WO1998003630A1 - Cepa de levadura de panaderia cect10868 y cepa de panaderia cect10869, su metodo de obtencion por tecnicas de adn recombinante y su aplicacion como levaduras de panaderia - Google Patents

Cepa de levadura de panaderia cect10868 y cepa de panaderia cect10869, su metodo de obtencion por tecnicas de adn recombinante y su aplicacion como levaduras de panaderia Download PDF

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José Antonio PÉREZ GONZÁLEZ
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Definitions

  • Yeast strains belonging to various genera such as Saccharomyces cerevisiae, are used in different industrial processes in which there is partial or total degradation of different types of hemicelluloses and starches (making bread, wine, beer, etc.).
  • Saccharomyces cerevisiae are used in different industrial processes in which there is partial or total degradation of different types of hemicelluloses and starches (making bread, wine, beer, etc.).
  • these yeasts are unable to synthesize enzymes that degrade icellulose and / or starch, the usual practice is the exogenous addition of these compounds as food additives.
  • baker's yeast strains are expressed that express Aspergillus nidulans X24 endoxylanase enzyme and baker's yeast strains that jointly express the above enzyme and also, the Aspergillus oryzae ⁇ -amylase enzyme.
  • This strategy a normalization is achieved in the quantity of the enzymes produced, avoids the contribution of unnecessary components and reduces the Occupational Health problems posed by the use of enzymatic preparations in powder form.
  • the present invention consists in obtaining an industrial strain of baker's yeast capable of expressing and exporting the Aspergillus nidulans X24 endoxylanase enzyme to the outside of the cell and obtaining an industrial bakery strain capable of expressing and exporting to the outside cell, together , the Aspergill us nidulans X24 endoxylanase enzyme and the Aspergillus oryzae ⁇ -amylase enzyme, in order to increase the degradation process of the hemicelluloses and starch present in the flour and, consequently, improve the volume, texture and half-life of the Bread
  • the genes corresponding to these enzymes have been introduced into yeast and their expression has been regulated by a typical yeast promoter, such as that of the actin gene (pACTl), which is also functional in the industrial conditions of Molasses growth.
  • the cDNA corresponding to Aspergill us nidulans X24 endoxylanase was obtained as described in Pérez-González et al. [(1996), Applied Enviromental Microbiology 62: (in press, vol. June)].
  • This cDNA was placed under the control of the pACTl promoter in an episomal plasmid that carried the TRP1 gene as a selection marker (YEpACT-X2).
  • the construction of the YEpACT-AMY plasmid containing the cDNA corresponding to the Aspergill us oryzae ⁇ -amylase enzyme, under the control of the pACTl promoter, has already been described previously [Randez-Gil, F.
  • Figure 1 describes the construction of plasmid YEpACT-X24. Plasmids are represented schematically and not to scale.
  • Figure 2 describes the construction of plasmid YEpACT-AMY-ACT-X24.
  • Figure 3 shows the production of the enzymes endoxylanase X24 and ⁇ -amylase by different transformants when grown in molasses media.
  • Figure 4 shows the firmness curves of breads made with different yeasts over 5 days of storage at room temperature and at 4 ° C.
  • This cDNA was obtained by the polymerase chain reaction (PCR) technique from Aspergill us nidulans RNAs grown under induction conditions (oat xylan as sole carbon source), using synthetic oligonucleotides specially designed for this purpose. These oligos were: oligo 1 5 'CCTCTAGACGTCAACAACCGGCAACATGG3' (Xbal site) oligo 2 5 'CGGTCGACTGCAGAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3' (Pstly Hmdlll sites)
  • the cDNA was subcloned into the YEpACT plasmid (TRP1), which contains the pACTl actma promoter and the TRP1 gene as a selection marker, resulting in the YEpACT-X24 plasmid, in which the expression of the endoxylanase X24 is controlled by the promoter pACTl ( Figure 1).
  • TRP1 YEpACT plasmid
  • Plasmid YEpACT-AMY-ACT-X24 was constructed ( Figure 2).
  • plasmid YEpACTX24 was digested with restriction enzymes EcoRI and Pstl.
  • the resulting fragment, which contained the construct (pACTl-X24) was subcloned into the plasmid pBlue-Script previously digested with the same enzymes, resulting in plasmid pBS-ACT-X24.
  • This plasmid was then digested with the enzyme Hmdlll, releasing a fragment similar to the previous one but flanked by Hindlll cohesive ends.
