WO1997048730A1

WO1997048730A1 - Procedes de traitement de cellulose bacterienne

Info

Publication number: WO1997048730A1
Application number: PCT/JP1997/001949
Authority: WO
Inventors: Kunihiko Watanabe; Akira Shibata; Hiroshi Ougiya; Nobuya Hioki; Yasushi Morinaga
Original assignee: Bio-Polymer Research Co., Ltd.
Priority date: 1996-06-21
Filing date: 1997-06-09
Publication date: 1997-12-24
Also published as: EP0846703A4; KR19990037728A; US6153413A; EP0846703A1

Description

明細書バクテリァセルロースの処理方法技術分野

本発明は、セルロース生産菌を培養することによって製造し得るセルロース性物質（以'下、「バクテリアセルロース」又は「B C」という。 ) の処理方法、及びその結果得られるバクテリアセルロースに係わるものである。

更に本発明は、こうして得られるバクテリァセルロースの離解物から成る塡料歩留り剤、及び該離解物を含む高強度シー卜に係わる。背景技術

B C (バクテリアセルロース）は可食性であり無味無臭であるため、食品分野で利用されるほか、水系分散性に優れているので食品、化粧品又は塗料等の粘度の保持、食品原料生地の強化、水分の保持、食品安定性向上、低力□リー添加物又は乳化安定化助剤としての産業上利用価値がある。

B Cは木材パルプ等から製造されるセルロースに較べ、フィブリル（又は微細織維）の断面幅が 2ケタ程度も小さいことを特徴とする。

従って、 B Cの離解物はフイブリルのかかる構造的物理的特徴に基づき高分子、特に水系高分子用補強剤として各種の産業用用途がある。このようなセルロース性離解物を紙状または固型状に固化した物質は高い引張弾性率を示すのでフィプリルの構造的特徴に基づくすぐれた機械特性が期待され、各種産業用素材としての応用がある。

しかしながら、かかる B Cの離解物等を水性懸濁液又は分散液の状態のままで扱う際には、セルロース成分に対して数倍〜数百倍の重量で存在する水等の溶媒のために、保存スペースの増大、保存及び輸送コストの増大、保存中の微生物による分解等、種々の問題点がある。

又、バクテリアセルロースを乾燥させると、それに特有の種々の特徴的な物性が失われることが判っている。これは、主に以下のような理由による。即ち、バクテリアセルロースのフィブリルは非常に細いので、それだけ体積当たりの表面積が大きい。したがって乾燥した時に、水分が蒸発すると、フイブリル間で水素結合に由来する強固な相互の膠着が起こる。一旦このような膠着が起こると、再び水を加えてもフィブリル間の水素結合が水分子によって断ち切られにくい。そのために、一旦乾燥したバクテリァセルロースを再び水に懸濁したもとの離解物の状態に復元するのは非常に困難であるからである。

そこで、このような課題を解決するために、すでに、バクテリアセル

□一スの水懸濁液を凍結乾燥や溶剤置換乾燥することによって、乾燥時にフィプリル間に水素結合に由来する結合を生じせしめない方法が知られている。しかし、周知の通り、凍結乾燥や溶剤置換乾燥は、膨大なェネルギーゃ複雑な工程が必要となる。

そこで、このような欠点を解決する方法として、本発明者等によって、既に、バクテリアセルロースを含有する水性懸濁液にバクテリアセルロースと水以外の第 3成分を加えた後に脱水乾燥することを特徴とする、バクテリアセルロースの乾燥方法が提案されている（特願平 7 — 3 2 9 4 7 2 ) 。該方法によって、乾燥状態（水分含置 2 5重置％以下）のものを水に再懸濁させたときに、 B Cの溶解性、分散性、沈降度及び粘度等の諸特性が復元することが可能になった。

本発明者等は、上記課題を解決する為の新たな処理方法を更に検討した結果、擾拌培養によって得られた B Cを乾燥する際に、上記のような第 3成分を添加しなくとも、 B Cを張力下で脱水乾燥し、得られた B C を離解することによって、前述した B Cの諸特性が復元することを見出し、本発明を完成させた。発明の開示

即ち、本発明は、擾拌培養で製造されたバクテリアセルロースを緊張下で脱水乾燥して得られた B Cを離解処理することを特徴とする、 B C の処理方法に係わる。

本発明処理方法において、緊張下で B Cを脱水乾燥させるとは、脱水乾燥の操作中、 B Cに張力が働いた状態を意味する。周知のように、 B Cを含む天然セルロースは、結晶部分と非結晶部分からなる。この内の結晶部分同士は非結晶部分を介して結合している。乾燥することによりセルロースが収縮する。この収縮に伴って、張力がはたらいた状態の場合には、この結晶部分と非結晶部分の両方に引張応力がかかる。結晶部分の方が非結晶部分よリも弾性率が高いので、引張応力に対する歪みの程度は非結晶部分の方が大きい。非結晶部分の結合は、セルロース分子間あるいは分子内の水素結合であるから、歪みの程度が大きいということは水素結合間の距離が大きいということになる。水素結合間の距離が大きいと水分子が容易に入り込みやすい。したがって、再び水を加えた時に、こうして歪みの大きい B Cの微細繊維間の水素結合は容易に壊れ、脱水乾燥する前にみられた水分子と B Cの間での水素結合が再び形成され易くなるものと考えられる。

乾燥時の緊張は、湿潤状態の B Cのガラス板等の上に張り付けたり、キャストしたりしてから乾燥することによって行わしめることもできるが、ガラス板等に張り付けなくとも、乾燥前の湿潤状態の B Cをシート状の形状を保ったまま乾燥することによつても行わしめることができる。前者のガラス板上での乾燥の場合には、水分は懸濁液の上面から蒸発し、乾燥にともなう収縮は、厚さ方向にのみ選択的におこり、その結果、 B Cに張力が働く。さらに、バクテリアセルロースは、結晶面の内（

