WO1997035988A1 - Thermostabile dna-polymerase aus thermococcus spec. ty - Google Patents

Thermostabile dna-polymerase aus thermococcus spec. ty Download PDF

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WO1997035988A1
WO1997035988A1 PCT/EP1997/001476 EP9701476W WO9735988A1 WO 1997035988 A1 WO1997035988 A1 WO 1997035988A1 EP 9701476 W EP9701476 W EP 9701476W WO 9735988 A1 WO9735988 A1 WO 9735988A1
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PCT/EP1997/001476
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Frank Niehaus
Garabed Antranikian
Bruno Frey
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Boehringer Mannheim Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the invention relates to a thermostable DNA polymerase from archaebacteria, a method for their extraction or cloning and their use, in particular for the enzymatic amplification of specific nucleic acid sequences (e.g. PCR).
  • the enzyme according to the invention which is obtainable from a Thermococcus strain, can be used to amplify nucleic acid fragments up to a length of approximately 5.0 kb specifically and in good yield.
  • thermostable DNA polymerases from archaebacteria are known today (Ciaramella et al., "Molecular biology of extremophiles” World Journal of Microbiology and Biotechnology JJ. 7 I “84 (1994)).
  • the enzymes come mainly to the specific ver Diversity of certain nucleic acids are used in clinical diagnostics and in the field of research, however, many of these thermostable DNA polymerases have undesired (side) activities or, with appropriate amplification methods, do not produce sufficient specificity of the nucleic acid fragments or are only too difficult to obtain - Common microorganisms accessible.
  • the object of the present invention was therefore to provide a new thermostable DNA polymerase which is particularly well suited for the specific duplication of nucleic acid fragments of approximately 10 kb in length or shorter fragments and can be made available reproducibly in good yield.
  • thermophilic microorganism which has an enzyme with DNA polymerase activity and high thermal stability.
  • the microorganism contains a nucleic acid sequence coding for the enzyme according to SEQ. ID NO: Contains 2 or fragments derived therefrom.
  • the thermophilic enzyme with DNA polymerase activity has a half-life of approx. 20 minutes at approx. 90 ° C (relative to the initial activity). New experiments have shown that the enzyme according to the invention even has a half-life of approximately 60 minutes at approximately 90 °.
  • the optimum temperature of the enzyme is between approximately 65 ° and 90 ° C., preferably approximately 70 ° C. to 80 ° C.
  • the DNA polymerase according to the invention has a pH optimum between approx. 7.2 and 7.8, in particular at approx. PH 7.5, and shows an optimal activity at a potassium chloride concentration between 60 and 120 mM, preferably at approx. 80 up to 100 mM.
  • the presence of magnesium ions is essential for the activity of the enzyme, advantageously in concentrations of approximately 10 mM or less.
  • a concentration of approximately 4 mM magnesium chloride (MgCl 2 ) has proven to be suitable and if, in addition, no or only traces of manganese ions, such as MnCl 2 , are present.
  • the DNA polymerase according to the invention also has 3'-5'-exonuclease activity, ie so-called "proofreading" activity. In the PCR reaction, this activity causes a degradation of the respective primers at a certain concentration of deoxynucleotide triphosphates (dNTPs); at higher nucleotide concentrations, this is overlaid by the polymerase activity of the enzyme. Ribonucleotides are not incorporated by the enzyme according to the invention.
  • Another object of the invention is a method for obtaining the DNA polymerase from corresponding thermophilic microorganisms, such as a heterotrophic, sulfur-reducing isolate of an archaeon with an optimum temperature at about 88 ° C.
  • thermophilic microorganisms such as a heterotrophic, sulfur-reducing isolate of an archaeon with an optimum temperature at about 88 ° C.
  • the microorganism Thermococcus spec. TY proved to be suitable.
  • a sample of the strain was deposited on March 20, 1996 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ), Mascherorder Weg lb, D-38124 Braunschweig under No. 10597.
  • Thermococcus spec. TY was carried out by means of PCR screening, and homologous DNA fragments were identified by means of Southern blot. This resulted in two restriction fragments that were used for cloning.
  • SEQ. ID NO: 2 the sequence of the DNA was determined (SEQ. ID NO: 2). The comparison of the corresponding amino acid sequence with that of other archaebacterial DNA polymerases showed a high homology of the enzymes.
  • the TY gene is the only gene.
  • the ineinfree DNA sequence (SEQ. ID NO: 4) was used for expression in E. coli.
  • Appropriately suitable strains and related methods, for example for disrupting the cells after expression and protein purification, are generally familiar to the person skilled in the art.
  • the crude extract obtained by cell disruption first undergoes heat denaturation and then at least two affinity chromatographies, one for the separation of nucleotide-binding proteins (eg Blue Sepharose) and one for components containing histidine groups (eg nickel chetate). In this way, approximately 50% of the starting activity of the TY-DNA polymerase could be achieved with a specific activity of approximately 4500 U / mg, which corresponds to an enrichment by a factor of approximately 134.
  • the purified fraction In addition to DNA polymerase activity, the purified fraction also showed 3'-5'-exonuclease ("proofreading") activity. It was found that a degradation of the primer used down to a nucleotide concentration of approximately 1 ⁇ M of deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) takes place in the reaction mixture. The 3'-5'-exonuclease activity, however, is superimposed by the polymerase activity of the enzyme at higher nucleotide concentrations. The one Ribonucleotides (NTPs, 100 ⁇ M) added to another test batch could not be incorporated.
  • NTPs deoxynucleotide triphosphates
  • Another object of the invention is the use of TY DNA polymerase for the multiplication of specific DNA fragments, such as in PCR.
  • the buffer solutions known to the person skilled in the art for PCR have proven suitable for this.
  • a 2 to 50 mM, preferably about 5 to 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.9) is used, the 10 to 100 mM, preferably about 20 to 60 mM potassium chloride, 0.75 to 4 mM, preferably 1.00 to 2.00 mM magnesium chloride and a zwitterionic detergent in an amount of about 0.01 to 0.1%.
  • the detergent Tween 20 has proven to be particularly advantageous here.
  • the DNA polymerase according to the invention has the advantage over other "proofreading" polymerases in particular that, as a single enzyme, it can specifically amplify fragments of genomic DNA that are 4 to 5 kb long in good yield.
  • Fig. 1 a Temperature dependence of TY DNA polymerase.
  • b Mg / Mn dependence TY DNA polymerase.
  • Fig. 2 Polymerase chain reaction (PCR) using the TY DNA polymerase. The following were used as primers: 1. [extein 1-extein 2], 2. [extein 1-extein 4], 3. [exein 1 -extein 6] (see Table 1). Chromosomal DNA from Thermococcus spec. TY (DSM 10597) used.
  • Fig. 3 Southern blot of the chromosomal DNA from Thermococcus spec. TY, restricted with 1. Xbal, 2. PstI, 3. Kpnl, 4. SphI and 5. Sacl. The Dig-PCR
  • Fig. 4 Sequencing methods pTYl and pTY2.
  • the starting vector is pUCBM21
  • Fig. 5 Sequencing vector pTY3.
  • the starting vector is pCR TM II (Invitrogen).
  • the insert amplified by PCR with the primers [c2981 -680peprev] has a size of approx. 2.7 kb.
  • Fig. 6 Southern blot of the chromosomal DNA from Thermococcus TY, resting with 1. Apal, 2. Sacl, 3. Smal, 4. BamHI, 5. Hindlll, 6. Kpnl and 7. Sphl.
  • the Dig-labeled PCR fragment with the Prime ⁇ aar [cty351-cty770] was used as a probe.
  • Fig. 7 Sequencing vector pTY4.
  • the starting vector is pCR TM II (Invitrogen).
  • the insert amplified by PCR with the primers [cty351-pUC / M13 rev] has a size of approx. 1.2 kb.
  • Fig. 8 Graphical overview of the arrangement of the extein and intein regions of the TY DNA polymerase compared to known DNA polymerases.
  • Fig. 9 Principle of deletion using PCR.
  • Fig. 10 Expression vector pTYPol.
  • Fig. 11 SDS-PAGE (gradient 10-15%) of the purification of the TY DNA polymerase
  • Fig. 12 Use of TY DNA polymerase in PCR and separation in SDS-PAGE:
  • Lane 1 1.3 kb
  • Lane 2 2.6 kb
  • Lane 3 4.35 kb
  • MWM molecular weight marker
  • composition of the medium is composition of the medium:
  • Vitamin solution (s.n.) 10 ml ad aqua dest 1000 ml
  • Vitamin B- 2 0.1 mg p-aminobenzoic acid 5 mg
  • the corresponding vessels were filled under an N 2 atmosphere and gassed for a few more minutes. They were then sealed with butyl rubber stoppers and aluminum caps or wire and autoclaved at 121 ° C for 20 minutes. The storage took place at room temperature.
  • the appropriately prepared media vessels were inoculated 10% with a liquid culture and incubated at 88 ° C. in a water bath for 24 hours. The cultures were then stored at 4 ° C.
  • the fermentation of The ⁇ nococcus spec. TY was carried out in a 20 1 stainless steel fermenter, which was operated according to the manufacturer.
  • the medium autoclaved in the fermenter was cooled to 88 ° C. and the pH was adjusted to pH 7 with sterile KOH solution.
  • During the fermentation process was treated with N 2 gassed (0.2 w '' m '').
  • the growth was photometrically documented and fermentation ended in the late log phase.
  • the cell cultures were cooled to 30 ° C ", and under aerobic conditions sterile 30 min at 4 ° C and 10,000 g centrifugation. Larger volumes (> 5 1) were continuously sedimented in a continuous rotor also at 4 ° C and 10,000 g.
  • the cell pellet obtained was then stored at -20 ° C.
  • the 16S rDNA was amplified as described (Barns SM et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 91, 1609-1613, 1994; Rainey FA et al. System Appl. Microbiol. 16, 224-226, 1992; Rainey FA and Stackebrandt, FEMS Microbiology Letters H3, 125-128, 1993).
  • the sequencing was carried out using the "Taq Dye-Deoxy TM Terminator Sequencing Kit” and "DNA Sequencer 373A” (Applied Biosystems, Foster City, USA).
  • the 16S rDNA sequence (SEQ. ID NO: 1) was manually compared against selected species from the Archaean realm. A phylogenetic dendrogram was created using the method of De Soete G., Psychometrika 48, 621-626, 1983.
  • Chromosomal DNA was purified by repeated phenol extraction. Approx. 200 mg of Thermococcus sp. TY (DSM 10597) resuspended in 500 ⁇ l RNase buffer and incubated for 5 minutes at room temperature (RT). The cells were disrupted and proteins denatured by extraction three times with a) Tris saturated phenol and b) phenol-chloroform-isoamyl alcohol (24: 24: 1). The aqueous phase was separated from the phenol phase by centrifugation, the proteins collecting in the intermediate phase. The DNA-containing solution was extracted three times with CWoroform / Isoaylohol (24/1) to remove phenol residues from the mixture.
  • the purified DNA was precipitated through 1 volume of isopropanol and 1/10 volume of 4 M LiCl, centrifuged at 13,000 g, dried at RT and in bidistilled in sterile H 2 O. or TE-Puffe- solved.
  • the quality of the DNA was checked electrophoretically and quantified photometrically at 260 nm.
  • the screening of the total DNA from The ⁇ nococcus TY for sequences which code for a DNA polymerase was carried out by means of PCR using various consensus oligonucleotide primers. These primers were generated on the basis of sequence comparisons of already known DNA polymerases from the order of the Thermococcales. The primers used and their derivation are listed in Table 1.
  • the PCR was carried out using the Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim) and the specified program with an annealing temperature of 55 ° C. and an elongation time of 2 minutes.
  • the Prime ⁇ aar [tcgl-cl 190] resulted in a discrete fragment with a size of approx. 1.1 kb.
  • This fragment was labeled with didoxenin (Dig) -labeled nucleotides and used as a probe to identify further fragments.
  • the direction of the insert in the vector and the size of the DNA region located downstream of the primer region tcgl were determined by means of PCR analysis. For this, the
  • the inserts of the two plasmids were sequenced. Sequencing revealed that the insert from pTYl was contained in pTY2. A sequence comparison of the first 1230 bases with the DNA ⁇ Polymerase sequences from Thermococcus lithoralis and Pvrococcus furiosus showed a similarity of 8% and 76%, respectively.
  • c2981 was synthesized, which is homologous to the end region of the pTY2 insert.
  • c2981 was combined with further consensus primers which were derived from sequence comparisons of Pyrococcus furiosus.
  • the amplificate was separated from non-specific PCR products by gel electrophoresis and isolated from the gel. In the following, the fragment was cloned directly.
  • the "TA Cloning® Kit” (Invitrogen) was used for this.
  • E.coli INVaF was transformed with the ligation batch and plated onto LB (ampicillin, X-Gal) agar dishes. 6 recombinant (white) colonies were examined for insertion by means of PCR. All contained the required 2.7 kb fragment.
  • the recombinant plasmid referred to below as pTY3 was isolated and sequenced (FIG. 5).
  • the end region of the TY polymerase gene was identified and cloned using a modified chromosome walking method.
  • a Dig-labeled probe with the Prime ⁇ aar [cty351-cty770] was generated via PCR. This represented a 420 bp sequence from the end region of the polymerase sequence of the vector pTY3 known to date.
  • This probe was also used for the screening of several restriction approaches analogously to the procedure described above.
  • the Southern blot gave a signal in the 3 kb range of the Sphl-RE approach (Fig. 6).
  • the DNA in this area was again isolated and used for ligation with the SphI-restricted and dephosphorylated vector pUCBM21.
  • this ligation approach was not used for transformation like the preceding vectors, but rather the DNA region adjacent to pTY4 was amplified directly by means of a PCR.
  • the Prime ⁇ aar [cty351 - pUC / M13 rev] was used for this.
  • the approximately 1.2 kb fragment contained the end region of the TY polymerase gene and a hypothetical stop codon.
  • the fragment was isolated by agarose gel electrophoresis and using the "TA Cloning® Kit" (Invitrogen) cloned. 6 recombinant (white) colonies were examined for insertion by means of PCR. All contained the required 1.2 kb fragment.
  • the recombined plasmid referred to below as pTY4 was isolated and sequenced (FIG. 7).
  • Fig. 8 gives a graphic overview of the position of the ex and ineins in the DNA polymerases listed in the alignment. An exception is the enzyme from Pyrococcus furiosus, which contains no intein elements.
  • the TY ORF is the only gene in which all three conserved intein regions can be found.
  • the high degree of homology of the individual exeine areas allows exact identification of the hypothetical intein areas in the TY DNA polymerase gene. To express the TY DNA polymerase, these regions of the gene were deleted.
  • FIG. 9 shows a schematic of the procedure.
  • the DNA fragments A and C to be linked were amplified in separate PCRs with the primers afonv-a rC v and Cf onv -c rev (1).
  • the primer a rev has a sequence at the 5 'end which is homologous to the N-terminal region of the C fragment.
  • the primer C fonv is homologous to the C-terminus of the fragment A.
  • the PCR resulted in two fragments A and C, each of which was extended by a region of the other fragment (2).
  • these regions were hybridized with one another and these mutually priming DNA single strands were elongated into a double strand (3).
  • the fusion fragment with the primers a fonv and ce V could be amplified and cloned (3).
  • the exein regions 1 and 2 and the regions 3 and 4 were first fused and the fragments extein 1-2 and extein 3-4 were linked to one another in a second PCR.
  • the primers extein 1-7 and extein9 used here are listed in Table 1.
  • a Ndel-RE site was added to the N-terminal end of the PCR and a BglII site for cloning into the expression vector (primer extein 1 + 9) at the C-terminus.
  • the intact DNA and amino acid sequence of the TY DNA polymerase can be found in SEQ. ID NO: 4.
  • the pET Expression System 15b (Novagen, Madison USA, Cat. No. 69668-1) was used as the expression system.
  • the vector was characterized by the following properties:
  • the polymerase gene was ligated into the Ndel-BamHI RE site so that the resulting
  • Fusion protein has an N-terminal histidine target site and a thrombin protease region to remove the histidine residues.
  • the NovaBlue strain was used to amplify the pTY Pol vector (Fig. 10).
  • the expression of the target gene was suppressed here since the strain contains no T7 RNA polymerase gene. Any interfering influences of the recombinant protein from the growth of the cells were thus reduced.
  • the strain BL21 (DE3) carries a chromosomal copy of the T7 RNA polymerase. This is under the control of the lacUV5 promoter inducible by IPTG.
  • BL21 (DE3) was transformed with the vector pTY Pol and cultivated in LB medium under selective conditions (LB + 50 ⁇ g / ml ampicillin). At a cell density of OD 0.6, expression was induced with 2 mM IPTG and the cells were cultivated further into the late log phase.
  • the centrifuged cells were resuspended in TY digestion buffer (50 mM Tris / HCl, pH 7.5, 10 mM KC1, 0.5 mM EDTA, 10 mM MgCl 2 , 5 mM DTT) and digested using ultrasound.
  • TY digestion buffer 50 mM Tris / HCl, pH 7.5, 10 mM KC1, 0.5 mM EDTA, 10 mM MgCl 2 , 5 mM DTT
  • the protein was purified in three steps:
  • the crude extract was incubated at 80 ° C. for 15 minutes immediately after the digestion.
  • the heat-labile denatured proteins were centrifuged off at 40,000 g for 20 min and the supernatant was filtered (0 0.45 ⁇ m).
  • Blue Sepharose carries the dye Cibacron Blue 3G-A as a functional group. Proteins that have a nucleotide binding pocket are bound.
  • the filtered crude extract was applied several times over a 1 ml HiTrap Blue column.
  • the maximum binding capacity is 20 mg protein / ml column material.
