CN104611305A - 胰蛋白酶抗性提高的黄曲霉毒素解毒酶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对胰蛋白酶抗性提高的黄曲霉毒素解毒酶。本发明通过蛋白质工程技术对野生型黄曲霉毒素解毒酶三维结构外层部位的关键氨基酸残基进行了改造，提供了一种获得对胰蛋白酶抗性提高的ADTZ突变体。本发明所述的作用于黄曲霉毒素的突变体黄曲霉毒素解毒酶(ADTZ^{K213C/K244C/K270S})，对胰蛋白酶的抗性比野生型ADTZ提高2.73倍，其半衰期比野生型酶延长了72分钟，其他酶学性质与野生型酶基本一致。

Description

胰蛋白酶抗性提高的黄曲霉毒素解毒酶

技术领域

本发明涉及黄曲霉毒素解毒酶，特别涉及到对胰蛋白酶抗性提高的黄曲霉毒素解毒酶。

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的剧毒性次生代谢产物，已经确定的黄曲霉毒素分子的结构主要有八种，分别是AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，AFM1，AFM2，AFGM1，AFGM2，其中毒性最强的黄曲霉毒素B1被认为是潜在的对人类危害极为突出的一类强致癌诱变剂，一次大量摄入黄曲霉毒素B1会引起人及动物的急性中毒、甚至死亡；小剂量长期摄入会致畸、致突变和致癌，即使几十ppb的含量仍有极大的毒性；黄曲霉毒素广泛存在于谷物、粮食和饲料原料中，畜禽摄入污染了黄曲霉毒素的饲料会引起动物体重下降或引发疾病，通过食物链间接进入人体的黄曲霉毒素具有极强的致癌作用，严重威胁人类健康。因此，解决黄曲霉毒素对饲料粮食的污染及对动物生产和人类健康的危害有非常重要的意义；

由于黄曲霉毒素的热稳定性好、耐高温，饲料中含有的毒素绝大部分是随着动物对其消化在消化道内分解过程逐步释放出来，化学去毒方法通常不具备在饲料中应用价值；传统的物理吸附方法存在特异性差，应用效果促在争议的问题。生物酶解黄曲霉毒素具有特异性好，分解效果切确等优点。利用黄曲霉毒素解毒酶对AFB1进行降解具有以上优点，黄曲霉毒素解毒酶(Aflatoxin Detoxinfizyme，ADTZ)是一种在体外能够使一族黄曲霉毒素结构双呋喃环中的呋喃双键断裂，将黄曲霉毒素转化成无毒产物的酶。

目前，饲料添加剂用酶的使用都是通过添加在饲料中一起喂食动物，经胃到达肠道，在肠道中发挥酶的作用。在这个过程中，饲用酶会受到动物肠道消化酶不同程度的破坏，而降低了使用效率，因此，提高饲料用酶对消化酶，如胰蛋白酶的耐受性，可以延长其在动物体内消化道的使用寿命，对饲用酶的应用十分有价值。

本发明利用酶促反应理论和蛋白分子之间相互识别的原理，以及计算化学的方法，设计并筛选到了一株黄曲霉毒素解毒酶突变体，所获得的黄曲霉毒素解毒酶突变体对AFBI催化降解功能不受影响，而对胰蛋白酶的耐受提高了，该突变株对胰蛋白酶抗性比野生型提高了2.73倍，命名为ADTZ^{K213C/K244C/K270S}。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种对胰蛋白酶抗性提高的黄曲霉毒素解毒酶。

本发明是对黄曲霉毒素解毒酶的基因(称为ADTZ基因)进行定点突变。由假密环菌(Armillariellatabescens)AS165中获得的黄曲霉毒素解毒酶，已经被测序，GENBANK登录号为AY941095。该酶的成熟蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.1。

根据本发明所述的一种定点突变改造的黄曲霉毒素解毒酶，是由氨基酸序列为SEQ ID NO.1的来源于假密环菌(Armillariellatabescens)的黄曲霉毒素解毒酶中制造多个氨基酸取代而产生的，对胰蛋白酶抗性提高的黄曲霉毒素解毒酶，所述的氨基酸取代是第213、244和270位的取代。

根据本发明所述的定点突变改造的黄曲霉毒素解毒酶的进一步特征，所述在第213位的氨基酸取代是用半胱氨酸取代赖氨酸；在244位的氨基酸取代是用半胱氨酸取代赖氨酸；在第270位的氨基酸取代是用丝氨酸取代赖氨酸；所述的定点突变改造的黄曲霉毒素解毒酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明所述的作用于黄曲霉毒素的突变体黄曲霉毒素解毒酶(ADTZ^{K213C/K244C/K270S})，经人工肠液(pH6.0，1mg/mL胰蛋白酶溶液)处理10min后，其对胰蛋白酶的抗性比野生型ADTZ提高2.73倍，经人工肠液(pH6.0，1mg/mL胰蛋白酶溶液)处理180min后，其半衰期比野生型酶延长了72分钟，其他酶学性质与野生型酶基本一致。