1丁 0 ) 面（以下、特に断らないかぎり、結晶面の指数づけを単斜晶セルロース I >3に従って記載する）が乾燥の方向（厚さ方向）に対して、直角に配列するように選択的に面配向する。後者のように張り付けずに乾燥しなくとも、得られる乾燥物の形状がシート状の場合には、水分の蒸発がシートの表面（または裏面）からのみおこるので、結果的にシー卜の厚さ方向にのみに収縮がおこり、ガラス板等に張り付けて乾燥したのと同様に B Cに張力が働く効果が得られる。従って、この場合にも（

1 1 0 ) 面の選択的面配向が起こる。これに対して、バクテリアセル口一スを無緊張下で乾燥した場合には、このような選択的面配向はおこらない。

以上のことから、緊張下で乾燥した B Cの構造は、無緊張下で乾燥した B Cと結晶の選択的面配向の程度の強弱によっても区別されることが判る。先に述べたように、含水 B Cを乾燥するとセルロースの結晶面の内、（ 1丁 0 ) 面が選択的に配向する。すなわち緊張下で乾燥して形成されたシート状あるいはフィルム状の B Cでは、この（ 1 1 0 ) 面の結晶面がシート面に対して、平行に並ぶように配向する程度が大きい。この配向の程度は、 X線回折を反射法で行った場合に得られる回折曲線の中から（ 1 1 0 ) 面と（ 1 1 0 ) 面とに由来するピークの高さをそれぞれ h 1 、 h 2とすると、 h 1 / h 2と定義される面配向度の値が 2以上、好ましくは 3以上であることが望ましい。この面配向度が大きいほど選択的面配向性が高いことを意味し、このことは緊張下で乾燥したことと相関関係がある。

このように、本発明方法によって緊張下に脱水乾燥された B Cは、例えばシート状及びフィルム状等の種々の形態を有するものとなる。脱水乾燥処理は、従来公知の、例えば、風乾、熱風乾燥、及び真空乾燥等によって実施することが出来る。

B Cに張力をかけながら脱水乾燥させるのに使用し得る乾燥装置の例としては、以下のようなものがある。すなわち、連続式のトンネル乾燥装置、バンド乾燥装置、縱型乾燥装置、垂直ターボ乾燥装置、多重段円板乾燥装置、通気乾燥装置、回転乾燥装置、気流乾燥装置、噴霧乾燥装置、円筒乾燥装置、ドラム乾燥装置、スクリューコンベア乾燥装置、加熱管付回転乾燥装置、振動輪送乾燥装置等、回分式の箱型乾燥装罱、通気乾燥装置、真空箱型乾燥装置、及び搜拌乾燥装置等の乾燥装置を単独で又は 2つ以上組み合わせて用いることができる。

特に、 B Cを工業的に緊張下で脱水乾燥するためには、ドラムドライヤーを用いればよい。このドラムドライヤーとは、スチームなどの媒体により加熱されて回転するドラム表面に、液体状のバクテリァセルロースをフィルム状に付着させ、ドラムが一回転する間に蒸発乾燥し、スクレーバーナイフでフィルムの乾燥物をはぎ取るものである。このドラム上の乾燥時に、 B Cは、面配向性が高くなるような条件で乾燥させられるために、緊張下状態で乾燥することになる。

乾燥において被乾燥物に熱エネルギーを供給する方法としては、例えば、直接加熱、放射加熱、間接加熱等が挙げられるが、このうち特に、赤外線加熱、マイク口波加熱などがエネルギー効率の点から望ましい。上記のような装置を用いることで、 B Cを元の湿潤状態に復元可能な状態に乾燥することができる。尚、本明細書中で「乾燥」状態とは、乾燥物に含まれる水が全くない絶乾状態ではない。すなわち、乾燥物に含まれる B C等の固形分の合計重量に対して、約 2 5 %以下の場合をいう。このような状態の時の乾燥物の外観は、ほとんど乾いたものである。

B C等の固形分中には、分子内に水酸基などの極性基をもっために水分を吸着する作用がある場合が多かったり、低分子の場合には結晶水のような形で水を保持する作用があったりするために、上記に述べるような方法、装置で乾燥をおこなって一見乾燥したと思われる乾燥物を得ても、通常の空気中に放 Sすると、空気中の水蒸気を吸着して平衡状態に達する。保存を必要とする場合には、本発明の乾燥物の水分活性値が、微生物の生育できない程度以下である必要がある。高くとも 0 . 9以下、望ましくは 0 . 了 5以下の水分活性の値が要求される。

本発明処理方法にあっては、パクテリァセルロースを脱水乾燥する際に特別の成分を添加する必要はないが、上記特願平 7 - 3 2 9 4 了 2に第 3成分として記載されている、例えば、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、界面活性剤、乳酸、グルコン酸及びデルタグルコノラクトン並びにそれら 1 つ以上の混合物のような親水性液体、又は、例えば、水溶性低分子及び水溶性高分子等の水溶性物質、並びに冰不溶性物質及び水難溶性物質のような親水性固体を含有させることもできる。

これら第 3成分の添加量は、当業者であれば物質の種類等に応じて適宜選択することができ、通常 B Cの重量に対して 2重量％〜 1 , 0 0 0 重量％である。

更に、第 3成分が含まれるパクテリァセルロース水性懸濁液の例として、セルロース生産菌の培養液そのもの又はそれに上記第 3成分が含有されたものを使用することもできる。又、水性分散液中のバクテリアセル ο—スの濃度は濃縮物中の濃度と較べて有意に低いものであリ、当業者が適宜選ぶことができるが、通常 0 . 0 1 重置％〜 3 0重置％である本発明方法では、脱水乾燥して得られた B Cに、更に、離解処理を施すものである。離解処理は、通常 B Cを 0 . 0 1 重量％〜 3 0重 %含む水性懸濁液又は分散液の状態で行なう。

