CN102212506A

CN102212506A - 无去污剂的聚合酶

Info

Publication number: CN102212506A
Application number: CN2011100895569A
Authority: CN
Inventors: U.菲舍尔; M.格赖夫; H.佐贝克; J-P.塔尔霍费尔
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2010-04-12
Filing date: 2011-04-11
Publication date: 2011-10-12
Also published as: JP2011217746A; US20110250598A1; EP2374874A3; ES2528230T3; EP2374874B1; US20140134633A1; CA2737015A1; EP2374874A2; US10227642B2

Abstract

本发明涉及完全不含去污剂的耐热DNA聚合酶的制剂，及其在实时PCR中的具体用途。

Description

无去污剂的聚合酶

技术领域

本发明涉及耐热DNA聚合酶制备和应用的技术领域。更明确而言，本发明涉及提供了在酶的生产、贮存或应用过程中无任何去污剂添加的用于耐热DNA聚合酶生产和使用的新方法。

背景技术

耐热DNA聚合酶是自从聚合酶链反应（PCR）建立后已分离且重组表达很久的酶。然而，如对于其他酶促反应的情况一样，PCR的性能也已知至少部分受痕量各种不同试剂例如去污剂的存在而被阻碍。另一方面，去污剂的存在已知对于许多聚合酶纯化方案和一般而言酶和特别是DNA聚合酶的长期稳定作用是必需的。

Lawyer，F.C.等人（JBC 264（1989）6427-6434）首次公开了Taq DNA聚合酶的克隆和重组表达。类似地，US 5,127,155公开了用非离子型去污剂稳定的聚合酶制剂，所述非离子型去污剂特别用于PCR应用。所使用的一般去污剂稳定去污剂是Triton X100、Tween 20和Nonidet P-40。

此外，根据US 5,127,155发明人的观察，去污剂在公开的制剂内的存在不仅是维持酶稳定性所需的，还是增强聚合酶活性所需的。

可替代的纯化方法和制剂已被公开。例如，WO 08/077017公开了用阴离子或两性离子型去污剂代替非离子型去污剂的聚合酶制剂。

Lawyer等人（PCR Methods and Applications，Cold Spring Harbor，第275-287页（1993））提供了改善方案，其中减少了在酶纯化过程中去污剂的存在。Engelke，D.R.等人（Anal. Biochem. 191（1990）396-400）公开了仅具有痕量去污剂的重组Taq聚合酶制剂，因为最后加入的贮存缓冲液不含去污剂化合物。

由概述的现有技术看来，本发明的目的之一是提供在聚合酶链反应（PCR）中具有最优化性能的改善的聚合酶制剂。

发明概述

因此，本发明提供了完全不含去污剂的耐热DNA聚合酶制剂。如果所选择的纯化方法不需要在任何纯化步骤时加入去污剂，那么可以获得此类制剂。

本发明还提供了包含完全不含去污剂的耐热DNA聚合酶制剂或反应混合物的试剂盒，所述反应混合物包含完全不含去污剂的耐热DNA聚合酶制剂。

此外，本发明涉及如上文公开的本发明聚合酶制剂的使用。当此类制剂用于借助于PCR优选实时PCR且最优选实时PCR（其中扩增产物通过至少一对FRET杂交探针进行检测）扩增靶核酸时，此类制剂是显著有利的。

此外，本发明提供了用于制备耐热DNA聚合酶的方法，其中所有制备步骤都在不存在任何去污剂的情况下执行。

例如，此类方法可以包含下述步骤：

a）提供补充有蛋白酶抑制剂的裂解物，

b）硫酸铵沉淀

c）使用第一种亲和层析基质的第一次层析分离

d）使用第二种亲和层析基质的第二次层析分离

e）使用羟磷灰石（Hydoxyapatite）基质的第三次层析分离。

可替代地，此类方法可要求耐热DNA聚合酶以融合蛋白的形式重组表达，所述融合蛋白包含His标记。随后制备包含使用装载镍的离子亲和柱纯化所述融合蛋白的步骤。

发明内容

本发明源于下述理论假设：对于某些酶促活性，痕量去污剂可能由于某种原因在至少某些特定条件下影响耐热DNA聚合酶的性能。如在实施例中将显示的，该假设可以实际上经检验为真实的。

酶制剂

因此，在第一个方面，本发明提供了完全不含去污剂的耐热DNA聚合酶制剂。在本发明的上下文中，术语“耐热DNA聚合酶制剂”应理解为至少部分纯化的耐热DNA聚合酶的任何制剂，其已从细胞裂解物中分离。裂解物可以得自天然含有所述耐热DNA聚合酶的生物，或优选得自重组修饰的宿主细胞，其表达编码所述耐热DNA聚合酶的基因。

