WO1998007036A1 - Verfahren zur erfassung des status eines organismus durch messung von peptiden - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the status of an organism by measuring peptides from a sample of the organism.
  • the diagnostic procedure should be universally applicable, not limited to more sophisticated systems, but also be used to record the status of lower organisms.
  • it should be easy to establish and be able to be carried out using techniques known per se.
  • a technical problem on which the invention is based therefore lies in the provision of such a method.
  • the method according to the invention for detecting the statue of an organism assumes that a sample is taken from the organism to be examined.
  • the sample can also be the whole organism.
  • the sample must contain low-molecular peptides, although it does not matter if the sample also contains high-molecular peptides or proteins in addition to low-molecular peptides.
  • the low molecular weight peptides are directly detected and characterized and serve as an indicator of the status of the organism. It is both possible to measure individual peptides directly by measurement, and several peptides by measurement Detect all the way down to all the low-molecular peptides in the sample that can be measured.
  • the high-molecular structures such as proteins
  • diagnostic methods known per se such as, for example, radioimmunoassay or other competition assays for measuring peptide hormones and the like
  • the low-molecular peptides are measured directly according to the invention and not indirectly as in the methods mentioned.
  • the distribution of low molecular weight peptides with a representative cross-section of defined controls serves as reference.
  • the sample to be examined can come from tissue or liquid samples from the organism whose status is to be recorded, or it can be the organism itself or parts thereof.
  • the organism itself preferably serves as a sample.
  • Single organisms such as prokaryotic systems or simple eukaryotic systems, such as yeasts or other microorganisms, are particularly suitable as lower organisms.
  • the low molecular weight peptides used for the measurement should preferably have a molecular weight of at most 30,000 daltons.
  • the lower limit is not critical per se, but dipeptides represent the lower limit of the low-molecular peptides which are to be detected according to the invention.
  • Molecular weights of the low-molecular peptides of 100 to 10,000 daltons are particularly preferred.
  • mass spectrometry is preferably used to detect the low molecular weight peptides.
  • the so-called MALDI method matrix-assisted laser desorption ionization mass spectroscopy
  • mass spectrometry is used as a method, it is advisable to use the data that can be determined by mass spectroscopy to characterize the low molecular weight peptides, such as their molecular weight. It is also possible under certain circumstances to analyze other parameters, such as the charge of the peptides or the characteristic retention time on chromatography columns or a fragment pattern of the low molecular weight peptides or combinations of the mass of the low molecular weight peptides and their charges.
  • prokaryotes In particular, prokaryotes, eukaryotes, multicellular organisms, cells from tissue cultures, cells from animals and humans serve as organisms.
  • any consciously or unconsciously manipulated (conditioned) organism can influence its status, be it in the context of the administration of medication, gene therapy, in the case of infections, in the workplace through contact with chemical substances, in experimental animals, especially transgenic animals, and knock-out Mutants.
  • it can be checked whether the predicted, desired changes in status are made by intra- and inter-individual comparison, for example by chronological sampling from an organism before and in the course of one of the above-mentioned measures or by comparison with untreated control organisms have actually occurred and whether, in addition or instead, unpredictable, undesirable or even desired changes have occurred which are detected by the method according to the invention free of hypotheses.
  • the method according to the invention is therefore also suitable, for example, for accompanying clinical studies, toxicological examinations when testing all kinds of medication, for analyzing / recording degradation products, for identifying gene products.
  • the method according to the invention develops its outstanding importance in that a hypothesis-free detection of the status of the organism in question is made possible. A confirmation assay is therefore not already carried out with a preconceived opinion, but a real overall picture of the status of the examined organism can be created.
  • the inventive method that as a differential peptide display (differential Peptide Display), assumes that a certain peptide pattern is present in a healthy organism and is therefore able to serve as a reference standard. If you now record the peptide status of an individual and compare it with the reference, you can on the one hand find deviations that already give an initial indication of a possibly pathogenic condition.
  • the disease in question can be directly determined by comparing the deviations in the peptide pattern of the sample of the individual and agreement of the deviation with an associated clinical picture be identified from the analysis.
  • the procedure can in particular be as follows.
  • Ultrafiltrates from body fluids and tissue extracts can be used to prepare a reference sample.
  • the filtrate peptides are obtained and separated into fractions by, for example, obtaining low-molecular peptide fractions.
  • the peptide fractions can be characterized, for example, on the basis of retention behavior and molecular mass, which can be determined by chromatography or mass spectroscopy. If, for example, ultrafiltrate from patients suffering from a known disease is used and compared with the previously created spectrum of healthy reference subjects, the specific disease can be assigned to the status of the peptide mixture in question using the different pattern.
  • the method can thus also be used in a conventional manner, for example by querying the corresponding peptide ester indicating pathogenic changes. In individual cases, this can even be a peptide characteristic of the corresponding disease. If you analyze e.g. B. a sample from a patient in which a particular Disease pattern is recognizable and there is a hypothesis for the cause of this disease, for example this specific peptide can also be queried in the analysis according to the invention and, if the outcome is positive, appropriate therapy plans can be set up.
  • this specific peptide can also be queried in the analysis according to the invention and, if the outcome is positive, appropriate therapy plans can be set up.
