローブ被検体 DNA RPLCでの溶出時間（分）

B P 0 3 Cy 5 T 4 7.02- 7.59 BP 0 3 Cy 5 T 8 7.37-8, 10 BP 0 3 Cy 5 T 10 8.74-9.32 B P 0 3 Cy 5 T 12 8.9 1 -9.22 B P 0 3 Cy 5 T 15 8.83-9.18 BP 0 3 Cy 5 T 20 8.69-9.17 ハイブリツド体の蛍光減衰カーブ

B P 0/3 Cy 5/T 4 n = 4 図 29 BP 0/3 Cy 5/T 8 n= 8 図 30

B P 0/3 C y 5/T 10 n= 10 図 3 1 BP 0/3 Cy 5/T 1 2 n = 12 図 32

BP 0/3 Cy 5/T 1 5 n= 15 図 33 B P 0/3 Cy 5/T 20 n= 20 図 34

(図 35は、 B P 0 40 pmol と C y 5 10 40 pmol を、 20 mM Tris-HCl pH9.5、 0.5M NaCK 200 μ.\ に溶かした試料の蛍光減袞カーブである。）

励起光：チタンサファイアレーザー 480 nm (図 29—図 34)

窒素—色素レーザー 4901 111 (図35)

¾光の測定波長域： 650— 700 nm

2. 検出用ブローブが被検体に対して過剰に存在する試料における被検体の検出 ( 1 ) プローブの合成以下の塩基配列をもつ蛍光標識オリゴ D N Aおよび蛍光標識ホスホロチォエート型オリゴヌクレオチド（s—オリゴ）を、前記「 1. 検出用プローブ、（ 1) 検出用プロ一ブの合成」の項で示された手順にしたがつて合成した。

Bodipy493/503標識ォリゴ D N A

BP 0 ： 5' -XAGCGCGCAATTAACCC- 3'

D 1 ： 5' -XTCTAGTTGGTCTGTC-3'

上記 BP 0および D 1で、は Bodipy493/503 が結合している位置をあらわす。

Bodipy493/503標識 S—才リゴ

D 2 ： 5' - XTCTAGTTGGTCTGTC - 3'

上記 D 2で、 Xは、 Bodipy493/503 が結合している位置をあらわす。

Cy 5標識ォリゴ DNA

C y 5 12 ： 5' -GCTAXGACCATGATTAC- 3⁵

A 1 ： 5 ' -GCAXACTTCXTCATCT-3'

上記 Cy 5 12および A 1で、 Xは Cy 5が結合している位置をあらわす。

Cy 5標識 S—オリゴ

A 2 ： 5 ' 一 GCAGAXCTT CTCATCT - 3'

上記 A 2で、 Xは Cy 5の結合位蹬をあらわす。

(2) 被検体 DNA、被検体 RN Aの合成

以下の塩基配列をもつ被検体 DN Aおよび被検体 RN Aを、前記「1. 検出用プローブ、（2) 被検体 DNAの合成」の項で示された手順に準じて合成した。被検体 DNA (TO)

5' — GGGTTAATTGCGCGCTGTAATCATGGTCATAGC 一 3，被検体 RNA (RT 1 )

(3) 測定用試料の作製および蛍光スペクトル、蛍光減衰カーブの測定

ドナープローブとァクセプ夕一プロ一ブからなる一組の検出用プローブ（ドナ —プローブ、ァクセプ夕ープローブ各々 200 pmol) と種々の量の被検体とを、 2 00 fil の I xSS C緩衝液（15mM Na₃citrate pH7.0、 150mM NaCl) 中で混合して、室温で 10分間反応させた。その後、蛍光スペクトルおよび蛍光減衰カーブを測定した。