耐热DNA聚合酶是已从嗜热菌中最初分离且克隆的耐热酶。借助于在所述引物的游离3’OH基团和脱氧核苷酸（desoxynucleotide）的α-磷酸盐部分之间产生磷酸二酯键，这些酶催化模板依赖性引物延伸，然而，同时生成焦磷酸盐作为副产物。优选地，所述模板是DNA模板。可替代地，模板可以是RNA。

耐热DNA依赖性DNA聚合酶的最突出例子是源于水生栖热菌（Thermos aquaticus）的Taq DNA聚合酶。它具有2种酶促活性：5'–3'聚合酶活性和双链特异性5'–3'核酸外切酶活性，这给酶提供了链置换能力。

根据本发明可以配制各种各样的耐热DNA聚合酶。优选地，耐热DNA聚合酶选自嗜热古菌（Aeropyrum pernix）、闪烁古球菌（Archaeoglobus fulgidus）、脱硫球菌属物种Tok.（Desulfurococcus sp. Tok.）、嗜热自养甲烷杆菌（Methanobacterium thermoautotrophicum）、甲烷球菌属物种（Methanococcus sp.）（例如詹氏甲烷球菌（jannaschii）、沃氏甲烷球菌（voltae））、炽热甲烷嗜热菌（Methanothermus fervidus）、热球菌属（Pyrococcus）物种（强烈炽热球菌（furiosus）、物种GB-D、沃氏热球菌（woesii）、abysii、掘越氏热球菌（horikoshii）、KOD）、Pyrodictium abyssii、隐蔽热网菌（Pyrodictium occultum）、硫化叶菌属物种（sulfolobus sp.）（例如嗜酸热硫化叶菌（acidocaldarius）、硫磺矿硫化叶菌（solfataricus））、嗜热球菌属（Thermococcus）物种（zilligii、barossii、fumicolans、gorgonarius、JDF-3、kodakaraensis KODI、litoralis、物种9度North-7、物种JDF-3、gorgonarius、TY）、嗜酸热原体（Thermoplasma acidophilum）、非洲栖热腔菌（Thermosipho africanus）、栖热袍菌属物种（Thermotoga sp.）（例如海栖热袍菌（maritima）、新阿波罗栖热袍菌（neapolitana））、嗜热自养甲烷杆菌、栖热菌属（Thermus）物种（例如水生栖热菌、brockianus、丝状栖热菌（filiformis）、黄栖热菌（flavus）、乳栖热菌（lacteus）、红色栖热菌（rubens）、红栖热菌（ruber）、嗜热栖热菌（thermophilus）、ZO5。

在一个实施方案中，耐热DNA聚合酶是DNA模板依赖性聚合酶。在另一个实施方案中，耐热DNA聚合酶具有另外的逆转录酶活性且可以用于RT-PCR。关于此类酶的一个实例是来自嗜热栖热菌的Tth DNA聚合酶（Roche Diagnostics目录号11 480 014 001）。

许多耐热DNA依赖性DNA聚合酶例如Taq DNA聚合酶缺乏也称为校正读码活性的双链依赖性3'–5'核酸外切酶。然而，本发明的范围还包括具有此类校正读码活性的其他耐热酶，例如Pwo聚合酶（Roche Applied Science目录号04 743 750 001）、Tgo聚合酶和Pfu聚合酶。

还在本发明的范围内的是其突变体、变体或衍生物，嵌合或“融合-聚合酶”例如Phusion（Finnzymes或New England Biolabs，目录号F-530S）或iProof（Biorad,目录号172-5300），Pfx Ultima（Invitrogen，目录号12355012）或Herculase II Fusion（Stratagene，目录号600675）。此外，根据本发明的组合物可以包含一种或多种上述聚合酶的掺和物。

耐热DNA聚合酶还可以由于化学修饰可逆灭活。更明确而言，将不耐热封闭基（blocking groups）引入Taq DNA聚合酶内，其在室温下致使酶灭活（US 5,773,258）。这些封闭基在高温下在PCR前步骤过程中去除，从而使得酶变得被激活。此类不耐热修饰例如可以通过使柠康酸酐或乌头酸酐（aconitric anhydride）与酶的赖氨酸残基偶联而获得（US 5,677,152）。携带此类修饰的酶可以同时作为Amplitaq Gold（Moretti，T.等人，Biotechniques 25（1998）716-22）或FastStart DNA聚合酶（Roche Applied Science目录号04 738 284 001）商购可得。

在一个特定实施方案中，根据本发明的所述耐热DNA聚合酶是如US 2005/0037412中公开的Taq DNA聚合酶或δ288 TaqDNA聚合酶或如US 6,020,130中公开的与适体结合的所述δ288 TaqDNA聚合酶。