  • Unbound protein was rinsed off the column with TY digestion buffer and the bound proteins with a linear gradient eluted (10 mM - 1.5 M KC1 in the digestion buffer).
  • the flow rate was 0.5 ml / min for 50 fractions of 0.5 ml each.
  • the enzymatically active fractions were pooled and buffered against imidazole buffer (Centricon. Exclusion size 30 kDa).
  • the N-terminal histidine residues of the recombinant polymerase bind to immobilized Ni 2+ cations of the column material and are replaced by imidazole during the elution.
  • the activity of the individual fractions was determined as above.
  • the active fractions were pooled and dialyzed against TY polymerase layer buffer (50 mM Tris / HCl, pH 7.5, 100 mM KC1, 0.5 mM EDTA, 5 mM DTT, 50% glycerol).
  • TY polymerase layer buffer 50 mM Tris / HCl, pH 7.5, 100 mM KC1, 0.5 mM EDTA, 5 mM DTT, 50% glycerol.
  • the DNA polymerase activity was determined indirectly via an "enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA). Calf thymus DNA activated with DNasel was used as the substrate. The DNA polymerase synthesizes complementary free nucleotides at the free 3 'end to the opposite strand. In addition to the four native nucleotide triphosphates, digoxigenin-labeled dUTP (Boehringer Mannheim) was also offered in the reaction mixture to quantify the newly formed double strand. After the polymerase reaction, the dUTP Installation quantified.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • ⁇ Boehringer Mannheim anti-DIG alkaline phosphatase (AP) Fab frag- ments.) was a DIG-Antikö ⁇ er used, which was in turn coupled to an alkaline phosphatase.
  • the AP chemiluminescent substrate Lumigen TM PPD (Lumigen Inc. Detroit, USA) was used for detection. The light emission was measured in the lumometer and compared against a reference polymerase.
  • the DNA polymerase test was composed as follows:
  • SM045BWP SM045BWP
  • the bottom of these microtitre plates consisted of a nylon membrane with a pore diameter of 0.45 ⁇ m.
  • the DNA in the reaction mixture was coupled to the membrane by heating at 70 ° C. for 10 minutes.
  • the dig-labeled DNA was detected in a vacuum chamber.
  • the individual solutions were sucked through the membrane. First, it was incubated 2 ⁇ 2 minutes with 100 ⁇ l blocking buffer to prevent non-specific antibody binding. The mixture was then incubated 2 ⁇ 2 minutes with 100 ⁇ l of antibody solution. Between the individual steps, the solutions were vacuumed off. To remove excess antibodies, 2 times 200 ⁇ l of washing buffer were applied under vacuum and buffered twice with AP buffer. The detection was carried out by 5 minutes incubation with Lumigen TM PPD (1: 100 in AP buffer). The substrate was suctioned off and the light emission was measured after a further 15 minutes in the luminometer.
  • Taq DNA polymerase (Boehringer Mannheim) was used as the reference enzyme for calibration.
  • Taq Pol incubation buffer 250mM Tris-HCl, pH 9.0, 500mM KC1, 20mM
  • AP buffer 100mM Tris-HCl, pH 9.5, 100mM NaCl, 50mM
  • the 3'-5'-exonuclease (“proofreading") activity was determined with the aid of 5'-digoxygenin-labeled DNA.
  • a defined DNA primer / template hybrid was used as the test substrate.
  • the enzyme was used in the PCR under the following conditions:
  • the batches are pipetted separately on ice and combined immediately before the start of the reaction.
  • AAAGGAAUUG NCGGGGGAGC ACÜACAAGGG GÜGGAGCGUG CGGUUÜAAUÜ GGAUUCAACG 900
  • CAAAGCTCAA AACAGGTTGG ACTGGACGCG TGGCTTAAGA AGTAG 2325
  • MOLECULE TYPE cDNA
  • SEQUE DESCRIPTION SEQ ID NO: 16:

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Abstract

Thermostabiles Enzym mit DNA-Polymerase- und 3'-5'-Exonuklease-Aktivität erhältlich aus Thermococcus spec. TY (DSM 10597); die zugrunde liegende genomische DNA entspricht den in SEQ. ID NO:2 und SEQ. ID NO:4 wiedergegebenen Nukleinsäuresequenzen. Die Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung des rekombinanten thermophilen Enzyms sowie dessen Verwendung zur spezifischen Vervielfältigung von Nukleinsäuresequenzen.

Description

THERMOSTABILE DNA-POLYMERASE AUS THERMOCOCCUS SPEC . TY
Die Erfindung betrifft eine thermostabile DNA-Polymerase aus Archaebakterien, ein Ver¬ fahren zu deren Gewinnung bzw. Klonierung sowie deren Verwendung, insbesondere zur enzymatischen Amplifikation von spezifischen Nukleinsäuresequenzen (z.B. PCR). Insbe¬ sondere können mit dem erfindungsgemäßen Enzym, welches aus einem Thermococcus- Stamm erhältlich ist, Nukleinsäurefragmente bis zu einer Länge von ca. 5,0 kb spezifisch und in guter Ausbeute amplifiziert werden.
Es sind heute eine Reihe thermostabiler DNA-Polymerasen aus Archaebakterien bekannt (Ciaramella et al., "Molecular biology of extremophiles" World Journal of Microbiology and Biotechnology JJ.. 7 I "84 (1994)). Die Enzyme kommen hauptsächlich zur spezifischen Ver¬ vielfältigung bestimmter Nukleinsäuren in der klinischen Diagnostik und im Forschungsbe¬ reich zum Einsatz. Viele dieser thermostabilen DNA-Polymerasen weisen jedoch nicht ge¬ wünschte (Neben-)aktivitäten auf bzw. bewirken bei entsprechenden Amplifikationsverfahren keine ausreichende Spezifität der Nukleinsäurefragmente oder sind lediglich über schwer zu- gängliche Mikroorganismen zugänglich.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war somit, eine neue thermostabile DNA-Polymerase zur Verfügung zu stellen, die sich insbesondere gut zur spezifischen Vervielfältigung von Nu- kleinsäurefragmenten von ca. 10 kb Länge oder kürzeren Fragmenten eignen und sich in guter Ausbeute reproduzierbar zur Verfügung stellen lassen.
Die Aufgabe wird gelöst durch einen hoch thermophilen Mikroorganismus, welcher ein En¬ zym mit DNA-Polymerase- Aktivität und hoher Thermostabilität aufweist. Darüber hinaus ent¬ hält der Mikroorganismus eine für das Enzym codierende Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ. ID NO: 2 oder hiervon abgeleitete Fragmente enthält. Das thermophile Enzym mit DNA-Po- lymerase-Aktivität besitzt eine Halbwertszeit von ca. 20 Minuten bei ca. 90°C (relativ zur Ausgangsaktivität). Neue Versuche haben gezeigt, daß das erfindungsgemäße Enzym sogar eine Halbwertszeit von ca. 60 Minuten bei ca. 90° aufweist. Das Temperaturoptimum des Enzyms liegt zwischen ca. 65° und 90°C, vorzugsweise bei ca. 70°C bis 80°C. Ferner weist die erfindungsgemäße DNA-Polymerase ein pH-Optimum zwischen ca. 7,2 und 7,8, insbeson¬ dere bei ca. pH 7.5 auf und zeigt eine optimale Aktivität bei einer Kaliumchloridkonzentration zwischen 60 und 120 mM, bevorzugt bei ca. 80 bis 100 mM. Die Anwesenheit von Magnesi¬ umionen ist für die Aktivität des Enzyms unerläßlich, und zwar vorteilhafterweise in Konzen¬ trationen von ca. 10 mM oder weniger. Insbesondere hat sich eine Konzentration von ca. 4 mM Magnesiumchlorid (MgCI2) als geeignet erwiesen und wenn zudem keine bzw. ledig¬ lich Spuren von Manganionen, wie z.B. MnCl2, zugegen sind. Es konnte vielmehr gezeigt werden, daß die Anwesenheit von Manganionen, ab ca. 2 mM, die Polymeraseaktivität deut¬ lich inhibiert. Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase weist zudem 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, d.h. soge¬ nannte "proofreading"-Aktivität auf. Bei der PCR-Reaktion findet aufgrund dieser Aktivität eine Degradation der jeweiligen Primer bei einer bestimmten Konzentration an Desoxynu- kleotidtriphosphaten (dNTPs) statt; bei höheren Nukleotidkonzentrationen wird diese von der Polymeraseaktivität des Enzyms überlagert. Ribonukleotide werden von dem erfindungsge¬ mäßen Enzym nicht eingebaut.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung der DNA-Poly¬ merase aus entsprechenden thermophilen Mikroorganismen, wie einem heterotrophen, schwefelreduzierenden Isolat eines Archaeon mit einem Termperaturoptimum bei ca. 88°C. Insbesondere hat sich hier der Mikroorganismus Thermococcus spec. TY als geeignet erwie¬ sen. Eine Probe des Stammes ist am 20.03.1996 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorga¬ nismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascherorder Weg lb, D-38124 Braunschweig unter Nr. 10597 hinterlegt worden.
Nach geeigneter Fermentation wurde die gesamte chromosonale DNA durch mehrmalige Phe¬ nolextraktion isoliert. Die Detektion von DNA-Polymerasen kodierenden Nukleinsäurese¬ quenzen aus Thermococcus spec. TY erfolgte mittels PCR-Screening, die Identifizierung ho¬ mologer DNA-Fragmente mittels Southern Blot. Dabei ergaben sich zwei Restriktionsfrag- mente, die zur Klonierung eingesetzt wurden. Nach entsprechender Selektion über Erstellung einer angereicherten Genbank, Plasmidligation, Transformation und Screening mittels PCR wurde die Sequenz der DNA ermittelt (SEQ. ID NO: 2). Der Vergleich der entsprechenden Aminosäuresequenz mit der anderer archaebakteriellen DNA-Polymerasen ergab eine hohe Homologie der Enzyme. Jedoch ist das TY-Gen das einzige Gen. in dem drei konservierten Inteinregionen enthalten sind. Dadurch ist eine klare Differenzierung zwischen Intein- und Exteinbereichen möglich, was insbesondere vorteilhaft für das angestrebte Expressionspro¬ dukt ist. Die inteinfreie DNA-Sequenz (SEQ. ID NO: 4) wurde zur Expression in E. coli ver¬ wendet. Entsprechend geeignete Stämme sowie diesbezügliche Methoden, beispielsweise zum Aufschließen der Zellen nach Expression und Proteinreinigung sind dem Fachmann prinzi- piell geläufig. Für die Aufreinigung des TY DNA-Polymeraseproteins hat sich besonders vor¬ teilhaft erwiesen, wenn der mittels Zellaufschluß gewonnene Rohextrakt zunächst einer Hitze- denaturierung und anschließend mindestens zwei Affinitätschromatographien, eine zur Ab¬ trennung von Nukleotid-bindenden, Proteinen (z.B. Blue Sepharose) und eine für Histidin- gruppen-aufweisende Bestandteile (z.B. Nickelchetat), unterzogen wird. Auf diese Weise kon- nten annähernd 50% der Ausgangsaktivität der TY-DNA-Polymerase mit einer spezifischen Aktivität von ca. 4500 U/mg erzielt werden, was einer Anreicherung um den Faktor von ca. 134 entspricht.
Die aufgereinigte Fraktion zeigte neben DNA-Polymerase- Aktivität zudem 3'-5'-Exonuklease- ("proofreading"-)Aktivität. Dabei zeigte sich, daß eine Degradation des verwendeten Primers bis zu einer Nukleotidkonzentration von ca. 1 μM an Desoxynukleotidtriphosphaten (dNTPs) im Reaktionsansatz stattfindet. Die 3'-5'-Exonukleaseaktivität wird dagegen bei höheren Nukleotidkonzentrationen von der Polymeraseaktivität des Enzyms überlagert. Die in einem weiteren Testansatz zugegebenen Ribonukleotide (NTPs, 100 μM) konnten nicht eingebaut werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist der Einsatz der TY DNA-Polymerase zur Ver- vielfaltigung spezifischer DNA-Fragmente, wie beispielsweise in der PCR. Hierfür haben sich prinzipiell die dem Fachmann für die PCR bekannten Pufferlösungen als geeignet erwiesen. In der Regel wird ein 2 bis 50 mM, bevorzugt ca. 5 bis 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,9) verwen¬ det, der 10 bis 100 mM, bevorzugt ca. 20 bis 60 mM Kaliumchlorid, 0,75 bis 4 mM, bevor¬ zugt 1,00 bis 2.00 mM Magnesiumchlorid und ein zwitterionisches Detergenz in einer Menge von ca. 0,01 bis 0,1% aufweist. Das Detergenz Tween 20 hat sich hier als besonders vorteil¬ haft erwiesen.
Auf diese Weise konnten Nukleinsäurefragmente bis zu einer Länge von ca. 5000 Basen¬ paaren spezifisch amplifiziert werden. D.h. die erfindungsgemäße DNA-Polymerase hat ge- genüber anderen "proofreading"-Polymerasen insbesondere den Vorteil, daß sie als einzelnes Enzym bereits 4 bis 5 kb lange Fragmente aus genomischer DNA in guter Ausbeute spezifisch amplifizieren kann.
Abbildungen:
Abb. 1 a: Temperaturabhängigkeit TY DNA-Polymerase. b: Mg/Mn-Abhängigkeit TY DNA-Polymerase.
Abb. 2: Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung der TY DNA-Polymerase. Als Primer wurden verwendet: 1. [extein 1-extein 2], 2. [extein 1-extein 4], 3. [ex- tein 1 -extein 6] (s. Tabelle 1 ). Als Template wurde chromosomale DNA aus Thermococcus spec. TY (DSM 10597) eingesetzt.
Abb. 3: Southern Blot der chromosomalen DNA aus Thermococcus spec. TY, restringiert mit 1. Xbal, 2. PstI, 3. Kpnl, 4. SphI und 5. Sacl. Als Sonde wurde das Dig-PCR-
Fragment [tcgl -cl 190] verwendet.
Abb. 4: Sequenzierungsverfahren pTYl und pTY2. Ausgangsvektor ist pUCBM21
(Boehringer Mannheim). In beiden Fällen ist das Insert, bezogen auf die Richtung des Primers tcgl, im Uhrzei gersinn insertiert. Im Fall von pTYl beträgt die
Fragmentgröße zwischen tcgl und pUC/M13 forward ca. 1,3 kb, im Fall pTY2 ca. 3,2 kb.
Abb. 5: Sequenzierungsvektor pTY3. Ausgangsvektor ist pCR™II (Invitrogen). Das über eine PCR mit den Primern [c2981 -680peprev] amplifizierte Insert hat eine Größe von ca. 2,7 kb. Abb. 6: Southern Blot der chromosomalen DNA aus Thermococcus TY, restingiert mit 1. Apal, 2. Sacl, 3. Smal, 4. BamHI, 5. Hindlll, 6. Kpnl und 7. Sphl. Als Sonde wurde das Dig-markierte PCR-Fragment mit dem Primeφaar [cty351-cty770] verwendet. Abb. 7: Sequenzierungsvektor pTY4. Ausgangsvektor ist pCR™II (Invitrogen). Das über eine PCR mit den Primern [cty351-pUC/M13 rev] amplifizierte Insert hat eine Größe von ca. 1,2 kb.
Abb. 8: Graphische Übersicht über die Anordnung der Extein- und Inteinregionen der TY DNA-Polymerase im Vergleich zu bekannten DNA-Polymerasen.
Abb. 9: Prinzip der Deletion mittels PCR.
Abb. 10: Expressionsvektor pTYPol.
Abb. 11 : SDS-PAGE (Gradient 10-15%) der Aufreinigung der TY DNA-Polymerase
(Gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine des TY-Rohextraktes (Spur 1 ), nach Hitzedenaturierung, 10 min, 80°C (Spur 2) und der beiden chromatogra¬ phischen Aufreinigungen (Hi Trap Blue, Spur 3; Ni-Chelat, Spur 4); LS Längen- Standard).
Abb. 12: Verwendung der TY DNA-Polymerase in der PCR und Auftrennung im SDS- PAGE:
A) Spur 1 : 1,3 kb; Spur 2: 2,6 kb; Spur 3: 4,35 kb;
MWM: Molekurlargewichtsmarker
B) Abhängigkeit der Menge an PCR-Produkt vom pH-Wert (8.2-9,4)
C) von der Konzentration an KC1 (0-100 mM)
D) und von der Konzentration an MgCl2 (0,5-3.0 mM).