  • the YEpACT-AMY plasmid was digested with the enzyme Hmdlll and was used to house the fragment (pACT-X24) described in the previous paragraph. Of the two possible orientations, the (pACT-AMY-pACT-X24) was selected, as it was the most efficient as far as the production of the two enzymes is concerned. Plasmid The result was called YEpACT-AMY-ACT-X2.
  • the transformants obtained were grown in industrial culture medium based on beet molasses, following the increase in biomass (absorbance at 600 n) and the appearance of endoxylanase and ⁇ -amylase activities in the culture medium.
  • the production of these two enzymes by the transformants tested [YEpACT-X2], [YEpACT-AMY] and [YEpACT-AMY-ACT-X24] is shown in Figure 3.
  • the determination of xylanic activity was carried out by measuring the release of reducing sugars resulting from the action of the enzyme on oats xylan. Reducing sugars were determined by the dinitrosalicylic (DNS) method [Bailey et al.
  • DNS dinitrosalicylic
  • One unit is defined as the amount of enzyme that is capable of releasing 1 ⁇ mol of reducing sugars per minute at 50 ° C under the test conditions.
  • the determination of amylastic activity was carried out using the ceralpha method, which uses pnitrofemlmal-toheptaoside as a substrate. [Sheenan, H. and McCleary, BV (1988), Biotechnology Techniques 2: 289-292];
  • a ceralpha unit is defined as the amount of enzyme that is capable of releasing 1 ⁇ mol of p-nitrophenol per minute at 42 ° C, under the conditions of the assay.
  • the [YEpACT-AMY-ACT-X24] transformant was able to secrete amounts of ⁇ -amylase similar to those of the [YEpACT-AMY] transformant, but the X24 endoxylase levels were lower than those of the [YEpACT-X24] transformant ( Figure 3) .
  • the breads obtained were stored at room temperature or at 4 ° C, and on different days, the texture was measured in slices of 2 cm thick, using an Instron 1140 press (Instron Food
  • Figure 4 shows the evolution of the texture observed for breads made with a commercial control yeast, and the transformants [YEpACT-X24], [YEpACTAMY] and [YEpACT-AMY-ACT-X24] respectively.

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Abstract

La presente invención consiste en la obtención de una cepa industrial de levadura de panadería capaz de expresar y exportar al exterior celular la enzima endoxilanasa X24 de Aspergillus nidulans y en la obtención de una cepa industrial de panadería capaz de expresar y exportar al exterior celular, conjuntamente, la enzima endoxilanasa X24 de Aspergillus nidulans y la enzima α-amilasa de Aspergillus oryzae, con el fin de aumentar el proceso de degradación de las hemicelulosas y almidón presentes en la harina y, consecuentemente, mejorar el volumen, textura y vida media del pan elaborado. Para ello se han introducido en la levadura los genes correspondientes a estas enzimas y su expresión se ha regulado por un promotor típico de levadura, como es el del gen de la actina pACT1, que es además, funcional en las condiciones industriales de crecimiento en melazas. Su aplicación en técnicas de ingeniería genética y levadura de panadería.

Description

CEPA DE LEVADURA DÉ Panadería CECT10868 Y CEPA DE PANADERÍA CECT10869. SU MÉTODO DE OBTENCIÓN POR TÉCNICAS DE ADN RECOMBINANTE Y SU APLICACIÓN COMO LEVADURAS DE Panadería
Campo de la Técnica:
Técnicas de ingeniería genética (C12 N15) . Levadura de panadería.
Indicación del estado de la Técnica:
La utilización de enzimas implicadas en la biodegradacion de hemicelulosas y de almidón es una de las áreas de mayor interés industrial. Cepas de levadura pertenecientes a diversos géneros, como por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, son utilizadas en diferentes procesos industriales en los que existe una degradación parcial o total de diferentes tipos de hemicelulosas y almidones (elaboración de pan, vino, cerveza, etc.). Sm embargo, debido a que estas levaduras son incapaces de sintetizar enzimas que degraden he icelulosas y/o almidón, la practica usual consiste en la adición exogena de estos compuestos como aditivos alimentarios .
Asi por ejemplo, la insuficiente actividad xilanasica y amilasica de la harina es contrarrestada en la practica panadera, hasta el momento, mediante la adición de preparados xilanol ticos y/o a iloliticos parcialmente purificados [Pyler, E.J. (1988), en: Baking, Science and Technology, vol 1, pp.132-183, Sosland
Publishmg Co., Merπem, Kansas; Pπtchard, P.E. (1992), Journal Biological Education 26: 12-18; van Dam, H.W. y Hille, J.D.R.
