WO1997034931A1 - Anticorps specifique de staphylococcus aureus et utilisations - Google Patents

Anticorps specifique de staphylococcus aureus et utilisations Download PDF

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WO1997034931A1
WO1997034931A1 PCT/FR1997/000510 FR9700510W WO9734931A1 WO 1997034931 A1 WO1997034931 A1 WO 1997034931A1 FR 9700510 W FR9700510 W FR 9700510W WO 9734931 A1 WO9734931 A1 WO 9734931A1
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staphylococcus aureus
antibody
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fibrinogen
reagent
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PCT/FR1997/000510
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Sylviane Merlin
Nicole Battail
Jean-Pierre Flandrois
Gérard CARRET
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Bio Merieux
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells

Definitions

  • the present invention relates to the field of detection of Staphylococcus aureus bacteria, and in particular strains of Staphylococcus aureus which are resistant to methicillin.
  • detection is understood collectively all the techniques making it possible to identify, qualitatively and / or quantitatively, or to enrich, purify or separate a biological analyte, in this case bacteria
  • a reagent for detecting Staphylococcus aureus bacteria, including strains resistant to methicillin, this reagent comprising:
  • an antibody, monoclonal or polyclonal, which specifically recognizes an epitope is brought to the strains of Staphylococcus aureus of different capsular serotypes, in particular strains resistant to methicillin.
  • This antibody is chosen from type G immunoglobulins, type M immunoglobulins and type A immunoglobulins.
  • a particularly advantageous application of the antibody according to the invention consists in incorporating it into a specific reagent for the detection of Staphylococcus aureus, including strains resistant to methicillin.
  • the sensitivity of the reagent of the invention is higher, since the capacity for recognition of capsular serotypes is greater.
  • a monoclonal or polyclonal antibody specific for an epitope common to strains of Staphylococcus aureus of different capsular serotypes, in particular strains resistant to methicillin, said antibody being chosen from immunoglobulins of the type G, type M immunoglobulins and type A immunoglobulins; this antibody recognizes both specifically at least two different capsular serotypes of said strains of Staphylococcus aureus; preferably, it is chosen from type G immunoglobulins and type M immunoglobulins;
  • a monoclonal or polyclonal antibody as defined above which in particular recognizes at least the capsular serotype of type 5 and the capsular serotype of type 8 of said strains of Staphylococcus aureus, a monoclonal antibody capable of being obtained according to a technique suitable for Galfe et al.
  • the myeloma line SP2 / 0-Agl4 (ATCC CRL 1581); the fusion is carried out with spleen cells of mice of the BALB / C species and of the BALB / CBYJICO strain (marketed by the company IFFA Credo), immunized with a strain of Staphylococcus aureus type 5, according to conventional techniques; the clones obtained were screened by immunoenzymatic techniques (ELISA); the selected clones were reinjected intraperitoneally into mice prepared beforehand for the production of ascites fluid; each monoclonal antibody was used to sensitize latex particles and was tested for its specificity in recognizing the capsular polysaccharides of Staphylococcus aureus; the monoclonal antibodies called P2G7A1E5 and P6D8D12E1 respectively were chosen because of their specificity in recognizing a common epitope with different capsular
  • hybridoma cell line such as that deposited under No. 96021514, on 02/15/1996 with ECACC, or such as that deposited under No. 96021513, on 02/15/1996 with ECACC , or any other hybridoma cell line derived, for example any offspring of this line;
  • the cell lines are claimed as such, as well as any derived cell line, that is to say capable of producing antibodies having the same immunological characteristics as those described in the present invention
  • a specific reagent for detecting Staphylococcus aureus bacteria and in particular strains resistant to methicillin comprising at least one antibody specifically recognizing at least one common epitope of the various capsular serotypes of Staphylococcus aureus strains resistant to methicillin, said reagent comprising at least a monoclonal or polyclonal antibody as defined above; said antibody can be fixed or coupled, or not, on a support or a marker; the term “monoclonal or polyclonal antibody” means the antibodies as defined above as well as any antibody having cross-specificity with them; - a specific reagent, in particular for detecting Staphylococcus aureus bacteria and in particular strains resistant to methicillin, further comprising fibrinogen or a fibrinogen-based compound capable of being recognized by the affinity factor for fibrinogen of Staphylococcus aureus ; the fibrinogen or fibrinogen compound can be fixed or coupled, or not, on a support or on a marker;
  • a specific reagent in particular for detecting Staphylococcus aureus bacteria and in particular strains resistant to methicillin, further comprising immunoglobulins or their Fc fragment recognized by protein A of Staphylococcus aureus, fixed or coupled, or not, on a support or on a marker, all kinds of support or marker can be envisaged according to the invention.
  • suspended particles are in particular latex particles, such as polystyrene beads or similar particles, preferably having a size of less than 2 ⁇ m.
  • latex particles such as polystyrene beads or similar particles, preferably having a size of less than 2 ⁇ m.
  • Estapor particles sold by the company RHONE-POULENC, such as:
  • - polystyrene particles having carboxylic groups PSI 480, having a diameter of 0.8 ⁇ m.
  • Magnetic gels can also be used, such as polyacrylamide and / or agarose gels containing magnetic particles.
  • gels such as Ultrogel and Magnogel (trademarks) from the company IBF can be used.
  • the support used in a reagent according to the present invention can also be red cells, for example from sheep.
  • the support may be in the form of a plate, a cone, a strip, for example of polystyrene, or a styrene-based copolymer, a glass tube or the like.
  • the fixation being able to be spontaneous, during an incubation of the latex particles in a solution containing the antibodies and the fibrinogen; an incubation for example of approximately 2 hours at 20 ° C is often sufficient;
  • the fixing being able to be carried out by creating a covalent bond between the antibodies and the reactive groups present on certain particles of the latex; it is possible for example to use a carbodiimide to create the covalent bond.
  • the support consists of red blood cells
  • these can be sensitized beforehand by fibrinogen or any other suitable molecule, according to conventional techniques.
  • concentration of antibodies to be fixed on the latex particles which must be determined for each antibody according to known methods, is usually between 0.1 ⁇ g and 100 ⁇ g of antibody proteins per milliliter of latex in solution.
  • the antibodies and the fibrinogen can be fixed on a single suspension of particles, for example of latex, or else can be fixed on suspensions of respectively different particles, such as red blood cells and latex particles, or different latexes which are then mixed to form the reagent.
  • the marker can be any biological or chemical molecule, for example an enzyme, a hapten, an oligonucleotide, a radioactive element, etc.
  • reagent as defined above comprising an antibody of the immunoglobulin type comprising an Fc fragment capable of binding to protein A of Staphylococcus aureus and / or another compound based on fibrinogen or derivative, capable of reacting with the affinity factor for the fibrinogen of said bacteria, said reagent further comprising at least one polyclonal or monoclonal antibody capable of specifically recognizing different capsular serotypes of Staphylococcus aureus, in particular serotypes type 5 and 8;
  • EXAMPLE 1 Composition of a reagent according to the invention, called SLIDEX 5 ⁇ PH PLUS
  • the reagent comprises an antibody of the immunoglobulin type comprising an Fc fragment capable of binding to the protein A of Staphylococcus aureus and / or another compound based on fibrinogen or derivative, capable of reacting with the affinity factor for fibrinogen of said bacteria , said reagent comprising in addition, at least one polyclonal or monoclonal antibody capable of specifically recognizing different capsular serotypes of Staphylococcus aureus, in particular serotypes of type 5 and 8.
  • EXAMPLE 2 Process for obtaining the antibody contained in the reagent of Example 1
  • Culture medium Columbia agar + 5% sheep blood.
  • the strains stored at -80 ° C are cultured twice on sheep blood agar.
  • the colonies are suspended in physiological saline at a concentration of 3 ⁇ 10 9 germs / ml.
  • Vaccines are prepared immediately.
  • Immunization animal female mice of the BALB / C species and of the BALB / CBYJICO strain (supplied by
  • insulin (5 ⁇ g / l), 2-mercaptoethanol (10 ⁇ M), ethanolamine (20 ⁇ M), penicillin (100 U / ml), streptomycin (50 ⁇ g / ml).
  • Subculture technique the cells are subcultured every 2 or 3 days.
  • IMDM IMDM added with 10% of FCS and 10% of DMSO (dimethyl sulfoxide - Sigma)
  • the cell suspension is centrifuged at 200 g, 10 minutes, 25 ° C.
  • the cells are resuspended in NaCl 9% at a rate of IO 6 cells / ml,
  • Pasteur diagnosis ref. 56356 lot 4L042R (exp 2/96) and lot SE 047 R (exp. 7/96),
  • the strains were grown on Columbia agar + 5% sheep blood.
  • inint means "uninterpretable" In accordance with this table, all of the strains have been detected, which gives a sensitivity of 100% for each of the reagents.
  • S species. epidermidis, S. simulans, S. hyicus may have a capsule.
  • S species. lugdunen ⁇ is, S. schleiferi, S. hyicus, S. intermedius may include the affinity factor for fibrinogen.
  • PASTOREX STAPH PLUS and STAPHAUREX are identical (88.44%) but lower than those of STAPHYSLIDE (91.37%) and SLIDEX STAPH PLUS (92.57%).
  • Table 5 shows the sensitivity and specificity results for each of the reagents.
  • meti R meti S
  • meti S mean "resistant to methicillin” and “sensitive to methicillin” respectively.

