WO1997036604A1 - Compositions renfermant des triterpenes a activite anticancereuse - Google Patents

Compositions renfermant des triterpenes a activite anticancereuse Download PDF

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WO1997036604A1
WO1997036604A1 PCT/FR1997/000560 FR9700560W WO9736604A1 WO 1997036604 A1 WO1997036604 A1 WO 1997036604A1 FR 9700560 W FR9700560 W FR 9700560W WO 9736604 A1 WO9736604 A1 WO 9736604A1
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pharmaceutical preparations
iridals
preparations according
iridal
hydroxyiridal
Prior art date
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PCT/FR1997/000560
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Inventor
Jean Paul Bonfils
Frédéric PINGUET
Stéphane CULINE
Yves Sauvaire
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Universite De Montpellier Ii Sciences Et Techniques Du Languedoc
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A61K31/343—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide condensed with a carbocyclic ring, e.g. coumaran, bufuralol, befunolol, clobenfurol, amiodarone
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    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin

Definitions

  • compositions of triterpenes with anticancer activity which can be used in particular in therapy, in particular in chemotherapy.
  • camptothecin was originally extracted from Camptotheca acuminata, while paclitaxel was isolated from the bark of a Pacific yew, Taxus brev ⁇ fol ⁇ a.
  • CPT-11 is an inhibitor of topoisomerases I, enzymes involved in DNA metabolism, whereas paclitaxel targets intracellular micro- tubules which in particular constitute the mitotic spindle.
  • CPT-11 has a notable activity in metastatic colon cancer after failure of 5-fluorouracil; as for paclitaxel, it is currently indicated in the treatment of ovarian and breast cancers in the metastatic phase.
  • docetaxel from the European yew raxus Jbaccata, is also marketed as an anti-cancer drug. These different molecules thus join other cytotoxic molecules derived from plants, such as the periwinkle alkaloids, known for about 20 years.
  • Chemotherapy nevertheless has significant limitations to date. Certain malignant tumors are indeed immediately resistant to known cytotoxic drugs, such as kidney or prostate cancer. Other cancers, initially chemosensitive, acquire during the course of treatment, resistance mechanisms which make them secondarily insensitive to chemotherapy, such as small cell lung cancers, breast or ovarian cancers.
  • compositions are meant, according to the invention, both the extracts obtained from ⁇ Iris, as well as the constituent fractions of these extracts or the iridals which they contain.
  • Iridals are triterpenoids, found in the rhizomes, leaves and roots of the Iris. So far, around thirty iridals have been isolated.
  • Some of the co-inventors of the present application are interested in previous work on the function of iridals in the plant and have shown, in particular, the intervention of cytochrome P450 during the hydroxylation reactions of iridals and the role of these compounds in maintaining membrane integrity through their apparently analogous function to that of sterols.
  • compositions of iridals obtained from Iris have anticancer properties vis-à-vis human cancer lines.
  • such properties are exerted with practically the same level of efficiency with respect to lines considered to be resistant in the prior art.
  • the invention therefore aims to take advantage of said cytotoxic properties of triterpenoid compositions based on iridals, in particular, for the study of mechanisms of action vis-à-vis human cancer cells and especially their use in pharmaceutical preparations for cancer therapy.
  • the pharmaceutical preparations of the invention are characterized in that they contain, in combination with a pharmaceutical vehicle, an effective amount of at least one tripernoidal composition based on iridals having cytotoxic properties with respect to cancer cells human.
  • compositions based on triterpenes used in the preparations are characterized in that they are produced from extracts such as obtained by alcoholic extraction in ethanol at 70% (v / v) of a ground material of plant parts of Iris, leaves, roots and especially rhizomes, at room temperature, followed, where appropriate, by a step of concentrating the ethanolic phase, diluting in water and at least one step of washing the resulting aqueous phase with a solvent such as diethyl ether, recovery of the ethereal phase or phases and, after evaporation to dryness, their recovery in 70% ethanol (v / v).
  • extracts such as obtained by alcoholic extraction in ethanol at 70% (v / v) of a ground material of plant parts of Iris, leaves, roots and especially rhizomes, at room temperature, followed, where appropriate, by a step of concentrating the ethanolic phase, diluting in water and at least one step of washing the resulting aqueous phase with a solvent such as die
  • the triterpene compositions used according to the invention are characterized in that they are produced from fractions of the extracts defined above, essentially constituted by monocycloiridals, bicycloiridals and spiroiridals.