SEQ. ID NO: 1
1 CCACUGCUAU GGGGGÜCCGA CUAAGCCAÜG CGAGUCAUGG GGUCCCUCUG GGACACCACC 61 GGCGGACGGC ÜCAGÜAACAC GUCGGUAACC UACCCUCGGG AGGGGGAUAA CCCCGGGAAA 121 CUGGGGCUAA UCCCCCAUAG GCCUGAGGUA CÜGGAAGGUC CUCAGGCCGA AAGGGGCUUU 181 UGCCCGCCCG AGGAUGGGCC GGCGGCCGAÜ UAGGUAGUUG GUGGGGÜAAC GGCCCACCAA 241 GCCGAAGAUC GGUACGGGCU GUGAGAGCAG GAGCCCGGAG AUGGACACÜG AGACACGGGU 301 CCAGGCCCUA CGGGGCGCAG CAGGCGCGAA ACCUCCGCAA UGCGGGAAAC CGCGACGGGG 361 GGACCCCGAG UGCCGUGGUA UCGACACGGU UUUUCCGGAG UGUAAAAAGC UCCGGGAAUA 421 AGGGCUGGNC AAGGCCGGUG GCAGCCGCCG CGGUAAUACC GGCGGCCCGA GUGGUGGCCG 481 CUAUUAUUGG GCCUAAAGCG UCCGUAGCCG GGCCCGUAAG UCCCUGGCGA AAUCCCACGG 541 CUCAACCGUG GGGCUUGCUG GGGAUACUGC GGGCCUUGGG ACCGGGAGAG GCCGGGGGUA 601 CCCCUGGGGU AGGGGUGAAA UCCUAUAAUC CCAGGGGGAC CGCCAGUGGC GAAGGCGCCC 661 GGCUGGAACG GGUCCGACGG UGAGGGACGA AGGCCAGGGG AGCAAACCGG AUUAGAUACC 721 CGGGUAGUCC UGGAUGUAAA GGAUGCGGGC UAGGUGUCGG GCGAGCUUCG AGCUCGCCCG 781 GUGCCGUAGG GAAGCCGUUA AGCCCGCCGC CUGGGGAGUA CGGCCGCAAG GCUGAAACUU 841 AAAGGAAUUG NCGGGGGAGC ACUACAAGGG GUGGAGCGUG CGGUUUAAUU GGAUUCAACG 901 CCGGGAACCU CACCGGGGGC GACGGCAGGA UGAAGGCCAG GCUGAAGGUC UUGCCGGACA 961 CGCCGAGAGG AGGUGCAUGG CCGCCGUCAG CUCGUACCGU GAGGCGUCCA CUUAAGUGUG 1021 GUAACGAGCG AGACCCGCGC CCCCAGUUGC CAGCCCUUCC CGUUGGGAAG GGGGCACUCU 1081 GGGGGGACUG CCGGCGAUAA GCCGGAGGAA GGAGCGGGCG ACGGUAGGUC AGUAUGCCCC 1141 GAAACCCCCG GGCUACACGC GCGCUACAAU GGGCGGGACA AUGGGAUCCG ACCCCGAAAG 1201 GGGAAGGUAA UCCCCUAAAC CCGCCGUCAG UUCGGAUCGC GGGCUGCAAC UCGCCCGCGU 1261 GAAGCUGGAA UCCCUAGUAC CCGCGUGUCA UCAUCGCGCG G
SEQ. ID NO: 1 16S rDNA Sequenz aus Thermococcus spec. TY
SEQ. LD NO: 2
TYPol mit Inteinsequenzen
SEQ. ID NO: 3 (Protein)
I I I ! I 60
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I I I I I 120
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I I I I I 180
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I I I I i 240
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I I I I I 300
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I I I I I 360
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I ! I I I 420
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I I I I I 480
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I I I I I 540
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I I I I I 600
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I I I I I 660
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I I I I I 720
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I I I I I 780
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I I I I I 900
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I I I I I 960
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I I I I I 1020
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I I I I I 1080
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I I I I I 1140
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I I I I I 1200
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I I I ! I 1320
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I I I I I 1380
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I I I I I 1500
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I I I I I 1560
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I I I I I 1620
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I I I I I 1740
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I I I I I 2040
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I I I I I 2100
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GTTGAAAAAAGAGAATATGAAGGGTATGTCTATGATTTGAGCGTTGAAGACAACGAAAAC ValGluLysArgGluTyrGluGlyTyrValTyrAspLeuSerValGluAspAsnGluAsn I I I I I 4200
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I I I I I 4260
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I I I I I 4320
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GACAGCGTTACGGGTGATACGGAGATAATCGTTAAGAGAAATGGGCGGATAGAGTTTGTT AspSerValThrGlyAspThrGluIlelleValLysArgAsnGlyArglleGluPheVal
I I I I I 4440
CCTATTGAAAAGCTCTTTGAACGCGTAGATTACCGGATTGGAGAAAAAGAATACTGCATC ProIleGluLysLeuPheGluArgValAspTyrArglleGlyGluLysGluTyrCysIle
I I I I I 4500
CTTGAGGACGTTGAAGCGCTGACACTCGACAATAGAGGCAAGCTCATCTGGAAAAAAGTT LeuGluAspValGluAlaLeuThrLeuAspAsnArgGlyLysLeuIleTrpLysLysVal
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CCGTACGTTATGAGGCACAGAGCGAAAAAGAAGGTCTACCGCATCTGGATTACAAACTCG ProTyrValMetArgHisArgAlaLysLysLysValTyrArglleTrpIleThrAsnSer
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TGGTACATTGACGTTACCGAGGATCACTCTCTTATAGTAGCTGAGGATGGTCTGAAGGAA TrpTyrlleAspValThrGluAspHisSerLeuIleValAlaGluAspGlyLeuLysGlu
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GCTAGGCCAATGGAAATCGAAGGCAAGAGCCTAATAGCGACCAAAGATGACCTTTCAGGA AlaArgProMetGluIleGluGlyLysSerLeuIleAlaThrLysAspAspLeuSerGly
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GTGGAATATATCAAGCCTCATGCCATCGAGGAAATATCCTACAACGGCTACGTTTACGAC ValGluTyrlleLysProHisAlalleGluGluIleSerTyrAsnGlyTyrValTyrAsp
I I I I I 4800
ATCGAGGTGGAGGGGACCCACAGGTTCTTCGCAAATGGAATACTCGTGCACAACACTGAT IleGluValGluGlyThrHisArgPhePheAlaAsnGlylleLeuValHisAsnThrAsp
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GGTTTTTACGCCACAATACCGGGAGAAAAACCTGAAACAATCAAAAAGAAAGCTAAGGAA GlyPheTyrAlaThrlleProGlyGluLysProGluThrlleLysLysLysAlaLysGlu
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TTCTTAAAATACATAAACTCCAAACTTCCCGGTCTGCTCGAGCTTGAGTATGAGGGCTTT PheLeuLysTyrlleAsnSerLysLeuProGlyLeuLeuGluLeυGluTyrGluGlyPhe
I I I I I 4980
TACTTGAGAGGATTTTTCGTCGCAAAGAAGCGCTATGCGGTTATAGACGAAGAAGGTAGG TyrLeuArgGlyPhePheValAlaLysLysArgTyrAlaVallleAspGluGluGlyArg I ! I I I 5040
ATAACGACAAGGGGTCTGGAAGTTGTAAGGAGGGACTGGAGCGAAATAGCCAAAGAGACC IleThrThrArgGlyLeuGluValValArgArgAspTrpSerGluIleAlaLysGluThr
I I I I I 5100
CAGGCTAAAGTCTTGGAGGCAATACTTAAAGAAGATAGTGTCGAAAAAGCTGTGGAAATC GlnAlaLysValLeuGluAlalleLeuLysGluAspSerValGluLysAlaValGluIle
I I I I I 5160
GTTAAGGACGTTGTTGAGGAGATAGCAAAATACCAAGTCCCGCTTGAAAAGCTTGTTATC ValLysAspValValGluGluIleAlaLysTyrGlnValProLeuGluLysLeuVallle
I I I I I 5220
CACGAGCAGATTACCAAGGATCTAAGTGAATACAAAGCCATTGGGCCTCATGTAGCAATA HisGluGlnlleThrLysAspLeuSerGluTyrLysAlalleGlyProHisValAlalle
I I I I I 5280
GCAAAGAGGCTTGCTGCAAAGGGAATAAAAGTGAGACCCGGCACGATAATAAGCTATATC AlaLysArgLeuAlaAlaLysGlylleLysValArgProGlyThrllelleSerTyrlle
I I I I I 5340
GTCCTCAGGGGAAGCGGAAAGATAAGTGACAGGGTAATTTTGCTTTCAGAGTATGATCCG ValLeuArgGlySerGlyLysIleSerAspArgVallleLeuLeuSerGluTyrAspPro
I I I I I 5400
AAAAAACACAAGTACGACCCCGACTACTACATAGAAAACCAAGTTCTGCCGGCGGTGCTT LysLysHisLysTyrAspProAspTyrTyrlleGluAsnGlnValLeuProAlaValLeu
I I I I I 5460
AGGATCCTTGAAGCCTTCGGCTACAGAAAAGAGGACTTAAAATACCAAAGCTCAAAACAG ArglleLeuGluAlaPheGlyTyrArgLysGluAspLeuLysTyrGlnSerSerLysGln
I I I I I 5520
GTTGGACTGGACGCGTGGCTTAAGAAGTAG ValGlyLeuAspAlaTrpLeuLysLys
ORF der zusammengesetzten DNA Sequenz (SEQ. ID NO: 2) der Plasmide pTYl-4 und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ. ID NO: 3)
SEQ. ID NO* 4 SEQ. ID NO: 5
I I I I I 60
ATGATATTAGACACTGACTACATAACAAAGGACGGTAAACCCATAATTCGAATTTTCAAG MetlleLeuAspThrAspTyrlleThrLysAspGlyLysProIlelleArgllePheLys
I I I I I 120
AAAGAGAACGGGGAATTTAAAATAGAACTTGATCCACATTTTCAGCCCTACATTTACGCT LysGluAsnGlyGluPheLysIleGluLeuAspProHisPheGlnProTyrlleTyrAla
I I I I I 180
CTTCTCAAAGATGACTCCGCTATTGATGAAATAAAAGCAATAAAAGGCGAGAGACACGGA LeuLeuLysAspAspSerAlalleAspGluIleLysAlalleLysGlyGluArgHisGly
I I I I I 240
AAAATTGTGAGAGTAGTCGATGCAGTGAAAGTCAAGAAGAAATTTTTGGGGAGAGATGTT LysIleValArgValValAspAlaValLysValLysLysLysPheLeuGlyArgAspVal
I I I I I 300
GAGGTCTGGAAGCTTATATTTGAGCATCCCCAAGACGTCCCGGCCCTAAGGGGCAAGATA GluValTrpLysLeuIlePheGluHisProGlnAspValProAlaLeuArgGlyLysIle
I I I I I 360
AGGGAACATCCAGCTGTGATTGACATTTATGAGTACGACATACCCTTTGCCAAGCGCTAC ArgGluHisProAlaVallleAspIleTyrGluTyrAspIleProPheAlaLysArgTyr
I I I I I 420
CTCATAGACAAGGGCTTGATCCCTATGGAGGGCGACGAGGAGCTTAAGCTAATGGCCTTC LeuIleAspLysGlyLeuIleProMetGluGlyAspGluGluLeuLysLeuMetAlaPhe
I I I I I 480
GACATTGAGACGTTTTACCACGAGGGAGACGAGTTTGGGAAGGGCGAGATAATAATGATA AspIleGluThrPheTyrHisGluGlyAspGluPheGlyLysGlyGluIlelleMetlle
I I I I I 540
AGCTACGCCGATGAGGAAGAGGCAAGGGTAATTACATGGAAGAATATTGATCTGCCCTAC SerTyrAlaAspGluGluGluAlaArgVallleThrTrpLysAsnlleAspLeuProTyr
I I I I I 600
GTTGATGTTGTATCCAACGAAAGGGAGATGATAAAGCGGTTTGTGCAAATTGTCAGGGAA ValAspValValSerAsnGluArgGluMetlleLysArgPheValGlnlleValArgGlu
I I I I I 660
AAAGACCCGGATGTCCTGATAACTTACAATGGAGACAACTTTGATTTGCCGTACCTTATA LysAspProAspValLeuIleThrTyrAsnGlyAspAsnPheAspLeuProTyrLeuIle
I I I I I 720
AAAAGGGCAGAGAAGTTAGGAGTTACTCTTCTCTTGGGGAGGGACAAAGAACACCCCGAG LysArgAlaGluLysLeuGlyValThrLeuLeuLeuGlyArgAspLysGluHisProGlu
I I I I I 780
CCCAAGATTCACAGAATGGGCGATAGCTTTGCCGTGGAAATTAAAGGCAGAATTCACTTT ProLysIleHisArgMetGlyAspSerPheAlaValGluIleLysGlyArglleHisPhe I I I I I 840
GATCTCTTCCCGGTTGTGCGGAGAÄCCATAAACCTCCCAACATACACGCTTGAGGCAGTT AspLeuPheProValValArgArgThrlleAsnLeuProThrTyrThrLeuGluAlaVal
I I I I I 900
TATGAAGCCGTCTTGGGAAAAACCAAAAGCAAGCTGGGTGCGGAGGAAATCGCCGCCATC TyrGluAlaValLeuGlyLysThrLysSerLysLeuGlyAlaGluGluIleAlaAlalle
I I I I I 960
TGGGAAACAGAGGAGAGCATGAAGAAGCTGGCCCAGTACTCGATGGAAGATGCTAGGGCA TrpGluThrGluGluSerMetLysLysLeuAlaGlnTyrSerMetGluAspAlaArgAla
I I I I I 1020
ACTTATGAACTCGGAAAAGAGTTTTTCCCCATGGAGGCAGAGCTAGCAAAGCTAATAGGC ThrTyrGluLeuGlyLysGluPhePheProMetGluAlaGluLeuAlaLysLeuIleGly
I I I I I 1080
CAAAGCGTATGGGACGTCTCAAGATCAAGCACTGGCAACCTTGTAGAGTGGTACCTGTTA GlnSerValTrpAspValSerArgSerSerThrGlyAsnLeuValGluTrpTyrLeuLeu
I I I I I 1140
AGGGTGGCATATGAGAGGAATGAGCTCGCTCCGAACAAGCCGGATGAAGAAGAGTACAGA ArgValAlaTyrGluArgAsnGluLeuAlaProAsnLysProAspGluGluGluTyrArg
I I I I I 1200
AGGCGTTTAAGGACTACTTACCTGGGAGGATACGTAAAAGAGCCGGAAAGAGGCTTATGG ArgArgLeuArgThrThrTyrLeuGlyGlyTyrValLysGluProGluArgGlyLeuTrp
I I I I I 1260
GAGAACATCGCCTATTTAGACTTTAGGTCTCTATACCCCTCAATTATAGTTACCCACAAC GluAsnlleAlaTyrLeuAspPheArgSerLeuTyrProSerllelleValThrHisAsn
I I I I I 1320
GTCTCCCCTGACACTTTAGAAAGAGAAGGCTGCAAGAATTACGATGTTGCCCCGATAGTA ValSerProAspThrLeuGluArgGluGlyCysLysAsnTyrAspValAlaProIleVal
I I I I I 1380
GGTTATAAGTTCTGCAAGGATTTTCCCGGTTTCATTCCATCTATACTCGGGGAATTAATC GlyTyrLysPheCysLysAspPheProGlyPhelleProSerlleLeuGlyGluLeuIle
I I I I I 1440
ACAATGAGGCAAGAAATAAAGAAGAAGATGAAAGCTACAATTGACCCAATAGAAAAGAAA ThrMetArgGlnGluIleLysLysLysMetLysAlaThrlleAspProIleGluLysLys
I I I I I 1500
ATGCTTGATTATAGGCAAAGAGCTGTTAAATTGCTCGCAAACAGCTATTACGGTTATATG MetLeuAspTyrArgGlnArgAlaValLysLeuLeuAlaAsnSerTyrTyrGlyTyrMet
I I I I I 1560
GGCTATCCCAAGGCGAGGTGGTACTCGAAGGAATGTGCCGAAAGCGTTACCGCGTGGGGA GlyTyrProLysAlaArgTrpTyrSerLysGluCysAlaGluSerValThrAlaTrpGly
I I I I I 1620
AGGCACTACATAGAAATGACCATAAAAGAGATAGAGGAGAAATTTGGATTTAAGGTGCTA ArgHisTyrlleGluMetThrlleLysGluIleGluGluLysPheGlyPheLysValLeu I I I I I 1680
TATGCCGACACTGATGGTTTTTACGCCACAATACCGGGAGAAAAACCTGAAACAATCAAA TyrAlaAspThrAspGlyPheTyrAlaThrlleProGlyGluLysProGluThrlleLys
I I I I I 1740
AAGAAAGCTAAGGAATTCTTAAAATACATAAACTCCAAACTTCCCGGTCTGCTCGAGCTT LysLysAlaLysGluPheLeuLysTyrlleAsnSerLysLeuProGlyLeuLeuGluLeu
I I I I I 1800
GAGTATGAGGGCTTTTACTTGAGAGGATTTTTCGTCGCAAAGAAGCGCTATGCGGTTATA GluTyrGluGlyPheTyrLeuArgGlyPhePheValAlaLysLysArgTyrAlaVallle
I I I I I 1860
GACGAAGAAGGTAGGATAACGACAAGGGGTCTGGAAGTTGTAAGGAGGGACTGGAGCGAA AspGluGluGlyArglleThrThrArgGlyLeuGluValValArgArgAspTrpSerGlu
I I I I I 1920
ATAGCCAAAGAGACCCAGGCTAAAGTCTTGGAGGCAATACTTAAAGAAGATAGTGTCGAA IleAlaLysGluThrGlnAlaLysValLeuGluAlalleLeuLysGluAspSerValGlu
I I I I I 1980
AAAGCTGTGGAAATCGTTAAGGACGTTGTTGAGGAGATAGCAAAATACCAAGTCCCGCTT LysAlaValGluIleValLysAspValValGluGluIleAlaLysTyrGlnValProLeu
I I I I I 2040
GAAAAGCTTGTTATCCACGAGCAGATTACCAAGGATCTAAGTGAATACAAAGCCATTGGG GluLysLeuVallleHisGluGlnlleThrLysAspLeuSerGluTyrLysAlalleGly
I I I I I 2100
CCTCATGTAGCAATAGCAAAGAGGCTTGCTGCAAAGGGAATAAAAGTGAGACCCGGCACG ProHisValAlalleAlaLysArgLeuAlaAlaLysGlylleLysValArgProGlyThr
I I I I I 2160
ATAATAAGCTATATCGTCCTCAGGGGAAGCGGAAAGATAAGTGACAGGGTAATTTTGCTT IlelleSerTyrlleValLeuArgGlySerGlyLysIleSerAspArgVallleLeuLeu
I I I I I 2220
TCAGAGTATGATCCGAAAAAACACAAGTACGACCCCGACTACTACATAGAAAACCAAGTT SerGluTyrAspProLysLysHisLysTyrAspProAspTyrTyrlleGluAsnGlnVal
I I I I I 2280
CTGCCGGCGGTGCTTAGGATCCTTGAAGCCTTCGGCTACAGAAAAGAGGACTTAAAATAC LeuProAlaValLeuArglleLeuGluAlaPheGlyTyrArgLysGluAspLeuLysTyr
I I I I I 2340
CAAAGCTCAAAACAGGTTGGACTGGACGCGTGGCTTAAGAAGTAG GlnSerSerLysGlnValGlyLeuAspAlaTrpLeuLysLys
Intronfreie DNA- (SEQ. ID NO:4) und Aminosäuresequenz (SEQ. ID NO: 5) der TY DNA Polymerase Die folgenden Beispiele erläuteπrdie Erfindung weiter:
Beispiel 1 :
Kultivierung von Thermococcus spec. TY
Herstellung des anaeroben Mediums
Die Medienherstellung wurde nach der HUNG ATE-Methode ( 1969) durchgeführt. Durch Kochen wurde der Großteil des gelösten Sauerstoffs entfernt. Die hierdurch bedingte Steige¬ rung des Redoxpotentials des Mediums wurde durch die Zugabe des reduzierenden Agens Cystein-HCl (E'o = -210 mV) ausgeglichen. Hierdurch wurde ein von vielen Anaerobiern be¬ nötigtes, niedriges Reduktionspotential eingestellt. Als Redoxindikator wurde Resazurin ver- wendet. Das Medium veränderte bei der Reduktion des Resazurins zu Resofurin bzw. Hydror- esofurin seine Farbe von blau zu pink bzw. farblos. Durch die Entfärbung des Mediums wurde somit ein ausreichend niedriges Redoxpotential angezeigt.