进一步地，本发明提供了一种DNA分子，其编码本发明所述的对胰蛋白酶抗性提高的黄曲霉毒素解毒酶。

优选地，本发明所述的DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

本发明的另一个目的是提供一种载体，其含有本发明所述的DNA分子。

本发明的又一个目的是提供一种宿主细胞，其含有本发明所述的DNA分子，或者含有本发明所述的载体。

上述载体和宿主细胞都可以通过本领域公知的技术手段进行制备。

本发明还提供了本发明所述的对胰蛋白酶抗性提高的黄曲霉毒素解毒酶的生产方法，包括：在适于黄曲霉毒素解毒酶表达的条件下培养本发明所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的黄曲霉毒素解毒酶。

当本发明所述的DNA分子以合适的取向和正确的阅读框插入到所述的载体，或者转入所述的宿主细胞中，所述的DNA分子可以在任何真核或者原核表达系统中表达。许多宿主-载体系统都可以用来表达蛋白质编码序列。宿主-载体系统包括但不限于：用噬菌体、质粒或粘粒转化的细菌；含有酵母载体的微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳动物细胞系统；用病毒感染的昆虫细胞系统；用细菌感染的植物细胞系统。本发明优选的载体包括病毒载体、质粒、粘粒或者寡核苷酸。

本发明优选的宿主为真核系统如毕赤酵母；本发明优选的蛋白质表达方法为毕赤酵母甲醇诱导分泌表达。

附图说明

图1显示本发明所述的突变体与野生型ADTZ蛋白在胰蛋白酶处理前和处理后的酶比活力。

图2是本发明所述的突变体的酶活测定标准曲线。

图3是本发明所述的突变体的蛋白定量标准曲线。

图4是SDS-PAGE蛋白电泳图，图4中，“→”处为目的蛋白条带，大小为77Kd左右；“空载”为不含目的基因的野生型毕赤酵母SMD1168对照样品；“wtADTZ”为野生型黄曲霉毒素解毒酶蛋白；mADTZ为突变体mADTZ^{K213C/K244C/K270S}蛋白。

具体实施方式

本文中所采用的术语，除非另有说明，均为本领域技术人员所通常理解的含义。以下提供在本发明中使用的一些特殊术语的定义。

“wtADTZ”表示野生型黄曲霉毒素解毒酶，其基因以斜体wtADTZ表示。

“mADTZ^{K213C/K244C/K270S}”表示突变体黄曲霉毒素解毒酶mADTZ^{K213C/K244C/K270S}，其基因以mADTZ^{K213C/K244C/K270S}表示。

实施例1：黄曲霉毒素解毒酶基因的PCR扩增和测序

1、本发明以假蜜环菌来源的的黄曲霉毒素解毒酶基因(AY941095.1)序列作为参考，采用软件Primer 5设计并合成两条寡核苷酸引物，碱裂解法提取DH-5α中的PSA质粒，通过PCR法扩增ADTZ目的基因。

两条PCR引物如下：

正向引物：

5’GTTTCTTCGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAATGGCCACCACAACTGTCC 3’；

反向引物：

5’GTTTCTTCCTGCAGCGGCGCTACTAGTTCACAATCGTCTCTCAATGAAACT 3’。

下划线部分为接头，其中蓝色碱基分别为EcoRI、XbaI、SpeI、Pest限制性内切酶酶切位点。

PCR反应体系如下：

PCR程序设定：

94℃预变性2min；

94℃，15s；67℃，30s；

68℃，2min 30个循环；

68℃，5min。

PCR扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA回收试剂盒进行胶回收，得到大约2.1kb的片段。

实施例2：黄曲霉毒素解毒酶基因(ADTZ)与克隆载体Tao_x+PgHT+PB的连接

1.将mADTZ目的基因和克隆载体Tao_x+PgHT+PB分别用限制性内切酶EcoRI和SpeI/XbaI于37℃酶切10min，酶切条件如下：

2.酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后分别回收两个目的片段，用T4DNA连接酶连接，连接体系如下：

ADTZ酶切产物	13ul
		克隆载体酶切产物	4ul
T4DNA酶	0.2ul
		10×缓冲液	2ul
ddH2O	0.8ul
		总量	20ul

用连接酶22℃连接3h，连接产物转化DH5a感受态细胞扩增后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，用EcoRI和PestI双酶切后跑电泳结果显示有7.5kb和2.1kb两条带，表明连接成功，通过DNA测序，确定为黄曲霉毒素解毒酶基因。