本発明では B Cを脱水乾燥して得られるものの形態は例えば、シート状になるが、これを通常の乾式粉碎機で粉砕することで粉末化してから、雜解処理することも可能である。この操作により、後の離解処理がより容易になる。

パクテリァセルロースの離解現象は、機械的外力等によってセルロース内部に発生した応力が、これを変形 ·破壊することによる現象と考えられる。従って、本発明に於いて、バクテリアセルロースの離解処理は、バクテリアセルロースに機械的外力を与えることにより行なえる。更に酸及び又はアル力リ加水分解、酵素を用いた加水分解及び漂白剤によっても雜解処理を行なうことができる。

ここでいう機械的外力とは、例えば、引っ張り、曲げ、圧縮、ねじり、衝撃及び剪断等の応力が挙げられるが、一般的には圧縮、衝撃及び剪断応力が主体である。

実際にこれら機械的外力をパクテリァセルロースに与える場合は、例えば、ミキサー、ポリトロン又は超音波発振機等を使用することで達成できる。

ミキサーによる雜解処理においては、機械的外力は掇拌羽根とバクテリァセルロースが衝突することによる衝撃力と、媒体の速度差によるズレ現象によって発生する剪断力が主体となる。

ポリトロンによる雜解処理においては、機械的外力はバクテリアセルロースが外歯と内歯に挟まることによる圧縮力、高速に回転する歯とバクテリアセルロースが衝突することによる衝撃力、静止している外歯と高速に回転する内歯の隙間に存在する媒体に発生する剪断応力が主体となる。

超音波粉碎機、例えば、ソノレ一夕と呼ばれている自励式超音波粉砕機による離解においては、機械的外力は超音波発振部の発振により媒体中にキヤビテージョン（空洞現象）が連続的に発生し、局部的に生じる著しい剪断応力が主体となる。

本発明の雜解処理は、バクテリアセルロースに一定の負荷（機械的外力）を与えることができれば、上記具体例以外のいかなる方法でも行ない得る。

その他の離解処理条件は当業者が適宜選択することが出来る。

尚、このような雜解処理は、脱水乾燥する前の B Cに対して行なうこともでき、これによつて、脱水乾燥する際に再配向しやすく、本発明でいう「緊張下での脱水乾燥」が起こりやすい為、 B Cの諸特性の復元を更に向上させることができる。

本発明は又、このような本発明の処理方法によつて得ることのできるバクテリアセルロースの離解物に係わり、更には、該雜解物から成る塡料歩留り剤及び該雜解物を含む高強度シー卜にも係わるものである。尚、本発明の高強度シートを調製する場合には、本発明方法に従ってパクテリァセルロースを緊張下で脱水乾燥した後に行なう離解処理に際して、その離解の程度を適宜調節することによって B Cの諸特性の復元の度合いを抑え、ヤング率が高い高強度性に加えて、抄造時の濾水速度が落ちないようにすることが可能である。

本発明の高強度シートは当業者に周知の方法で調製することができ、本発明に係わるバクテリアセルロース離解物の他に、各種電解質、顔料、有機，無機化合物、サイズ剤、填料歩留り剤、蛍光剤、防カビ剤及び帯電防止剤等の各種公知添加剤を目的等に応じて適宜含有させることができる。尚、本発明で用いる B Cを生産するセルロース生産菌は、例^ば、 B P R 2 0 0 1 株に代表されるァセ卜パクター ' キシリナム ' サブスビーシーズ - シュクロフアーメンタンス (Acetobacter xy I inum subsp. sue rof ermentans) 、ァセ卜バクタ一 ■ キシリナム (Acetobacter xy I inum ) A T C C 2 3 7 6 8、ァセトパクター ' キシリナム A T C C 2 3 7 6 9、ァセトパクター ' パスッリアヌス（A. pasteurianus ) A T C C 1 0 2 4 5、ァセトパクター ' キシリナ厶 A T C C 1 4 8 5 1 、ァセトノ< クタ一 . キシリナム A T C C 1 1 1 4 2及びァセ卜バク夕一 - キシリナ厶 A T C C 1 0 8 2 1 等の齚酸菌（ァセトパクター属）、その他に、ァグロバクテリウム厲、リゾピウム属、サルシナ厲、シユードモナス厲、ァクロモバク夕ー厲、アルカリゲネス属、ァェロバクター属、ァゾトバクター属及びズーグレア厲並びにそれらを N T G (ニトロソグァ二ジン ) 等を用いる公知の方法によって変異処理することにより創製される各種変異株である。

尚、 B P R 2 0 0 1 株は、平成 5年 2月 2 4 日に日本国茨城県つくぱ市東 1 丁目 1 番 3号（郵便番号 3 0 5 ) 所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所待許微生物寄託センターに寄託され（受託番号 F E R P — 1 3 4 6 6 ) 、その後 1 9 9 4年 2月 7 日付で特許手続上の寄託の国際的承認に関するブダぺス卜条約に基づく寄託（受託番号 F E R M B P — 4 5 4 5 ) に移管されている。

N T G等の変異剤を用いての化学的変異処理方法には、例えば、 Bio Factors, Vol. I. p.297- 302 (1988)及び丄 Gen. Microbiol, Vol. 1 35, p.2917- 2929 (1989) 等に記載されているものがある。従って、当業者であればこれら公知の方法に基づき本発明で用いる変異株を得ることができる。また、本発明で用いる変異株は他の変異方法、例えば放射線照射等によっても得ることができる。上述の方法によつて創製されるセルロース生産菌の中でも、通気授拌培養することによって、ポリスチレン換算の重量平均重合度が 1 . 6 X 1 0 ⁴ 以上、好ましくは 1 . 7 X 1 0 ⁴ 以上である高重合度のバクテリァセルロースを製造するか、又は、静 S培養することによって、ポリスチレン換算の重量平均重合度が 2. 0 X 1 0 ⁴ 以上である高重合度のバクテリアセルロースを製造する菌株が好ましい。