  • the monocycloiridals more specifically include iridal (21-deoxy-iridogermanal), 16-0-acetyl-isoiridogermanal, 17-hydroxyiridal, 26-hydroxyiridal, 17, 26-dihydroxyiridal, 21-hydroxyiridal (iridogermanal), 10-deoxy-21-hydroxyiridal (10-deoxy-iridogermanal), 10-deoxy-17-hydroxyiridal, iriversical, 16,17 dehydro-26, acetoxy-iriversical, 16,17-didehydro-iridal, 16,17-didehydro-26-hydroxy-iridal and 17,29-didehydroiridal.
  • the bicycloiridals feature iriflorental,
  • spiranic derivatives mention will be made of spiroiridal, 29-hydroxy-spiroiridal, 29-acetoxyspiroiridal, and forms X, Y and Z represented in the single figure D, the belamcandal and the 28-deacetyl-belamcandal.
  • compositions used according to the invention consist of iridals per se, in particular one of those listed above.
  • the enantiomeric or diastereoisomeric forms, alone or as a mixture, of the iridals of the above compositions also form part of the invention. It will be noted that the iridals of these different compositions can exist in reduced form, or if necessary in oxidized, or even dehydrated form, leading to cyclic or polymerized structures.
  • the side chain of the iridals may contain double bonds resulting from dehydration or dehydrogenation of the natural iridals, or may be hydroxylated.
  • compositions thanks to the nature of their substituents, for example ethers or esters, advantageously constitute a prodrug.
  • compositions of the invention are used, where appropriate, in combination with active principles.
  • active principles such as anthracyclines.
  • compositions of the invention have demonstrated their cytotoxic effect in vitro.
  • an anticancer activity is thus observed in the crude extracts, amplified in the purified extracts, the fractions and the iridals.
  • the anticancer effect is observed both with respect to solid tumor lines and with liquid tumor lines, corresponding to cancers among the most frequent encountered in humans.
  • Tests carried out in vivo on the animal confirmed the results obtained in vitro and consequently the interest of the iridal compositions used according to the invention. To these advantageous properties is added that of satisfactory safety.
  • They can be administered in different forms, more especially by the oral or injectable route, or even in the form of liposomes.
  • compositions advantageously contain from 0.01 mg to 1000 mg of active principle per unit of intake.
  • compositions for intravenous, subcutaneous or intramuscular injection developed from sterile or sterilizable solutions. They can also be suspensions or emulsions.
  • injectable forms contain from 0.01 mg to 1000 mg of active ingredient per intake unit.
  • 1 man corresponds to the following doses: thus the patient is administered for example 0.01 mg to 1000 mg / day in one or more doses.
  • the invention also relates to biological reagents, the active principles of which consist of the compositions defined above and containing the excipients or vehicles necessary for the intended application.
  • compositions based on iridals defined above can be obtained by extraction of plant parts of Iris using organic solvents.
  • the free iridals that is to say non-esterified, are soluble in solvents such as 50-100% ethanol, methanol, ethyl acetate, diethyl ether or mixtures of chloroform and methanol for example at a rate of 2/1, 1/1 or 1/2 v / v.
  • the extraction is carried out at a temperature above 0 * C and ranging up to room temperature.
  • the plant parts of the Iris, the roots, the leaves and especially the rhizomes, are crushed beforehand.
  • This raw extract can be purified, if desired, so as to have a more active extract with regard to its effects on human cancer cells.
  • the ethanol is advantageously removed, then the viscous mixture obtained is treated to recover at least the major part of the active compounds.
  • an ethereal solvent suitable for this step mention will be made of diethyl ether, which makes it possible to leave the water-soluble molecules in the aqueous phase and to recover the iridals in the organic phase. More than half of the dry matter of the ethanolic extract is thus eliminated in the aqueous phase, which allows a significant enrichment of the ethereal phase in iridals.
  • the ethereal phase or phases obtained at the end of the washing step or steps are combined and, after removal of the ether, are added with a solvent.
  • a solvent As in the extraction step, use is advantageously made of ethanol of 50 to 100% approximately and, preferably, of the order of 70% (v / v), these ethanolic solutions being less toxic than d other solvents for cell cultures.
  • the purified extract thus obtained is fractionated, if desired, so as to separate the most active compounds.
  • iridals By operating for example by thin layer chromatography, on column, counter-current chromatography, chromatography by supercritical fluid, we isolates a fraction composed of iridals, which contains most of the anti-tumor activity sought, as shown by tests on the proliferation of human cancer cells.
  • the iridals can in turn be separated and purified, operating, for example, by HPLC.