(1992), Cereals Food World 37:245-252; Kulp, K. (1993), en:
Advances m Baking Technology, VCH Publishers Inc. New York] .
Recientemente se ha caracterizado el sistema xilanolitico de Aspergill us mdulans [Fernandez-Espinar, T. y col. (1992), FEMS
Microbiology Letters 91:91-96; Fernandez-Espinar, T. y col. (1993), FEMS icrobiology Letters 113:223-228; Piñaga, F. y col. (1994), FEMS Microbiology Letters 115:319323; Fernández- Espinar, T. y col. (1994), Applied Microbiology Biotechnology 42:555-562; Fernández-Espinar, T. y col. (1996), Applied Microbiology Biotechnology 45:338-341]. Entre las xilanasas producidas por este hongo, la denominada xilanasa X24 tiene unas propiedades bioquímicas adecuadas para su utilización en el proceso de fermentación panana. Se trata de una endoxilanasa cuyo pH y temperatura óptimas de actuación son compatibles con el citado proceso. El gen que codifica para esta enzima ha sido caracterizado y secuenciado [Pérez- González, J.A. y col. (1996), Applied Environmental Microbiology 62: (en prensa, vol. Junio)].
En la literatura existen ejemplos de la expresión de actividades xilanolíticas en cepas de Saccharomyces cerevisiae, pero en ningún caso se describe la expresión y utilización de la endoxilanasa X24 de Aspergillus mdulans por cepas industriales de levadura.
Recientemente, también se ha descrito la construcción de cepas de levadura de panadería capaces de expresar y exportar al exterior celular la enzima α-amilasa de Aspergill us oryzae [Randez-Gil, F. y col. (1995), Journal Cereal Science 21: 1 85-1 93; Sanz, P. y col. (1 994), Patente Española n°9402330, PCT/ES95/00102] .
En la presente invención se obtienen cepas de levadura de panadería que expresan la enzima endoxilanasa X24 de Aspergillus nidulans y cepas de levadura de panadería que expresan conjuntamente la anterior enzima y además, la enzima α-amilasa de Aspergillus oryzae. Con esta estrategia se consigue una normalización en la cantidad de las enzimas producidas, evita el aporte de componentes innecesarios y se reducen los problemas de Salud Laboral que plantea el uso de los preparados enzimáticos en forma de polvo. Breve descripción de la invención:
La presente invención consiste en la obtención de una cepa industrial de levadura de panadería capaz de expresar y exportar al exterior celular la enzima endoxilanasa X24 de Aspergillus nidulans y en la obtención de una cepa industrial de panadería capaz de expresar y exportar al exterior celular, conjuntamente, la enzima endoxilanasa X24 de Aspergill us nidulans y la enzima α-amilasa de Aspergillus oryzae, con el fin de aumentar el proceso de degradación de las hemicelulosas y almidón presentes en la harina y, consecuentemente, mejorar el volumen, textura y vida media del pan elaborado. Para ello se han introducido en la levadura los genes correspondientes a estas enzimas y su expresión se ha regulado por un promotor típico de levadura, como es el del gen de la actina (pACTl ) , que es, además, funcional en las condiciones industriales de crecimiento en melazas.
Descripción detallada de la invención:
El cDNA correspondiente a la endoxilanasa X24 de Aspergill us nidulans se obtuvo como se describe en Pérez-González y col. [(1996), Applied Enviromental Microbiology 62: (en prensa, vol. Junio) ] . Este cDNA se puso bajo el control del promotor pACTl en un plásmido episomal que llevaba el gen TRP1 como marcador de selección (YEpACT-X2 ) . La construcción del plásmido YEpACT-AMY que contiene el cDNA correspondiente a la enzima α-amilasa de Aspergill us oryzae, bajo el control del promotor pACTl , ya se ha descrito con anterioridad [Randez-Gil, F. y col. (1995), Journal Cereal Science 21:185-193; Sanz, P. y col. (1994), Patente Española n° 9402330, PCT/ES95/00102] . La construcción (pACTl-X24) se introdujo apropiadamente en el plásmido YEpACT-AMY al lado de la construcción (pACTl-AMY) , obteniéndose el plásmido YEpACT-AMY-ACT-X2 . Los plásmidos YEpACT-X2 y YEpACT-AMY-ACT-X24 se introdujeron en la levadura industrial Saccharomyces cerevisiae 10al2-13x28b4 (trpl ) (CECT 10837), siguiendo el procedimiento del acetato de litio [Ito, H. y col. (1983), Journal Bacteπology 153:163-168], seleccionándose los transformantes por crecimiento en medio mínimo.