本発明で使用し得る高重合度のバクテリアセルロースの生産菌のうち、 B P R 3 0 0 1 Aは、平成 7年 6月 1 2日付で日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号（郵便番号 3 0 5 ) 所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され（受託番号 F E

R M P— 1 4 9 8 2 ) 、その後 1 9 9 6年 2月 2 3日付で特許手続上の寄託の国際的承認に関するブダぺスト条約に基づく寄託（受託番号 F E R M B P - 5 4 2 1 ) に移管されている。

一般的に、高分子材料の強度や弾性率は、高分子の重合度が高いほど、高いものとなることが知られている。バクテリアセルロースの場合にも同様で、高重合度のバクテリァセルロースを原料として得られた各種製品は、相対的に低い重合度のパクテリアセルロースを原料として得られたものと比較して、その強度や弾性率が高い。従って、高強度や弾性率のものを製造したい場合には、先に述べたような高重合度のパクテリァセルロースを用いた方が高い効果が得られる。

本発明における B C等の各種セルロースの重量平均重合度は、検出器として R I を内蔵した G P C システム（Tosoh H L C— 8 0 2 0 ) を用いて以下のようにして測定する。

各種セルロース試料を発煙硝酸—五酸化リン溶液で W.丄 Alexander. R. L. Mitchel I, Analytical chemistry 21. 12, 1497-1500 (1949) の方法によリニト口化する。コントロールとして同時に二トロ化したコットンリン夕一を用いる。セルロース二ト口化物は T H F (和光純薬 1級）に 0. 0 5 %濃度で溶かしたのち、 1 . 0 // mポアサイズのフィルターで濾過する。

G P Cの溶離液にも T H Fを用いる。

流速は 0. 5 mi/min 、圧力は 1 0〜 1 3 kg f/cm² 、サンプル注入量は 1 0 0 I とする。

カラムは T S K g e l GMH— H R (S) ( 7. 5 I D x 3 0 0 mm X 2本）とガードカラム（ H H R ( S) ) (Tosoh Co.. Ltd. ) を用い 3 5 °Cで測定する。

分子童算出のためにス夕ンダードボリスチレン（Tosoh) を用いポリスチレン換算の相対分子置を求める。

2 X 1 0 ¹ から 2 6 3 0の分子置のポリスチレンを用い、溶出時間（ t ) と分子量の対数（ I 0 g M) について、 3次式：（ I o g M = A t ³ + B t ² + C t + D) による近似を行いスタンダード曲線を作製する分子置は Tosoh のデータ処理専用機（S C— 8 0 2 0 ) に内蔵されたプログラム（ _{v e} に 3， 1 0 ) により重量平均分子最を計算する。これらの分子置の値から二トロ化後の置換度を考慮して重量平均重合度を計算する。

本発明方法に於いて、培養に用いる培地の組成物中、炭素源としてはシュクロース、グルコース、フラクトース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、マルトース、エリスリット、グリセリン、エチレングリコール、エタノール等を単独或いは併用して使用することができる。更にはこれらのものを含有する ¾粉水解物、シトラスモラセス、ビートモラセス、ビート搾汁、サトウキビ搾汁、柑橘類を始めとする果汁等をシュクロースに加えて使用することもできる。また、窒素源としては硫酸アンモニゥム、塩化アンモニゥム、リン酸アンモニゥム等のアンモニゥ厶塩、硝酸塩、尿素等有機或いは無機の窒素源を使用することができ、或いは Bacto_Peptone、 Bacto - Soy tor>e、 Yeas t -Ext r act , 豆 isなどの含窒素天然栄養源を使用してもよい。有機微量栄養素としてアミノ酸、ビ夕ミン、脂肪酸、核酸、 2 . 7 , 9 — トリカルボキシー 1 Hピロ □ 〔2 . 3 , 5〕一キノリン一 4 . 5 —ジオン、亜硫酸パルプ廃液、リグニンスルホン酸等を添加してもよい。

生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、要求される栄養素を補添することが必要である。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、コバルト塩、モリブデン酸塩、赤血塩、キレート金属類等が使用される。

更に、イノシトール、フィチン酸、ピロ口キノリンキノン（ P Q Q ) (特公平 5 - 1 7 1 8号公報：高井光男，紙パ技協誌，第 4 2巻. 第 3 号，第 2 3 7〜 2 4 4頁）、カルボン酸又はその塩（特開平 7 — 3 9 3 8 6号公報）、インベルターゼ（特開平 7 - 1 8 4 6 7 7号公報）及びメチ才ニン（特開平 7 — 1 8 4 6 7 5号公報）等のセルロース生成促進因子を適宜培地中に添加することもできる。

例えば、詐酸菌を生産菌として用いる場合には、培蓑の p Hは 3ないし 7に、好ましくは 5付近に制御する。培養温度は 1 0 〜 4 0 °C、好ましくは 2 5〜 3 5での範囲で行う。培養装置に供給する酸素濃度は 1 〜 1 0 0 %、望ましくは 2 1 〜 8 0 %であれば良い。これら培地中の各成分の組成割合及び培地に対する菌体の接種等は培養方法に応じて当業者が適宜選択し得るものである。

更に、本発明者らは、鋭意検討した結果、本発明で用いるバクテリアセルロースば、 a拌培養で生産されたものが適していることを見出した。擾拌培養で生産されたバクテリアセルロース（擾拌 B C ) は、通常の静置培養で生産されたバクテリアセルロース（静置 B C ) と比較すると、結晶化度が小さい、重合度が小さいなど、種々の点で乱れた構造をもつことが知られている。このような乱れた構造は、非結晶部分に相当するものであると考えられる。既に述べたように、非結晶部分の方が張力に対する歪みの程度が大きいので、擾拌 B Cの方が「緊張下での脱水乾燥 J による効果が大きく、 B Cの諸特性がより復元しやすくなるからである。