  • Example 1 Obtaining extracts of derivatives of triterpenes. Rhizomes of Iris (1. german ⁇ ca, I. pall ⁇ da,
  • the aqueous phase obtained after washing with ether of EB70 is called: PA.
  • the PO70 extract is fractionated by thin layer chromatography.
  • fractions P070a, PO70b and P070c are obtained, which are tested as reported below on the proliferation of human cancer cells.
  • the cytotoxic activity is found in the fraction P070b.
  • This fraction consists almost exclusively of mono-, bi- and spirocyclic iridals.
  • Monocycloiridals iridal (21-deoxy-iridogermanal), 16-0-acetyl-isoiridogermanal, 17-hydroxyiridal, 26-hydroxyiridal, 17, 26- dihydroxyiridal, 21-hydroxyiridal (iridogermanal), 10- deoxy-21-hydroxyiridal (10-deoxy-iridogermanal), 10-deoxy-17-hydroxyiridal, iriversical, 16,17 dehydro-26, acetoxy-iriversical, 16,17-didehydro-iridal, 16, 17-didehydro-26-hydroxy-iridal and 17,29-didehydroiridal.
  • the bicycloiridals include iriflorental, iripallidal, ⁇ -irigermanal, ⁇ -irigermanal and deoxy-iripallidal.
  • A2780 (ovarian cancer), adherent line sensitive to doxorubicin and A2780 R, daughter line made resistant to doxorubicin and expressing the MDR chemoresistance mechanism.
  • the cytotoxicity test used to demonstrate cell proliferation is the MTT test.
  • the viability of the cells is checked by the blue trypan test.
  • Cell density is determined by a coulter counter.
  • culture conditions are as follows: culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal calf serum, glutamine and penicillin / streptomycin. culture conditions: Cells were cultured at 37 ° C under 95% relative humidity in an atmosphere containing 5% C0 2. . Results In the 2 tables which follow, the results obtained with the extracts EB70, P070 and PA are reported, as well as the compound of formula XXI.
  • the values of the IC 50 are substantially of the same order of magnitude in the tests on resistant cells, while they are ten times higher with the known active principles, doxorubicin and taxol.
  • the aqueous phase obtained during the purification of the crude extract is devoid of activity.
  • the new compositions of the invention are therefore of great interest for anti-cancer chemotherapy, especially since their safety is very high as shown by the results given in Example 4 below.
  • Example 3 Study of the toxicity of 1 iridal on 1 animal.
  • LD 50 lethal dose 50
  • 8 Swiss mice were included in this work. The animals were 6 weeks old and weighed about 30 grams.
  • the injected compound was iridal conditioned in a small amount of ethanol. Before the injection, the active principle was taken up in isotonic physiological saline so as to obtain a volume of 100 ⁇ l per mouse and the whole was subjected to agitation for 3 minutes. 3 injections were given 1 week apart intraperitoneally. The doses were successively 0.01 mg per mouse (1st week), 0.1 mg (2nd week), 1 mg (3rd week). After these various injections, a viability check was carried out systematically 3, 24 and 48 hours later.
  • mice Whatever the level of injection, no mortality was observed. However, after the 4th injection, the mice underwent transient toxicity manifested by behavioral abnormalities.
  • the LD 50 of the iridal is therefore greater than 33.3 mg / kg in the Swiss mouse.
  • Example 4 Solution for injection of iridals. 2 g of iridals from the P 070 b fraction are used in 1000 ml of pyrogen-free physiological solution. The solution obtained is distributed into 10 ml ampoules.

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Abstract

L'invention vise des préparations pharmaceutiques comprenant, en association avec un véhicule pharmaceutique, une quantité efficace d'au moins une composition d'iridals à activité anti-tumorale vis-à-vis de cellules cancéreuses humaines.

Description

COMPOSITIONS RENFERMANT DES TRITERPENES A ACTIVITE ANTICANCEREUSE
L'invention a pour objet des compositions de triterpènes à activité anticancéreuse utilisables notamment en thérapeutique, en particulier en chimiothérapie.
Le développement de la chimiothérapie anti¬ cancéreuse a connu un essor important au cours des vingt dernières années. Elle est actuellement considérée comme une arme à part entière dans le traitement des cancers, complémentaire de la chirurgie et de la radiothérapie.
Les progrès réalisés dans ce domaine résultent d'une part d'une meilleure connaissance des stratégies d'administration des drogues, mais également de la découverte de nouvelles molécules cytotoxiques. L'année 1995 constitue à cet égard une étape importante avec la délivrance d'autorisations de mise sur le marché de deux nouvelles molécules originales : le CPT-11 (Campto ), dérivé de la camptothecine et le paclitaxel (Taxol ). Ces deux molécules sont d'origine végétale. La camptothecine a été initialement extraite de Camptotheca acuminata, alors que le paclitaxel a été isolé de l'écorce d'un if du Pacifique, Taxus brev±fol±a .