理想地，通过在任何纯化步骤时不需要添加去污剂的纯化方法获得完全不含去污剂的耐热DNA聚合酶制剂。在获得足够纯化程度之后，制剂可以包含缓冲系统和其他非去污剂补充剂。此类制剂可以包含下述组分中的一个、数个或所有：Tris-缓冲液、EDTA、DTT、盐和甘油。例如，此类制剂可以包含下述量的组分中的一个、数个或所有：10 - 50 mM Tris/HCl pH 7.5、0,05-0,2 mM EDTA、0,5-2 mM DTT、50-200mM氯化钾和20-80 % 甘油。

试剂盒

在本发明的第二个方面，上文公开的任何本发明聚合酶都可以是试剂盒的组分。在一个简单实施方案中，此类试剂盒可以仅包含所述制剂和在其中可以有效发生各自的聚合反应的反应缓冲液。任选地，此类试剂盒另外可以包含一种或多种脱氧核苷（desoxynucleoside）三磷酸例如dATP、dGTP、dCTP和/或dTTP或其衍生物或类似物。

在一个更详细阐述的实施方案中，此类试剂盒可以包含用于进行一般而言地引物延伸反应或特别地聚合酶链反应（PCR）的另外试剂。例如，此类试剂盒另外可以包含能够结合应被扩增的核酸模板的至少一种引物。在PCR试剂盒的情况下，所述试剂盒可以包含一个或数个引物对，每个设计为扩增模板DNA的特异性片段。可替代地，如果试剂盒设计用于随机扩增方法，例如但不限于全基因组或全转录组扩增应用，那么引物组分可以是具有至少部分随机化序列的寡核苷酸库。

在与先前的实施方案相容的另一个实施方案中，根据本发明的试剂盒可以包含能够检测由耐热DNA聚合酶产生的产物的另外试剂。具体地，这些试剂可以能够检测借助于实时PCR的PCR扩增产物。

根据本发明的各自的试剂盒因此另外可以包含双链特异性荧光DNA结合试剂，例如SybrGreen（Invitrogen目录号4304886）或LC480 Resolight染料（Roche Applied Science目录号 04 909 640 001）。可替代地，根据本发明的各自的试剂盒可以包含标记的杂交探针，例如TaqMan水解探针（US 5,804,375）或Molecular Beacons（US 5,118,801）。在一个具体实施方案中，各自的试剂盒包含至少一对或数对FRET杂交探针（US 6,174,670）。

反应混合物

在本发明的第三个方面，任何本发明聚合酶制剂可以是用于进行一般而言地模板依赖性引物延伸反应和特别地PCR扩增反应的反应混合物的部分。以其最广泛的含义，不含任何痕量去污剂的此类反应混合物包含

-可通过如实施例中公开的方法获得的不含任何去污剂的聚合酶制剂

-优选为DNA的模板核酸

-至少一个引物，其为能够与所述DNA结合的寡核苷酸，和

-至少一种脱氧核苷三磷酸或其任何类似物或衍生物，但优选4种dNTPs，即dATP、dCTP、dGTP和dTTP、或dUTP代替dTTP。

在一个实施方案中，此类反应混合物是不含任何去污剂的PCR反应混合物且包含

-完全不含去污剂的耐热DNA聚合酶制剂

-优选为DNA的模板核酸

-以此类方式设计的至少一对或数对扩增引物，使得由模板核酸扩增靶DNA的特定区域，和

-脱氧核苷三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP/或dUTP。

在一个具体实施方案中，此类PCR反应混合物可以另外包含任何另外试剂，其能够实时检测由耐热DNA聚合酶产生的产物。根据本发明的各自的混合物因此可以另外包含双链特异性荧光DNA结合试剂、TaqMan水解探针、Molecular Beacons或FRET杂交探针，其已在上文得到公开。

使用方法

不含任何去污剂的本发明的耐热DNA聚合酶制剂对于任何类型的核酸扩增反应有用。在一个实施方案中，它们可以用于随机扩增例如随机引发反应或全基因组扩增。在一个具体实施方案中，所述本发明制剂特别用于借助于进行PCR反应，其可以是实时PCR反应，来扩增特定靶核酸。

对于分析目的，此类PCR反应可以实时进行监控。在实时PCR内，样品分析与扩增在同一仪器内在同一管中同时发生。PCR产物的形成在PCR的每个循环中进行监控。它通常在热循环仪中进行测量，所述热循环仪具有用于在扩增反应过程中测量荧光信号的另外设备。DNA染料或荧光探针可以在扩增前加入PCR混合物，并且用于在扩增过程中分析PCR产物。这种组合方法减少样品处理，节省时间，且极大减少对于后续反应的产物污染危险，因为不需要从其密闭容器中取出样品用于进一步分析。