实施例3：基因片段Pao_x+SS₁与克隆载体M+Tao_x+PgHT+PB连接

1.基因片段Pao_x+SS₁由本研究所保存的克隆载体Pao_x+SS₁+PB中调出，使用EcoRI和SpeI内切酶双酶切并纯化回收获得；

2.克隆载体M+Tao_x+PgHT+PB由实施例2获得，基因片段Pao_x+SS₁与克隆载体M+Tao_x+PgHT+PB的连接方法同实施例2。

实施例4：定点突变

1、经过利用酶促反应理论和蛋白分子之间相互识别的原理，以及计算化学的方法在DS3.0软件平台，我们确定对以下位点的氨基酸进行定点突变：

(1)对于第213位氨基酸的氨基酸突变，设计引物如下：

mADTZ^K213C

正向突变引物：5’CTTAGTTGCCTCTGCTTGTACCAGTCCACCCTC 3’

反向突变引物：5’GAGGGTGGACTGGTACAAGCAGAGGCAACTAAG 3’

(2)对于第244位氨基酸突变，设计引物如下：

mADTZ^K213C/K244C

正向突变引物：5’CGTCATCTCTAACGCAAGTTGTCGCCGCCCTT 3’

反向突变引物：5’AAGGGCGGCGACAACTTGCGTTAGAGATGACG 3’

(3)对于第270位氨基酸突变，设计引物如下：

mADTZ^{K213C/K244C/K270S}

正向突变引物：5’CGAAGGCTATGTCTCGTCGTTCAACTCAGG 3’

反向突变引物：5’CCTGAGTTGAACGACGAGACATAGCCTTCG 3’

其中蓝色碱基分别为突变后的碱基。

PCR程序设定：

94℃预变性2min；

94℃，30s；63℃，30s；68℃，65S 5个循环；

94℃，30s；59℃，30s；68℃，65S 25个循环；

68℃，5min。

PCR反应后连接测序。基因定点突变是采用重叠延伸PCR的方法，依次对三个位点进行突变，最终得到的DNA序列可表达为本发明所述的对胰蛋白酶抗性提高的黄曲霉毒素解毒酶。

实施例5：野生型ADTZ与突变体mADTZ^{K213C/K244C/K270S}基因分别整合毕赤酵母基因组及重组蛋白的甲醇诱导分泌表达

1.为了提高单考贝表达盒在毕赤酵母染色体上的整合效率，用限制性内切酶XbaI和SpeI将表达盒Pao_x+SS₁+M+Tao_x+PgHT从Pao_x+SS₁+M+Tao_x+PgHT+PB上切下来并用试剂盒纯化回收。本实验的受体菌为毕赤酵母SMD1168，电转化后使用MD平板进行初步筛选，然后挑取MD平板上的单克隆于2mL的YPG液体培养基中培养14～16h后抽取毕赤酵母基因组进行PCR验证和进一步筛选阳性克隆重组子。

2.阳性克隆重组子的甲醇诱导分泌表达

(1)挑取阳性克隆重组子，接种至25ml BMGY中(250ml摇瓶)28度、250rpm摇至OD600＝2-6；

(2)室温1500g离心5min，收集细胞，去除上清，用BMMY重悬细胞至OD600＝1.0，进行诱导表达；

(3)1L摇瓶中加入上述培养物，加盖两层灭菌纱布，放入摇床继续生长；

(4)每24小时加甲醇至终浓度为0.5％以继续诱导。检查培养基的量，确保正确加入甲醇，因为蒸发作用会减少培养基的体积；

(5)在下列的各个时间点，取1ml培养基至1.5ml离心管。这些样品用于分析表达水平及确定诱导后收集细胞的最佳时间。室温用水平离心机最大转速离心2-3min。时间点：48(2天)，60，72(3天)，84，96(4天)；

(6)将上清转移至单独管中，将上清存于-80度直至开始检测。

实施例6：野生型ADTZ及突变体mADTZ^{K213C/K244C/K270S}重组蛋白的SDS-PAGE电泳检测

(1)配置10mL 15％的分离胶，混匀后用移液枪往玻板中灌胶，直到离短玻板顶部2～3厘米处停止，然后用蒸馏水封住胶面，可轻轻抬起制胶器一端然后放下使胶面平整，聚合40min后到弃蒸馏水，用滤纸吸去多余水分；

(2)配置4mL 5％的浓缩胶，均匀的灌在分离胶之上，插入相应规格的柱子同时应避免产生气泡，聚合30min待胶凝固；

(3)装好电泳槽，将槽内灌电泳液，体积宜大于电泳槽体积的一半，把制好的胶移入电泳槽中，小心拔去样品梳子；

(4)依次点样，点样量不宜过多，15uL每孔为合适；

(5)电泳开始时先设置120V跑胶，指示剂至浓缩胶部分将电压改为180V继续电泳，目的条带跑到中间位置时可停止电泳(目的条带对应于Maker的相应条带，事先可获知)；