Le CPT-11 est un inhibiteur des topoisomérases I, enzymes participant au métabolisme de l'ADN, alors que le paclitaxel a pour cible intra-cellulaire les micro- tubules qui constituent en particulier le fuseau mitotique. Le CPT-11 possède une activité notable dans les cancers du colon métastatique après échec du 5- fluoro-uracile ; quant au paclitaxel, il est actuellement indiqué dans le traitement des cancers de l'ovaire et du sein en phase métastatique.
Un autre taxane, le docétaxel, issu de l'if européen raxus Jbaccata, est également commercialisé comme médicament anti-cancereux. Ces différentes molécules viennent ainsi rejoindre d'autres molécules cytotoxiques issues de végétaux, comme les alcaloïdes de la pervenche, connues depuis environ 20 ans.
La chimiothérapie connaît néanmoins à ce jour d'importantes limites. Certaines tumeurs malignes sont en effet résistantes d'emblée aux drogues cytotoxiques connues, comme les cancers du rein ou de la prostate. D'autres cancers, initialement chimio-sensibles, acquièrent en cours de traitement, des mécanismes de résistance qui les rendent secondairement insensibles à la chimiothérapie, comme les cancers pulmonaires à petites cellules, les cancers du sein ou de l'ovaire.
Les voies de recherche permettant d'augmenter l'efficacité de la chimiothérapie comportent l'accroissement des doses administrées, le développement de molécules cherchant à diminuer les résistances et la recherche de nouvelles molécules cytotoxiques présentant des mécanismes d'action originaux.
Dans le cadre d'une telle recherche, les inventeurs ont étudié des compositions de triterpènes obtenues à partir d'Iris. Par "compositions", on entend, selon l'invention, aussi bien les extraits obtenus à partir â ^ Iris , que les fractions constitutives de ces extraits ou encore les iridals qu'elles renferment. Les iridals sont des composés triterpénoïdiques, présents dans les rhizomes, les feuilles et les racines de l'Iris. Jusqu'à présent, une trentaine d' iridals a été isolée. Certains des co- inventeurs de la présente demande se sont intéressés dans des travaux antérieurs à la fonction des iridals dans la plante et ont montré, notamment, l'intervention du cytochrome P450 au cours des réactions d'hydroxylation des iridals et le rôle de ces composés dans le maintien de 1 'intégrité membranaire par l'intermédiaire de leur fonction apparemment analogue à celle des stérols.
La poursuite de ces études a montré que, d'une manière surprenante, des compositions d' iridals obtenues à partir d'Iris possèdent des propriétés anticancéreuses vis-à-vis de lignées cancéreuses humaines. De plus, selon un aspect revêtant un intérêt majeur, de telles propriétés s'exercent avec pratiquement le même niveau d'efficacité vis-à-vis de lignées considérées comme résistantes dans l'art antérieur. L'invention vise donc la mise à profit desdites propriétés cytotoxiques de compositions triterpénoïdiques à base d'iridals, notamment, pour l'étude de mécanismes d'actions vis-à-vis de cellules cancéreuses humaines et tout spécialement leur utilisation dans des préparations pharmaceutiques pour la thérapie des cancers.
Les préparations pharmaceutiques de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles renferment, en association avec un véhicule pharmaceutique, une quantité efficace d'au moins une composition tripernoïdique à base d' iridals possédant des propriétés cytotoxiques vis-à-vis de cellules cancéreuses humaines.
Selon un premier aspect, les compositions à base de triterpènes utilisées dans les préparations pharmaceutiques selon l'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont élaborées à partir d'extraits tels qu'obtenus par extraction alcoolique dans de l'éthanol à 70 % (v/v) d'un broyât de parties végétales d'Iris, feuilles, racines et tout spécialement rhizomes, à température ambiante, suivie, le cas échéant, d'une étape de concentration de la phase ethanolique, de dilution dans l'eau et d'au moins une étape de lavage de la phase aqueuse résultante avec un solvant tel que l'éther diéthylique, la récupération de la ou des phases éthérées et, après évaporation à sec, leur reprise dans de l'éthanol à 70 % (v/v).
Selon un autre aspect, les compositions de triterpènes utilisées selon l'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont élaborées à partir de fractions des extraits définis ci-dessus, essentiellement constituées par des monocycloiridals, des bicycloiridals et des spiroiridals.