蛍光スぺクトルの測定

蛍光分光光度計：日立製作所 F— 4500

励起波長： 490 nm

蛍光スぺクトルの測定波長： 500— 750nm

蛍光減衰カーブの測定

ビコ秒蛍光寿命測定装置 C 4780 (浜松ホトニクス）

励起光源

1 アルゴンレーザー励起チタンサファイアレーザー（スぺク卜ラフイジックス）

アルゴンイオンレーザーモデル 2080

モードロックチタンサファイアレーザ一 TSUNAMI

フリークエンシーダブラー/パルスセレクタ— モデル 3980 2 窒素一色素レーザー（レーザ一ホトニクス）

窒素レーザーモデル LN 1200

色素 COUMAR I N307

蛍光を測定する波長域： 650— 700 nm

(a) 検出用プローブとして、「Bodipy 493/503 をドナ一蛍光色素とし、 Cy 5をァクセプ夕ー蛍光色素として、ハイプリッド体を形成したときの蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間が二本鎖構造をとり、塩基間数が 12 (n = 12) であり、 Bodipy493/503 がハイプリッド体の切れ目の位置にあるヌクレオチドに結合している」一組のオリゴ DNAを使用し、被検体として DNAを検出する。ドナ -フ。 D-フ" ァクセフ。タ-フ °D -フ" 被検体蛍光減衰カーブ蛍光スぺクトル

BP 0 C y 5 12 TO 図 4 図 5 蛍光減衰カーブ（図 4)

図中の番号検出用フ。 Π-フ"の量被検体 DN Aの量量比（被検体 /7°D-フ"）

1 200 pmo 1 0 0

2 200 pmo 1 2 p rn o 1 1%

3 200 pmo 1 6 p m o 1 3%

4 200 pmo 1 10 p m o 1 5%

5 200 pm o 1 40 p m o 1 20% 図 4から明らかなように、被検体 DNAの §が増えるにつれて、減衰カーブは遅くなつていく。図中で 1の减衰カーブ（被検体が含まれていない試料）と 2の减衰カーブ（被検体 DNAが含まれており、その存在 ffl:がプローブに対して 1 % (モル比）である試料）は明瞭に識別可能であり、検出用プローブが被検体の 1 00倍量過剰に存在していても、被検体の検出が可能である。蛍光スぺクトル（図 5)

図中の番号検出用フ°0 -フ"の量被検体 DN Aの量量比（被検体 /7°D -フ"

1 200 pmo 1 0 0

2 200 pmo 1 2 p m o 1 1 %

3 200 pmo 1 6 p m o 1 3%

4 200 pmo 1 10 pmo 1 5%

5 200 pmo 1 40 pmo 1 20% 蛍光スぺクトルでは 1一 3のスぺクトルは実質的に識別不能であり、 1と 4のスぺクトルの変化を識別することも困難である。

(b) 検出用プローブとして、「Bodipy 493/503 をドナー蛍光色素とし、 Cy 5をァクセプ夕一蛍光色素として、ハイプリッド体を形成したときの蛮光色素が結合している 2つのヌクレオチド間が二本鎖構造をとり、 Bodipy 493/503 がハイブリツド体の切れ目の位置にあるヌクレオチドに結合している」一組のオリゴ DNAを使用し、被検体として RN Aを検出する。

2つの色素間の

ドナ -フ°1!-フ" ァクセフ。タ -7°D-フ" 被検体塩 S数 11!光減衰力-フ" 蛍光ス ⁵外ル D 1 A 1 RT 1 n= 1 2 図 36 図 37 蛍光減袞カーブ（図 36)

図中の番号検出用ブローブの量被検体 RNAの ffi 量比（被検体/プローブ） 1 200 pmo 1 0 0

2 200 pmo 1 5 p m o 1 2.5%

3 200 pmo 1 10 p m o 1 5%

4 200 pmo 1 40 p m o 1 20% 蛍光スぺクトル（図 37)

図中の番号検出用ブローブの量被検体 RN Aの量量比（被検体/ブロ-ブ）

1 200 pmo 1 0 0

2 200 pmo 1 5 pmo 1 2.5%

3 200 pmo 1 10 pmo 1 5%

4 200 pmo 1 40 pmo 1 20% 図 36に示されているように、被検体 RNAの量が増えるにつれて、減衰カーブはより遅くなる。図から、検出用プローブが被検体 RN Aよりも大過剰に存在している条件において、被検体 R N Aの検出が可能であることが明らかである。