Kultivierung in Hungateröhrchen, Serum- und Steilbrustflaschen
Zusammensetzung des Mediums:
Stärke 5 g
KC1 0,33 g
MgCl2-2H2O 2,7 g
MgSO4*7H2O 3,4 g
Figure imgf000018_0001
CaCl2'2H2O 0,14 g
K2HPO4 0,14 g
NaHCO3 1 g
NaCl 18 g
Resazurinlösung 0,1% 1 ml
Cystein-HCl 0,5 g
Spurenelementelösung (s.n.) 10 ml
Vitaminlösung (s.n.) 10 ml ad aqua dest 1000 ml
Spurenelementelösung:
Nitriloessigsäure 1,5 g
MnSO4 0,5 g FeSO4«7H2O 0,1 g CoSO4 »7H2O 0,18 g \ 7
ZnSOWH2O 0,18 g
CuSO4«5H2O 0,01 g
KAl(SO4)2»12H2O 0,02 g
H3BO3 0,01
Na2MoO4-2H2O 0,01
NiCl2-6H2O 0,025 g
Na2SeO3«5H2ü 0,3 mg ad aqua dest. 1000 ml
Vitaminlösung:
Biotin 2 mg
Folsäure 2 mg
Pyridoxin-HCl 10 mg Thiamin-HCl 5 mg
Riboflavin 5 mg
Nikotinsäure 5 mg
DL-Kalziumpantothenat 5 mg
Vitamin B-2 0,1 mg p-Aminobenzoesäure 5 mg
Liponsäure 5 mg ad aqua dest. 1000 ml cra cra
Der pH- Wert wurde auf 6,9 eingestellt, das Medium gekocht und unter N2-Begasung abge- kühlt. Anschließend wurde Cystein-HCl zugegeben und der pH- Wert nachreguliert. Die ent¬ sprechenden Gefäße wurden unter N2-Atmosphäre befüllt und noch einige Minuten begast. Danach wurden sie mit Butylgummistopfen und Alukappen oder Draht verschlossen und 20 Minuten bei 121°C autoklaviert. Die Lagerung erfolgte bei Raumtemperatur. Zur Kultivierung wurden die entsprechend vorbereiteten Mediengefäße 10%ig mit einer Flüssigkultur an- geimpft und bei 88°C im Wasserbad 24 h inkubiert. Die Kulturen wurden anschließend bei 4°C gelagert.
Fermentation im Batch- Verfahren
Die Fermentation von Theπnococcus spec. TY (DSM 10597) erfolgte in einem 20 1-Edelstahl- fermenter, der nach Angaben des Herstellers betrieben wurde. Das im Fermenter autoklavierte Medium wurde auf 88°C abgekühlt und der pH- Wert mit steriler KOH-Lösung auf pH 7 eingestellt. Während des Fermentationsvorgangs wurde mit N2 begast (0,2 w''m"'). Nach vollständiger Reduktion des Mediums mit Cystein-HCl wurde mit einer frischen Vorkultur (max. 24h) 10%ig angeimpft. Das Wachstum wurde photometrisch dokumentiert und die Fermentation in der späten log-Phase beendet. Die Zellkulturen wurden auf 30oC"abgekühlt und unter aeroben Bedingungen unsteril 30 min bei 4°C und 10.000 g abzentrifugiert. Größere Volumina (> 5 1) wurden kontinuierlich in einem Durchlaufrotor ebenfalls bei 4°C und 10.000 g sedimentiert. Das gewonnene Zellpellet wurde anschließend bei -20°C gelagert.
Beispiel 2:
16S rRN A Gen- Analyse aus Thermococcus TY
Die 16S rDNA wurde wie beschrieben amplifiziert (Barns S.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 91, 1609-1613, 1994; Rainey F.A. et al. System Appl. Microbiol. 16, 224-226, 1992; Rainey F.A. and Stackebrandt, FEMS Microbiology Letters H3, 125-128, 1993). Die Sequen¬ zierung erfolgte mittels "Taq Dye-Deoxy™ Terminator Sequencing Kit" und "DNA Sequen- cer 373A" (Applied Biosystems, Foster City, USA). Die 16S rDNA Sequenz (SEQ. ID NO: 1 ) wurde manuell gegen ausgewählte Spezies aus dem Reich der Archaea verglichen. Ein phylo- genetisches Dendrogramm wurde nach der Methode von De Soete G., Psychometrika 48, 621- 626, 1983 erstellt.
Beispiel 3 :
a) Isolierung chromosomaler DNA aus Thermococcus TY
Die Reinigung chromosomaler DNA erfolgte durch mehrmalige Phenolextraktion. Hierbei wurden ca. 200 mg Zellen von Thermococcus sp. TY (DSM 10597) in 500 μl RNasepuffer re¬ suspendiert und 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Durch jeweils dreimalige Ex¬ traktion mit a) Tris gesättigtem Phenol und b) Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (24:24:1) wurden die Zellen aufgeschlossen und Proteine denaturiert. Durch Zentrifugation wurde die wäßrige von der Phenolphase getrennt, wobei sich die Proteine in der Inteφhase sammeln. Die DNA-haltige Lösung wurde dreimal mit CWoroform/Isoaylalkohol (24/1) extrahiert, um Phenolrückstände aus dem Ansatz zu entfernen. Die gereinigte DNA wurde durch 1 Volumen Isopropanol und 1/10 Volumen 4 M LiCl gefällt, bei 13.000 g abzentrifugiert, bei RT getrock¬ net und in sterilem H2O bidest. oder TE-Puffe- gelöst. Die Qualität der DNA wurde elektro- phoretisch überprüft und bei 260 nm photometrisch quantifiziert.
RNasepuffer 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 C mM EDTA, 100 μg/ml RNase A TE-Puffer 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA b) Detektion von DNA-Polvmerase kodierenden Sequenzen aus Thermococcus TY mittels PCR- Screening
Das Screening der Gesammt-DNA aus Theπnococcus TY nach Sequenzen, die für eine DNA- Polymerase kodieren, erfolgte mittels PCR unter Verwendung verschiedener Konsensus-Oli- gonukleotid-Primer. Diese Primer wurden anhand von Sequenzvergleichen bereits bekannter DNA-Polymerasen aus der Ordnung der Thermococcales generiert. Die verwendeten Primer und deren Ableitung sind in Tabelle 1 aufgelistet.
Tabelle 1 : Primersequenzen
Figure imgf000022_0001
Die PCR wurde unter Verwendung des Expand High Fidelity PCR Systems (Boehringer Mannheim) und des angegebenen Programms mit einer Annealingtemperatur von 55°C und einer Elongationszeit von 2 Minuten durchgeführt. Das Primeφaar [tcgl-cl 190] ergab ein diskretes Fragment mit einer Größe von ca. 1,1 kb.
Dieses Fragment wurde mit Didoxenin (Dig)-gelabelten Nukleotiden markiert und als Sonde zur Identifizierung weiterer Fragmente eingesetzt.
c) Identifizierung homologer DNA-Fragmente mittels Southeπt Blot
Jeweils 2 μg chromosomale TY-DNA wurde mit einer der unten angegebenen Endonukleasen restringiert und in einem 0,7%ige Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Danach wurde die DNA auf eine Nylonmembran transferiert und fixiert. Als Kybridisierungssonde wurde das unter b) hergestellte Dig-markierte PCR-Fragment eingesetzt und der Southern Blot ent¬ wickelt (Abb. 3).
Auf dem Blot sind zwei Fragmente markiert (Pfeil), ein ca. 4 kb großes Pstl-Fragment und ein ca. 5 kb Sphl-Fragment, welche im folgenden auf das Vorhandensein von DNA-Polymerase- sequenzen untersucht wurden. Aus einem zweiten Gel wurde die DNA der beiden Restrik¬ tionsansätze in diesen Größenbereichen aus dem Gel isoliert und zur Klonierung eingesetzt.
Beispiel 4:
a) Konstruktion der Sequenzierungsvektoren pTYl und pTY2
Mit den in Beispiel 3 c) erhaltenen PstI- und Sphl-Fragmenten wurde jeweils eine angerei- cherte Genbank erstellt. Hierdurch wurde die Anzahl der Klone drastisch reduziert. Die DNA wurde in den Plasmidvektor pUCBM21 (Boehringer Mannheim) ligiert. Für die jeweilige Plasmidbank wurde der Vektor mit PstI oder Sphl restringiert und zur Reduzierung von Reli- gationen dephosphoryliert. Der E.coli-Stamm TG1 wurde mit dem Ligationansatz transfor¬ miert und jeweils 18 rekombinante Klone untersucht. Das Screening erfolgte mittels PCR. Je- weils ein Klon aus jedem Ansatz ergab mit dem Primeφaar [tcg 1 -c 1 190] ein 1,1 kb-Amplifi- kat. Die im folgenden als pTYl und pTY2 bezeichneten Plasmide wurden zur weiteren Cha¬ rakterisierung isoliert.
Die Direktion des Inserts im Vektor und die Größe des stomabwärts von der Primerregion tcgl liegenden DNA-Bereichs wurde über PCR- Analyse ermittelt. Hierzu wurden die
"pUC/M13 sequencing" und "reverse sequencing"-Primer verwendet (Boehringer Mannheim). Diese flankieren die jeweils linke und rechte Multikloningsite des Vektors. Entweder das Primeφaar [tcgl-pUC/M13 forward] oder [tcgl-pUC/MI3 reverse] ergab, je nach Aus¬ richtung des Inserts, ein Amplifikat. Die Vektoren pTYl und pTY2 sind in Abb. 4 graphisch dargestellt.
Die Inserts der beiden Plasmide wurden sequenziert. Die Sequenzierung ergab, daß das Insert von pTYl in pTY2 enthalten war. Ein Sequenzvergleich der ersten 1230 Basen mit der DNA¬ Polymerasesequenzen aus Thermococcus lithoralis und Pvrococcus furiosus ergab eine Ähn¬ lichkeit von 8~>% bzw. 76%. Die Länge des Inserts im Vektor pTY2, ausgehend vom Primer tcgl mit einem hypothetischen Startkodon (Pos. 1) bis zur SphI -Restriktionsstelle des Vek¬ tors, betrug 3C71 Basen.
b) Konstruktion des Sequenzierungsvektors pTY3
Ausgehend von der Sequenz des Plasmids pTY2 wurde versucht, DNA-Regionen jenseits der Sphl-RE-Site mittels PCR zu amplifizieren. Hierzu wurde der Primer c2981 synthetisiert, der homolog zur Endregion des pTY2 Inserts ist. Zur Amplifikation wurde c2981 mit weiteren Konsensusprimern kombiniert, die aus Sequenzvergleichen von Pyrococcus furiosus abge¬ leitet wurden.
Mit einem entsprechenden Primeφaar [c2981 -680pep-rev] wurde aus chromosomaler TY- DNA ein ca. 2,7 kb großes Fragment amplifiziert, das im folgenden charakterisiert wurde.
Das Amplifikat wurde gelelektrophoretisch von unspezifischen PCR-Produkten getrennt und aus dem Gel isoliert. Im folgenden wurde das Fragment direkt kloniert. Hierzu wurde der "TA Cloning® Kit" (Invitrogen) verwendet. E.coli INVaF' wurde mit dem Ligationansatz transfor¬ miert und auf LB (Ampicillin, X-Gal) Agarschalen ausplattiert. Es wurden 6 rekombinante (weiße) Kolonien mittels PCR auf Insertion untersucht. Alle enthielten das geforderte 2,7 kb Fragment. Das im folgenden als pTY3 bezeichnete rekombinante Plasmid wurde isoliert und sequenziert (Abb. 5).
c) Konstruktion des Sequenzierungsvektors pTY4
Die Endregion des TY-Polymerasegens wurde durch eine abgewandelte Chromosome-Wal- king Methode identifiziert und kloniert. Zuerst wurde über PCR eine Dig-markierte Sonde mit dem Primeφaar [cty351- cty770] generiert. Diese repräsentierte eine 420 bp große Sequenz aus dem Endbereich der bis hierher bekannten Polymerasesequenz des Vektors pTY3. Auch diese Sonde wurde analog der oben beschriebenen Vorgehensweise zum Screening mehrerer Restriktionansätze verwendet. Der Southern Blot ergab unter anderem ein Signal im 3 kb-Be- reich des Sphl-RE- Ansatz (Abb. 6).
Die DNA in diesem Bereich wurde wiederum isoliert und zur Ligation mit dem SphI restrin¬ gierten und dephosphorylierten Vektor pUCBM21 eingesetzt. Dieser Ligationsaπsatz wurde jedoch nicht wie die vorangegangenen Vektoren zur Transformation eingesetzt, sondern es wurde der an pTY4 angrenzende DNA-Bereich direkt über eine PCR amplifiziert. Hierzu wurde das Primeφaar [cty351 - pUC/M13 rev] verwendet. Das ca. 1,2 kb lange Fragment ent¬ hielt die Endregion des TY-Polymerasegens und ein hypothetisches Stopcodon. Das Fragment wurde über Agarosegelelektrophorese isoliert und mittels "TA Cloning® Kit" (Invitrogen) kloniert. Es wurden 6 rekombinante (weiße) Kolonien mittels PCR auf Insertion untersucht. Alle enthielten das geforderte 1,2 kb Fragment. Das im folgenden als pTY4 bezeichnete re¬ kombinante Plasmid wurde isoliert und sequenziert (Abb. 7).
Beispiel 5:
a) Sequenzvergleiche mit archaebakteriellen DNA-Polvmerasen
Die Sequenzierung der vier Inserts der Plasmide pTYl-4 ergab ein offenes Leseraster (ORF) von 5487 bp Länge, welches 1829 Aminosäuren entspricht (SEQ. ED NO: 2).
Multiple Sequenzvergleiche der Aminosäuresequenz des TY ORF mit den DNA-Polymerasen aus den Archaea Pyrococcus furiosus, P. Stamm GB-D, P. Stamm KOD1 und Thermococcus litoralis zeigen hohe Homologien.
Der Sequenzabgleich ergab eine hohe Ähnlichkeit des TY ORF mit den aufgeführten Se¬ quenzen und zwar nicht nur in den eigentlichen Polymerasebereichen, sondern auch in Regio¬ nen, die im maturierten Enzym mcht erscheinen. Bei diesen Regionen handelt es sich um "in frame"-Insertionen, sogenannte Inteine. Das primäre Translationsprodukt wird im Fall der Polymerasen KOD1, Deepvent und Tli posttranslational prozessiert. Man erhält durch die Verknüpfung der externen Bereiche ("Externe") die maturierte DNA-Polymerase. Einige Inteine sind in ihrer Funktion als Endonukleasen beschrieben (Perler F.B. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 5577-5581, 1992; Hodges R.A. et al., Nucleic Acid Res. 20-23, 1371- 1377, 1992; Ming-Qun Xu et al., Cell 75, 1371-1377, 1993; Perler F.B. et al., Nucleic Acid Res. 22/7, 1125-1127, 1994; Pietrokovski S., Protein Science 3, 2340-2350, 1994; T. Imanaka, Genbank entry D29671,1994).
Abb. 8 gibt eine grafische Übersicht über die Lage der Ex- und Inteine in den im Alignment aufgeführten DNA-Polymerasen. Ausgenommen ist das Enzym aus Pyrococcus furiosus, welches keine Inteinelemente enthält.