Descripción de los Dibujos:
La Figura 1 describe la construcción del plásmido YEpACT-X24. Los plasmidos están representados esquemáticamente y no a escala.
La Figura 2 describe la construcción del plasmido YEpACT-AMY-ACT- X24.
La Figura 3 muestra la producción de las enzimas endoxilanasa X24 y α-amilasa por diferentes transformantes cuando se crecen en medios con melazas.
La Figura 4 muestra las curvas de firmeza de panes elaborados con diferentes levaduras a lo largo de 5 días de almacenamiento a temperatura ambiente y a 4°C.
Un modo de realizar la invención:
1. - Construcción del plásmido YEpACT-X24
El cDNA correspondiente a la endoxilanasa X24 de Aspergillus nidulans ha sido caracterizado y secuenciado con anterioridad [Pérez-González, J.A. y col. (1996), Applied Environmental Microbiology 62: (en prensa, vol. Junio)].
Este cDNA se obtuvo por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de RNAs de Aspergill us nidulans crecido en condiciones de inducción (xilano de avena como única fuente de carbono) , utilizando oligonucleótidos sintéticos especialmente diseñados para este fin. Estos oligos fueron: oligo 1 5 ' CCTCTAGACGTCAACAACCGGCAACATGG3 ' (sitio Xbal) oligo 2 5 ' CGGTCGACTGCAGAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT3 ' (sitios Pstly Hmdlll)
El cDNA se subclonó en el plásmido YEpACT (TRP1) , que contiene el promotor de la actma pACTl y el gen TRP1 como marcador de selección, resultando el plásmido YEpACT-X24, en el que la expresión de la endoxilanasa X24 está controlada por el promotor pACTl (Figura 1) .
2.- Construcción del plásmido YEpACT-AMY
La construcción de este plasmido se realizo como se describe en Randez-Gil, F. y col. (1995), Journal Cereal Science 21:185-193.
3.- Construcción del plásmido YEpACT-AMY-ACT-X24
A fin de obtener una expresión conjunta de la endoxilanasa X24 de Aspergill us nidulans y la α-amilasa de Aspergill us oryzae, se construyo el plasmido YEpACT-AMY-ACT-X24 (Figura 2) . Para ello, el plasmido YEpACTX24 se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y Pstl . El fragmento resultante, que contenía la construcción (pACTl-X24) se subclonó en el plásmido pBlue-Script digerido previamente con los mismos enzimas, resultando el plasmido pBS-ACT-X24. Este plasmido se digirió entonces con la enzima Hmdlll , liberándose un fragmento similar al anterior pero flanqueado por extremos cohesivos Hindlll .
El plás ido YEpACT-AMY se digirió con la enzima Hmdlll y se utilizo para albergar el fragmento (pACT-X24) descrito en el párrafo anterior. De las dos orientaciones posibles, se seleccionó la (pACT-AMY-pACT-X24) , pues fue la mas eficiente en cuanto a la producción de las dos enzimas se refiere. El plasmido resultante se denominó YEpACT-AMY-ACT-X2 .
4. - Transformación
La levadura industrial CECT 10837 [Saccharomyces cerevisiae 10al213x28b4 (Randez-Gil, F. y Sanz, P. 1994, Applied Microbiology Biotechnology 42:581-586)] se transformó con los plásmidos YEpACT-X24 y YEpACT-AMYACT-X24, siguiendo el procedimiento del acetato de litio [Ito, H. y col. (1983), Journal Bacteriology 153:163-168], seleccionándose los transformantes por crecimiento en medio mínimo. Los transformantes conteniendo estos plásmidos se encuentran depositados con fecha 30-Mayo-1996 en la Colección Española de Cultivos Tipo con los números CECT10868 y CECT10869 respectivamente.