本発明のバクテリアセルロースは、従来より、微生物を培養する培養形式として公知の通気搜拌培養の方法で製造することができる。培養操作法としては、いわゆる回分発酵法、流加回分発酵法、反復回分発酵法及び連続発酵法等がある。

ここで、攪拌培養とは、培養液を攬拌しながら行なう培養法であり、当該擾拌培養中に受ける授拌作用によって、バクテリアセルロースの構造が、例えば、結晶化指数が低下して非結晶部分が増すように変化する o

擾拌手段としては、例えばインペラ一、エアーリフト発酵槽、発酵ブロスのポンプ駆動循環、及びこれら手段の組合せ等を使用することができる。

更に、本出願人名義の特開平 8 - 3 3 4 9 4号公報に記載された培養装蘆と分離装置の間で菌体を含む培養液を循環させるセルロース性物質の製造方法であって、該分離装置に於いて、生産物であるセルロース性物質を菌体及び培養液から分離することを特徴とする前記方法や、同じく、本出願人名義の特開平 8 - 3 3 4 9 5号公報に記載されたセルロース生産菌を培養してセルロース性物質を製造する方法であって、培養期間中、培養系からの培養液の引き抜き及び該引き抜き量とほぼ等容置の新たな培養液の供給を連続的に行なうことによって、培養中の培養液に於けるセルロース性物質の濃度を低く維持することを特徴とする前記製造方法がある。

前記擾拌培養を行なうための槽としては、例えば、ジャーフアーメンター及びタンク等の擾拌槽、並びにバッフル付きフラスコ、坂ロフラスコ及びエアーリフト型の撮拌槽が使用可能であるがこの限りではない。本発明でいう擾拌培養においては、擾拌と同時に、必要に応じて、通気を行なっても良い。ここでいう通気とは、例えば空気等の酸素を含有するガス、並びに例えばアルゴン及び窒素等の酸素を含有しないガスのいずれを通気しても良く、これらガスは培養系の条件に合わせて当業者により適宜、選択されよう。

例えば、嫌気性の微生物の場合は、不活性ガスを通気をすれば、その気泡によって培養液を擾拌することができる。

好気性の微生物の場合には、酸素を含有するガスを通気することで微生物の成育に必要な酸素を供給すると同時に、培養液を擾拌することができる。

通気擾拌培養等にょリ得たパクテリァセルロースを速心分離法又は濾過法等により培養液から分離する。

本発明の方法によつて製造されるバクテリアセルロースは菌体はそのまま回収してもよく、さらに本物質中に含まれる菌体を含むセルロース性物質以外の不純物を取り除く処理を施すことが出来る。

不純物を取り除くためには、水洗、加圧脱水、希酸洗浄、アルカリ洗浄、次亜塩素酸ソーダ及び過酸化水素などの漂白剤による処理、リゾチームなどの菌体溶解酵素による処理、ラウリル硫酸ソーダ、デ才キシコール酸などの界面活性剤による処理、常温から 2 0 0 °Cの範囲の加熱洗浄などを単独及び併用して行い、セルロース性物質から不純物をほぼ完全に除去することができる。

このようにして得られた本発明でいうセルロース性物質とは、セル口ース及び、セルロースを主鎖としたへテロ多糖を含むもの及び /9一 1 , 3、 ^ - 1 , 2等のグルカンを含むものである。ヘテロ多糖の場合のセルロース以外の構成成分はマンノース、フラクトース、ガラクトース、キシロース、ァラビノース、ラムノース、グルクロン酸等の六炭糖、五炭糖及び有機酸等である。

なおこれ等の多糖が単一物質である場合もあるし 2種以上の多糖が水素結合等により混在してもよい。図面の簡単な説明

第 1図は、乾燥 B C試料に反射法による X線回折を行った結果、得られる X線回折曲線の一例を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明をよリ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。各実施例に於いて、特記のない限り、 B Cの含有置を示す（％) は重量％である。

尚、各実施例に於いて、諸特性値は以下のように測定した。

分散性

懸濁液の分散性については肉眼で、乾燥前の離解物との比較をおこなつた。

懸菜液の速心沈降度

遠心沈降度の測定方法は、バクテリアセルロース（B C ) 濃度 0 . 2 %の懸濁液 1 0 m lを Fa l con製の 1 5 m lのチューブにいれたものを 3 0 0 0回転で 1 5分間速心分離した後に沈降部分の体積の全体に対する比率で表した。沈降度の値が大きいほど沈降しにくく、分散していることになる。また、沈降度復元率として（乾燥後復水後の雜解物の沈降度ノ乾燥前の雜解物の沈降度）の値を用いた。

粘度

本発明での粘度とは、 8 0含量0. 1 %の水性懸溷液を動的液体粘弾性測定法により測定したときの、 3 0 °Cにおける角周波数 1 0 rad/sec での複素粘性率の絶対値（以下、単に粘度という）をいい、以下の式により表される。

複素粘性率の絶対値（P) Ι τ? * I = I G * I /ω

I G * I = (G' ²+ G" ²) ^{, /2}

(ただし、 I G * I ：複素弾性率の絶対値（dyn/cm^z)、 G' ：貯蔵弾性率（dyn/cm²) G" ：損失弾性率（dyn/cm²)、 ω ；平行円板の振動の角周波数（rad/s)を表す。）