因此，在第四个方面，本发明还涉及完全不含去污剂的耐热DNA聚合酶制剂用于借助于PCR且特别是实时PCR的扩增的用途。

在一个实施方案中，因为双链扩增产物的量通常超过最初存在于待分析样品中的核酸量，所以可以使用双链DNA特异性染料，这仅在它们与双链DNA结合时，在用合适波长激发后显示增强荧光。优选地，仅可以使用如SybrGreenI I例如不影响PCR反应效率的那些染料。

可替代地，可以使用仅在与其靶核酸结合后发出荧光的荧光标记的杂交探针。

在另一个实施方案中，单链杂交探针用2种组分进行标记。当第一种组分用合适波长的光激发时，根据荧光共振能量转移原理，所吸收能量转移给第二种组分，所谓的猝灭剂。在PCR反应的退火步骤过程中，杂交探针与靶DNA结合，并且在后续延伸期过程中通过Taq DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性降解。因此，被激发的荧光组分和猝灭剂在空间上彼此分开，并且因而可以测量第一种组分的荧光发射。TaqMan水解探针测定详细公开于US 5,210,015、US 5,538,848和US 5,487,972中。TaqMan杂交探针和反应混合物公开于US 5,804,375中。

在一个进一步的实施方案中，Molecular Beacon杂交探针用第一种组分和猝灭剂进行标记，所述标记优选位于探针的两端上。由于探针的二级结构，2种组分在溶液中处于空间上邻近。在与靶核酸杂交后，2种组分彼此分开，从而使得在用合适波长的光激发后，可以测量第一种组分的荧光发射（US 5,118,801）。

在再进一步的具体实施方案中，完全不含去污剂的耐热DNA聚合酶制剂用于借助于PCR扩增靶核酸，其特征在于所述实时PCR借助于FRET杂交探针进行实时监控。

FRET杂交探针测试形式用于所有种类的同源杂交测定（Matthews，J.A.和Kricka，L.J.，Analytical Biochemistry 169（1988）1-25）。它的特征在于2个单链杂交探针，其同时使用且与扩增靶核酸相同链的邻近部位互补。2种探针用不同荧光组分进行标记。当用合适波长的光激发时，根据荧光共振能量转移原理，第一种组分将吸收的能量转移给第二种组分，从而使得当2种杂交探针与待检测靶分子的相邻位置结合时，可以测量第二种组分的荧光发射。可替代地，为了监控FRET受体组分荧光中的增加，还可能的是监控FRET供体组分的荧光减少作为杂交事件的定量测量。

特别地，FRET杂交探针形式可以在实时PCR中使用，以便检测扩增的靶DNA。在实时PCR领域中已知的所有检测形式中，FRET杂交探针形式已证明是高度敏感、精确且可靠的（US 6,174,670）。作为2种FRET杂交探针使用的替代方案，还可能的是使用荧光标记的引物和唯一一种标记的寡核苷酸探针（Bernard，P.S.等人，Analytical Biochemistry 255（1998）101-107）。在这点上，可以任意进行选择，无论引物是用FRET供体还是用FRET受体化合物进行标记。

类似于其他基于探针的检测形式，FRET杂交探针检测形式也可以是“多重的” （“multiplexed”）。更明确而言，在一个反应容器中，多重靶可以变得用多对扩增产物进行扩增且用多重杂交探针进行检测。在这种情况下，所述多重探针用不同可检测荧光染料进行标记，以便检测且区分假定在样品中待发现的多重靶。

对于用FRET杂交探针形式的多重检测，Fluorescein或Fluorescein衍生物用作FRET供体部分与不同FRET受体部分例如Cy-5、LC-Red-640或LC-red 705组合是可能的。

关于能够执行多重实时PCR的仪器的一般实例是Roche Diagnostics LightCycler（目录号3 531 414 201）。它是能够动态在线PCR扩增和后续分析PCR产物解链曲线的快速PCR系统。商购可得的目前LightCycler版本2.0的光学系统含有一种光源，蓝光发射二极管（470 nm LED）和6个检测通道。对于待分析的所有反应确定限定的信号阈，并且对于靶核酸以及参考核酸例如标准或持家基因确定达到这个阈值所需的循环Cp数目。靶分子的绝对和相对拷贝数可以基于对靶核酸和参考核酸的获得的Cp值进行测定。

由样品发出的荧光由一组分色镜和滤片分离成不同波长，所述波长可以在6个检测通道之一中进行记录。由于可在市场上获得的荧光化合物，这允许检测双链DNA结合染料SybrGreenI、用TaqMan Probe形式的双重颜色检测和用Hybridization Probe（HybProbe）形式的4色检测。LightCycler系统的细节公开于WO 97/46707、WO 97/46712和WO 97/46714。