  • Peptides can be obtained by methods known to those skilled in the art, such as ultrafiltration of the corresponding starting material. Filters with a molecular exclusion size are used which lie in the range claimed according to the invention, that is between those of a dipeptide and a maximum of 30,000 daltons. By suitable choice of the respective membranes, certain molecular weight fractions can also be obtained. Preferably, 0.2 ml to 50 l of filtrate are obtained in the course of the filtration, which is adjusted to a pH of 2 to 4, for example, immediately after completion of the filtration by acidification with dilute hydrochloric acid. The quantities mentioned are used in particular to examine pooled samples, on the one hand to develop reference samples from healthy subjects or to determine disease-specific peptide markers to create a peptide database.
  • the peptides present in the filtrate after ultrafiltration are obtained by adsorption on chromatographic materials, in particular cation exchangers, such as, for example, fractogel, anion exchanger fractogel TMAE and reverse phase (RP) materials, with subsequent elution by linear gradients or step gradients.
  • chromatographic materials in particular cation exchangers, such as, for example, fractogel, anion exchanger fractogel TMAE and reverse phase (RP) materials, with subsequent elution by linear gradients or step gradients.
  • fractogel such as, for example, fractogel, anion exchanger fractogel TMAE and reverse phase (RP) materials
  • RP reverse phase
  • the peptide fractions are preferably detected by mass spectrometric analysis, in particular using MALDI-MS (matrix assisted laser desorption ionization ass spectrometry) or ESI -MS (electro spray ionization-MS). These are methods that can be used to analyze peptides. This is preferably carried out with an on-line coupling of a Microbore RP separation and mass spectrometry (LC-MS coupling). From the data obtained, a multidimensional table according to retention behavior, molecular weight and signal intensity is created as the preferred guiding parameter. However, other quantities which can be determined using the methods mentioned can also be recorded.
  • MALDI-MS matrix assisted laser desorption ionization ass spectrometry
  • ESI -MS electro spray ionization-MS
  • the data obtained from the above steps about patients with a known underlying disease are compared with the similarly obtained data from a healthy reference population. Both qualitative changes (e.g. the appearance of new peptides or the absence of peptides) and quantitative changes (the increased or decreased occurrence of individual peptides) are determined. If necessary, the targets defined by means of the comparative analysis can be further purified and identified peptically by methods known to the person skilled in the art. The sequence information obtained can then be compared with protein and nucleic acid databases and subsequently with literature data. The relevance of the peptides shown with regard to the disease examined is checked by functional studies and by series screening on suitable patient groups. example 1
  • body fluids here: blood filtrate (hemofiltrate, HF)
  • HF is carried out in the context of arterio-venous or also veno-venous hemofiltration according to techniques known to those skilled in the art on selected patients or test subjects. HF is obtained in the same way that it is routinely carried out in principle in patients with chronic kidney disease.
  • a hemofiltration device eg hemoprocessor, Sartorius, Göttingen; AK 10 HFM, Gambro, Hechingen
  • a hemofilter e.g.
  • Hemoflow F 60 or Hemoflow HF 80 S Fresenius, Bad Homburg; Hemoflow FH 77 H and Hemoflow HF 88 H, Gambro), which has a molecular exclusion size of up to to 30 kDa.
  • the filtrate volume withdrawn from the patient is replaced by an electrolyte solution (e.g. SH 01, SH 05, SH 22, SH29, Schiwa, Glandorf).
  • a diagnostic hemofiltration is carried out with the aim of obtaining between 1 and 30 1 HF in a patient within one hemofiltration.
  • the hemofiltrate is immediately adjusted to a pH between 2 and 4 with dilute acid (e.g. 1 M HCl) and cooled to 4 ° C. 2. Extraction of the HF peptides and separation into fractions
  • Buffer pH value buffer substances molarity
  • Eluates 1-7 are chromatographed separately on a reverse phase column.
  • the eluate is collected in 4 ml fractions.
  • Measuring range m / z from 300 to 2,390
  • Aliquots of the fractions obtained in 2.2 are mixed with different matrix substances, e.g. B. measured with the addition of L (-) fucose in MALDI-MS.
  • a multidimensional table is created from the raw data, taking into account the scan number, signal intensity and after calculating the masses from the multiply charged ions of a scan.
  • the identified targets are purified from the raw material obtained (e.g. large preparations of hemofiltrate) in quantities that allow identification.
  • the different chromatographic separation techniques known to the person skilled in the art reverse phase, ion exchange, exclusion size chromatography, hydrophobic interaction chromatography etc.
  • the targets are identified again in the fractions via ESI-MS, MALDI-MS or also LC-MS. This procedure is repeated with variation of the chromatographic parameters until a pure product of the desired specification, i.e. H. Retention time and molecular mass. This is followed by the determination of a partial or complete amino acid sequence or a fragment pattern.
  • a database comparison is then carried out on the known databases (Swiss-Prot and EMBL peptide and nucleic acid database) with the aim of identifying the partial or complete sequence or a fragment pattern. If there is no database entry, the primary structure is clarified.
  • Buffer A 0.1% trifluoroacetic acid in water
  • Buffer B 80% acetonitrile in A
  • the eluate is collected in 50 ml fractions.
  • urine Collection of urine
  • Urine is obtained directly as catheter urine or as spontaneous urine from patients in quantities of 0.5 to 50 liters and used for Avoid proteolysis immediately with dilute acid (e.g. 1 M HCl) to a pH between 2.0 and 4.0 and cool to 4 ° C. After ultrafiltration over a cellulose triacetate membrane with an exclusion size of 30 kDa (Sartocon mini apparatus, Sartorius), the filtrate is subsequently used as a source of peptides.