より具体的には、動的液体粘度測定装 S (Rheometrics 社製の「FLUI DS SPECTROMETER RFS I I」を使用し、直径 5 cmの平行回転円盤の間に港度 0. 1 %の B C離解物の水性懸溧液を 2 mlはさんで、温度 3 0 °Cに調整後、 Frequency sweep モードにおいてひずみを 1 0 %に設定し、角周波数を 1 〜 1 0 0 rad/s まで 1 0段階で上昇させて円扳を振動させた際の角周波数 1 0 rad/s において測定された粘度である。なお、この場合のひずみは以下の式によつて表される。

ひずみ（％) 7 = R/H X ^ X 1 0 0

(ただし、 R ：平行回転円板の半径 (mm) 、 H ：平行円板間に挟まれた試料の厚み（■) 、 Θ ：平行円板の振動の振幅（rad)を表す。）実施例

バクテリアセルロースの製造及び雜解処理（参考例） ( 1 ) シード菌液の調製（菌体の増殖）

セルロース生産菌をフラスコ培養法によって菌体を増殖させた。

フラクトース 4 0 gZし、リン酸—カリウム 1 . O g /し、硫酸マグネシゥ厶 0. 3 gZ L、硫酸ァンモニゥム 3 g / L, バク卜—ペプトン 5 g L、乳酸 1 . 4mlZ L、初発 p H 5. 0の組成の基本培地 1 0 0 mlを張り込んだ 7 5 0 ml容 R o u xフラスコに、 B P R 2 0 0 1株（F E RM B P— 4 5 4 5 ) の凍結保存菌液 1 mlを植菌し、定温培養器内で 2 8 °Cで 3 日間静置培養を行なった。このシード培養後、前記 R o u Xフラスコをよく振盪した後、無菌条件下で内容物をガーゼ濾過し、シ一ド菌液を得た。

( 2 ) 擾拌培養によるパクテリアセルロースの製造

上記シード菌液 6 0 mlを滅菌済みの後述する擾拌培養用の培地 5 4 0 mlを張り込んだ小型ジャーフアーメンター（全容量 1 0 0 O ml) に無菌的に植菌し、 3 0 °Cで 2 0時間又は 3 0時間、 p Hをアンモニアガス又は 1 N H ₂ S 0 で 5. 0にコント□ールしながら、また、攪拌回転数を初発 4 0 0 rpm で、溶存酸素量（D 0) が 3. 0 - 2 1 . 0 %内に入るように回転数を自動制御しながらジャーファーメンターで攪拌培養を行なった。

擾拌培養には、以下の組成の培地を用いた。

表 1

C S L - u培地フルクトース 4 . 0 (%)

K H P 0 0 . 1

M g S 0 ■ 7 H 0 0 . 0 2 5

(N H )₂ S 0 0 . 3 3 ビ夕ミン混合液 1 . 0 塩類混合液 1 . 0

C S L (コーンステ一プリカー） 4 . 0

P H 5 . 0

表 2

塩類混合液

F e S 0 ■ 7 H ₂ 0 3 6 0 mg/ L

C a C I ₂ · 2 H ₂ 0 1 4 7 0 mg/ L

N a M 00 · 2 H 2 0 2 4 2 mg/ L

Z n S 0 · 7 H _z 0 1 7 3 mg/し n S 0 · 5 H ₂ 0 1 3 9 mg/ L

C u S 0 · 5 H ₂ 0 5 mg/し

表 3

ビタミン混合物

化合物

イノシトール 2 0 0

ナイァシン 4 0

ピリドキシン H C 1 4 0

チアミン H C I 4 0

パントテン酸カルシウム 2 0

リボフラビン 2 0

p —ァミノ安息香酸 2 0

葉酸 0 . 2 ビ才チン 0 . 2

培養終了後、ジャーフアーメンター内の固形物を集積し、水洗して培地成分を除去した後、 1 % N a 0 H水溶液中で 8 0 °C、一晚処理して菌体を除去した。さらに、硫酸で中和したのち、洗浄液が中性付近になるまで生成セルロースを水洗して精製パクテリァセルロースを得た。

( 3 ) 静置培養によるパクテリアセルロースの製造

( 2 ) と同じ培地 6 0 0 m lを 3 0 m lずつ無菌シャーレに分取し、 3 0 °Gの条件下に静置し、 7日間培養した。培養終了後、シャーレ表面に形成されたパクテリアセルロースを水洗し、培地成分を除去した。

なお、上記における B Cの濃度は、培養液から遠心分離で湿潤状態の固形分を取りだした後に、この固形分の 2 0倍量の 0 . 2規定の水酸化ナ卜リウム溶液中で 1 0 0 °Cで 1 時間浸漬することで、パクテリァセルロース以外の菌体ゃ培地成分を取り除いた後に、十分水洗乾燥して測定した乾燥重量から計算した。実施例 1

参考例で得られた擾拌 B Cまたは静 B Cをそれぞれ 5部と水 9 9 5 部を混合し、ホモジナイザー（才ステライザ一）を用いて離解し、 0 . 5 %の濃度からなる離解物を得た。雜解条件は、 1 8 0 0 0 r pm、 2分間、容量は、 2 5 O m lであった。これらの離解物の遠心沈降度を測定した。これらの離解物を、直径約 4 cmのポリプロピレン製の器に約 5隱程度の厚さになるように入れてから、赤外線を用いて、 1 0 5 °Cで乾燥することによリシ一トを得た。シー卜の厚さは、約 3 0 ミクロン以下であつた。このシート 2 0 mgと水 1 0 m lを混合してから、フィスコ卜ロン（日音医理科器械製作所）を用いて、最高回転で 1 分間離解した。この離解物の速心沈降度を測定し、乾燥前の離解物と比較した。さらにまた、シー卜状に乾燥する操作と離解する操作を繰り返し、遠心沈降度を測定した。結果を表 4に示す。

表 4 遠心沈降度（％)