然而，在基于FRET的实时PCR测定和特别是各自的多重测定的晚期阶段时，频繁观察到荧光的减少。使用FRET杂交探针的常规实时PCR的这种缺点被称为“钩状”（“hook”）效应。实例在图2和3中给出。令人惊讶的是，如果使用根据本发明的聚合酶制剂且反应混合物不含任何痕量去污剂，那么可以消除这种效应。

制备方法

在第五个方面，本发明提供用于制备耐热DNA聚合酶的方法，其特征在于所有制备步骤在不存在任何去污剂的情况下进行。一般而言，可以应用任何制备方法，其可以成功应用于纯化耐热DNA聚合酶，在所需的每个步骤中无需去污剂的任何添加。

例如，此类纯化方法可以包含步骤

a）提供补充有蛋白酶抑制剂的裂解物，

b）硫酸铵沉淀

c）使用第一种亲和层析基质的第一次层析分离

d）使用第二种亲和层析基质的第二次层析分离

e）使用羟磷灰石（Hydoxyapatite）基质的第三次层析分离。

裂解物优选衍生自重组原核细胞，例如大肠杆菌，其被遗传修饰以高产率表达编码所需耐热DNA聚合酶的基因。在借助于离心从发酵培养基中收获细胞后，团块可以进行冷冻且在该状态中，细胞可以以物理方法例如超声处理或优选地通过用弗氏细胞压碎器处理进行破坏。在裂解前、在裂解过程中或立刻在裂解后，可以加入已含有合适蛋白酶抑制剂例如举例来说PMSF、亮抑酶肽等的缓冲液。

与硫酸铵沉淀步骤平行，在裂解物中含有的核酸可以酶促或优选借助于沉淀例如用Polymin P去除。核酸沉淀物和蛋白质沉淀物都可以通过离心去除。

随后可以使用亲和层析柱对上清液实施第一个层析步骤，这优选根据疏水相互作用层析原理起作用。最优选地，亲和基质是苯基-琼脂糖，例如苯基-琼脂糖 CL-4B。

随后，可以使用第二种亲和基质进行第二次亲和层析，所述第二种亲和基质不同于第一种亲和基质。例如，样品可以在含有肝素琼脂糖 CL-6B的肝素琼脂糖柱上进行纯化。

然后，借助于第三个层析步骤可以达到进一步纯化，所述第三个层析步骤是优选借助于羟磷灰石（Hydoxyapatite）层析的纯化。

如果重组表达的耐热DNA聚合酶包含所谓的多His标记，简化的纯化方案是可能的。多组氨酸标记通常用于在原核生物和其他表达系统中表达的多组氨酸标记的重组蛋白质的亲和纯化。重组细菌细胞经由离心进行收获，并且所得到的细胞团块通过例如物理方法在如上文公开的条件下进行裂解。

在这个阶段时，粗提取物含有重组蛋白质以及源于细菌宿主的几种其他蛋白质和核酸。任选地，在这个阶段，在样品中含有的核酸可以通过DNA酶I进行消化。

随后将混合物装载到包含特异性亲和基质例如装载镍或钴的琼脂糖等的柱上。各自的的琼脂糖（sepharose）或琼脂糖(agarose)基质含有多组氨酸标记以高亲和力与之结合的被结合的镍或钴离子。树脂随后用缓冲液洗涤，以去除不与钴或镍离子特异性相互作用的其他蛋白质。

随后，进一步纯化可以借助于第二个层析步骤来达到，其优选是阴离子交换层析。例如，可以使用Q-琼脂糖 ff柱。

因此，用于纯化his标记的耐热DNA聚合酶的一般纯化方法可以包含步骤

a）提供补充有蛋白酶抑制剂的衍生自细胞的冷冻细胞裂解物，所述细胞重组表达His标记的耐热DNA聚合酶

b）用DNA酶I消化在样品中含有的核酸

c）使用装载镍的琼脂糖基质的层析分离

d）使用优选为Q-琼脂糖 ff的阴离子交换基质的层析分离。

如对于技术人员显而易见的，如有需要时，可以在每次层析洗脱后进行透析步骤。特别地，此类透析是特别有利的，以便将纯化的耐热DNA聚合酶转移到合适贮存缓冲液内。用于在-20℃下长期贮存的合适缓冲系统是20 mM Tris/HCl、0.1 mM EDTA、100 mM氯化钾、1 mM DTT、50% 甘油，pH 8.0。

提供下述实施例、序列表和附图以帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求中阐述。应当理解可以在所示操作中进行修饰而不背离本发明的精神。