  • dilute acid e.g. 1 M HCl
  • the filtrate is subsequently used as a source of peptides.
  • Buffer A 50 mM NaH 2 P0 4 pH 3.0 Buffer B 1.5 M NaCl in A gradient 0% B to 100% B in 2.000 ml
  • the eluate is collected in 10 200 ml pools 2.2 Second chromatographic separation
  • fractions are chromatographed separately on a reverse phase column.
  • Buffer A 0.1% trifluoroacetic acid in water
  • Buffer B 80% acetonitrile in A gradient 0% B to 100% B in 200 ml
  • the eluate is collected in 4 ml fractions.

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Abstract

Verfahren zur Erfassung des Status eines Organismus durch Messung von Peptiden aus einer Probe des Organismus, die hoch- und niedrigmolekulare Peptide enthält, als Indikator für den Status des Organismus, wobei niedrigmolekulare Peptide direkt erfaßt und charakterisiert und mit einer Referenz in Beziehung gesetzt werden.

Description

Verfahren zur Erfassung des Status eines Organismus durch Messung von Peptiden
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erfassung des Status eines Organismus durch Messung von Peptiden aus einer Probe des Organismus.
Zur Erfassung des Status eines Organismus werden verschiedene analytische Methoden eingesetzt. So wird beispielsweise in der Diagnostik von höheren Organismen bei pathologischen Befunden aufgrund der Symptomatik versucht, die Ursache der pathologischen Veränderung zu ergründen, um eine kausale Therapie zu entwickeln. Desweiteren ist man bemüht, durch Sequenzierung der Genome von Organismen und Etablierung von "Wildtyp-Genomen" eine Referenz eines durchschnittlichen, "gesunden" Organismus zu entwickeln, um dann individuelle Abweichungen, die auf mögliche pathogene Entwicklungen hinweisen können, durch entsprechende Genanalysen zu entdecken. Nachteilig an dem ersten methodischen Ansatz ist, daß man keine hypothesenfreie Diagnostik durchführen kann, da dabei eine Diagnose unternommen wird, die bereits auf Vermutungen beruht. Nachteilig an dem zweiten Verfahren ist, daß es auf lange Sicht noch nicht möglich sein wird, wichtige oder gar alle auf genetische Fehlfunk ionen zurückzuführende Erkrankungen zu diagnostizieren. Ein weiterer Nachteil der zuletzt genannten Methode kann auch darin bestehen, daß eine Mutation auf einem Gen nicht unbedingt zur Expression des damit verbundenen Phänotypen führt .
Es wäre mithin wünschenswert, über ein universell einsetzbares diagnostisches Verfahren zu verfügen, mit welchem es gelingt, die geschilderten Nachteile zu vermeiden und insbesondere eine hypothesenfreie Diagnostik durchführen zu können. Das diagnostische Verfahren sollte darüber hinaus universell einsetzbar sein, nicht beschränkt bleiben auf höher entwickelte Systeme, sondern auch gleichfalls einsetzbar sein, um den Status von niederen Organismen zu erfassen. Es sollte darüber hinaus leicht etablierbar sein und mit an sich bekannten Techniken ausgeführt werden können.
Ein der Erfindung zugrundeliegendes technisches Problem liegt mithin in der Bereitstellung eines solchen Verfahrens.
Überraschenderweise wird das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem in einfacher Weise durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst . Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens .
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Erfassung des Statue eines Organismus geht davon aus , daß dem zu untersuchenden Organismus eine Probe entnommen wird. Die Probe kann auch der vollständige Organismus sein. Die Probe muß niedrigmolekulare Peptide enthalten, wobei es nicht stört, wenn die Probe neben niedrigmolekularen Peptiden auch hochmolekulare Peptide oder Proteine enthält. Die niedrigmolekularen Peptide werden dabei erfindungsgemäß direkt erfaßt und charakterisiert und dienen als Indikator für den Status des Organismus . Dabei ist es sowohl möglich, einzelne Peptide direkt meßtechnisch zu erfassen, mehrere Peptide meßtechnisch zu erfassen bis hin zu allen in der Probe befindlichen und meßtechnisch erfaßbaren niedermolekularen Peptide. Anders als bei herkömmlichen analytischen oder diagnostischen Methoden, wie die Gel -Elektrophorese oder die zwei- dimensionale Elektrophorese und beispielsweise klinische diagnostische Methoden, werden hier nicht die hochmolekularen Strukturen, wie beispielsweise Proteine untersucht. Im Gegensatz zu an sich bekannten diagnostischen Methoden, wie beispielsweise Radioimmunassay oder anderen Kompetitions- assays zur Messung von Peptidhormonen und ähnlichem, werden erfindungsgemäß die niedermolekularen Peptide direkt meßtechnisch erfaßt und nicht wie in den genannten Methoden indirekt. Als Referenz dient die Verteilung niedrigmolekularer Peptide bei einem repräsentativen Querschnitt von definierten Kontrollen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren kann die zu untersuchende Probe von Geweben- oder Flüssigkeitsproben aus dem Organismus, dessen Status aufgenommen werden soll, stammen oder es kann der Organismus selbst oder Teile davon sein. Im Falle der Untersuchung niederer Organismen dient vorzugsweise der Organismus selbst als Probe. Als niedere Organismen kommen insbesondere Einzeller, wie prokaryontische Systeme oder einfache eukaryontische Systeme, wie Hefen oder andere Mikroorganismen, in Betracht.