Der TY ORF ist das einzige Gen, in dem alle drei konservierten Inteinregionen zu finden sind. Die hohe Homologie der einzelnen Exteinbereiche läßt eine exakte Identifizierung der hypo- thetischen Inteinbereiche im TY DNA-Polymerasegen zu. Zur Expression der TY DNA-Poly¬ merase wurden diese Regionen des Gens deletiert.
b) Deletion der Inteinregionen des TY DNA- Polvmerasegens mittels Polymerase Ketten- reaktion (PCR)
Zur Deletion der Inteinbereiche wurden die Exteinsequenzen des TY ORF mittels PCR ampli¬ fiziert und miteinander verknüpft. Abbildung 9 zeigt schematisch die Vorgehensweise. Die zu verknüpfenden DNA-Fragmente A und C wurden in getrennten PCRs mit den Primern afonv-arCv und Cfonv-crev amplifiziert (1). Der Primer arev besitzt am 5'-Ende eine Sequenz, die zur N-terminalen Region des Fragments C homolog ist. Des weiteren ist der Primer Cfonv zum C-Terminus des Fragments A homolog. Durch die PCR entstanden zwei Fragmente A und C, die jeweils um einen Bereich des anderen Fragments erweitert wurden (2). In einer zweiten PCR wurden diese Regionen miteinander hybridisiert und diese sich gegenseitig primenden DNA-Einzelstränge zu einem Doppelstrang elongiert (3). Im selben FCR- Ansatz konnte das Fusionsfragment mit den Primern afonv und c-eV amplifiziert und kloniert werden (3).
Im Fall des TY DNA-Polymerasegens wurden zuerst die Exteinregionen 1 und 2 und die Re¬ gionen 3 und 4 fusioniert und in einer zweiten PCR die Fragmente Extein 1-2 und Extein 3-4 miteinander verknüpft. Die hierbei verwendeten Primer extein 1-7 und extein9 sind in Tabelle 1 aufgeführt. Als Klonierungshilfe wurde über die PCR am N-terminalen Ende eine Ndel-RE- Site und am C-Terminus eine Bglll-Site zur Klonierung in den Expressionsvektor angefügt (Primer extein 1+9). Die inteinfreie DNA- und Aminosäuresequenz der TY DNA-Polymerase findet sich in SEQ. ID NO: 4.
Beispiel 6:
Klonierung in E.coli und Reinigung einer rekombinanten DNA-Polvmerase (TY Pol) aus Thermococcus spec. TY
a) Vektor
Als Expressionssystem wurde das pET Expression System 15b (Novagen, Madison USA, Cat. No. 69668-1) verwendet. Der Vektor zeichnete sich durch folgende Eigenschaften aus:
- T7 Promotor und lad Repressorgen - His-Tag Leader Sequenz (Affinitätschromatographie an Ni-Chelatsäulen)
- N-terminale Thrombin Proteaseregion
- Fusionsklonierungsregionen Ndel, Xhol und BamHI
- Ampicillinresistenz (bla)
Das Polymerasegen wurde in die Ndel-BamHI RE-Site ligiert, so daß das resultierende
Fusionsprotein eine N-terminale Histidin-Targetsite und eine Thrombin-Proteaseregion zur Entfernung der Histidinreste besitzt.
b) Verwendete Stämme und Anzucht
Zur Amplifikation des Vektors und zur Expression wurden verschiedene Stämme benutzt (Novagen). • NovaBlue: endAl hsdR17(rκi2-πifcι2 +) supE44 thi-1 recAl gyrA96 relAl lac [F proA+B+ laqIqZ_M15::Tnl0(tetR)]
• BL21(DE3): P ompT hsdSB(rB 'mB ') gal dem (DE3)
Der Stamm NovaBlue diente zur Amplifikation des Vektors pTY Pol (Abb. 10). Die Ex¬ pression des Zielgens wurde hier unterdrückt, da der Stamm kein T7 RNA-Polymerasegen enthält. Eventuell störende Einflüsse des rekombinanten Proteins aus das Wachstum der Zellen wurden somit reduziert.
Der Stamm BL21 (DE3) trägt eine chromosomale Kopie der T7 RNA-Polymerasε. Diese steht unter der Kontrolle des durch IPTG induzierbaren lacUV5-Promotors.
BL21(DE3) wurde mit dem Vektor pTY Pol transformiert und in LB-Medium unter selektiven Bedingungen kultiviert (LB + 50 μg/ml Ampicillin). Bei einer Zelldichte von OD 0,6 wurde die Expression mit 2 mM IPTG induziert und die Zellen bis in die späte log-Phase weiter kultiviert.
c) Zellaufschluß
Die abzentrifugierten Zellen wurden in TY-Aufschlußpuffer resuspendiert (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 10 mM KC1, 0,5 mM EDTA, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT) und im Ultraschall aufge¬ schlossen.
d) Proteinreinigung
Die Aufreinigung des Proteins erfolgte in drei Schritten:
1. Hitzedenaturierung (80°C HD*)
2. Chromatographie an Blue Sepharose (HiTrap Blue Pharmacia)
3. Chromatographie an Ni2+ Chelat Harz (Novagen)
Der Rohextrakt wurde sofort nach dem Aufschluß 15 Minuten bei 80°C inkubiert. Die hitze- labilen denaturierten Proteine wurden bei 40.000 g 20 min abzentrifugiert und der Überstand filtriert (0 0,45 μm).
Blue Sepharose trägt als funktionelle Gruppe den Farbstoff Cibacron Blue 3G-A. Gebunden werden Proteine, die eine Nukleotidbindungstasche besitzen.
Der filtrierte Rohextrakt wurde mehrmals über eine 1 ml HiTrap Blue-Säule aufgetragen. Die maximale Bindungskapazität beträgt 20 mg Protein/ml Säulenmaterial. Ungebundenes Protein wurde mit TY-Aufschlußpuffer von der Säule gespült und die gebundenen Proteine mit einem linearen Gradienten eluiert (10 mM-- 1.5 M KC1 im Aufschlußpuffer). Die Flußratebetrug 0.5 ml/min bei 50 Fraktionen a 0,5 ml. Die enzymatisch aktiven Fraktionen wurden gepoolt und gegen Imidazolpuffer umgepuffert (Centricon. Ausschlußgröße 30 kDa).
Bei der Nickel-Chelatsäule binden die N-terminalen Histidinreste der rekombinanten Poly¬ merase an immobilisierte Ni2+-Kationen des Säulenmaterials und werden bei der Elution durch Imidazol ausgetauscht.
Zu Beginn der Chromatographie wurde eine 1 ml Säule mit H2O dest. gespült und mit 50 mM NiSO4 geladen. Danach wurde die Säule mit Imidazolpuffer equilibriert (5 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl pH 7,9). Die gepoolte, aktive Fraktion der Blue Sepharoseauf- reinigung wurde auf die Säule aufgetragen und nicht gebundenes Protein eluiert. Die gebun¬ denen Proteine wurden mit einem linearen Gradienten (5 mM - 1 M Imidzol im Säulenpuffer) eluiert (Flowrate 0,5 ml/min, Gradient 0 - 300 mM Imidazol, 15 ml = 30 Fraktionen, 300- 1000 mM 2,5 ml = 5 Fraktionen). Die Aktivität der einzelnen Fraktionen wurde wie oben be¬ stimmt.
Die aktiven Fraktionen wurden gepoolt und gegen TY Polymerase Lageφuffer dialysiert (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 100 mM KC1, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 50% Glycerin).
Tabelle 2:
Reinigung von rekombinanter TY DNA-Polvmerase (Abb. 11 )
Figure imgf000028_0001
Beispiel 7:
DNA-Polvmerase-Aktivitätstest
Die DNA-Polymeraseaktivität wurde indirekt über einen "Enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA) bestimmt. Als Substrat wurde mit DNasel aktivierte Kalbsthymus DNA ver¬ wendet. Die DNA-Polymerase synthetisiert an das freie 3'-Ende zum Gegenstrang komple¬ mentäre freie Nukleotide. Zur Quantifizierung des neugebildeten Doppelstranges wurden ne¬ ben den vier nativen Nukleotidtriphosphaten auch Digoxigenin gelabeltes dUTP (Boehringer Mannheim) im Reaktionsansatz angeboten. Nach der Polymerase-Reaktion wurde der dUTP- Einbau quantifiziert. Hierzu wurde~ein DIG-Antiköφer verwendet, der wiederum mit einer alkalischen Phosphatase gekoppelt war (Anti-DIG-Alkalische Phosphatase (AP)-Fab-Frag- mente. Boehringer Mannheim). Zur Detektion wurde das AP-Chemoluminiszenz- Substrat Lumigen™ PPD (Lumigen Inc. Detroit, USA) eingesetzt. Die Lichtemission wurde im Lu- minometer gemessen und gegen eine Referenzpolymerase verglichen.
Der DNA-Polymerasetest setzte sich folgendermaßen zusammen:
Inkubationsmix:
100 μl lOx Inkubationspuffer (jeweiliger Polymerase- Aktivitätspuffer, s.u.)
3,3 μl dNTP's (10 mM Stammlösung, Endkonzentration 33 μM)
3,6 μl Dig-dUTP (10 μM Stammlösung, Endkonzentration 36 nM)
10 μl BSA (20 mg/ml) 12 μg Kalbsthymus DNA (DNasel aktiviert) ad 1000 μl aqua bidest.
Zu 50 μl Inkubationsmix wurden auf Eis 2 μl verdünnte Polymerase-Lösung zugegeben und 30 Minuten bei 70°C inkubiert. Danach wurde die Reaktion sofort mit 2 μl 0.5 M EDTA ge- stoppt. Von diesem Ansatz wurden 5 μl auf membranbeschichtete Mikrotiteφlatten (Pall
SM045BWP) pipettiert. Der Boden dieser Mikrotiteφlatten bestand aus einer Nylonmembran mit einem Porendurchmeser von 0,45 μm. Die DNA im Reaktionsansatz wurde durch 10 Min¬ uten Erhitzen auf 70°C an die Membran gekoppelt.
Die Detektion der Dig-markierten DNA erfolgte auf einer Vakuumkammer. Die einzelnen Lösungen wurden dabei durch die Membran gesaugt. Zuerst wurde 2 mal 2 Minuten mit 100 μl Blockingpuffer inkubiert, um unspezifische Antiköφerbindung zu verhindern. Danach wurde 2 mal 2 Minuten mit 100 μl Antiköφerlösung inkubiert. Zwischen den einzelnen Schritten wurden die Lösungen unter Vakuum abgesaugt. Zur Entfernung überschüssiger Antiköφer wurden unter Vakuum 2 mal 200 μl Waschpuffer aufgetragen und 2 mal mit AP- Puffer umgepuffert. Die Detektion erfolgte durch 5 Minuten Inkubation mit Lumigen™ PPD (1:100 in AP-Puffer). Das Substrat wurde abgesaugt und die Lichtemission nach weiteren 15 Minuten im Luminometer gemessen.
Als Referenzenzym zur Eichung wurde Taq DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) verwendet.
Taq Pol-Inkubationspuffer (lOx) 250 mM Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM KC1, 20 mM
MgCl2, lO mM DTT TY Pol-Inkubationspuffer (1 Ox) 500 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1000 mM Kel, 40 mM
MgCl2, 50 mM DTT Maleinsäurepuffer 100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl pH 7,5
Blockingpuffer 1 % (w/v) Blocking Reagenz in Maleinsäurepuffer Waschpuffer 0,3% Tween® in Maleinsäurepuffer Antiköφerlösung 150 mU/ml Anti-DIG-Alkalische Phosphatase (Fab-
Fragmente, Boehringer Mannheim) in
Blockingpuffer
AP-Puffer 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM
MgCl2
Beispiel 8:
3'-5'- Exonuklease-Aktivitätstest
Die 3'-5'-Exonuklease-("proofreading") Aktivität wurde mit Hilfe von 5'-Digoxygenin- markierter DNA bestimmt. Als Testsubstrat diente ein definiertes DNA-Primer /Template- Hybrid.
5'-Dig Exonuclease Polvmerase
\
GCATGGATCCCACTGCCCAGGG (SEQ.IDNO:20)
CGTACCTAGGGTGACGGGTCCCAAAATCAAAATA (SEQ.IDNO:21)
3' /
In diesem Test wurde die Fähigkeit der DNA-Polymerase zur Degradation des Dig-Primers gemessen. Des weiteren konnte bestimmt werden, ab welcher Konzentration freier Desoxy- nukleotidtriphosphate im Reaktionsansatz die Polymeraseaktivität gegenüber der Exonu- kleaseaktivität überwiegt. Des weiteren wurde die Fähigkeit zum Einbau von Ribonukleotiden getestet.
Pipettierschema eines Reaktionansatzes:
μl 5'-Dig-Primer (500 fmol) μl Template (500 fmol) μl dNTPs (Endkonzentration 1 pM - 10 μM) 1 μl Polymerase Aktivitätspuffer (lOx) μl DNA-Polymerase (100 mU) ad 10 μl aqua bidest.
Der Reaktionsansatz wurde bei 60 Minuten bei 70°C inkubiert, auf Eis mit 2 μl Formamid- puffer versetzt und die DNA-Fragmente in einem 12,5%igen Polyamid-Harnstoffgel aufge¬ trennt . Der Transfer und die Detektion der Dig-markierten Fragmente erfolgte nach Angaben Boehringer Mannheim ("Dig System Users Guide for Filter Hybridization", 1993). Beispiel 9:
Anwendung der TY DNA-Polvmerase in der PCR
Das Enzym wurde unter folgenden Bedingungen in der PCR eingesetzt:
Mix l Endkonzentration dGTP (10 mM) 1 μl 200 μM dATP (10 mM) 1 μl 200 μM dTTP (10 mM) 1 μl 200 μM dCTP (lO mM) 1 μl 200 μM
Primer 1 x μl 600 nM
Primer 2 x μl 600 nM
Template DNA X μl 100 ng
H2O ad 25 μl
Mix 2 lOx PCR- Puffer 5 μl
TY DNA-Polymerase 1 μl (2 U)
H2O ad 25 μl
Die Ansätze werden getrennt voneinander auf Eis pipettiert und direkt vor Start der Reaktion vereinigt.
Im folgenden sind Eckdaten eines Cycleprogramms angegeben:
lx 2 min 94°C (Denaturierung der Template-DNA)
10 sek 94°C (Denaturierung) lOx 30 sek 55°C (Annealing des Primers)
2-4 min 68°C (Elongation)
10 sek 94°C (Denaturierung)
>0x 30 sek 55°C (Annealing des Primers)
2-4 min* 68°C (Elongation + Verlängerung 20 sek/Cycle)
lx 7 min 68°C (Elongation)
1 Ox PCR Puffer 100 mM Tris-HCl, pH 8,9, 1 M KCI, 15 mM MgCl2, 500 μg/ml BSA. 0,5% (v/v) Tween 20
Es konnten Fragmente von 1,3 kb (Spur 1), 2,6 kb (Spur 2) und 4.35 kb (Spur 3) amplifiziert werden ( Abb. la)). ~ SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Boehringer Mannheim GmbH
(B) STRASSE: Sandhoferstr. 116
(C) ORT: Mannheim (E) LAND: DE
(F) POSTLEITZAHL: 68305
(G) TELEFON: 06217595482 (H) TELEFAX: 06217594457
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Thermostabile DNA-Polymerase aus Thermococcus spec.