5.- Producción de endoxilanasa X24 y α-amilasa por los transformantes
Los transformantes obtenidos se crecieron en medio de cultivo industrial a base de melazas de remolacha, siguiéndose el aumento de biomasa (absorbancia a 600 n ) y la aparición de las actividades endoxilanasa y α-amilasa en el medio de cultivo. En la Figura 3 se muestra la producción de estas dos enzimas por parte de los transformantes ensayados [YEpACT-X2 ] , [YEpACT-AMY] y [YEpACT-AMY-ACT-X24] . La determinación de la actividad xilanásica se llevo a cabo midiendo la liberación de azúcares reductores resultantes de la acción de la enzima sobre xilano de avena. Los azúcares reductores se determinaron por el método del dinitrosalicílico (DNS) [Bailey y col. (1992), Journal Biotechnology 23:257-270]; una unidad se define como la cantidad de enzima que es capaz de liberar 1 μmol de azúcares reductores por minuto a 50°C en las condiciones del ensayo. La determinación de la actividad amilásica se llevo a cabo utilizando el método ceralpha, que usa pnitrofemlmal-toheptaosido como sustrato [Sheenan, H. y McCleary, B.V. (1988), Biotechnology Techniques 2:289-292]; una unidad ceralpha se define como la' cantidad de enzima que es capaz de liberar 1 μmol de p-nitrofenol por minuto a 42°C, en las condiciones del ensayo.
El transformante [YEpACT-AMY-ACT-X24] fue capaz de secretar cantidades de α-amilasa similares a las del transformante [YEpACT-AMY] , pero los niveles de endoxilanasa X24 fueron inferiores a los del transformante [YEpACT-X24] (Figura 3) .
6.- Ensayos tecnológicos
Se elaboraron panes por el procedimiento del amasado directo incluyendo un 2% de las correspondientes levaduras. En la Tabla 1 se muestra el volumen y la densidad de los panes obtenidos. Como se observa, el transformante [YEpACT-AMY-ACT- X24] es capaz de producir un pan con un volumen superior (30o) que el obtenido con una levadura comercial control.
Tabla 1:
Volumen y densidad de los panes elaborados por el procedimiento de amasado directo, utilizando diferentes levaduras .
Cepa Volumen (mi) Densidad (g/ml)
Levadura Comercial 290.0 ± 17.3 0.331 ± 0.016
[YEpACT-X24] 307.4 ± 10.1 0.311 ± 0.004 [YEpACT-AMY] 285.0 ± 27.2 0.330 ± 0.013
[YEPACT-AMY-ACT-X2 ] 382.9 + 11.3 0.230 ± 0.010
Los panes obtenidos se almacenaron a temperatura ambiente o a 4°C, y en diferentes días, se midió la textura en rebanadas de 2 cm de grosor, utilizando una prensa Instron 1140 (Instron Food
Testing Machine, USA) . Se registraron los valores de tres rebanadas centrales por muestra y se midió la fuerza requerida para comprimir 3/4 partes de cada pieza. En la Figura 4 se muestra la evolución de la textura observada para los panes elaborados con una levadura comercial control, y los transformantes [YEpACT-X24] , [YEpACTAMY] y [YEpACT-AMY-ACT-X24] respectivamente. Los panes elaborados con el transformante
[YEpACT-AMY-ACT-X2 ] mostraron una menor textura en todos los tiempos ensayados, tanto en panes almacenados a temperatura ambiente como a 4°C.
8/1
TRATADO DE DUDAΓI-ST COBRE EL RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL
D¡.L DEPOSITO DK MICROORGANISMOS Λ LOS FINES DEL
PROCEDIMIENTO EN MATERIA DE PATENTES
FORMULARIO INTERNACIONAL r DESTINATARIO:
-scensio 'i v-rro, ~ι
".érente .
Instituto de
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ΛQío xε. de l^s .-linentos . expedida en virtud de la Regla 10.2 por la
ÜIC.
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AUTORIDAD INTERNACIONAL DE DEPOSITO identificada en la pβglna siguiente
A LA QUE SE EXPIDE LA I DECLARACIÓN SOBRE LA VIABILIDAD.
DEPOSITANTE II. IDENTIFICACIÓN DEL MICROORGANISMO
l | >",mbre '-.scensio Navarro. Gerente. InsNumero de orden atribuido por la
AUTORIDAD INTERNACIONAL DE DEPOSITO: CT 1 i.868 tituto ue Tortii i ca y
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de
• Dirección: ios -i-lι_aentos. .31... -oli- Fecha del depósito o de la transferencia : Tono α Cocía su. 46930 I-J..¿,___ia"Λ 31 άe ..avo 1396
III. DECLARACIÓN DE VIABILIDAD
' La viabilidad del microorganismo identificado en II ha sido controlada i el 4 f'.e Junio U06 2- En esa fecha, el microorganismo
I J i'Ξ tra viable
I . ,3
O ya no era viable
indlqucse la fecha del depósito inicial o, si se ha efectuado un nuevo depósito o una transferencia, la más reciente de las fechas pertinentes (fecha del nuevo depósito o fecha de la transferencia) .