Erfindungsgemäß sollen die niedrigmolekularen Peptide, die zur Messung herangezogen werden, vorzugsweise ein Molekulargewicht von höchstens 30.000 Dalton aufweisen. Die untere Grenze ist an sich nicht kritisch, jedoch stellen Dipeptide die untere Grenze der niedrigmolekularen Peptide, die erfindungsgemäß erfaßt werden sollen, dar. Insbesondere bevorzugt sind Molekulargewichte der niedrigmolekularen Peptide von 100 bis 10.000 Dalton.
Falls erforderlich, weil beispielsweise durch eine veränderte Meßanordnung bedingt, kann es vorteilhaft sein, hochmole- kulare Peptide oder Proteine sowie andere Biopolymere, die möglicherweise mit der Messung interferieren, aus der Probe zu entfernen. Dies ist insbesondere dann nicht erforderlich, wenn durch die erfindungsgemäß einzusetzende Meßmethode die höhermolekularen Peptidverbindungen meßtechnisch nicht erfaßt werden .
Vorzugsweise wird erfindungsgemäß die Massenspektroskopie zur Erfassung der niedermolekularen Peptide eingesetzt. Insbesondere bewährt hat sich dabei die sogenannte MALDI-Methode (Matrixunterstützte Laser-Desorptions-Ionisations-Massen- Spektroskopie) . Wird die Massenspektrometrie als Methode eingesetzt, empfiehlt es sich, die durch die Massenspektroskopie ermittelbaren Daten zur Charakterisierung der niedermolekularen Peptide einzusetzen, wie beispielsweise deren Molekulargewicht. Es ist ebenfalls möglich, unter bestimmten Umständen andere Parameter zu analysieren, wie beispielsweise die Ladung der Peptide oder die charakteristische Retentionszeit auf Chromatographiesäulen oder ein Fragmentmuster der niedermolekularen Peptide oder Kombinationen aus Masse der niedrigmolekularen Peptide und deren Ladungen .
Je nach Fragestellung, die mit der Erfassung des Status des Organismus noch verbunden ist, kann es vorteilhaft sein, die Probe auf mehrere Fraktionen zu verteilen und die Proben unter verschiedenen Fragestellungen oder meßtechnischen Anordnungen zu analysieren und somit einen Status des Organismus zu erfassen.
Als Organismen dienen insbesondere Prokaryonten, Eukaryonten, vielzellige Organismen, Zellen aus Gewebekulturen, Zellen von Tieren und Menschen. So wird es erfindungsgemäß ermöglicht, den Status von genetisch veränderten oder transformierten und/oder konditionierten Organismen zu untersuchen. Dies kann insbesondere bei Überprüfungen von transformierten Systemen vorteilhaft sein, um zu erkennen, inwie- weit transformierte Organismen möglicherweise unerwartete oder unerwünschte Eigenschaften entwickelt haben, indem beispielsweise Peptide gebildet werden, die auf unerwünschte oder unerwartete Eigenschaften, wie toxische Eigenschaften, hinweisen.
Insbesondere kann jede bewußt oder unbewußt vorgenommene Manipulation (Konditionierung) eines Organismus dessen Status beeinflussen, sei es im Rahmen der Verabreichung von Medikamenten, der Gentherapie, bei Infektionen, am Arbeitsplatz durch Kontakt mit chemischen Stoffen, bei Versuchstieren, insbesondere transgenen Tieren und knock-out-Mutanten. Insbesondere bei solchen Verfahren kann durch den intra- und inter-individuellen Vergleich, beispielsweise durch chronologische Probenentnahme aus einem Organismus vor und im Verlauf einer der oben genannten Maßnahmen oder durch Vergleich mit nicht behandelten Kontrollorganismen, überprüft werden, ob die vorhergesagten, erwünschten Änderungen im Status tatsächlich eingetreten sind und ob darüberhinaus oder stattdessen nicht vorhergesagte, unerwünschte oder auch erwünschte Änderungen eingetreten sind, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hypothesenfrei erfaßt werden.
Daher eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren auch zum Beispiel zur Begleitung von klinischen Studien, toxikologischen Untersuchungen bei der Erprobung von Medikamenten aller Art, zur Analyse/Erfassung von Abbauprodukten, zur Identifikation von Genprodukten.
In der Veterinär- und Humanmedizin entwickelt das erfindungs- gemäße Verfahren seine überragende Bedeutung dadurch, daß eine hypothesenfreie Erfassung des Status des betreffenden Organismus ermöglicht wird. Es wird also nicht bereits mit einer vorgefaßten Meinung ein Bestätigungsassay durchgeführt , sondern es wird ein echtes Gesamtbild des Status des untersuchten Organismus erstellbar. Das erfindungsgemäße Verfahren, daß als differentielles Peptiddisplay (Differential Peptide Display) bezeichnet werden kann, geht dabei davon aus, daß in einem gesunden Organismus ein bestimmtes Peptid- muster vorhanden ist und deshalb in der Lage ist, als Referenzstandard zu dienen. Nimmt man nun den Peptidstatus eines Individuums auf und vergleicht diesen mit der Referenz, so kann man einerseits Abweichungen feststellen, die bereits einen ersten Hinweis auf einen möglicherweise pathogenen Zustand geben. Werden nunmehr die Abweichungen, die durch Vergleich mit ähnlichen pathogenen Zuständen erstellt worden sind, aus entsprechenden Proben eines Erkrankten ermittelt, so kann bereits durch Vergleich der Abweichungen im Peptid- muster der Probe des Individuums und Übereinstimmung der Abweichung mit einem zugeordneten Krankheitsbild die betreffende Erkrankung direkt aus der Analyse identifiziert werden.