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 21
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 1301 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1: CCACl'GCUAU GGGGGUCCGA CUAÄGCCAUG CGAGUCAUGG GGUCCCUCUG GGACACCACC 60
GGCGGACGGC UCAGUAACAC GUCGGUAACC UACCCUCGGG AGGGGGAUAA CCCCGGGAAA 120
CUGGGGCUAA UCCCCCAUAG GCCUGAGGUA CÜGGAAGGUC CUCAGGCCGA AAGGGGCUUU 180
UGCCCGCCCG AGGAUGGGCC GGCGGCCGAÜ UAGGUAGUUG GUGGGGÜAAC GGCCCACCAA 240
GCCGAAGAUC GGUACGGGCU GUGAGAGCAG GAGCCCGGAG AUGGACACÜG AGACACGGGU 300
CCAGGCCCUA CGGGGCGCAG CAGGCGCGAA ACCUCCGCAA UGCGGGAAAC CGCGACGGGG 360
GGACCCCGAG UGCCGUGGUA UCGACACGGU UUUUCCGGAG UGUAAAAAGC UCCGGGAAUA 420
AGGGCUGGNC AAGGCCGGUG GCAGCCGCCG CGGUAAUACC GGCGGCCCGA GUGGUGGCCG 480
CUAUUAUUGG GCCUAAAGCG UCCGUAGCCG GGCCCGUAAG UCCCUGGCGA AAUCCCACGG 540
CUCAACCGUG GGGCUUGCUG GGGAUACUGC GGGCCUUGGG ACCGGGAGAG GCCGGGGGUA 600
CCCCUGGGGU AGGGGUGAAA UCCUAUAAUC CCAGGGGGAC CGCCAGUGGC GAAGGCGCCC 660
GGCUGGAACG GGUCCGACGG UGAGGGACGA AGGCCAGGGG AGCAAACCGG AUUAGAUACC 720
CGGGUAGUCC UGGAUGUAAA GGAUGCGGGC UAGGUGUCGG GCGAGCUUCG AGCUCGCCCG 780
GUGCCGUAGG GAAGCCGUUA AGCCCGCCGC CUGGGGAGUA CGGCCGCAAG GCUGAAACUU 840
AAAGGAAUUG NCGGGGGAGC ACÜACAAGGG GÜGGAGCGUG CGGUUÜAAUÜ GGAUUCAACG 900
CCGGGAACCU CACCGGGGGC GACGGCAGGA UGAAGGCCAG GCUGAAGGUC UUGCCGGACA 960
CGCCGAGAGG AGGUGCAUGG CCGCCGUCAG CUCGUACCGU GAGGCGUCCA CUUAAGUGUG 1020
GUAACGAGCG AGACCCGCGC CCCCAGÜUGC CAGCCCUUCC CGÜUGGGAAG GGGGCACUCU 1080
GGGGGGACUG CCGGCGAUAA GCCGGAGGAA GGAGCGGGCG ACGGUAGGUC AGUAUGCCCC 1140 GAAACCCCCG GGCUACACGC GCGCÜACAAU GGGCGGGACA AUGGGAUCCG ACCCCGAAAG 1200
GGGAAGGUAΛ UCCCCUAAAC CCGCCCUCAG ÜÜCGGAUCGC GGGCUGCAAC ÜCGCCCGCGU 1260
GAAGCUGGAA UCCCUAGUAC CCGCGUGUCA UCAUCGCGCG G 1301
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 5490 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
ATGATATTAG ACACTGACTA CATAACAAAG GACGGTAAAC CCATAATTCG AATTTTCAAG 60
AAAGAGAACG GGGAATTTAA AATAGAACTT GATCCACATT TTCAGCCCTA CATTTACGCT 120
CTTCTCAAAG ATGACTCCGC TATTGATGAA ATAAAAGCAA TAAAAGGCGA GAGACACGGA 180
AAAATTGTGA GAGTAGTCGA TGCAGTGAAA GTCAAGAAGA AÄTTTTTGGG GAGAGATGTT 240
GAGGTCTGGA AGCTTATATT TGAGCATCCC CAAGACGTCC CGGCCCTAAG GGGCAAGATA 300
AGGGAACATC CAGCTGTGAT TGACATTTAT GAGTACGACA TACCCTTTGC CAAGCGCTAC 360
CTCATAGACA AGGGCTTGAT CCCTATGGAG GGCGACGAGG AGCTTAAGCT AATGGCCTTC 420
GACATTGAGA CGTTTTACCA CGAGGGAGAC GAGTTTGGGA AGGGCGAGAT AATAATGATA 480
AGCTACGCCG ATGAGGAAGA GGCAAGGGTA ATTACATGGA AGAATATTGA TCTGCCCTAC 540
GTTGATGTTG TATCCAACGA AAGGGAGATG ATAAAGCGGT TTGTGCAAAT TGTCAGGGAA 600 AAAGACCCGG ATGTCCTGAT AACTTACAAT GGAGACAACT TTGATTTGCC GTACCTTATA 660
AAAAGGGCAG AGAAGTTAGG AGTTACTCTT CTCTTGGGGA GGGACAAAGA ACACCCCGAG 720
CCCAAGATTC ACAGAATGGG CGATAGCTTT GCCGTGGAAA TTAAAGGCAG AATTCACTTT 780
GATCTCTTCC CGGTTGTGCG GAGAACCATA AACCTCCCAA CATACACGCT TGAGGCAGTT 840
TATGAAGCCG TCTTGGGAAA AACCAAAAGC AAGCTGGGTG CGGAGGAAAT CGCCGCCATC 900
TGGGAAACAG AGGAGAGCAT GAAGAAGCTG GCCCAGTACT CGATGGAAGA TGCTAGGGCA 960
ACTTATGAAC TCGGAAAAGA GTTTTTCCCC ATGGAGGCAG AGCTAGCAAA GCTAATAGGC 1020
CAAAGCGTAT GGGACGTCTC AAGATCAAGC ACTGGCAACC TTGTAGAGTG GTACCTGTTA 1080
AGGGTGGCAT ATGAGAGGAA TGAGCTCGCT CCGAACAAGC CGGATGAAGA AGAGTACAGA 1140
AGGCGTTTAA GGACTACTTA CCTGGGAGGA TACGTAAAAG AGCCGGAAAG AGGCTTATGG 1200
GAGAACATCG CCTATTTAGA CTTTAGGTGC CACCCTGCAG ATACAAAAGT CATAGTAAAA 1260
GGCAAAGGAA TCGTGAATAT TAGCGATGTT AAAGAAGGAG ACTACATACT AGGAATAGAT 1320
GGGTGGCAAA GAGTCAAAAA AGTCTGGAAG TATCATTACG AAGGCAAACT AATCAATATA 1380
AACGGCTTAA AATGCACTCC AAATCATAAG GTCCCGGTAG TCACGGAAAA TGATCGGCAA 1440
ACTAGGATTA GAGATAGTCT TGCAAAATCA TTCCTCTCAG GAAAAGTAAA AGGTAAAATT 1500
ATCACAACAA AGCTTTTTGA AAAAATTGCC GAGTTTGAGA AAAACAAGCC TTCTGAAGAG 1560
GAAATATTAA AGGGGGAACT TTCAGGGATT ATTTTAGCCG AGGGCACATT GCTTCGAAAA 1620
GATATTGAAT ACTTCGATTC ATCGAGAGGT AAAAAGAGAA TCTCACACCA ATATAGAGTC 1680
GAAATAACAA TCGGCGAAAA CGAAAAGGAG CTTTTAGAGA GGATTCTATA CATTTTCGAT 1740 AAGCTGTTTG GCATAAGACC TTCTGTGAAA AAGAAGGGAG ACACAAATGC GCTTAAAATT 1800
ACTACCGCAA AGAAAGCGGT TTACCTTCAA ATCGAGGAAC TTTTGAAAAA CATTGAAAGT 1860
CTTTACGCCC CAGCAGTATT GAGGGGCTTT TTTGAAAGAG ATGCCACTGT GAACAAAATA 1920
CGGAGTACAA TAGTTGTTAC TCAAGGTACA AACAACAAAT GGAAAATAGA TATAGTAGCA 1980
AAGTTACTTG ACAGCCTTGG AATCCCATAT AGCCGCTATG AGTACAAATA CATTGAAAAT 2040
GGAAAGGAGT TGACTAAGCA TATTTTAGAA ATAACAGGAA GGGATGGACT TATTTTATTC 2100
CAAACACTGG TGGGGTTCAT AAGTTCAGAG AAAAACGAAG CTTTAGAGAA AGCAATTGAA 2160
GTTAGAGAAA TGAATAGACT TAAGAATAAC AGCTTCTACA ACCTTTCAAC GTTTGAAGTG 2220
TCTTCTGAAT ATTATAAAGG CGAGGTTTAT GACCTAACCC TAGAAGGAAA CCCCTATTAT 2280
TTTGCAAATG GAATTCTGAC TCACAATTCT CTATACCCCT CAATTATAGT TACCCACAAC 2340
GTCTCCCCTG ACACTTTAGA AAGAGAAGGC TGCAAGAATT ACGATGTTGC CCCGATAGTA 2400
GGTTATAAGT TCTGCAAGGA TTTTCCCGGT TTCATTCCAT CTATACTCGG GGAATTAATC 2460
ACAATGAGGC AAGAAATAAA GAAGAAGATG AAAGCTACAA TTGACCCAAT AGAAAAGAAA 2520
ATGCTTGATT ATAGGCAAAG AGCTGTTAAA TTGCTCGCAA ACAGCATTTT GCCAAATGAA 2580
TGGCTACCAA TAATTGAAAA CGGAGAAGTA AAATTCGTAA AAATTGGTGA GTTCATAGAC 2640
CGCTACATGG AAGAGCAAAA GGACAAAGTA AGAACAGTGG ATAATACTGA AGTTCTCGAA 2700
GTGGATAACA TCTTTGCATT TTCACTAAAT AAGGAAAGCA AAAAGAGCGA GATCAAGAAA 2760
GTCAAAGCCC TCATAAGGCA TAAGTACAAG GGTGAAGCTT ACGAGGTCGA GCTCAACTCT 2820
GGAAGAAAAA TCCACATAAC CCGTGGTCAC AGCTTGTTCA CGATTAGGAA CGGGAAAATA 2880 AAGGAAATAT GGGGAGAAGA AGTAAAAGTT GGCGACCTTA TAATAGTGCC CAAAAAAGTT 294J
AAGCTCAATG AAAAAGAAGC CGTCATCAAC ATTCCAGAGT TGATTTCGAA ACTGCCCGAT 3000
GAAGACACGG CCGATGTTGT TATGΛCAACC CCAGTTAAGG GAAGAAAGAA CTTCTTTAAA 3060
GGCATGCTGA GAACACTAAA GTGGATTTTT GGAGAGGAAA GCAAGAGAAT TAGGACGTTT 3120
AACAGGTACC TCTTCCATCT TGAAGAGCTT GGTTTTGTTA AATTGCTGCC CCGTGGATAT 3180
GAAGTCACCG ACTGGGAAGG GCTAAAAAGA TATAGGCAAC TTTACGAGAA GCTCGTAAAA 3240
AACCTCAGAT ACAATGGAAA TAAGAGGGAG TATTTAGTGA GGTTTAACGA TATCAAAGAC 3300
TCCGTATCTT GCTTCCCACG AAAGGAGCTT GAAGAATGGA AAATTGGNAC GNTCAAGGGG 3360
TTTAGGNTGA AGTGCATCCT CAAAGTCGAT GAGGATTTCG GAAAGTTCTT AGGCTACTAT 3420
GTCAGCGAAG GCTATGCGGG GGCTCAGAAA AACAAAACAG GTGGAATGAG CTACTCAGTA 3480
AAGCTCTATA ATGAGAATCC TAACGTTCTC AAAGATATGA AAAATATTGC AGAGAAGTTT 3540
TTTGGCAAAG TTAGAGTCGG CAAAAACTGT GTGGATATAC CAAAAAAGAT GGCATACCTT 3600
CTCGCGAAAT CCCTCTGTGG AGTAACAGCA GAGAACAAAA GGATTCCTTC AATTATATTT 3660
GATTCCTCTG AACCTGTACG ATGGGCATTC TTGAGAGCGT ATTTTGTGGG TGATGGCGAT 3720
ATTCATCCAT CAAAAAGGCT TAGGCTCTCC ACAAAAAGCG AGCTCCTAGC AAACCAGCTT 3780
GTATTTCTCT TAAACTCCTT GGGAGTTTCA TCTATAAAAA TTGGGTTTGA CAGCGGGGTT 3840
TATAGGGTTT ACATAAACGA GGATTTGCCG TTCCTACAAA CTTCGAGGCA GAAAAACACG 3900
TACTACCCTA ATCTTATTCC CAAGGAGGTT CTTGAGGAAA TATTCGGAAG AAAATTCCAA 3960
AAGAACATAA CGTTTGAGAA ATTCAAAGAA CTCGCTGACT CCGGAAAACT GGACAAAAGA 4020 AAAGTCAAGC TCTTGGATTT CCTCCTCAAT GGAGACATTG TCCTTGACAG AGTAAAAAAT 4080
GTTGAAAAAA GAGAATATGA AGGGTATGTC TATGATTTGA GCGTTGAAGA CAACGAAAAC 4140
TTTCTCGTTG GTTTTGGACT GCTCTACGCA CACAACAGCT ATTACGGTTA TATGGGCTAT 4200
CCCAAGGCGA GGTGGTACTC GAAGGAATGT GCCGAAAGCG TTACCGCGTG GGGAAGGCAC 4260
TACATAGAAA TGACCATAAA AGAGATAGAG GAGAAATTTG GATTTAAGGT GCTATATGCC 4320
GACAGCGTTA CGGGTGATAC GGAGATAATC GTTAAGAGAA ATGGGCGGAT AGAGTTTGTT 4380
CCTATTGAAA AGCTCTTTGA ACGCGTAGAT TACCGGATTG GAGAAAAAGA ATACTGCATC 4440
CTTGAGGACG TTGAAGCGCT GACACTCGAC AATAGAGGCA AGCTCATCTG GAAAAAAGTT 4500
CCGTACGTTA TGAGGCACAG AGCGAAAAAG AAGGTCTACC GCATCTGGAT TACAAACTCG 4560
TGGTACATTG ACGTTACCGA GGATCACTCT CTTATAGTAG CTGAGGATGG TCTGAAGGAA 4620
GCTAGGCCAA TGGAAATCGA AGGCAAGAGC CTAATAGCGA CCAAAGATGA CCTTTCAGGA 4680
GTGGAATATA TCAAGCCTCA TGCCATCGAG GAAATATCCT ACAACGGCTA CGTTTACGAC 4740
ATCGAGGTGG AGGGGACCCA CAGGTTCTTC GCAAATGGAA TACTCGTGCA CAACACTGAT 4800
GGTTTTTACG CCACAATACC GGGAGAAAAA CCTGAAACAA TCAAAAAGAA AGCTAAGGAA 4860
TTCTTAAAAT ACATAAACTC CAAACTTCCC GGTCTGCTCG AGCTTGAGTA TGAGGGCTTT 4920
TACTTGAGAG GATTTTTCGT CGCAAAGAAG CGCTATGCGG TTATAGACGA AGAAGGTAGG 4980
ATAACGACAA GGGGTCTGGA AGTTGTAAGG AGGGACTGGA GCGAAATAGC CAAAGAGACC 5040
CAGGCTAAAG TCTTGGAGGC AATACTTAAA GAAGATAGTG TCGAAAAAGC TGTGGAAATC 5100
GTTAAGGACG TTGTTGAGGA GATAGCAAAA TACCAAGTCC CGCTTGAAAA GCTTGTTATC 5160 CACGAGCAGA TTACCAAGGA TCTAAGTGAA TACAA^GCCA TTGGGCCTCA TGTAGCAATA 5220
GCAAAGAGGC TTGCTGCAAA GGGAATAAAA GTGAGACCCG GCACGATAAT AAGCTATATC 5280
GTCCTCAGGG GAAGCGGAAA GATAAGTGAC AGGGTAATTT TGCTTTCAGA GTATGATCCG 5340
AAAAAACACA AGTACGACCC CGACTACTAC ATAGAAAACC AAGTTCTGCC GGCGGTGCTT 5400
AGGATCCTTG AAGCCTTCGG CTACAGAAAA GAGGACTTAA AATACCAAAG CTCAAAACAG 5460
GTTGGACTGG ACGCGTGGCT TAAGAAGTAG 5490
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1826 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBEΞCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
Met lle Leu Asp Thr Asp Tyr lle Thr Lys Asp Gly Lys Pro lle 1 5 10 15
lle Arg lle Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys lle Glu Leu
20 25 30
Asp Pro His Phe Gin Pro Tyr lle Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp
35 40 45
Ser Ala lle Asp Glu lle Lys Ala lle Lys Gly Glu Arg His Gly 50 55 60 Lys lle Val Arg Val Val Asp Ala Val Lys Val Lys Lys Lys Phe
65 70 75
Leu Gly Arg Asp Val Glu Val Trp Lys Leu lle Phe Glu His Pro 80 85 90
Gin Asp Val Pro Ala Leu Arg Gly Lys lle Arg Glu His Pro Ala
95 100 105
Val lle Asp lle Tyr Glu Tyr Asp lle Pro Phe Ala Lys Arg Tyr
110 115 120
Leu lle Asp Lys Gly Leu lle Pro Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu 125 130 135
Lys Leu Met Ala Phe Asp lle Glu Thr Phe Tyr His Glu Gly Asp 140 145 150
Glu Phe Gly Lys Gly Glu lle lle Met lle Ser Tyr Ala Asp Glu
155 160 165
Glu Glu Ala Arg Val lle Thr Trp Lys Asn lle Asp Leu Pro Tyr
170 175 180
Val Asp Val Val Ser Asn Glu Arg Glu Met lle Lys Arg Phe Val
185 190 195
Gin lle Val Arg Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu lle Thr Tyr Asn 200 205 210
Gly Asp Asn Phe Asp Leu Pro Tyr Leu lle Lys Arg Ala Glu Lys
215 220 225
Leu Gly Val Thr Leu Leu Leu Gly Arg Asp Lys Glu His Pro Glu
230 235 240 Pro Lys lle His Arg Met G~ly Asp Ser Phe Ala Val Glu lle Lys
245 250 255
Gly Arg lle His Phe Asp Leu Phe Pro Val Val Arg Arg Thr lle 260 265 270
Asn Leu Pro Thr Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Leu
275 280 285
Gly Lys Thr Lys Ser Lys Leu Gly Ala Glu Glu lle Ala Ala lle
290 295 300
Trp Glu Thr Glu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ala Gin Tyr Ser Met
305 310 315
Glu Asp Ala Arg Ala Thr Tyr Glu Leu Gly Lys Glu Phe Phe Pro
320 325 330
Met Glu Ala Glu Leu Ala Lys Leu lle Gly Gin Ser Val Trp Asp 335 340 345
Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu Val Glu Trp Tyr Leu Leu
350 355 360
Arg Val Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala Pro Asn Lys Pro Asp
365 370 375
Glu Glu Glu Tyr Arg Arg Arg Leu Arg Thr Thr Tyr Leu Gly Gly
380 385 390
Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn lle Ala Tyr
395 400 405
Leu Asp Phe Arg Cys His Pro Ala Asp Thr Lys Val lle Val Lys 410 415 420 Gly Lys Gly lle Val Asn lle Ser Asp Val Lys Glu Gly Asp Tyr
425 430 435
lle Leu Gly lle Asp Gly Trp Gin Arg Val Lys Lys Val Trp Lys 440 445 450
Tyr His Tyr Glu Gly Lys Leu lle Asn lle Asn Gly Leu Lys Cys
455 460 465
Thr Pro Asn His Lys Val Pro Val Val Thr Glu Asn Asp Arg Gin
470 475 480
Thr Arg lle Arg Asp Ser Leu Ala Lys Ser Phe Leu Ser Gly Lys
485 490 495
Val Lys Gly Lys lle lle Thr Thr Lys Leu Phe Glu Lys lle Ala
500 505 510
Glu Phe Glu Lys Asn Lys Pro Ser Glu Glu Glu lle Leu Lys Gly 515 520 525
Glu Leu Ser Gly lle lle Leu Ala Glu Gly Thr Leu Leu Arg Lys
530 535 540
Asp lle Glu Tyr Phe Asp Ser Ser Arg Gly Lys Lys Arg lle Ser
545 550 555
His Gin Tyr Arg Val Glu lle Thr lle Gly Glu Asn Glu Lys Glu
560 565 570
Leu Leu Glu Arg lle Leu Tyr lle Phe Asp Lys Leu Phe Gly lle
575 580 585
Arg Pro Ser Val Lys Lys Lys Gly Asp Thr Asn Ala Leu Lys lle 590 595 600 Thr Thr Ala Lys Lys Ala Val Tyr Leu Gin lle Glu Glu Leu Leu 605 610 615
Lys Asn lle Glu Ser Leu Tyr Ala Pro Ala Val Leu Arg Gly Phe 620 625 630
Phe Glu Arg Asp Ala Thr Val Asn Lys lle Arg Ser Thr lle Val 635 640 645
Val Thr Gin Gly Thr Asn Asn Lys Trp Lys lle Asp lle Val Ala
650 655 660
Lys Leu Leu Asp Ser Leu Gly lle Pro Tyr Ser Arg Tyr Glu Tyr 665 670 675
Lys Tyr lle Glu Asn Gly Lys Glu Leu Thr Lys His lle Leu Glu 680 685 690
lle Thr Gly Arg Asp Gly Leu lle Leu Phe Gin Thr Leu Val Gly 695 700 705
Phe lle Ser Ser Glu Lys Asn Glu Ala Leu Glu Lys Ala lle Glu
710 715 720
Val Arg Glu Met Asn Arg Leu Lys Asn Asn Ser Phe Tyr Asn Leu
725 730 735
Ser Thr Phe Glu Val Ser Ser Glu Tyr Tyr Lys Gly Glu Val Tyr
740 745 750
Asp Leu Thr Leu Glu Gly Asn Pro Tyr Tyr Phe Ala Asn Gly lle
755 760 765
Leu Thr His Asn Ser Leu Tyr Pro Ser lle lle Val Thr His Asn 770 775 780 ** 2