( c) 検出用プローブとして、「Bodipy 493/503 をドナ一蛍光色素とし、 Cy 5をァクセブ夕—蛍光色素として、ハイプリッド体を形成したときの蛍光色素が結合している 2つのヌクレオチド間が二本鎖構造をとり、 Bodipy 493/503 がハイブリツド体の切れ目の位置にあるヌクレオチドに結合している」一組のホスホロチォエート型オリゴヌクレオチド使用し、被検体として RNAを検出する。ドナ - 7°D-フ" ァクセフ。タ- 7°D -フ" 被検体 2つの色素の塩 ¾数蛍光減衰カ-フ"

D 2 A 2 RT 1 n= 10 図 38 蛍光減衰カーブ（図 38) 図中の番号検出用プローブの量被検体 RN Aの量量比（被検体/プローブ）

1 200 pmo 1 0 0

2 200 pmo 1 5 pmo 1 2.5%

3 200 pmo 1 10 pmo 1 5 %

4 200 pmo 1 40 pmo 1 20% 図 38に示されているように、被検体 RNAの量が増えるにつれて、減衰力一ブはより遅くなる。図から、検出用プロ一ブが被検体 RN Aよりも大過剰に存在している条件において、被検体 R N Aの検出が可能であることが明らかである。産業上の利用可能性

本発明は、検体試料中に含まれる特定の塩基配列をもつ D N Aや RN Aを、極めて簡便に、高精度 '高感度に検出することを可能とする検出用プロ一ブおよび検出方法を開発したものである。本発明の検出用プロ一ブならびに検出方法が、遺伝子診断、細胞診断などに適用されると、大きな威力を発揮すると予想される。また、本発明の検出用プロ一ブならびに検出方法を遺伝子のクローニングなど遺伝子工学分野の実験手法に適用することにより、当該分野の実験技術を大きく発展させることが期待される。

配列表配列番号： 1

配列の長さ： 17 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 配列

GCTATGACCA TGNTTAC 17 配列番号： 2

GCTATGACCA NGATTAC 17 配列番号： 3

配列の長さ： 17 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： D NA 配列

GCTATGACNA TGATTAC 17 配列番号： 4 配列の長さ： 17 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 配列

GCTATGANCA TGATTAC 17 配列番号： 5

GCTATGNCCA TGATTAC 17 配列番号： 6

GCTANGACCA TGATTAC 17 配列番号： 7

GCNATGACCA TGATTAC 17 配列番号： 8

配列の長さ： 16 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 配列

ANCGCGCAAT TAACCC 16 配列番号： 9

AGNGCGCAAT TAACCC 16 配列番号： 10 配列の長さ： 16 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 配列

AGCGNGCAAT TAACCC 16

配列番号： 11 配列の長さ： 17 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 配列

NAGCGCGCAA TTAACCC 17 配列番号： 12 配列の長さ： 11 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： D NA 配列

NCCATGATTA C 11 配列 ¾号： 13 配列の長さ： 13 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： D NA 配列 NGACCATGAT TAC 13 配列番号： 14

配列の長さ： 14

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 鋼

NTGACCATGA TTAC 14 配列番号： 15

配列の長さ： 16

配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 配列

NTATGACCAT GATTAC 16 配列番号： 16

配列の長さ： 18

配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の極類： DNA 配列

NGCTATGACC ATGATTAC 18 配列番号： 17

配列の長さ： 18 配列の型：核酸 ' トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 配列

GCTATGACCA TGATTACN 18

配列番号： 18

NAGCGCGCAA TTAACCC 17

配列番号： 19

配列の長さ： 16 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の稲類： D NA 配列

ANCGCGCAAT TAACCC 16

配列番号： 20

AGNGCGCAAT TAACCC 16 配列番号： 21 配列の長さ： 16 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 配列

AGCGNGCAAT TAACCC 16 配列番号： 22 配列の長さ： 17 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 配列