Erfindungsgemäß kann dabei insbesondere wie folgt vorgegangen werden. Zur Herstellung einer Referenzprobe können zunächst Ultrafiltrate aus Körperflüssigkeiten und Gewebsextrakten verwendet werden. Die Gewinnung der Filtratpeptide und ihre Auftrennung in Fraktionen erfolgt, indem beispielsweise niedrigmolekulare Peptidfraktionen gewonnen werden. Die Charakterisierung der Peptidfraktionen kann beispielsweise anhand von Retentionsverhalten und molekularer Masse, ermittelbar durch Chromatographie oder Massenspektroskopie, erfolgen. Wird beispielsweise Ultrafiltrat von Patienten, die an einer bekannten Erkrankung leiden, verwendet und dieses mit dem zuvor erstellten Spektrum von gesunden Referenzprobanden verglichen, kann durch das abweichende Muster eine Zuordnung der spezifischen Erkrankung mit dem Status des betreffenden Peptidgemisches erfolgen. Die Methode kann somit auch in an sich herkömmlicher Weise eingesetzt werden, indem beispielsweise gleich das entsprechende auf pathogene Veränderungen hinweisende Peptid uster abgefragt wird. Im Einzelfall kann dies sogar ein für die entsprechende Krankheit charakteristisches Peptid sein. Analysiert man z. B. eine Probe aus einem Patienten, bei dem ein bestimmtes Erkrankungsbild erkennbar ist und eine Hypothese für die Ursache dieser Erkrankung besteht, kann beispielsweise dieses spezifische Peptid in der .Analyse gemäß Erfindung ebenfalls abgefragt werden und bei positivem Ausgang entsprechende Therapiepläne eingerichtet werden. So ist es durchaus möglich, zunächst dem Patienten eine Probe zu entnehmen, mit dem er indungsgemäßen Verfahren einen Status aufzunehmen, um dann bei Feststellen des Vorliegens einer auf pathogene Zustände hinweisenden Abweichung entweder durch an sich bekannte Bestätigungsassays, unter Heranziehung der üblichen klinischen Assays, eine Kontrollmessung durchzuführen oder die Kontrollmessung durch spezifisches Screening nach dem Indikator des pathogenen Zustands durchzuführen.
Peptide können dabei nach dem Fachmann bekannten Verfahren, wie beispielsweise Ultrafiltration des entsprechenden Ausgangsmaterials, gewonnen werden. Dabei werden Filter mit einer molekularen Ausschlußgröße verwendet , die in dem erfindungsgemäß beanspruchten Bereich liegen, also zwischen denen eines Dipeptides und maximal 30.000 Dalton. Durch geeignete Wahl der jeweiligen Membranen können auch bestimmte Molekulargewichtsfraktionen gewonnen werden. Vorzugsweise werden im Rahmen der Filtration 0,2 ml bis 50 1 Filtrat gewonnen, das beispielsweise sofort nach .Abschluß der Filtration durch Ansäuern mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 bis 4 eingestellt wird. Die genannten Mengen dienen insbesondere dazu, gepoolte Proben zu untersuchen, zum einen zur Entwicklung von Referenzproben gesunder Probanden bzw. zur Bestimmung krankheitsspezifischer Peptid- marker zur Erstellung einer Peptiddatenbank.
Die nach Ultrafiltration im Filtrat vorliegenden Peptide werden durch Adsorption an chromatographische Materialien, insbesondere Kationenaustauscher, wie beispielsweise Fracto- gel , Anionenaustauscher-Fractogel TMAE und Reverse-Phase- (RP) -Materialien, mit nachfolgender Elution durch lineare Gradienten oder Stufengradienten gewonnen. Zur weiteren Aufreinigung können gegebenenfalls weitere chromatographische Trennungen, insbesondere über RP-Phasenmaterial durchgeführt werden.
Die Erfassung der Peptidfraktionen erfolgt vorzugsweise durch massenspektrometrische .Analyse, insbesondere mit der MALDI-MS (matrix assisted laser desorption ionisation ass spectro- metry) oder ESI -MS (electro spray ionisation-MS) . Dies sind Methoden, die zur Analyse von Peptiden einsetzbar sind. Hierbei wird vorzugsweise mit einer On-Line-Kopplung einer Microbore RP-Trennung und der Massenspektro etrie (LC-MS- Kopplung) gearbeitet. Aus den erhaltenen Daten wird eine mehrdimensionale Tabelle nach Retentionsverhalten, Molekulargewicht und Signalintensität als bevorzugte Leitparameter erstellt. Es können jedoch auch andere mit den genannten Methoden ermittelbare Größen erfaßt werden.