Val Ser Pro Asp Thr Leu Glu Arg Glu Gly Cys Lys Asn Tyr Asp
785 790 795
Val Ala Pro lle Val Gly Tyr Lys Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly 800 805 810
Phe lle Pro Ser lle Leu Gly Glu Leu lle Thr Met Arg Gin Glu
815 820 825
lle Lys Lys Lys Met Lys Ala Thr lle Asp Pro lle Glu Lys Lys
830 835 840
Met Leu Asp Tyr Arg Gin Arg Ala Val Lys Leu Leu Ala Asn Ser
845 850 855
lle Leu Pro Asn Glu Trp Leu Pro lle lle Glu Asn Gly Glu Val
860 865 870
Lys Phe Val Lys lle Gly Glu Phe lle Asp Arg Tyr Met Glu Glu 875 880 885
Gin Lys Asp Lys Val Arg Thr Val Asp Asn Thr Glu Val Leu Glu
890 895 900
Val Asp Asn lle Phe Ala Phe Ser Leu Asn Lys Glu Ser Lys Lys
905 910 915
Ser Glu lle Lys Lys Val Lys Ala Leu lle Arg His Lys Tyr Lys
920 925 930
Gly Glu Ala Tyr Glu Val Glu Leu Asn Ser Gly Arg Lys lle His
935 940 945
lle Thr Arg Gly His Ser Leu Phe Thr lle Arg Asn Gly Lys lle 950 955 960 Lys Glu lle Trp Gly Glu Glu Val Lys Val Gly Asp Leu lle lle 965 970 975
Val Pro Lys Lys Val Lys Leu Asn Glu Lys Glu Ala Val lle Asn 980 985 990
lle Pro Glu Leu lle Ser Lys Leu Pro Asp Glu Asp Thr Ala Asp 995 1000 1005
Val Val Met Thr Thr Pro Val Lys Gly Arg Lys Asn Phe Phe Lys
1010 1015 1020
Gly Met Leu Arg Thr Leu Lys Trp lle Phe Gly Glu Glu Ser Lys 1025 1030 1035
Arg lle Arg Thr Phe Asn Arg Tyr Leu Phe His Leu Glu Glu Leu 1040 1045 1050
Gly Phe Val Lys Leu Leu Pro Arg Gly Tyr Glu Val Thr Asp Trp 1055 1060 1065
Glu Gly Leu Lys Arg Tyr Arg Gin Leu Tyr Glu Lys Leu Val Lys 1070 1075 1080
Asn Leu Arg Tyr Asn Gly Asn Lys Arg Glu Tyr Leu Val Arg Phe
1085 1090 1095
Asn Asp lle Lys Asp Ser Val Ser Cys Phe Pro Arg Lys Glu Leu 1100 1105 1110
Glu Glu Trp Lys lle Thr Lys Gly Phe Arg Lys Cys lle Leu Lys 1115 1120 1125
Val Asp Glu Asp Phe Gly Lys Phe Leu Gly Tyr Tyr Val Ser Glu 1130 1135 1140 Gly Tyr Ala Gly Ala Gin Lys Asn Lys Thr Gly Gly Met Ser Tyr 1145 1150 1155
Ser Val Lys Leu Tyr Asn Glu Asn Pro Asn Val Leu Lys Asp Met 1160 1165 1170
Lys Asn lle Ala Glu Lys Phe Phe Gly Lys Val Arg Val Gly Lys 1175 1180 1185
Asn Cys Val Asp lle Pro Lys Lys Met Ala Tyr Leu Leu Ala Lys
1190 1195 1200
Ser Leu Cys Gly Val Thr Ala Glu Asn Lys Arg lle Pro Ser lle 1205 1210 1215
lle Phe Asp Ser Ser Glu Pro Val Arg Trp Ala Phe Leu Arg Ala 1220 1225 1230
Tyr Phe Val Gly Asp Gly Asp lle His Pro Ser Lys Arg Leu Arg 1235 1240 1245
Leu Ser Thr Lys Ser Glu Leu Leu Ala Asn Gin Leu Val Phe Leu 1250 1255 1260
Leu Asn Ser Leu Gly Val Ser Ser lle Lys lle Gly Phe Asp Ser
1265 1270 1275
Gly Val Tyr Arg Val Tyr lle Asn Glu Asp Leu Pro Phe Leu Gin 1280 1285 1290
Thr Ser Arg Gin Lys Asn Thr Tyr Tyr Pro Asn Leu lle Pro Lys 1295 1300 1305
Glu Val Leu Glu Glu lle Phe Gly Arg Lys Phe Gin Lys Asn lle 1310 1315 1320 Thr Phe Glu Lys Phe Lys Glu Leu Ala Asp Ser Gly Lys Leu Asp
1325 1330 1335
Lys Arg Lys Val Lys Leu Leu Asp Phe Leu Leu Asn Gly Asp lle 1340 1345 1350
Val Leu Asp Arg Val Lys Asn Val Glu Lys Arg Glu Tyr Glu Gly
1355 1360 1365
Tyr Val Tyr Asp Leu Ser Val Glu Asp Asn Glu Asn Phe Leu Val
1370 1375 1380
Gly Phe Gly Leu Leu Tyr Ala His Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr Met
1385 1390 1395
Gly Tyr Pro Lys Ala Arg Trp Tyr Ser Lys Glu Cys Ala Glu Ser
1400 1405 1410
Val Thr Ala Trp Gly Arg His Tyr lle Glu Met Thr lle Lys Glu 1415 1420 1425
lle Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Ser Val
1430 1435 1440
Thr Gly Asp Thr Glu lle lle Val Lys Arg Asn Gly Arg lle Glu
1445 1450 1455
Phe Val Pro lle Glu Lys Leu Phe Glu Arg Val Asp Tyr Arg lle
1460 1465 1470
Gly Glu Lys Glu Tyr Cys lle Leu Glu Asp Val Glu Ala Leu Thr
1475 1480 1485
Leu Asp Asn Arg Gly Lys Leu lle Trp Lys Lys Val Pro Tyr Val 1490 1495 1500 Met Arg His Arg Ala Lys Lys Lys VaJ Tyr Arg lle Trp lle Thr
1505 1510 1515
Asn Ser Trp Tyr lle Asp Val Thr Glu Asp His Ser Leu lle Val 1520 1525 1530
Ala Glu Asp Gly Leu Lys Glu Ala Arg Pro Met Glu lle Glu Gly
1535 1540 1545
Lys Ser Leu lle Ala Thr Lys Asp Asp Leu Ser Gly Val Glu Tyr
1550 1555 1560
lle Lys Pro His Ala lle Glu Glu lle Ser Tyr Asn Gly Tyr Val
1565 1570 1575
Tyr Asp lle Glu Val Glu Gly Thr His Arg Phe Phe Ala Asn Gly
1580 1585 1590
lle Leu Val His Asn Thr Asp Gly Phe Tyr Ala Thr lle Pro Gly 1595 1600 1605
Glu Lys Pro Glu Thr lle Lys Lys Lys Ala Lys Glu Phe Leu Lys
1610 1615 1620
Tyr lle Asn Ser Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu Leu Glu Tyr Glu
1625 1630 1635
Gly Phe Tyr Leu Arg Gly Phe Phe Val Ala Lys Lys Arg Tyr Ala
1640 1645 1650
Val lle Asp Glu Glu Gly Arg lle Thr Thr Arg Gly Leu Glu Val
1655 1660 1665
Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu lle Ala Lys Glu Thr Gin Ala Lys 1670 1675 1680 Val Leu Glu Ala lle Leu Lys Glu Asp Ser Val Glu Lys Ala Val 1685 1690 1695
Glu lle Val Lys Asp Val Val Glu Glu lle Ala Lys Tyr Gin Val 1700 1705 1710
Pro Leu Glu Lys Leu Val lle His Glu Gin lle Thr Lys Asp Leu 1715 1720 1725
Ser Glu Tyr Lys Ala lle Gly Pro His Val Ala lle Ala Lys Arg
1730 1735 1740
Leu Ala Ala Lys Gly lle Lys Val Arg Pro Gly Thr lle lle Ser 1745 1750 1755
Tyr lle Val Leu Arg Gly Ser Gly Lys lle Ser Asp Arg Val lle 1760 1765 1770
Leu Leu Ser Glu Tyr Asp Pro Lys Lys His Lys Tyr Asp Pro Asp 1775 1780 1785
Tyr Tyr lle Glu Asn Gin Val Leu Pro Ala Val Leu Arg lle Leu 1790 1795 1800
Glu Ala Phe Gly Tyr Arg Lys Glu Asp Leu Lys Tyr Gin Ser Ser
1805 1810 1815
Lys Gin Val Gly Leu Asp Ala Trp Leu Lys Lys 1820 1825
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2325 Basenpaare (B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
ATGATATTAG ACACTGACTA CATAACAAAG GACGGTAAAC CCATAATTCG AATTTTCAAG 60
AAAGAGAACG GGGAATTTAA AATAGAACTT GATCCACATT TTCAGCCCTA CATTTACGCT 120
CTTCTCAAAG ATGACTCCGC TATTGATGAA ATAAAAGCAA TAAAAGGCGA GAGACACGGA 180
AAAATTGTGA GAGTAGTCGA TGCAGTGAAA GTCAAGAAGA AÄTTTTTGGG GAGAGATGTT 240
GAGGTCTGGA AGCTTATATT TGAGCATCCC CAAGACGTCC CGGCCCTAAG GGGCAAGATA 300
AGGGAACATC CAGCTGTGAT TGACATTTAT GAGTACGACA TACCCTTTGC CAAGCGCTAC 360
CTCATAGACA AGGGCTTGAT CCCTATGGAG GGCGACGAGG AGCTTAAGCT AATGGCCTTC 420
GACATTGAGA CGTTTTACCA CGAGGGAGAC GAGTTTGGGA AGGGCGAGAT AATAATGATA 480
AGCTACGCCG ATGAGGAAGA GGCAAGGGTA ATTACATGGA AGAATATTGA TCTGCCCTAC 540
GTTGATGTTG TATCCAACGA AAGGGAGATG ATAAAGCGGT TTGTGCAAAT TGTCAGGGAA 600
AAAGACCCGG ATGTCCTGAT AACTTACAAT GGAGACAACT TTGATTTGCC GTACCTTATA 660
AAAAGGGCAG AGAAGTTAGG AGTTACTCTT CTCTTGGGGA GGGACAAAGA ACACCCCGAG 720
CCCAAGATTC ACAGAATGGG CGATAGCTTT GCCGTGGAAA TTAAAGGCAG AATTCACTTT 780
GATCTCTTCC CGGTTGTGCG GAGAACCATA AACCTCCCAA CATACACGCT TGAGGCAGTT 840
TATGAAGCCG TCTTGGGAAA AACCAAAAGC AAGCTGGGTG CGGAGGAAAT CGCCGCCATC 900
TGGGAAACAG AGGAGAGCAT GAAGAAGCTG GCCCAGTACT CGATGGAAGA TGCTAGGGCA 960 ACTTATGAAC TCGGAAAAGA GTTTTTCCCC ATGGAGGCAG AGCTAGCAAA GCTAATAGGC 1020
CAAAGCGTAT GGGACGTCTC AAGATCAAGC ACTGGCAACC TTGTAGAGTG GTACCTGTTA 1080
AGGGTGGCAT ATGAGAGGAA TGAGCTCGCT CCGAACAAGC CGGATGAAGA AGAGTACAGA 1140
AGGCGTTTAA GGACTACTTA CCTGGGAGGA TACGTAAAAG AGCC3GAAAG AGGCTTATGG 1200
GAGAACATCG CCTATTTAGA CTTTAGGTCT CTATACCCCT CAATTATAGT TACCCACAAC 1260
GTCTCCCCTG ACACTTTAGA AAGAGAAGGC TGCAAGAATT ACGATGTTGC CCCGATAGTA 1320
GGTTATAAGT TCTGCAAGGA TTTTCCCGGT TTCATTCCAT CTATACTCGG GGAATTAATC 1380
ACAATGAGGC AAGAAATAAA GAAGAAGATG AAAGCTACAA TTGACCCAAT AGAAAAGAAA 1440
ATGCTTGATT ATAGGCAAAG AGCTGTTAAA TTGCTCGCAA ACAGCTATTA CGGTTATATG 1500
GGCTATCCCA AGGCGAGGTG GTACTCGAAG GAATGTGCCG AAAGCGTTAC CGCGTGGGGA 1560
AGGCACTACA TAGAAATGAC CATAAAAGAG ATAGAGGAGA AATTTGGATT TAAGGTGCTA 1620
TATGCCGACA CTGATGGTTT TTACGCCACA ATACCGGGAG AAAAACCTGA AACAATCAAA 1680
AAGAAAGCTA AGGAATTCTT AAAATACATA AACTCCAAAC TTCCCGGTCT GCTCGAGCTT 1740
GAGTATGAGG GCTTTTACTT GAGAGGATTT TTCGTCGCAA AGAAGCGCTA TGCGGTTATA 1800
GACGAAGAAG GTAGGATAAC GACAAGGGGT CTGGAAGTTG TAAGGAGGGA CTGGAGCGAA 1860
ATAGCCAAAG AGACCCAGGC TAAAGTCTTG GAGGCAATAC TTAAAGAAGA TAGTGTCGAA 1920
AAAGCTGTGG AAATCGTTAA GGACGTTGTT GAGGAGATAG CAAAATACCA AGTCCCGCTT 1980
GAAAAGCTTG TTATCCACGA GCAGATTACC AAGGATCTAA GTGAATACAA AGCCATTGGG 2040
CCTCATGTAG CAATAGCAAA GAGGCTTGCT GCAAAGGGAA TAAAAGTGAG ACCCGGCACG 2100 ATAATAAGCT ATATCGTCCT CAGGGGAAGC GGAAAGATAA GTGACAGGGT AATTTTGCTT 2160
TCAGAGTATG ATCCGAAAAA ACACAAGTAC GACCCCGACT ACTACATAGA AAACCAAGTT 2220
CTGCCGGCGG TGCTTAGGAT CCTTGAAGCC TTCGGCTACA GAAAAGAGGA CTTAAAATAC 2280
CAAAGCTCAA AACAGGTTGG ACTGGACGCG TGGCTTAAGA AGTAG 2325
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 774 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
Met lle Leu Asp Thr Asp Tyr lle Thr Lys Asp Gly Lys Pro lle
1 5 10 15
lle Arg lle Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys lle Glu Leu 20 25 30
Asp Pro His Phe Gin Pro Tyr lle Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp
35 40 45
Ser Ala lle Asp Glu lle Lys Ala lle Lys Gly Glu Arg His Gly
50 55 60
Lys lle Val Arg Val Val Asp Ala Val Lys Val Lys Lys Lys Phe
65 70 75
Leu Gly Arg Asp Val Glu Val Trp Lys Leu lle Phe Glu His Pro
80 85 90 Gin Asp Val Pro Ala Leu Arg Gly Lys lle Arg Glu His Pro Ala
95 100 105
Val lle Asp lle Tyr Glu Tyr Asp lle Pro Phe Ala Lys Arg Tyr 110 115 120
Leu lle Asp Lys Gly Leu lle Pro Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu
125 130 135
Lys Leu Met Ala Phe Asp lle Glu Thr Phe Tyr His Glu Gly Asp
140 145 150
Glu Phe Gly Lys Gly Glu lle lle Met lle Ser Tyr Ala Asp Glu
155 160 165
Glu Glu Ala Arg Val lle Thr Trp Lys Asn lle Asp Leu Pro Tyr
170 175 180
Val Asp Val Val Ser Asn Glu Arg Glu Met lle Lys Arg Phe Val 185 190 195
Gin lle Val Arg Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu lle Thr Tyr Asn
200 205 210
Gly Asp Asn Phe Asp Leu Pro Tyr Leu lle Lys Arg Ala Glu Lys
215 220 225
Leu Gly Val Thr Leu Leu Leu Gly Arg Asp Lys Glu His Pro Glu
230 235 240
Pro Lys lle His Arg Met Gly Asp Ser Phe Ala Val Glu lle Lys
245 250 255
Gly Arg lle His Phe Asp Leu Phe Pro Val Val Arg Arg Thr lle 260 265 270 Asn Leu Pro Thr Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Leu
275 280 285
Gly Lys Thr Lys Ser Lys Leu Gly Ala Glu Glu lle Ala Ala lle 290 295 300
Trp Glu Thr Glu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ala Gin Tyr Ser Met
305 310 315
Glu Asp Ala Arg Ala Thr Tyr Glu Leu Gly Lys Glu Phe Phe Pro
320 325 330
Met Glu Ala Glu Leu Ala Lys Leu lle Gly Gin Ser Val Trp Asp
335 340 345
Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu Val Glu Trp Tyr Leu Leu
350 355 360
Arg Val Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala Pro Asn Lys Pro Asp 365 370 375
Glu Glu Glu Tyr Arg Arg Arg Leu Arg Thr Thr Tyr Leu Gly Gly
380 385 390
Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn lle Ala Tyr
395 400 405
Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser lle lle Val Thr His Asn
410 415 420
Val Ser Pro Asp Thr Leu Glu Arg Glu Gly Cys Lys Asn Tyr Asp
425 430 435
Val Ala Pro lle Val Gly Tyr Lys Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly 440 445 450 Phe lle Pro Ser lle Leu Gly Glu Leu lle Thr Met Arg Gin Glu
455 460 465
lle Lys Lys Lys Met Lys Ala Thr lle Asp Pro lle Glu Lys Lys 470 475 480
Met Leu Asp Tyr Arg Gin Arg Ala Val Lys Leu Leu Ala Asn Ser
485 490 495
Tyr Tyr Gly Tyr Met Gly Tyr Pro Lys Ala Arg Trp Tyr Ser Lys
500 505 510
Glu Cys Ala Glu Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg His Tyr lle Glu
515 520 525
Met Thr lle Lys Glu lle Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu
530 535 540
Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Phe Tyr Ala Thr lle Pro Gly Glu Lys 545 550 555
Pro Glu Thr lle Lys Lys Lys Ala Lys Glu Phe Leu Lys Tyr lle
560 565 570
Asn Ser Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe
575 580 585
Tyr Leu Arg Gly Phe Phe Val Ala Lys Lys Arg Tyr Ala Val lle
590 595 600
Asp Glu Glu Gly Arg lle Thr Thr Arg Gly Leu Glu Val Val Arg
605 610 615
Arg Asp Trp Ser Glu lle Ala Lys Glu Thr Gin Ala Lys Val Leu 620 625 630 Glu Ala lle Leu Lys Glu Asp Ser Val Glu Lys Ala Val Glu lle 635 640 645
Val Lys Asp Val Val Glu Glu lle Ala Lys Tyr Gin Val Pro Leu 650 655 660
Glu Lys Leu Val lle His Glu Gin lle Thr Lys Asp Leu Ser Glu 665 670 675
Tyr Lys Ala lle Gly Pro His Val Ala lle Ala Lys Arg Leu Ala
680 685 690
Ala Lys Gly lle Lys Val Arg Pro Gly Thr lle lle Ser Tyr lle
695 700 705
Val Leu Arg Gly Ser Gly Lys lle Ser Asp Arg Val lle Leu Leu
710 715 720
Ser Glu Tyr Asp Pro Lys Lys His Lys Tyr Asp Pro Asp Tyr Tyr 725 730 735
lle Glu Asn Gin Val Leu Pro Ala Val Leu Arg lle Leu Glu Ala 740 745 750
Phe Gly Tyr Arg Lys Glu Asp Leu Lys Tyr Gin Ser Ser Lys Gin
755 760 765
Val Gly Leu Asp Ala Trp Leu Lys Lys 770
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 32 Basenpaare (B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (11) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQÜENZBESCHREIBÜNG: SEQ ID NO: 6:
CCGCCAATGA TACTGGACAC TGATTACATA AC 32
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LANGE: 23 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(n) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQÜENZBESCHREIBÜNG: SEQ ID NO: 7:
TCATAMGTTG CCYTWGCATC TTCCAT 26
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 20 Basenpaare (B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
( n ) ART DES MOLEKÜLS : cDNA
( xi ) SEQÜENZBESCHREIBÜNG : SEQ I D NO : 8 :
ATTGGTGAGT TCATAGACCG 20 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:~9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQÜENZBESCHREIBÜNG: SEQ ID NO: 9:
GCDACRTGNG GNCCDATNGC YTTRTA 26
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
CGTGCACAAC ACTGATGGTT 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQÜENZBESCHREIBÜNG: SEQ ID NO: 11:
ATTGGTGAGT TCATAGACCG 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(il) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
TATGCGCATA TGATATTAGA CACTGACTAC ATA 33
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13;
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(il) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
GGGGTATAGA GACCTAAAGT CTAAATAGGC GATGTT 36 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: "l4 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 36 Basenpaare (B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
TTAGACTTTA GGTCTCTATA CCCCTCAATT ATAGTT 36
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQÜENZBESCHREIBÜNG: SEQ ID NO: 15:
ATAACCGTAA TAGCTGTTTG CGAGCAATTT AACAGC 36
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C ) STRANGFORM : Einzel strang ( D) TOPOLOGIE : linear
( ii ) ART DES MOLEKÜLS : cDNA (xi) SEQÜENZBESCHREIBÜNG: SEQ ID NO: 16:
CTCGCAAACA GCTATTACGG TTATATGGGC TATCCC 36
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
AAAACCATCA GTGTCGGCAT ATAGCACCTT AAATCC 36
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQÜENZBESCHREIBÜNG: SEQ ID NO: 18:
CTATATGCCG ACACTGATGG TTTTTACGCC ACAATA 36 [ 2 ) ANGABEN ZU SEQ ID N0:~19:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzeistrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQÜENZBESCHREIBÜNG: SEQ ID NO: 19:
TATGCGAGAT CTCTACTTCT TAAGCCACGC GTCCAG 36
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 22 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzeistrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQÜENZBESCHREIBÜNG: SEQ ID NO: 20:
GCATGGATCC CACTGCCCAG GG 22
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 34 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
( C ) STRANGFORM : Einzeistrang ( D) TOPOLOGIE : linear
( ii ) ART DES MOLEKÜLS : cDNA (xi) SEQÜENZBESCHREIBÜNG: SEQ ID NO: 21:
CGTACCTAGG GTGACGGGTC CCAAAATCAA AATA 34

Claims

Patentansprüche
1. Thermostabiles Enzym erhältlich aus einem Thermococcus spec. -Stamm, welches die Polymerisation von Desoxyribonukleinsäuren katalysiert, 3'-5'-Exonuklease-Aktivität aufweist und eine Halbwerszeit von ca. 60 Minuten bei ca. 90°C aufweist.
2. Thermophiles Enzym gemäß Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß es eine durch die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ. ID NO: 2 oder SEQ. ID NO: 4 codierte Aminosäurese¬ quenz oder einen Teil davon aufweist.
Thermostabiles Enzym gemäß Anspruch 1 oder 2 erhältlich aus Thermococcus spec. TY (DSM 10597).
4. Enzym nach Anspruch 1-3, welches eine optimale DNA-Polymerase-Aktivität in Gegen- wart von Magnesiumionen und in vollständiger oder nahezu vollständiger Abwesenheit von Manganionen aufweist.
5. Enzym nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Magnesiumionen-Konzentra¬ tion zwischen 2 und 10 mM und die Konzentration an Manganionen zwischen 0 und 2 mM beträgt.
6. Enzym nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine optimale 3'-5'-Exonukleaseaktivität in Gegenwart von maximal 1 μM der Desoxynukleotidtriphosphate und in Abwesenheit von Ribonukleotidtriphosphaten auf- weist.
7. DNA-Sequenz, die für ein aus Thermococcus spec. TY (DSM 10597) erhältliches Protein mit DNA-Polymerase-Aktivität oder einen Teilbereich von diesem codiert.
8. DNA-Sequenz nach Anspruch 7, wobei die DNA-Sequenz mindestens ca. 1200 Basen¬ paare aufweist.
9. DNA-Sequenz nach Anspruch 7 oder 8. dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ. ID NO: 2 oder SEQ. ID NO: 4 aufweist.
10. Vektor, welcher eine DNA-Sequenz gemäß der Ansprüche 7 bis 9 aufweist.
1 1. DNA-Sequenz, die für ein thermostabiles Enzym gemäß Anspruch 1 oder 2 codiert.
12. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 11, die in den Ndel/BamHI-Restriktionsbereich des Ex¬ pressionsvektors pET-15b ligiert ist. ', 3. Verfahren zur Gewinnung eines thermostabilen Enzyms mit DNA-Polymerase- und 3 '-5'- Exonuklease-Aktivität durch Expression in einem geeigneten eukaryotischen oder pro- karyotischen Stamm unter Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß der Ansprüche 10 oder 12 und anschließende Isolierung des Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß nach Zellaufschluß, der Extrakt einer Hitzebehandlung unterzogen wird und anschließend eine
Affinitätschromatographie sowie eine Chromatographie am Nickelchelat-Harz durchge¬ führt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13. dadurch gekennzeichnet, daß die Hitzebehandlung bei ca. 80°C über einen Zeitraum von ca. 15 Minuten erfolgt und/oder die Affinitätschromato¬ graphie an Blue Sepharose vorgenommen wird.
15. Verfahren zur Vervielfältigung von spezifischen DNA-Fragmenten unter Verwendung eines thermostabilen Enzyms gemäß einer der Ansprüche 1 bis 6 und mindestens eines geeigneten Primerpaares und der erforderlichen Nukleotidtriphosphate, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die Reaktion in Gegenwart einer bei ca. pH 8,9 puffernden Substanz bzw. entsprechenden Mischung, von 10 bis 100 mM Kaliumchlorid, 0,75 bis 4 mM Magne¬ siumchlorid und 0,01 bis 0,1% eines zwitterionischen Detergenzes durchgeführt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß Desoxynukleotidtriphosphate in einer (Gesamt-)Konzentration von maximal 1 μM im Reaktionsansatz enthalten sind.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Magnesiumionen ca. 1,25 mM beträgt.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2344591A (en) * 1998-08-24 2000-06-14 Bioline Limited A chimaeric DNA polymerase
US7122355B2 (en) 2001-07-11 2006-10-17 Roche Diagnostics Operations, Inc. Composition and method for hot start nucleic acid amplification
CN102212506A (zh) * 2010-04-12 2011-10-12 霍夫曼-拉罗奇有限公司 无去污剂的聚合酶

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1132474A1 (de) * 2000-03-11 2001-09-12 Roche Diagnostics GmbH B-Typ DNA-Polymerase Mutanten, die eine verbesserte PCR-Leistung aufweisen
JP2001269188A (ja) * 2000-03-11 2001-10-02 Roche Diagnostics Gmbh Ｐｃｒにおける性能が向上したｂ型ｄｎａポリメラーゼ変異体

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0455430A2 (de) * 1990-04-26 1991-11-06 New England Biolabs, Inc. Gereinigte thermostabile DNS-Polymerase zu erhalten aus Thermococcus litoralis
WO1992009689A1 (en) * 1990-12-03 1992-06-11 Stratagene PURIFIED THERMOSTABLE $i(PYROCOCCUS FURIOSUS)
EP0547359A1 (de) * 1991-12-18 1993-06-23 New England Biolabs, Inc. Gereinigte thermostabile DNS-Polymerase aus Pyrococcus-Arten
EP0547920A2 (de) * 1991-12-18 1993-06-23 New England Biolabs, Inc. Rekombinante thermostabile DNA-Polymerase von Archaebakterie
EP0602899A2 (de) * 1992-12-09 1994-06-22 New England Biolabs, Inc. Kontrollierbare Zwischensequenzen enthaltende modifizierte Proteine und Verfahren zur deren Herstellung
EP0632134A2 (de) * 1993-07-01 1995-01-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Reagenz und Verfahren für reverse Transkription bei hoher Temperatur, verbunden mit einer Polymerase-Kettenreaktion
WO1995016028A1 (en) * 1993-12-08 1995-06-15 Stratagene Novel polymerase compositions and uses thereof
EP0701000A2 (de) * 1994-07-06 1996-03-13 New England Biolabs, Inc. Rekombinierte thermostabile DNA-Polymerase von Archaebakterie
WO1996022389A1 (en) * 1995-01-18 1996-07-25 Pharmacia Biotech Inc. Purified thermococcus barossii dna polymerase
EP0745675A2 (de) * 1995-05-31 1996-12-04 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Methode zur Amplifizierung von Nukleinsäure und entsprechende Regenzien dafür

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0455430A2 (de) * 1990-04-26 1991-11-06 New England Biolabs, Inc. Gereinigte thermostabile DNS-Polymerase zu erhalten aus Thermococcus litoralis
WO1992009689A1 (en) * 1990-12-03 1992-06-11 Stratagene PURIFIED THERMOSTABLE $i(PYROCOCCUS FURIOSUS)
EP0547359A1 (de) * 1991-12-18 1993-06-23 New England Biolabs, Inc. Gereinigte thermostabile DNS-Polymerase aus Pyrococcus-Arten
EP0547920A2 (de) * 1991-12-18 1993-06-23 New England Biolabs, Inc. Rekombinante thermostabile DNA-Polymerase von Archaebakterie
EP0602899A2 (de) * 1992-12-09 1994-06-22 New England Biolabs, Inc. Kontrollierbare Zwischensequenzen enthaltende modifizierte Proteine und Verfahren zur deren Herstellung
EP0632134A2 (de) * 1993-07-01 1995-01-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Reagenz und Verfahren für reverse Transkription bei hoher Temperatur, verbunden mit einer Polymerase-Kettenreaktion
WO1995016028A1 (en) * 1993-12-08 1995-06-15 Stratagene Novel polymerase compositions and uses thereof
EP0701000A2 (de) * 1994-07-06 1996-03-13 New England Biolabs, Inc. Rekombinierte thermostabile DNA-Polymerase von Archaebakterie
WO1996022389A1 (en) * 1995-01-18 1996-07-25 Pharmacia Biotech Inc. Purified thermococcus barossii dna polymerase
EP0745675A2 (de) * 1995-05-31 1996-12-04 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Methode zur Amplifizierung von Nukleinsäure und entsprechende Regenzien dafür

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CANGANELLA F ET AL: "CHARACTERIZATION OF AMYLOLYTIC AND PULLULYTIC ENZYMES FROM THERMOPHILIC ARCHAEA AND FROM A NEW FERVIDOBACTERIUM SPECIES", APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 42, no. 2/03, 1994, pages 239 - 245, XP000602919 *
F. CANGANELLA ET AL.: "Biochemical and physiogenetic characterization of two novel deep-sea Thermococcus isolates with potentially biotechnological applications", ARCHIVES OF MICROBIOLOGY, vol. 167, no. 4, April 1997 (1997-04-01), SPRINGER, BERLIN, BRD, pages 233 - 238, XP000676980 *
F. NIEHAUS ET AL.: "A new thermostable archaeal DNA polymerase.", FIRST INTERNATIONAL CONGRESS ON EXTREMOPHILES, 1996, ESTORIL *
F.B. PERLER ET AL.: "Intervening sequences in an Archaea DNA polymerase gene", PROC. NATL.ACAD SCI., vol. 89, June 1992 (1992-06-01), NATL. ACAD SCI.,WASHINGTON,DC,US;, pages 5577 - 5581, XP002033280 *
FENG G ET AL: "Single-step purifications of His-6-MutH, His-6-MutL and His-6-MutS repair proteins of Escherichia coli K-12.", BIOTECHNIQUES 19 (6). 1995. 956-965. ISSN: 0736-6205, XP002033278 *
M. CAMBON ET AL.: "Cloning, sequencing and expression of DNA dependent DNA polymerase from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus abyssi", EMBL SEQUENCE DATABASE, 14 September 1995 (1995-09-14), HEIDELBERG, BRD, XP002027049 *
R.A. HODGES ET AL.: "Protein splicing removes intervening sequences in an archaea DNA polymerase", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 20, no. 23, 1992, IRL PRESS LIMITED,OXFORD,ENGLAND, pages 6153 - 6157, XP002033279 *
TABOR S ET AL: "EFFECT OF MANGANESE IONS ON THE INCORPORATION OF DIDEOXYNUCLEOTIDES BY BACTERIOPHAGE T7 DNA POLYMERASE AND ESCHERICHIA COLI DNA POLYMERASE I", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, vol. 86, no. 11, 1 June 1989 (1989-06-01), pages 4076 - 4081, XP000307484 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2344591A (en) * 1998-08-24 2000-06-14 Bioline Limited A chimaeric DNA polymerase
GB2344591B (en) * 1998-08-24 2003-11-12 Bioline Ltd Thermostable DNA polymerase
US7122355B2 (en) 2001-07-11 2006-10-17 Roche Diagnostics Operations, Inc. Composition and method for hot start nucleic acid amplification
CN102212506A (zh) * 2010-04-12 2011-10-12 霍夫曼-拉罗奇有限公司 无去污剂的聚合酶
JP2011217746A (ja) * 2010-04-12 2011-11-04 F Hoffmann La Roche Ag 界面活性剤非含有ポリメラーゼ
EP2374874A3 (de) * 2010-04-12 2012-01-11 Roche Diagnostics GmbH Tensidfreie Polymerasen
US10227642B2 (en) 2010-04-12 2019-03-12 Roche Diagnostics Operations, Inc. Detergent free polymerases

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