Les monocycloiridals comprennent plus spécialement l'iridal (21-désoxy-iridogermanal), le 16-0- acétyl-isoiridogermanal, le 17-hydroxyiridal, le 26- hydroxyiridal, le 17, 26-dihydroxyiridal, le 21- hydroxyiridal (iridogermanal), le 10-désoxy-21- hydroxyiridal (10-désoxy-iridogermanal), le 10-désoxy-17- hydroxyiridal, l'iriversical, le 16,17 déhydro-26, acétoxy-iriversical, le 16,17-didéhydro-iridal, le 16,17- didéhydro-26-hydroxy-iridal et le 17,29-didéhydroiridal. Les bicycloiridals comportent l'iriflorental,
1'iripallidal, l'α-irigermanal, le γ-irigermanal et le désoxy-iripallidal.
Comme dérivés spiraniques, on citera le spiroiridal, le 29-hydroxy-spiroiridal, le 29- acétoxyspiroiridal, et les formes X, Y et Z représentées sur la figure unique D, le bélamcandal et le 28-déacétyl-bélamcandal.
Selon encore un autre aspect, les compositions utilisées selon l'invention sont constituées par les iridals per se, en particulier l'un de ceux énumérés ci- dessus.
Les formes énantiomères ou diastéréoisomères, seules ou en mélange, des iridals des compositions ci- dessus font également partie de l'invention. On notera que les iridals de ces différentes compositions peuvent exister sous forme réduite, ou le cas échéant sous forme oxydée, ou encore déshydratée, conduisant à des structures cycliques ou polymérisées. En particulier, la chaîne latérale des iridals peut comporter des doubles liaisons résultant de déshydratations ou de déshydrogénations des iridals naturels, ou peut être hydroxylée.
Ils peuvent également être obtenus sous forme hydroxylée ou estérifiée, par exemple avec des acides gras, ou éthérifiée.
Ces différents dérivés d'iridals entrent dans le champ des compositions utilisées selon l'invention.
Ces compositions, grâce à la nature de leurs substituants, par exemple éthers ou esters, constituent avantageusement une prodrogue.
Dans les préparations pharmaceutiques de l'invention, ces compositions sont utilisées, le cas échéant, en association avec des principes actifs. On citera, à titre d'exemple, leur association avec d'autres médicaments anticancéreux comme les anthracyclines.
Elles sont, en outre, avantageusement utilisées en association avec des composés facilitant leur assimilation, tels que des sucres ainsi que tous les composés entrant classiquement dans la composition galénique des différentes formes d'administration.
L'étude des propriétés pharmacologiques des compositions de l'invention a mis en évidence leur effet cytotoxique in vitro.
Sur des cellules tumorales humaines, on constate ainsi une activité anticancéreuse dans les extraits bruts, amplifiée dans les extraits purifiés, les fractions et les iridals. D'une manière avantageuse, l'effet anticancéreux est observé aussi bien vis-à-vis de lignées de tumeurs solides que de lignées de tumeurs liquides, correspondant à des cancers parmi les plus fréquents rencontrés chez l'homme. Des essais effectués in vivo sur l'animal ont confirmé les résultats obtenus in vitro et par voie de conséquence l'intérêt des compositions d'iridals utilisées selon l'invention. A ces propriétés avantageuses, s'ajoute celle d'une inocuité satisfaisante.
Ces préparations sont donc particulièrement appropriées pour la chimiothérapie des cancers.
Elles sont administrables sous différentes formes, plus spécialement par voie orale ou injectable, ou encore sous forme de liposomes.
Pour l'administration par voie orale, on a recours en particulier à des comprimés, pilules, tablettes, gélules, gouttes. Ces compositions renferment avantageusement de 0,01 mg à 1000 mg de principe actif par unité de prise.
D'autres formes d'administration comprennent des solutions injectables par voie intra-veineuse, sous- cutanée ou intra-musculaire, élaborées à partir de solutions stériles ou stérilisables. Il peut s'agir également de suspensions ou d'émulsions.
Ces formes injectables renferment par unité de prise de 0,01 mg à 1000 mg de principe actif. A titre indicatif, la posologie utilisable chez
1 'homme correspond aux doses suivantes : ainsi on administre par exemple au patient 0,01 mg à 1000 mg/jour en une ou plusieurs prises.
L'invention vise encore les réactifs biologiques dont les principes actifs sont constitués par les compositions définies plus haut et renfermant les excipients ou véhicules nécessaires pour 1 ' application envisagée.