Die über die vorgenannten Schritte gewonnenen Daten über Patienten mit einer bekannten Grunderkrankung werden mit den gleichartig gewonnenen Daten einer gesunden Referenz- Population verglichen. Hierbei werden sowohl qualitative Änderungen (z. B. das Auftreten neuer Peptide oder das Fehlen von Peptiden) , als auch quantitative Änderungen (das vermehrte beziehungsweise verminderte Auftreten von einzelnen Peptiden) festgestellt. Die über die vergleichende Analyse definierten Targets können, falls erforderlich, im weiteren durch den Fachmann bekannte Methoden peptidche isch gereinigt und identifiziert werden. Die erhaltenen SequenzInformationen können dann mit Protein- und Nucleinsäuredatenbanken sowie nachfolgend mit Literaturdaten verglichen werden. Die Relevanz der dargestellten Peptide bezüglich der untersuchten Erkrankung wird überprüft durch funktionelle Studien und durch Reihenscreening an geeigneten Patientengruppen. Beispiel 1
Verwendung von Körperflüssigkeiten, hier: Blutfiltrat (Hämo- filtrat, HF)
1. Gewinnung von HF
HF wird im Rahmen einer arterio-venösen oder auch veno- venösen Hämofiltration nach dem Fachmann bekannten Techniken an ausgewählten Patienten oder Probanden durchgeführt. Die Gewinnung von HF erfolgt in der Weise, wie sie im Prinzip bei chronisch nierenkranken Patienten routinemäßig durchgeführt wird. Über eine arterielle Ableitung und venöse Zuleitung (arterio-venöse HF) oder eine venöse Ableitung mit venöser Zuleitung (veno-venöse HF) wird das Blut des Patienten unter apparativer Unterstützung durch ein Hämo- filtratsgerät (z. B. Hemoprozessor, Sartorius, Göttingen; AK 10 HFM, Gambro, Hechingen) über ein Hämofilter geleitet (z. B. Hemoflow F 60 oder Hemoflow HF 80 S, Fresenius, Bad Homburg; Hemoflow FH 77 H und Hemoflow HF 88 H, Gambro) , das eine molekulare Ausschlußgröße von bis zu 30 kDa besitzt. Das dem Patienten entzogene Filtratvolumen wird durch eine Elektrolytlösung substituiert (z. B. SH 01, SH 05, SH 22, SH29, Schiwa, Glandorf ) .
Im Rahmen des hier vorliegenden Verfahrens wird eine diagnostische Hämofiltration mit dem Ziel durchgeführt, zwischen 1 und 30 1 HF bei einem Patienten innerhalb einer Hämofiltration zu gewinnen. Das Hämofiltrat wird zur Vermeidung der Proteolyse sofort mit verdünnter Säure ( z . B . 1 M HCl) auf einen pH-Wert zwischen 2 und 4 eingestellt und auf 4°C gekühlt. 2. Gewinnung der HF-Peptide und Auftrennung in Fraktionen
2.1 Peptidextraktion mit stufenweiser Elution
10 1 Hämofiltrat werden mit entionisiertem Wasser auf eine Leitfähigkeit von 6 mS/cm verdünnt und der pH mit Salzsäure auf 2,7 eingestellt. Das HF wird dann auf eine Chromatographiesäule aufgetragen. Nach Bindung der HF-Peptide werden die gebundenen Peptide mit einer pH-Stufenelution eluiert . Dabei werden 7 Puffer mit aufsteigendem pH verwendet .
Chromatographiebedingungen :
Fluß beim Auftrag: 100 ml/min Fluß beim Eluieren: 30 ml/min Detektion: 214, 280 nm
Säule: Vantage (Amicon, Witten) 6 cm Durchmesser x 7 cm Füllhöhe
Säulenmaterial: Fraktogel TSK SP 650 M (Merck, Darmstadt) Anlage: BioCAD 250, Perseptive Biosystems, Wiesbaden- Nordenstadt
Puffer pH-Wert Puffersubstanzen Molarität
Elutionspuffer 1 3,6 Zitronensäure 0,1
Elutionspuffer 2 4,5 Essigsäure 0,1
Elutionspuffer 3 5,0 Apfelsäure 0,1
Elutionspuffer 4 5,6 Bernsteinsäure 0,1
Elutionspuffer 5 6,6 Natriumdihydrogenphosphat 0,1
Elutionspuffer 6 7,4 Dinatriumhydrogenphosphat 0,1
Elutionspuffer 7 9,0 Ammoniumcarbonat 0,1
Die Eluate 1 - 7 werden separat gesammelt. 2.2 Zweite chromatographische Auftrennung
Die Eluate 1 - 7 werden separat über eine Reverse-Phase-Säule chromatographiert .
Chromatographiebedingungen :
Fluß beim Auftrag: 10 ml/min
Fluß beim Eluieren: 4 ml/min
Detektion: 214 nm
Säule: HPLC-Stahlsäure, 1 cm Durchmesser, 12,5 Füllhöhe
Säulenmaterial: Source RPC 15 μm (Pharmacia, Freiburg)
Anlage: BioCAD, Perseptive Biosystems, Wiesbaden-Nordenstadt
Das Eluat wird in 4 ml-Fraktionen gesammelt.