(6)小心剥下凝胶，考马斯亮蓝R-250染色30min后，脱色液脱色至背景较浅蛋白条带清晰即可；

(7)凝胶成像并观察结果。

SDS-PAGE蛋白电泳结果如图4所示。

实施例7：野生型ADTZ及突变体mADTZ^{K213C/K244C/K270S}重组蛋白的胰蛋白酶抗性检测

1.将野生型ADTZ及突变体mADTZ^{K213C/K244C/K270S}重组蛋白分别用人工模拟肠液消化10min后(野生型ADTZ蛋白与突变体mADTZ^{K213C/K244C/K270S}蛋白的添加量相同，人工模拟肠液和反应酶液蛋白含量按照质量比为2：3.41的比例在37℃温浴10min)，分别测定人工模拟肠液处理前后野生型ADTZ及突变体mADTZ^{K213C/K244C/K270S}重组蛋白的酶活，计算其残余酶活力。实验共进行3批次的培养，每批每个样品设2个平行进行测量，残余酶活力取6个测量数据的平均值。

2.酶活力测定：

酶活力采用UItiMate3000高效液相色谱仪进行测定，利用FLD荧光分别监测反应体系中AFBI分子被黄曲霉毒素解毒酶降解前后的含量，激发波长为365nm，发射波长为425nm。

表1：样品处理方法

酶活力单位的定义：一个单位(U)定义为在30℃，pH为6.0的条件下，每分钟降解1pmol AFB1所需要的酶量。(m)ADTZ酶活力按下列式计算：

$X_D=\frac{[C_0-C]\×A\×{10}^3\×1000\×100}{T\×\mathrm{m\×M}}$

式中：

X_D——试样稀释液的ADTZ酶活力，单位：U/mg；

C₀——试样对照组的AFBI浓度，单位：ng/ml；

C——试样反应组的AFBI浓度，单位：ng/ml；

A——反应体系的体积；

10³——转换因子，1mg＝10³ug；

1000——转换因子，1nmol＝1000pmol；

T——反应时间，为30min；

100——转换因子，1ml＝1000μl。

m——样品蛋白含量，单位：ug；

M——黄曲霉毒素B1的摩尔质量，M＝312.3g/mol。

测量结果如图1所示。

酶活测定结果显示，野生型ADTZ蛋白胰蛋白酶处理前相对酶活为3882.70U/mg，胰蛋白酶处理后剩余酶活为566.98U/mg；突变体mADTZ^{K213C/K244C/K270S}蛋白胰蛋白酶处理前相对酶活为3481.88U/mg，胰蛋白酶处理后剩余酶活为1427.57U/mg。突变体mADTZ^{K213C/K244C/K270S}蛋白的胰蛋白酶抗性是野生型蛋白的2.73倍。

酶活测定标准曲线如图2所示，分别准确配制AFBI标准系列溶液，浓度分别为25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml和200ng/ml。

样品蛋白定量标准曲线如图3所示，样品蛋白均稀释5倍后进行定量，吸光度值均在标准曲线范围之内。

Claims (7)

1.一种对胰蛋白酶抗性提高的黄曲霉毒素解毒酶，其特征在于：它是由氨基酸序列为SEQ ID NO.1的来源于假密环菌(Armillariellatabescens)的黄曲霉毒素解毒酶中制造多个氨基酸取代而产生的、对胰蛋白酶抗性更强的解毒酶，所述的氨基酸取代是第213、244和270位的取代。

2.根据权利要求1所述的对胰蛋白酶抗性提高的黄曲霉毒素解毒酶，其特征在于：所述在第213位的氨基酸取代是用半胱氨酸取代赖氨酸；在244位的氨基酸取代是用半胱氨酸取代赖氨酸；在第270位的氨基酸取代是用丝氨酸取代赖氨酸；所述的定点突变改造的黄曲霉毒素解毒酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.一种DNA分子，其特征在于：其编码权利要求2所述的对胰蛋白酶抗性提高的黄曲霉毒素解毒酶。

4.根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

5.一种载体，其特征在于：其含有权利要求3或4所述的DNA分子。

6.一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求3或4所述的DNA分子，或者含有权利要求5所述的载体。

7.一种根据权利要求1所述的对胰蛋白酶抗性提高的黄曲霉毒素解毒酶的生产方法，其特征在于，所述方法包括：在适于黄曲霉毒素解毒酶表达的条件下培养权利要求6所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的黄曲霉毒解毒化酶。