NAGCGCGCAA TTAACCC 17 配列 Φ号： 23 配列の長さ： 11 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 配列

NCCATGATTA C 11 配列番号： 24 配列の長さ： 13 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 配列

NGACCATGAT TAC 13 配列番号： 25 配列の長さ： 14 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 配列

NTGACCATGA TTAC 14 配列 *号： 26 配列の長さ： 16 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 配列 NTATGACCAT GATTAC 16 配列番号： 27 '

配列の長さ： 18

配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 配列

GCTATGACCA TGATTACN 18 配列番号： 28

配列の長さ： 17

配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 配列

NAGCGCGCAA TTAACCC 17 配列番号： 29

配列の長さ： 17

配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の極類： DNA 配列

NAGCGCGCAA TTAACCC 17 配列番号： 30 配列の長さ： 17 配列の型：核酸卜ポロジ一：直鎖状配列の種類： DNA 配列

GCTATGACNA TGATTAC 17 配列番号： 31 配列の長さ： 17 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 配列

GCTANGACCA TGATTAC 17 配列番号： 32

S2列の長さ： 18 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の極類： DNA 配列

NGCTATGACC ATGATTAC 18 配列番号： 33

GCTATGACCA TGNTTAC 17 配列番号： 34

配列の長さ： 17

配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 配列

GCTATGACCA NGATTAC 17 配列番号： 35

配列の長さ： 17 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： DN A 配列

GCTATGACNA TGATTAC 17 配列 ¾号： 36

GCTATGANCA TGATTAC 17 配列番号： 37 配列の長さ： 17 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 配列

GCTATGNCCA TGATTAC 17 配列番号： 38 配列の長さ： 17 配列の型：核酸トポロジー：直銷状配列の種類： DNA 配列

GCTANGACCA TGATTAC 17 配列桥号： 39 配列の長さ： 17 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA 配列 GCNATGACCA TGATTAC 17 配列番号： 0