3. Kartierung der Peptid-Fraktionen
3.1
Aliquots der in 2.2 gewonnen Fraktionen werden auf einer Microbore-Reverse-Phase-Säule aufgetragen und im Gradient eluiert . Die Detektion erfolgt mit UV-Detektor und on-line mit einem Elektrospray-Massenspektrometer .
Chromatographiebedingungen: Fluß beim Auftragen: 20 μl/min Fluß beim Eluieren: 20 μl/min Detektion: 220 nm
Säule: C18 AQS, 3 μm, 120 A, 1 mm Durchmesser, 10 cm Länge (YMC, Schermbeck) Anlage: ABI 140 B Dual solvent Delivery System
Puffer A 0,06% Trifluoressigsäure in Wasser Puffer B 80% Acetonitril in A Gradient 0% B auf 100% B in 90 min On-Line-Massenspektrometrie :
API III mit Elektrospray- Interface ( Perkin- Eimer ,
Weiterstadt)
Positive Ion Modus
Meßbereich: m/z von 300 bis 2.390
Scan-Zeit: 7 see
Scan-Fenster: 0,25 m/z
Datenerfassung erfolgt mit MacSpec oder MultiView Software (Perkin-Elmer) .
3.2 MALDI-MS Messung der einzelnen Fraktionen
Aliquots der in 2.2 gewonnen Fraktionen werden mit unterschiedlichen Matrixsubstanzen, z. B. unter Zusatz von L(-) Fucose im MALDI-MS gemessen.
Aus den Rohdaten wird eine mehrdimensionale Tabelle erstellt unter Berücksichtigung der Scan-Nummer, Signalintensitat und nach Kalkulation der Massen aus den multipel geladenen Ionen eines Scans.
4. Vergleichende Analyse
4.1 Identifikation neuer, fehlender oder in ihrer Menge deutlich verschiedener Peptide
Durch Vergleich der unter 3.3 erhaltenen Datensätze, die auch als Peptidkarten bezeichnet werden können, werden qualitative und/oder quantitative Unterschiede festgestellt . Dabei werden unter Berücksichtigung von Kontrollen und Proben einzelne Datensätze oder auch Gruppen von Datensätzen zum Vergleich herangezogen . 4.2 Peptidchemische Charakterisierung der identifizierten Targets
Aus dem gewonnen Rohmaterial (z. B. Großpräparationen von Hämofiltrat) werden die identifizierten Targets in Mengen aufgereinigt , die eine Identifikation erlauben. Dazu werden die unterschiedlichen, dem Fachmann bekannten chromatographischen Trenntechniken (Reverse Phase, Ionenaustausch, Ausschlußgrößenchromatographie, hydrophobe Interaktions- Chromatographie etc.), die im allgemeinen zur Auftrennung von Peptidgemischen eingesetzt werden, verwendet. Nach jeder chromatographischen Trennung einer Fraktion werden über ESI- MS, MALDI-MS oder auch LC-MS die Targets erneut in den Fraktionen identifiziert. Dieses Procedere wird unter Variation der chromatographischen Parameter so oft wiederholt, bis ein reines Produkt der gesuchten Spezifikation, d. h. Retentionszeit und molekularer Masse, vorliegt. Darauf folgt die Bestimmung einer Teil- oder Komplett-Aminosäure- sequenz oder eines Fragmentmusters. Im Anschluß wird ein Datenbankvergleich durchgeführt an den bekannten Datenbanken (Swiss-Prot und EMBL-Peptid- und Nucleinsäure-Datenbank) mit dem Ziel der Identifikation der Teil- oder Komplettsequenz oder eines Fragmentmusters. Ist kein Datenbankeintrag vorhanden, erfolgt die Aufklärung der Primärstruktur.
Beispiel 2 :
Verwendung von Körperflüssigkeiten, hier: Aszites
1. Gewinnung von Aszites
Aszites bildet sich as extravasales Exsudat bei unterschiedlichen Erkrankungen (maligne Tumoren, Leberstörungen etc.) . Im Rahmen des hier vorliegenden Verfahrens werden zwischen 10 ml und 10 1 Aszites durch Punktion gewonnen und danach zur Vermeidung der Proteolyse sofort mit vrdünnter Säure (z. B. I M HCl) auf einen pH-Wert zwischen 2,0 und 4,0 einge- stellt und auf 4°C gekühlt. Nach einer Ultrafiltration über eine Cellulose-Triacetat-Membran mit einer Ausschlußgröße von 30 kDa (Sartocon-Mini -Apparatur, Sartorius) wird das Filtrat als Quelle von Peptiden im weiteren verwendet.
2. Gewinnung der Aszites-Peptide und Auftrennung in Fraktionen
2.1. Peptidextraktion mit Gradienten-Elution
5 1 Aszites-Filtrat werden auf pH 2,0 eingestellt und über eine präparative Reverse-Phase-Säule getrennt.
Chromatographiebedingungen :
Fluß beim Auftrag 40 ml/min
Fluß beim Eluieren: 40 ml/min
Detektion: 214 nm, 280 nm
Säule: Waters Kartuschensystem, 4,7 cm Durchmesser, 30 cm
Füllhöhe
Säulenmaterial: Vydac RP-C18, 15 - 20 μm
Anlage: BioCAD, Perseptive Biosystems, Wiesbaden-Nordenstadt
Puffer A: 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser
Puffer B: 80% Acetonitril in A
Gradient: 0% B auf 100% B in 3,000 ml
Das Eluat wird in 50 ml Fraktionen gesammelt.