附图说明

图1：如实施例6中公开的实验结果。靶DNA以各种量使用且以300 ng（A）、30 ng（B）、3 ng（C）、0.3 ng（D）、0.03 ng（E）滴加和无DNA（F）。所使用的Taq DNA聚合酶不添加去污剂进行制备。

图2：如实施例6中公开的实验结果。靶DNA以各种量使用且以300 ng（A）、30 ng（B）、3 ng（C）、0.3 ng（D）、0.03 ng（E）滴加和无DNA（F）。所使用的Taq DNA聚合酶含有去污剂（0.5% Tween 20，0.5% Nonidet NP-40）。

图3：如实施例6中公开的实验结果。靶DNA以各种量使用且以300 ng（A）、30 ng（B）、3 ng（C）、0.3 ng（D）、0.03 ng（E）滴加和无DNA（F）。Taq DNA聚合酶Roche Applied Science目录号： 11 146 165 001用于这个实验。

实施例

实施例1：

Taq DNA聚合酶的纯化

从含有质粒pUBS520和pT5-Taq的冷冻的大肠杆菌细胞K12LE392中纯化重组Taq DNA聚合酶至同质性。蛋白质浓度在280 nm下进行测量。使用1.64的摩尔消光因子。

使冷冻细胞（25克）解冻并且悬浮于60 ml缓冲液A（50 mM Tris/HCl、0.5 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）、1 mM EDTA、0.64 μg/ml亮抑酶肽，pH 8.0）中。细胞使用弗氏细胞压碎器进行破碎。

向溶液中加入硫酸铵（2.4 gr/100 ml）。将pH值重新调整至pH 8.0。通过加入Polymin P沉淀核酸。通过离心（在5 000 rpm下30分钟）去除沉淀的核酸。使澄清的上清液在75℃下温育15分钟。通过离心（在5 000 rpm下30分钟）去除沉淀的蛋白质。

向澄清的上清液中加入硫酸铵溶液（10.57 gr/100 ml）。使pH值重新调整至pH 8.0。将溶液应用到用缓冲液B（50 mM Tris/HCl、1 mM EDTA、1 M硫酸铵，pH 8.0）平衡的苯基琼脂糖 CL-4B（1.6 x 12 cm）上。用缓冲液B，随后用缓冲液C（50 mM Tris/HCl，pH 8.0），且最后用缓冲液D（50 mM Tris/HCl、1 mM EDTA、20%乙二醇， pH 8.0）洗涤柱。用缓冲液D和缓冲液D + 4 M尿素的线性梯度洗脱酶。使含有酶的级分合并。

将合并的库（pool）应用于用缓冲液E（50 mM Tris/HCl、0.1 mM EDTA、100 mM KCl、5%甘油，pH 8.0）平衡的肝素琼脂糖柱CL-6B（1.6 x 12.5 cm）。使用缓冲液E洗涤柱。用缓冲液E和缓冲液E + 650 mM氯化钾的线性梯度洗脱酶。通过SDS凝胶电泳分析级分且使含有酶的级分合并。将合并的级分用缓冲液F（10 mM磷酸钾、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、5% 甘油，pH 8.0）进行透析。

将透析的库装载到HA Ultrogel（Pall，1.6 x 8.5 cm）上。用缓冲液F洗涤柱。用缓冲液F和缓冲液G（500 mM磷酸钾、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、5% 甘油，pH 8.0）的线性梯度洗脱酶。使含有酶的级分合并，并且用无去污剂的贮存缓冲液（20 mM Tris/HCl、0.1 mM EDTA、100 mM氯化钾、1 mM DTT、50% 甘油，pH 8.0）进行透析。

实施例2：

δ288 Taq DNA聚合酶的纯化

从含有质粒pQE80-L的冷冻的大肠杆菌K12XL1 blue细胞中纯化Taq DNA聚合酶的重组截短形式δ288 Taq DNA聚合酶（参见US 20050037412）至同质性。蛋白质浓度在280 nm下进行测量。使用1.117的摩尔消光因子。

使冷冻细胞（20克）解冻并且悬浮于240 ml缓冲液A（50 mM磷酸钠、300 mM NaCl、10 mM 咪唑（imidazol）、0.1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）、1 mM EDTA，pH 8.0）中。细胞使用弗氏细胞压碎器进行破碎。

向溶液中加入MgCl₂至终浓度4 mM。在加入DNA酶（50 u/ml）后，使溶液在室温下温育30分钟。使溶液在72℃下温育30分钟。在使溶液冷却至2-8℃后，通过离心（在13 000 rpm下10分钟）去除沉淀的蛋白质。