Ces réactifs peuvent être utilisés comme références ou étalons dans des études d'éventuelles activités antitumorales.
Les compositions à base d' iridals définies ci- dessus peuvent être obtenues par extraction de parties végétales d' Iris à 1 'aide de solvants organiques. Les iridals libres, c'est-à-dire non estérifiés, sont solubles dans des solvants tels que l'éthanol à 50-100 %, le méthanol, l'acétate d'éthyle, l'éther diéthylique ou encore des mélanges de chloroforme et de méthanol par exemple à raison de 2/1, 1/1 ou 1/2 v/v.
On utilise avantageusement de l'éthanol à 50 à 100 % environ et, de préférence, de l'ordre de 70 % ce qui permet de faciliter la pré-purification des molécules d' iridals. Il s'avère en effet qu'on limite ainsi l'extraction des iridals aux formes libres et qu'on réduit l'extraction de lipides présents dans les parties végétales de 1 'Iris.
Selon des modalités optimales, l'extraction est réalisée à une température supérieure à 0*C et allant jusqu'à une température ambiante. Les parties végétales de l'Iris, les racines, les feuilles et tout spécialement les rhizomes, sont au prélable broyées.
Cet extrait brut peut être purifié, si on le souhaite, de manière à disposer d'un extrait plus actif au regard de ses effets sur des cellules cancéreuses humaines.
On procède avantageusement à l'élimination de l'éthanol, puis au traitement du mélange visqueux obtenu pour récupérer au moins la majeure partie des composés actifs. A cet effet, il s'est avéré approprié de diluer le mélange visqueux avec de l'eau et de laver la phase aqueuse avec un solvant éthéré. Comme solvant éthéré convenant pour cette étape, on citera l'éther diéthylique qui permet de laisser dans la phase aqueuse les molécules hydrosolubles et de récupérer les iridals dans la phase organique. Plus de la moitié de la matière sèche de l'extrait ethanolique est ainsi éliminée dans la phase aqueuse, ce qui permet un enrichissement important de la phase éthérée en iridals.
La ou les phases éthérées obtenues à l'issue de la ou des étapes de lavage sont regroupées et, après élimination de l'éther, sont additionnées d'un solvant. Comme dans l'étape d'extraction, on a recours avantageusement à de l'éthanol de 50 à 100 % environ et, de préférence, de l'ordre de 70 % (v/v), ces solutions éthanoliques étant moins toxiques que d'autres solvants pour les cultures cellulaires.
L'extrait purifié ainsi obtenu est fractionné, si on le désire, de manière à séparer les composés les plus actifs.
En opérant par exemple par chromatographie sur couche mince, sur colonne, chromatographie contre- courant, chromatographie par fluide supercritique, on isole une fraction composée d'iridals, qui renferme l'essentiel de l'activité anti-tumorale recherchée, comme le montrent les tests sur la prolifération de cellules cancéreuses humaines. Les iridals peuvent être à leur tour séparés et purifiés, en opérant, par exemple, par HPLC.
La connaissance de la formule de ces iridals permet également de recourir aux procédés de synthèse chimique pour leur obtention. Il est également possible d'opérer par hémisynthèse, à partir d'une molécule d'une classe d'iridal, ou encore par biotransformation.
On rapporte dans les exemples qui suivent d'autres caractéristiques et avantages de l'invention.
Dans ces exemples, relatifs à l'obtention de compositions de triterpènes et à l'étude de leur activité antitumorale, il sera fait référence à la figure unique A à D qui représente des formules d'iridals.
Exemple 1 : Obtention d'extraits de dérivés de triterpènes. Des rhizomes d'Iris (1. german±ca, I. pall±da,
I . pseudacorus , I . sp. ou variétés horticoles) sont broyés et soumis à une extraction à température ambiante dans l'éthanol 70 %. L'extrait ainsi obtenu est filtré à 0,6 μm et appelé Extrait Brut 70 ou EB70. Une partie d'EB70 est concentrée par élimination du solvant sous vide partiel. Le mélange visqueux obtenu est transféré dans une ampoule à décanter et dilué dans l'eau. On pratique alors plusieurs lavages de cette phase aqueuse avec de l'éther diéthylique. Les phases éthérées obtenues sont regroupées, évaporées à sec et reprises dans l'éthanol 70 %. On obtient ainsi une phase appelée Phase Organique 70 ou P070.
La phase aqueuse obtenue après le lavage à l'éther d'EB70 est appelée : PA. L'extrait PO70 est fractionné par chromatographie sur couche mince.