En los casos previstos en la Regla 10.2.a)ii) y iii), menciónese el control de viabilidad mis reciente.
M rqúese el recuadro correspondiente.
Formulario BP/9 (primera página) PCIZES97
WO 98/03630
8/2
TRATADO DE BUDAPEST SOBRE EL RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL
DEL DEPOSITO DE MICROORGANISMOS A LOS FINES DEL
PROCEDIMIENTO EN MATERIA DE PATENTES
FORMULARIO INTERNACIONAL
ID DEESS1TINATARIO: ~1 r. _). .Scens o Navarro
_ ^.. . . . RECIBO EN CASO DE DEPOSITO INICIAL
¿érente. Instituto αe .- ro-uiπicφx edido en virtud de la Regla 7.1 por la 7 Tecnolojri άe los .diaen- AUTORIDAD INTERNACIONAL DE DEPOSITO identificada en la parte inferior de esta página tos. -'oií.∑ζono La 3oπια sn.
48980 .-T-IL (Valencia)
NOMBRE Y DIRECCIÓN DEL DEPOSITANTE
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En caso de aplicación de la Regla 6.4d), ésta será la fecha en la αue haya
- 1 * , 4... 8/3
TRATADO DE BUDAPEST COBRE EL RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL Dl.L DEPOSITO DK MICROORGANISMOS A LOS TINES DEL PROCEDIMIENTO EN MATERIA DE PATENTES
FORMULARIO INTERNACIONAL
I r DwE<STINATARIO: 1
..scensi o liαvαrro . jereate
Dor la
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¿ndiqucse la fecha del depósito inicial o, si se ha efectuado un nuevo depósito o una transferencia, la más reciente de las fechas pertinentes (fecha del nuevo depósito o fecha de la transferencia) .
En los casos previstos en la Regla 10.2.a) li) y iii) , menciónese el control de viabilidad tΛ* reciente.
M rqúese el recuadro correspondiente .
Formulario BP/9 (primera página) 8/4
TRATADO DE BUDAPEST SOBRE EL RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL
DEL DEPOSITO DE MICROORGANISMOS A LOS FINES DEL
PROCEDIMIENTO EN MATERIA DE PATENTES
FORMULARIO INTERNACIONAL
¡DESTINATARIO: j
.iscensio .-íavαrro. ύe rente.
Instituto άe fl.rrocui.--i ca y Tecnoloβ-BTIBO EN CASO DE DEPOSITO INICIAL i- i _.,. ,!)„-„.„- ",-r-τr "'„!<_ expedido en virtud de la Regla 7.1 por la de los Λliπ_en«0_ . U-JIU, -OH AUTORIDAD INTERNACIONAL DE DEPOSITO
<?ono La Coma sn. 43930 ..-T-Hi-,-.- identificada en la parte inferior de esta página
(Valencia) .
NOMBRE Y DIRECCIÓN DEL DEPOSITANTE
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Claims

9 Reivindicaciones
1.- Levaduras de panadería, caracterizadas por su número de identificación, Saccharomyces cerevisiae 10al2-13x28b4 [YEpACT-X24] y [YEpACT-AMYACT-X24 ] y sus números de orden CECT10868 y CECT10869 respectivamente, atribuidos por la Autoridad Internacional de Depósitos, Colección Española de Cultivos Tipo.
2.- Método de obtención de las levaduras de panadería identificadas según la reivindicación 1, caracterizado por la expresión de la secuencia de cDNA que contenga el gen del hongo Aspergill us nidulans que codifica una actividad endoxilano-litica del tipo X24 y la expresión conjunta de la actividad anterior y la actividad α ( 1-4 ) amilasica del hongo Aspergill us oryzae, en cepas de levadura industrial, preferentemente en la cepa de levadura industrial Saccnaromyces cerevisiae 10al2-13x28b4 (CECT 10837) .
3.- Aplicación en la producción de pan y de productos de panadería de las levaduras industriales según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque se realiza por el inoculo de cepas CECT10868 y/o CECT10869 recombinantes que expresen la proteina endoxilanasa X24 de Aspergill us nidulans, sola o en combinación con la protema α ( 1-4 ) amilasa de Aspergill us oryzae, o por el inoculo de otras cepas recombinantes que expresen enzimas capaces de degradar hemicelulosas y/o almidón, preferentemente endoxilanasas y αamilasas, de forma que contribuyan a mejorar ei volumen, la textura y el tiempo de vida media del pan u otros productos de panadería.
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