将澄清的上清液应用于在缓冲液B（50 mM磷酸钠、300 mM NaCl、10 mM咪唑，pH 8.0）中平衡的装载镍的螯合琼脂糖 ff柱（5 x 4 cm）。在缓冲液B和缓冲液C（50 mM磷酸钠、300 mM NaCl、250 mM咪唑，pH 8.0）的线性梯度中洗脱酶。通过SDS凝胶电泳分析级分，并且使含有酶的级分合并。

在用缓冲液D（25 mM Tris/HCl、1 mM EDTA、15 mM NaCl、5 % 甘油，pH 8.5）透析后，将溶液应用到Q-琼脂糖 ff柱（1.6 x 4 cm）上。在用缓冲液D洗涤柱后，使用线性盐梯度（15-200 mM NaCl）洗脱酶。通过SDS凝胶电泳分析级分，并且使含有酶的级分合并。

最终的库再次用无去污剂的贮存缓冲液（20 mM Tris/HCl、0.1 mM EDTA、100 mM氯化钾、1 mM DTT、50% 甘油，pH 8.0）进行透析。

实施例3：

δ288 AptaTaq DNA聚合酶的制备

用适体掺和纯化的δ 288 Taq DNA聚合酶（参见实施例1）。

适体的序列是：CGA TCA TCT CAG AAC ATT CTT AGC GTT TTG TTC TTG TGT ATG ATC G-PO₄（SEQ. ID. NO：2）。

用适体掺和高度浓缩的酶溶液，并且用无去污剂的贮存缓冲液稀释至终浓度50 U/μl聚合酶和4.33 pmol适体/单位聚合酶。另外，以相同方法生产具有5 U/μl体积活性的形式。将酶掺和物贮存于-20℃。

实施例4：

聚合酶活性的测试

使用标准程序在引物延伸测定中测定DNA聚合酶活性。引物/模板杂交物用作底物。引物/模板由与M13 mp9ss DNA模板杂交的M13测序引物5′-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3′（SEQ. ID. No：1）组成。引物通过掺入dNTPs进行延伸。dNTPs混合物含有放射性标记的α ³²dCTP。用TCA沉淀合成产物，并且使用闪烁计数器定量掺入的α³²dCTP。

在含有下述试剂的50 μl体积中进行反应：67 mM Tris（pH 8.3）、5 mM MgCl₂、10 mM巯基乙醇、0.2% 聚桂醇（polydocanol）、0.2 mg/ml明胶、200 μM dATP、100 μM dCTP、200 μM dGTP、200 μM dTTP、DNA/引物杂交物（1 μg DNA、0.3 μg引物）和α³²dCTP（1 μC）。将稀释的酶的等分试样加入混合物中，混合且在65℃下温育60分钟。在温育后，将样品置于冰上，并且用10 % TCA溶液沉淀DNA。使样品通过GFC滤器（Whatman）过滤，滤器用5 % TCA洗涤3次，干燥且在2 ml闪烁液中在β计数器中计数。

实施例5：

使用不同DNA聚合酶制剂扩增人基因组DNA

从人基因组DNA（Roche Applied Science，Mat. No. 11 691 112）扩增tPA基因片段。使用FRET杂交探针进行扩增产物的检测和定量（US 6,174,670）。

为了证实去污剂的效应，使用根据实施例2不用去污剂制备的δ288 Taq DNA聚合酶制剂、根据实施例3的δ288 AptaTaq DNA聚合酶制剂和用0.5 % Tween 20制备的Taq DNA聚合酶制剂。3种不同聚合酶制剂如下：

制剂1：不含去污剂的δ 288 AptaTaq DNA聚合酶

制剂2：不含去污剂的δ 288 Taq DNA聚合酶

制剂3：含去污剂（0.5% Tween 20）的δ 288 Taq DNA聚合酶。

使用下述寡核苷酸引物：

tPA7正向：GGA AGT ACA GCT CAG AGT TCT（SEQ. ID. NO：3）

tPA7反向：CTC CAT TCA TTC TCA AAA GGA CT（SEQ. ID. NO：4）。

检测寡核苷酸是：

tPA Fluos：GGG AAA GGC GGG GTG G-Fluo（SEQ. ID. NO：5）

tPA LC-Red 640：LC-Red 640-GCC ACT TAC CCT CAG AGC AGG CA （SEQ. ID. NO：6）。

反应（20 μl）在Light Cycler LC480平台（Roche Applied Science目录号：05 015 278 001）上在384孔板中进行。使用2.95单位各自的聚合酶/20 μl反应。