On obtient trois fractions P070a, PO70b et P070c, qui sont testées comme rapporté ci-après sur la prolifération des cellules cancéreuses humaines. On retrouve l'activité cytotoxique dans la fraction P070b.
Cette fraction est presque exclusivement constituée d'iridals mono-, bi- et spirocycliques.
Plusieurs molécules d'iridals sont purifiées par HPLC et répondent aux formules I à XXVI données sur la figure unique. Il s'agit des composés suivants :
Monocycloiridals : l'iridal (21-désoxy- iridogermanal), le 16-0-acétyl-isoiridogermanal, le 17- hydroxyiridal, le 26-hydroxyiridal, le 17, 26- dihydroxyiridal, le 21-hydroxyiridal (iridogermanal), le 10-désoxy-21-hydroxyiridal (10-désoxy-iridogermanal), le 10-désoxy-17-hydroxyiridal, l'iriversical, le 16,17 déhydro-26, acétoxy-iriversical, le 16,17-didéhydro- iridal, le 16, 17-didéhydro-26-hydroxy-iridal et le 17,29- didéhydroiridal.
Les bicycloiridals comportent l'iriflorental, l'iripallidal, l'α-irigermanal, le γ-irigermanal et le désoxy-iripallidal.
Comme dérivés spiraniques, on citera le spiroiridal, le 29-hydroxy-spiroiridal, le 29- acétoxyspiroiridal, et les formes X, Y et Z représentées sur la figure unique D, le bélamcandal et le 28-déacétyl- bélamcandal. Exemple 2 : Etude de l'activité cytotoxique . Méthode
Différents tests de cytotoxicité ont été réalisés sur des extraits et fractions d'iridals et sur des iridals, en tant que composés individuels.
Deux types de lignées cellulaires d'origine humaine ont été utilisés :
- A2780 (cancer de l'ovaire), lignée adhérente sensible à la doxorubicine et A2780 R, lignée fille rendue résistante à la doxorubicine et exprimant le mécanisme de chimiorésistance MDR.
- K 562 (leucémie myéloïde chronique), lignée en suspension liquide sensible à la doxorubicine et K562 R, lignée fille rendue résistante à la doxorubicine et exprimant le mécanisme de chimiorésistance MDR.
Le test de cytotoxicité utilisé pour mettre en évidence la prolifération cellulaire est le test MTT. La viabilité des cellules est vérifiée par le test au trypan bleu. La densité cellulaire est déterminée par un coulter counter.
Les conditions de culture sont les suivantes : milieu de culture : RPMI 1640 supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal, glutamine et pénicilline/streptomycine. conditions de culture : les cellules sont cultivées à 37*C, sous 95 % d'humidité relative, dans une atmosphère contenant 5 % de C02. . Résultats Dans les 2 tableaux qui suivent, on rapporte les résultats obtenus avec les extraits EB70, P070 et PA, ainsi que le composé de formule XXI .
Figure imgf000014_0001
TABLEAUII
Activité cytotoxique (IC 50 en μg/ml)
Composés testés Lignées cellulaires
A2780 A2780R K562 K562R composé XXI 2,92 4,93 1,44 2,55
(29 acétoxy-spiroiridal) doxorubicine 0,049 0,47 0,26 11,2
Ces résultats montrent que les extraits éthanoliques bruts d'iris présentent une activité cytotoxique aussi bien sur des lignées cancéreuses humaines sensibles que résistantes. On constate l'amplification de cet effet avec la fraction purifiée PO70 et l'iridal.
On notera avec intérêt que les valeurs des IC50 (μg/ml) sont sensiblement du même ordre de grandeur dans les tests sur cellules résistantes, alors qu'elles sont dix fois supérieures avec les principes actifs connus, la doxorubicine et le taxol. En revanche, la phase aqueuse obtenue lors de la purification de l'extrait brut est dépourvue d'activité.
Les nouvelles compositions de l'invention présentent donc un grand intérêt pour les chimiothérapies anti-cancéreuses, d'autant plus que leur innocuité est très élevée comme le montrent les résultats donnés dans l'exemple 4 ci-après.
Exemple 3 : Etude de la toxicité de 1 ' iridal sur 1 ' animal.