繰り返し回数（回）静 g培養 B C «拌培養 B C

0 (乾燥なし） 1 8 4 0

1 8 4 1

2 8 4 0

3 5 0

4 5 6

5 6 1

授拌 B Cをシー卜状に乾燥したものは、静置 B Cよりも遠心沈降度でみたときに復元性が高いことがわかった。また、乾燥と雜解を緣リ返すうちに、援拌 B Cはもとの儺解物よリも遠心沈降度の値が高くなることがわかった。また、肉眼で観察される分散性も、攪拌 B Cの方が良好であった。

実施例 2

参考例で得られた擾拌 B Cを実施例〗の方法で離解したものと、離解せずにただ単に水に懸 Sしたものから、同様に乾燥シー卜を調製してから離解を行い、遠心沈降度を調べた。結果を表 5に示す。表 5 速心沈降度（％)

離解 B Cを未離解 B Cを乾燥した場合乾燥した場合乾燥なし 3 3 8 乾燥後離解 4 5 1 4

乾燥前に一旦雜解してからシートを調製することで、乾燥後の離解による復元性が増加することがわかった。分散性も同様の傾向であった。実施例 3

実施例 1 で IS製した擾拌 Bじから、アルミニウム板上にキャストしてから乾燥（赤外線 1 0 5 °Cで艳乾）、嘖霧乾燥（雜解物の濃度を、重量 %で 0. 2 %とし、スプレードライ装としてャマト科学製 SPRAY Drye r DL-41 を用いて、条件を Inlet temp. 2 7 0 °C、 Out let temp. 9 0 °C、雜解物懸 S液流置 2 0 g 分、空気流置 0. 6〜 0. 7立方メ一トルノ分と設定してスプレードライを行った）、又は液体窒素で急速冷凍後に凍結乾燥し、これら 3種類の乾燥サンプルを実施例 1 の方法に従つて雜解した。またそれぞれの乾燥サンプルについて X線回折を行い面配向度を算出した。 X線回折には、凍結乾燥 B C、噴霧乾燥 B Cについては 2 0 0 kg/cm² 下でプレスすることにより錠剤状の成型したものを、他のシート状 B Cはそのままを試料として用いておこなった。 X線回折は、ガイガーフレックス 2 0 2 7 (理学電機）を用いて 3 5 kV、 2 O mA で 2 0を 5 ° 〜 4 0。の範囲で反射法でおこなつた。得られた X線回折曲線から、（ 1丁0 ) 面（以下、特に断らないかぎり、結晶面の指数づけを単斜晶セルロース | に従って記載する）と（ 1 1 0 ) 面とに由来するピークの高さをそれぞれ h 1 、 h 2とすると、面配向度を h 1 / h 2と定義した。なお、シートの厚さは、マイクロメーターで 5箇所以上を測定した値の平均値である。結果を表 6に示す。表 6 乾燥サンプルの形状遠心沈降度（％) 面配向度（一）シート（厚さ 4 0 ミクロン） 2 6 4 . 1 シート（厚さ 3 5 0 ミクロン） 2 0 3 . 9 喷霧乾燥粉末 2 1 . 5 凍結乾燥物 3 8 1 . 4

凍結乾燥物は、セルロースの微細なフィブリルが相互結合していないので、水に再懸¾してから雜解して得られる雜解物の遠心沈降度は、乾燥前のもとの離解物と同じレベルであった。これに対して、噴霧乾燥物は、フィブリル相互の結合が起こっているので、乾燥物を離解しても、フイブリルの間に水分が浸入することができず、速心沈降度が復元しなかった。分散性も同様の傾向であった。シートの場合には、フィブリル間の結合が強いものの、面配向性が高いことから明らかなように、 B C が緊張した状態で乾燥されているために、水分の浸入した際に容易に水素結合が切断されたため、乾燥物を離解したときの遠心沈降度の復元がなされたと考えられる。

実施例 4

実施例 1 で IS製した «拌 B Cの雜解物を水で 0 . 2 %に希釈して粘度を測定した結果、 8 . 8 7 2 9ボイズであった。これを実施例 1 に記載のようにシー卜状に乾燥後に実施例 1 と同様に再び離解し粘度を測定した結果、 8 . 7 1 2 4ボイズであった。すなわち、離解物をシート状の形態になるように、乾燥後に、再び離解することで、粘度が復元することがわかった。

実施例 5

実施例 1 で得られた擾拌 B Cの離解物をドラムドライヤー（楠木機械製作所製、 K D S 1 ) を用いて乾燥して乾燥物を得た。この乾燥物の形状はシー卜状であった。この乾燥物を実施例 2と同様に離解して遠心沈降度を調べた結果、表 5に示したのと同様にもとの離解物よリも遠心沈降度が高くなることがわかった。

実施例 6

填料歩留り試験

実施例 1 で得られた擾拌 B Cの離解物をドラムドライヤー（楠木機械製作所製、 K D S 1 ) を用いて乾燥してフレーク状の乾燥物を得た。次に、乾式粉砕機を用いて粉末状の乾燥物を得た。この粉末状の乾燥物を実施例 2と同様にして離解した。得られた雜解物を」 I S - P - 8 2 0 9に準拠して離解した L B K Pと重量比で 5 : 9 5に混合したパルプ 1 0 0部に対し、軽質炭酸カルシウム 1 0 0部、陲性濺粉 1部を添加し、この抄紙原料を用いて T A P P I標準法 T 2 6 1 に準拠して、スクリーン通過分より填料歩留りを求めた。尚、填料分の定置は T A P P I 標準法 T 2 6 9に準拠し、 4 0 0 °C、 8時間で灰化して行なった。結果を表 7に示した。 B C量（％) 塡料歩留り剤（％) ブランク（ B Cなし） 1 6 8