配列の長さ： 17

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類： DNA

配列

NAGCGCGCAA TTAACCC 17 配列番号： 41

配列の長さ： 17

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類： DNA

配列

GCTATGACCAT GATTACN 17 配列番号： 42

配列の長さ： 33

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の極類： DNA

配列

GGGTTAATTG CGCGCTGTAA TCATGGTCAT AGC 33 配列番号： 43

配列の長さ： 35

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類： D N A

配列

GGGTTAATTG CGCGCTTGGT AATCATGGTC ATAGC 35 配列番号： 44

配列の長さ： 37

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類： D N A

配列

GGGTTAATTG CGCGCTTGGC GTAATCATGG TCATAGC 37 配列番号： 45

配列の長さ： 39

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の ¾Π¾Π： D N A

配列

GGGTTAATTG CGCGCTTGGC AAGTAATCAT GGTCATAGC 39 配列番号： 46

配列の長さ： 41 配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類： D N A

配列

GGGTTAATTG CGCGCTTGGC AAAAGTAATC ATGGTCATAG C 41 配列番号： 47

配列の長さ： 43

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類： D N A

配列

GGGTTAATTG CGCGCTTGGC AAAAAAGTAA TCATGGTCAT AGC 43 配列番号： 48

配列の長さ： 45

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類： D N A

配列

GGGTTAATTG CGCGCTTGGC AAAAAAAAGT AATCATGGTC ATAGC 45 配列桥号： 49

配列の長さ： 47

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状配列の種類： DNA

配列

GGGTTAATTG CGCGCTTGGC AAAAAAAAAAA GTAATCATGG TCATAGC 47 配列番号： 50

配列の長さ： 51

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類： DNA

配列

GGGTTAATTG CGCGCTTGGC AAAAAAAAAAA AAAAAGTAATC ATGGTCATAG C 51 配列番号： 51

配列の長さ： 17

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類： DNA

配列

NAGCGCGCAA TTAACCC 17 配列称号： 52

配列の長さ： 16

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類： DNA

配列 NTCTAGTTGG TCTGTC 16 配列番号： 53

配列の長さ： 16

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸

ホスホロチォエー卜型オリゴヌクレオチド（S—オリゴ）配列

NTCTAGTTGG TCTGTC 16 配列番号： 54

配列の長さ： 17

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類： D N A

配列

GCTANGACCA TGATTAC 17 配列番号： 55

配列の長さ： 16

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の極類： D N A

配列

GCANACTTCN TCATCT 16 配列番号： 56

配列の長さ： 16

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸

ホスホロチォェ一ト型オリゴヌクレオチド（ S —ォリゴ）配列

GCAGANCTTC TCATCT 16 配列番号： 57

配列の長さ： 33

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類： D N A

配列

GGGTTAATTG CGCGCTGTAA TCATGGTCAT AGC 33 配列番号： 58

配列の長さ： 30

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の極類： R N A

配列

GACAGACCAA CUAGAAGAUG AGAAGUCUGC 30

Claims

言冑求の範囲

1 . 特定のポリヌクレオチド塩基配列を有する被検体を検出するための 1組の検出用プロ一ブであって、

第 1の蛍光色素分子が結合し、前記ポリヌクレオチド塩基配列の一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を有するドナ一プローブと、

第 2の蛍光色素分子が結合し、前記ポリヌクレオチド塩基配列の一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を有するァクセプ夕ープローブとからなり、かつ、前記ドナープローブと前記ァクセプ夕一プローブに基づく蛍光の減衰カーブが、前記ドナ一プローブと前記ァクセブ夕ープローブと前記被検体とのハイブリッド体を形成する際に有意に変化する検出用プローブ。

2 . 請求項 1に記載の検出用プローブであって、

前記ハイブリツド体において、前記ドナープローブの前記第 1の蛍光分子が結合するヌクレオチドと、前記ァクセプ夕一プローブの前記第 2の蛍光分子が結合するヌクレオチド間が 2本鎖構造である、前記検出用プローブ。

3 . 詰求項 2に記載の検出用プローブであって、

前記ハイブリツド体において、前記ドナープローブと前記ァクセプ夕一プローブが被検体に隣り合って連続してハイブリダィズする、前記検出用プローブ。

4 . 請求項 3に記載の検出用プローブであって、

前記第 1の蛍光色素分子または前記第 2の蛍光色素分子のいずれかが、被検体上で速続してハイプリダイズする前記 1組の検出用プローブの隣り合う側の末端部である、前記検出用プローブ。

5 . 求項 1に記載の検出用プローブであって、

前記 1組の検出用プローブと被検体から形成されるハイブリッド体において、ドナープローブとァクセプ夕一プローブが被検体にハイプリダイズして、前記第 1 の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記第 2の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の一部が 2本鎖構造をとる、前記検出用プローブ。

6 . 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の検出用プローブであって、さらに、前記ハイブリツド体において、前記第 1の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記第 2の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の塩基数が 4〜 2 0である、前記検出用プローブ。

7 . 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の検出用プローブであって、

前記ハイブリッド体において、前記第 1の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記第 2の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の塩基数が 8〜 1 6である、前記検出用プローブ。

8 . 請求項 1 ~ 7のいずれか 1項に記載の検出用プローブであって、

前記第 1の蛍光色素分子が、 4， 4ージフルオロー 4一ポロ— 3 a、 4 a—ジァザ— s—インダセン系蛍光団またはフルォロセイン系蛍光団のいずれかを有し、かつ、前記第 2の蛍光分子が、インドシァニン系蛍光団またはローダミン系蛍光団のいずれかを有する、前記検出用プローブ。

9 . 請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の検出用プローブであって、さらに、前記第 1の蛍光色素分子が、 4， 4—ジフルオロー 4ーボロー 3 a、 4 a—ジァザ一 s—インダセン系蛍光団を有し、かつ前記第 2の蛍光分子が、インドシァニン系蛍光団を有する、前記検出用プローブ。