Une étude de toxicité ayant pour objectif de déterminer la dose létale 50 (DL 50) chez la souris a été réalisée. 8 souris Swiss ont été incluses dans ce travail. L'âge des animaux était de 6 semaines et le poids environ de 30 grammes. Le composé injecté a été 1 ' iridal conditionné dans une faible quantité d'éthanol. Avant l'injection, le principe actif a été repris par du sérum physiologique isotonique de façon à obtenir un volume de 100 μl par souris et l'ensemble a été soumis à agitation pendant 3 minutes. 3 injections ont été réalisées à 1 semaine d'intervalle par voie intrapéritonéale. Les doses ont été successivement de 0,01 mg par souris (1ère semaine), 0,1 mg ( 2ème semaine), 1 mg ( 3ème semaine). A l'issue de ces différentes injections, un contrôle de la viabilité a été réalisé de façon systématique 3, 24 et 48 heures après.
Quelque soit le niveau d'injection, aucune mortalité n'a été constatée. Cependant, après la 4ème injection, les souris ont subi une toxicité passagère concrétisée par des anomalies du comportement. La DL 50 de 1 ' iridal est donc supérieure à 33,3 mg/Kg chez la souris Swiss.
Exemple 4 : Solution injectable d' iridals. On utilise 2 g d' iridals provenant de la fraction P 070 b dans 1000 ml de soluté physiologique apyrogène. La solution obtenue est répartie dans des ampoules de 10 ml.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Préparations pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent en association avec un véhicule pharmaceutique une quantité efficace d'au moins une composition d'iridals possédant une activité anti¬ tumorale vis-à-vis de cellules cancéreuses humaines.
2/ Préparations pharmaceutiques selon la revendication 1, caractérisées en ce que les compositions d'iridals sont élaborées à partir d'extraits, tels qu'obtenus par extraction alcoolique dans de 1*éthanol à 70 % (v/v), d'un broyât de parties végétales d'Iris, feuilles, racines et tout spécialement rhizomes, à température ambiante, suivie, le cas échéant, d'une étape de concentration de la phase ethanolique, de dilution dans l'eau et d'au moins une étape de lavage de la phase aqueuse résultante avec un solvant tel que l'éther diéthylique, la récupération de la ou des phases éthérées et, après évaporation à sec, leur reprise dans de 1»éthanol à 70 % (v/v) .
3/ Préparations pharmaceutiques selon la revendication 2, caractérisées en ce que les compositions d'iridals sont élaborées à partir de fractions desdits extraits, essentiellement constituées par des monocycloiridals, des bicycloiridals et des dérivés spiraniques.
4/ Préparations pharmaceutiques selon la revendication 3, caractérisées en ce que les monocycloiridals comprennent l'iridal, le 16-0-acétyl- isoiridogermanal, le 17-hydroxyiridal, le 26- hydroxyiridal, le 17, 26-dihydroxyiridal, le 21- hydroxyiridal (iridogermanal), le 10-désoxy-21- hydroxyiridal (10-désoxy-iridogermanal), le 10-désoxy-17- hydroxyiridal, l'iriversical, le 16,17 déhydro-26, acétoxy-iriversical, le 16,17-didéhydro-iridal, le 16,17- didéhydro-26-hydroxy-iridal et le 17,29-didéhydroiridal, les bicycloiridals comprennent l'iriflorental, l'iripallidal, l'α-irigermanal, le γ-irigermanal et le désoxy-iripallidal et les dérivés spiraniques, comprennent le spiroiridal, le 29-hydroxy-spiroiridal, le 29-acétoxyspiroiridal, les formes X, Y et Z représentées sur la figure unique D, le bélamcandal et le 28-déacétyl- bélamcandal.
5/ Préparations pharmaceutiques selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisées en ce que les iridals correspondent aux formes énantiomères ou diastéréoisomères, seules ou en mélange, des iridals des compositions selon l'une des revendications 2 à 4.
6/ Préparations pharmaceutiques selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisées en ce qu'elles renferment des dérivés d'iridals, choisis parmi les esters, éthers, les composés à chaîne latérale, hydroxylée, déshydrogénée ou déshydratée.
7/ Préparations pharmaceutiques selon l'une des revendication 1 à 5, caractérisées en ce qu'elles sont administrables par voie orale ou injectable.
8/ Préparations pharmaceutiques selon la revendication 7, caractérisées en ce qu'il s'agit de tablettes, comprimés, gélules, pilules ou de liposomes et qu'elles renferment de 0,01 mg à 1000 mg de principe actif par unité de prise.
9/ Préparations pharmaceutiques selon la revendication 7, caractérisées en ce qu'il s'agit de solutions injectables, ces solutions renfermant avantageusement par unité de prise de 0,01 mg à 1000 mg de principe actif. 10/ Préparations pharmaceutiques selon l'une des revendications 1 à 9, utilisées comme médicaments anti-tumoraux.
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