试剂的终浓度是：

Tris/HCl 30 mM

MgCl₂ 3.2 mM

KCl 30 mM

dATP 0.2 mM

dCTP 0.2 mM

dGTP 0.2 mM

dUTP 0.6 mM

酪蛋白 0.5 g/l

tPA7正向 0.5 μM

tPA7反向 0.5 μM

tPA7 Fluos 0.2 μM

tPA7 Red640 0.2 μM

人基因组DNA 0.03 ng – 300 ng

下述循环程序在LC 480仪器上使用：

下表显示对于研究的3种不同聚合酶制剂所获得的计算的交叉点：

低交叉点数目与高度扩增核酸对应。

结果证实除使用与最低限度量模板DNA组合的不含去污剂的δ288 Apta Taq外，扩增反应在不存在去污剂例如Tween 20的情况下得到改善。

实施例6：

实验基本上如实施例5中公开的进行，除了测试不同Taq DNA聚合酶制剂的活性：

A）根据实施例1不用去污剂制备的聚合酶制剂（参见图1）

B）根据实施例1不用去污剂制备的聚合酶制剂，但最后补充有Nonidet NP-40和Tween 20；各0.5 %去污剂（参见图2）

C）用去污剂制备的聚合酶制剂（Roche Applied Science目录号11 146 165 001）（参见图3）。

代表实时PCR扩增曲线的如图1-3中所示的结果证实用3种不同制剂的各个均获得良好扩增信号。因此，可以得出结论Taq DNA聚合酶的性能不需要在扩增反应自身过程中去污剂的存在，在扩增程序过程中去污剂的添加也不引起改善的酶性能。

后面2种制剂的确显示对于测试的所有靶DNA浓度的特征性钩状效应（参见图2和3），即扩增信号在晚期扩增循环时再次降低。相反，不添加去污剂制备的聚合酶完全不显示任何钩状效应（参见图1）。可以得出结论用制剂B）观察到的钩状效应由于去污剂的存在是显著的，并且类似地在制剂C）中的钩状效应是由于痕量去污剂的存在是在测定中仍存在的，因为在Taq DNA聚合酶纯化过程中已使用的去污剂。因此，钩状效应仅在使用根据本发明的聚合酶，当在不存在任何去污剂的情况下进行扩增时可以得到避免。

序列表

<110> F. Hoffmann-La Roche AG，Basel（CH）

Roche Diagnostics GmbH，Mannheim（DE）

<120> 无去污剂的聚合酶

<130> 26670 FT

<150> EP10159673

<151> 2010-04-12

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链，人工 DNA

<400> 1

gtaaaacgac ggccagt 17

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链，人工DNA

<400> 2

cgatcatctc agaacattct tagcgttttg ttcttgtgta tgatc 45

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链，人工DNA

<400> 3

ggaagtacag ctcagagttc t 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链，人工DNA

<400> 4

ctccattcat tctcaaaagg act 23

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链，人工DNA

<400> 5

gggaaaggcg gggtgg 16

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链，人工DNA

<400> 6

gccacttacc ctcagagcag gca 23

Claims

1.一种完全不含去污剂的耐热DNA聚合酶的制剂，其包含10 - 50 mM Tris/HCl、0.05-0.2 mM EDTA、0.5-2 mM DTT、50-200mM氯化钾和20-80 %甘油。

2.根据权利要求1的制剂，其可通过在任何纯化步骤时不需要添加去污剂的纯化方法获得。

3.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-2的制剂。

4.一种完全不含去污剂的反应混合物，其包含：

- 完全不含去污剂的耐热DNA聚合酶的制剂，

- 模板核酸，

- 扩增引物对，和

- 脱氧核苷酸三磷酸。

5.根据权利要求3的试剂盒或根据权利要求4的反应混合物，其另外包含至少一对FRET杂交探针。

6.一种用于制备根据权利要求1的耐热DNA聚合酶的方法，其中所有制备步骤在不存在任何去污剂的情况下执行。

7.根据权利要求6的方法，其包含步骤：

- 提供补充有蛋白酶抑制剂的裂解物，

- 进行硫酸铵沉淀，

- 使用第一种亲和层析基质的第一次层析分离，

- 使用第二种亲和层析基质的第二次层析分离，和

- 使用羟磷灰石基质的第三次层析分离。

8.根据权利要求6的方法，其包含步骤：

a）提供补充有蛋白酶抑制剂的衍生自细胞的冷冻细胞裂解物，所述细胞重组表达His标记的耐热DNA聚合酶，

b）用DNA酶I消化在样品中含有的核酸，

c）使用装载镍的琼脂糖基质的层析分离，和

d）使用优选为Q-琼脂糖ff的阴离子交换基质的层析分离。

9.根据权利要求1-2的制剂用于借助于PCR扩增靶核酸的用途。

10.根据权利要求9的用途，其中所述PCR实时进行监控。

11.根据权利要求10的用途，其中所述PCR借助于加入至少一对FRET杂交探针进行监控。