1 0 . 特定のポリヌクレオチド塩基配列を有する被検体を検出する方法であつて、

( 1 ) 第 1の蛍光色素分子が結合し、前記のポリヌクレオチド塩基配列の一部にハイブリダィズすることが可能な塩基配列を有するドナ一プローブと、第 2の ¾ 光色素分子が結合し、前記ポリヌクレオチド塩基配列の一部にハイプリダイズすることが可能な塩基配列を有するァクセプタープローブとからなる 1組の検出用プローブと、前記被検体からハイブリツド体を形成する第 1のステップと、

(2)前記ハイプリッド体の前記第 2の蛍光色素に基づく蛍光波長域の蛍光強度の减衰カーブを測定する第 2のステップと、

( 3) 前記 1組の検出用プローブの前記第 2の蛍光色素に基づく蛍光波長域の蛍光強度の減衰カーブを測定する第 3のステップと、

(4) 前記第 2および第 3のステップで得られる蛍光減衰カーブの比較により前記ポリヌクレオチド塩基配列の存在を検出する第 4のステップとからなる方法。

1 1 . 請求項 1 0に記載の特定のポリヌクレオチド塩基配列を有する被検体を検出する方法であって、

前記ハイプリッド体において、前記ドナーブローブの前記第 1の蛍光分子が結合するヌクレオチドと、前記ァクセブ夕ープローブの前記第 2の蛍光分子が結合するヌクレオチド間が 2本鎖構造である、前記方法。

1 2 . 請求項 1 0に記載の特定のポリヌクレオチド塩基配列を有する被検体を検出する方法であって、

前記ハイプリッド体において、前記ドナープローブと前記ァクセプ夕一プローブが被検体に隣り合って連続してハイブリダィズする、前記方法。

1 3 . 請求項 1 2に記載の特定のポリヌクレオチド塩基配列を有する被検体を検出する方法であって、

前記第 1の蛍光色素分子または前記第 2の蛍光色素分子のいずれかが、被検体上で連続してハイブリダィズする前記 1組の検出用プロ一ブの隣り合う側の末端部である、己方法。

1 4 . 詰求項 1 0に記載の特定のポリヌクレオチド塩基配列を冇する被検体を検出する方法であって、

前記 1組の検出用プローブと被検体から形成されるハイブリツド体において、ドナーブローブとァクセプ夕ープローブが被検体にハイプリダイズして、前記第 1 の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記第 2の ¾光色素分子が結合するヌクレオチド間の一部が 2本鎖構造をとる、前記方法。

1 5 . 請求項 1 0〜 1 4のいずれか 1項に記載の特定のポリヌクレオチド塩基配列を有する被検体を検出する方法であって、

前記ハイブリツド体において、前記第 1の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記第 2の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の塩基数が 4〜 2 0である、刚 d方法 ₀

1 6 . 請求項 1 0〜 1 4のいずれか 1項に記載の特定のポリヌクレオチド塩基配列を有する被検体を検出する方法であって、

前記ハイプリッド体において、前記第 1の蛍光色素分子が結合するヌクレオチドと前記第 2の蛍光色素分子が結合するヌクレオチド間の塩基数が 8 ~ 1 6である、言' J g己方法。

1 7 . 請求項 1 0〜 1 6のいずれか 1項に記載の特定のポリヌクレオチド塩基配列を有する被検体を検出する方法であって、

前記第 1の蛍光色素分子が、 4 , 4ージフルオロー 4 一ポロ— 3 a、 4 a—ジァザ一 s —ィンダセン系蛍光団またはフルォロセイン系蛍光団のいずれかを有し、かつ、前記第 2の蛍光分子が、インドシァニン系蛍光団またはローダミン系蛍光団のいずれかを有する、前記方法。

1 8 . 請求 ¾ 1 0〜 1 6のいずれか 1項に記載の特定のポリヌクレオチド塩基配列を有する被検体を検出する方法であって、

前記第 1の蛍光色素分子が、 4 , 4ージフルオロー 4ーボ口— 3 a、 4 a—ジァザ一 s —インダセン系蛍光団を有し、かつ前記第 2の蛍光分子が、インドシァニン系蛍光団を有する、前記方法。