Der weitere Verlauf der Charakterisierung entspricht Beispiel 1.
Beispiel 3 :
Verwendung von Körperflüssigkeiten, hier: Urin 1. Gewinnung von Urin
Urin wird direkt als Katheterurin oder als Spontanurin von Patienten in Mengen von 0,5 bis 50 1 gewonnen und zur Ver- meidung der Proteolyse sofort mit verdünnter Säure (z. B. 1 M HCl) auf einen pH-Wert zwischen 2,0 und 4,0 eingestellt und auf 4°C gekühlt. Nach einer Ultrafiltration über eine Cellulose-Triacetat-Membran mit einer Ausschlußgröße von 30 kDa (Sartocon-Mini-Apparatur, Sartorius) wird das Filtrat als Quelle von Peptiden im weiteren verwendet.
2. Gewinnung der Urin-Peptide und Auftrennung in Fraktionen
2.1 Peptidextraktion mit stufenweiser Elution
10 1 Urin-Filtrat werden mit Wasser auf eine Leitfähigkeit von 6 mS/cm verdünnt und der pH mit HCl auf 2,7 eingestellt. Das Urin-Filtrat wird dann auf eine Chromatographiesäule aufgetragen. Nach Bindung der Peptide werden die gebundenen Peptide mit einem Kochsalzgradienten eluiert .
Chromatographiebedingungen :
Fluß beim Auftrag: 100 ml/min Fluß beim Eluieren: 30 ml/min Detektion: 214 nm
Säule: Vantage (Amicon, Witten) 6 cm Durchmesser x 7 cm Füllhöhe
Säulenmaterial: Merck Fraktogel TSK SP 650 M Anlage: BioCAD 250, Perseptive Biosystems, Wiesbaden- Nordenstadt
Puffer A 50 mM NaH2P04 pH 3 , 0 Puffer B 1,5 M NaCl in A Gradient 0% B auf 100% B in 2,000 ml
Das Eluat wird in 10 Pools ä 200 ml gesammelt 2.2 Zweite chromatographische Auftrennung
Die Fraktionen werden separat über eine Reverse-Phase-Säule chromatographiert .
Chromatographiebedingungen :
Fluß beim Auftrag: 10 ml/min
Fluß beim Eluieren: 4 ml/min
Detektion: 214 nm
Säule: HPLC-Stahlsäule, 1 cm Durchmesser, 12,5 cm Füllhöhe
Säulenmaterial : Pharmacia Source RPC 15 μm
Anlage: BioCAD, Perseptive Biosystems, Wiesbaden-Nordenstadt
Puffer A 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser Puffer B 80% Acetonitril in A Gradient 0% B auf 100% B in 200 ml
Das Eluat wird in 4ml Fraktionen gesammelt.
Der weitere Verlauf der Charakterisierung entspricht Beispiel 1.

Claims

A n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Erfassung des Status eines Organismus durch Messung von Peptiden aus einer Probe des Organismus, die hoch- und niedrigmolekulare Peptide enthält, als Indikator für den Status des Organismus, wobei
niedrigmolekulare Peptide direkt erfaßt und charakterisiert und
mit einer Referenz in Beziehung gesetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe Gewebe- oder Flüssigkeitsproben aus dem Organismus oder der Organismus selbst oder Kombinationen davon ist .
3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, wobei die niedrigmolekularen Peptide, die zur Messung herangezogen werden, ein Molekulargewicht von höchstens 30 000 Dalton aufweisen.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die niedrigmolekularen Peptide, die zur Messung herangezogen werden, mindestens ein Molekulargewicht, das dem von Dipeptiden entspricht, aufweisen.
5. Verfahren nach Anspruch 3 und/oder 4 , wobei die niedrigmolekularen Peptide, die zur Messung herangezogen werden, ein Molekulargewicht von 100 bis 10 000 Dalton aufweisen.
6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 , wobei die hochmolekularen Peptide vor der Messung der niedrigmolekularen Peptide abgetrennt werden oder meßtechnisch oder auswertetechnisch bei der Erfassung der Probe nicht berücksichtigt werden.
7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Erfassung der niedrigmolekularen Peptide durch Massenspektrometrie erfolgt .
8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die niedrigmolekularen Peptide durch die Messung ihres Molekulargewichtes charakterisiert werden.
9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Probe vor der Messung der niedrigmolekularen Peptide in verschiedene Fraktionen aufgeteilt wird und unter unterschiedlichen Bedingungen gemessen wird.
10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei als Organismus Prokaryonten, Eukaryonten, vielzellige Organismen, Zellen aus Gewebekulturen, Zellen aus Tieren und Menschen dienen.
11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Probe aus genetisch veränderten oder transformierten und/oder konditionierten Organismen stammt.
12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Erfassung des Status des Organismus zur hypothesefreien Untersuchung und Aufnahme des Status des Gesamtorganismus, zur Aufdeckung eventueller Abweichungen von einem Referenzzustand, dient.
13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Erfassung des Status eines transformierten Organismus zur hypothesef eien Untersuchung und Aufnahme des Status des Gesamtorganismus zur Aufdeckung von Veränderungen des transformierten Organismus dient, zur Aufdeckung von mit der Transformation verbundenem Auftreten von Peptiden, die kausal mit Stoffwechselveränderungen zusammenhängen.
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