B C乾燥物フレーク 3 2 2

B C乾燥物パウダー 1 6 4

比較（未乾燥） 3 0 6

表 7の結果よリ、本発明方法により得た微生物セルロースの離解物を添加した系では、未乾燥の微生物セルロースの離解物を添加した系と同様に有意に填料歩留リが向上した。

実施例 7

参考例で得られた擾拌 B Cを水と混合してから、ホモジナイザー（才ステライザ一）を用いて離解し、 0 . 5 %の濃度からなる離解物を得た。雜解条件は、 1 8 0 0 0 rpm 、 2分間、容量は 2 5 0 m lであった。

この難解物を直径 4 c mの底の平らなポリプロピレン製の器に約 5 m m程度の厚さになるように入れてから、赤外線を用いて、 1 0 5 °Cで乾燥することによりシートを得た。シー卜の厚さは、約 3 0 ミクロン以下でめつに o

又、雜解物を真空下で凍結乾燥して塊状サンプルを得た。

上記のシート状サンプル 2 0 m gと水 1 0 m l を混合してから、フィスコトロン（日音医理科器械製作所）を用いて、最高回転で 2分間雜解した。雜解を何回も繰り返して、大置の離解物（ 1 ) の懸濁液を調製し更に、上記の塊状サンプルについて同様に離解して離解物（ 2 ) を誦製した。

乾燥工程を経ていない元の雜解物（対照）及び乾燥工程を経た 2種類の離解物（ 1 ) 及び（ 2 ) を直径 4 c mの底の平らなポリスチレン製の器に約 5 mm程度の厚さになるように入れてから、赤外線を用いて、 5 0 ^で乾燥することによリシー卜を得た。乾燥したシー卜を容器から剝離してからそれぞれのシー卜の厚さを測定した。次に、これらのシー卜から幅 5 mm、長さ 3 c mの短栅状のサンプルを切り出し、ヤング率を非共振強制振動法で測定した。装 Sとしては DM S 2 1 0 (セイコー ¾ 子工業製）を用い、室温で 1 0 H zの振動を与え、初期テンション 1 0 0 g、変位量 1 0 m、試料長さ 2 c mとした。

乾燥工程を経ていない元の離解物（対照）及び乾燥工程を経た 2種類の離解物（ 1 ) 及び（ 2 ) の瀘過速度を測定した。 0. 2 %の B C濃度に IS製した離解物の懸濁液 5 0 m l を直径 4 7 mmの濾紙（ァドパンテック、 N o. 2 ) を用いて、吸引濾過した。最初の 1分間に濾過された水の量を測定した。

結果を表 8に示す。見かけ比重はサンプルの重置、厚さ、幅、長さから算出した。

表 8 離解物 (対照）離解物 ( 1 ) 雜解物 ( 2 ) 厚さ（ m ) 5 0 . 6 4 2 . 4 5 4 . 2 見かけ比重 0 . 8 3 0 . 7 3 0 . 7 0 ヤング率（GPa) 1 8 . 6 1 4 . 5 1 3 . 1 補正ヤング率 3 6 . 0 3 1 . 6 2 9 . 7

(GPa) *

湓過速度 1 1 . 2 5 1 8 . 5 0 2 7 . 5 0 t,m i /m i n)

* 補正ヤング率（GPa)は，測定されたヤング率の値を見かけ比重で割つてからセルロースの比重（ 1 . 5 9 ) を乗じた値とした。産業上の利用可能性

本発明に従って、一旦乾燥してから離解した B Cを用いることにより優れた填料歩留り剤を得ることができる。更に、かかる B Cから得られたシー卜の濾過速度は大きく増加したにもかかわらず、それらのヤング率は、乾燥工程を経ていない離解物から绸製したシー卜のヤング率と比較して、それ程の減少はなかった。この結果は、本発明方法により乾燥した B Cを離解してから用いることで、製紙工程等で高強度のシート製造するのに、逋水速度の点で特に有利であることを示している。

Claims

請求の範囲

1 . 提拌培養で製造されたパクテリアセルロースを緊張下で脱水乾燥して得られたバクテリァセルロースを離解処理することを特徴とする、バクテリァセルロースの処理方法。

2 . 攪拌培養で製造されたバクテリアセルロースを、面配向度（ h 1 / h 2 ) の値が 2以上（h 1 ：反射法による X線回折により得られる回折曲線において（ 1丁 0 ) 面に由来するピークの高さ、 h 2 ：同様にして（ 1 1 0 ) 面に由来するビークの高さ）となるように脱水乾燥して得られたバクテリァセルロースを離解処理することを特徴とする、バクテリァセルロースの処理方法。

3 . 脱水乾燥前にパクテリアセル□一スを離解処理する請求項 1 又は 2記載の方法。

4 . 離解処理の方法が機械的剪断力、超音波、高圧処理、酸加水分解、酵素を用いた加水分解若しくは漂白剤を用いる方法又はそれらの組合せである請求項 1 ないし 3のいずれか一項に記載の方法。

5 . 脱水乾燥が、ドラムドライヤー、圧搾、風乾、熱風乾燥若しくは寘空乾燥又はそれらを組合せた方法である請求項 1 ないし 3のいずれか一項に記載の方法。

6 . 通気擾拌培養で得られた、ポリスチレン換算の重置平均重合度が 1 . 6 X 1 0 以上であるバクテリァセル□ースを用いる請求項 1 ないし 5のいずれか一項に記載の方法。

7 . 静 g培養で得られた、ポリスチレン換算の重量平均重合度が 2 . 0 1 0 ⁴ 以上であるバクテリァセルロースを用いる請求項 1 ないし 5 のいずれか一項に記載の方法。

8 . 請求項 1 ないし 7のいずれか一項に記載の方法により得ることのできるバクテリァセルロースの離解物。

9 . 請求項 8記載のバクテリァセルロースの雜解物から成る ¾料歩留り剤。

1 0 . 請求項 8記載のバクテリアセルロースの離解物を含む高強度シ一卜。