Abstract

Anticorps monoclonal ou polyclonal spécifique d'un épitope commun aux souches Staphylococcus aureus de différents sérotypes capsulaires, notamment des souches résistantes à la méticillines, ledit anticorps étant choisi parmi les immunoglobulines de type G, les immunoglobulines de type M, et les immunoglobines de type A, et utilisation dans un réactif pour détecter les Staphylococcus aureus.

Description

ANTICORPS SPÉCIFIQUE DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS,
ET UTILISATIONS
La présente invention relève du domaine de la détection de bactéries Staphylococcus aureus , et notamment des souches de Staphylococcus aureus qui sont résistantes à la méticilline.
Par "détection", on entend collectivement toutes les techniques permettant d'identifier, qualitativement et/ou quantitativement, ou d'enrichir, purifier ou séparer un analyte biologique, en l'occurrence des bactéries
Staphylococcus aureus .
Conformément au document EP-A-0 323 331, on connaît un réactif pour détecter des bactéries Staphylococcus aureus , y compris les souches résistantes à la méticilline, ce réactif comprenant :
- du fibrinogène,
- un anticorps reconnu par la protéine A de Staphylococcus aureus, - un anticorps reconnaissant spécifiquement le sérotype capsulaire de type 5 de Staphylococcus aureus ou un anticorps reconnaissant spécifiquement le sérotype de type 8 de Staphylococcus aureus , et de préférence un mélange de ces deux anticorps. Selon la présente invention, on apporte un anticorps, monoclonal ou polyclonal, qui reconnaît, de manière spécifique, un épitope commun aux souches de Staphylococcus aureus de différents serotypes capsulaires, notamment les souches résistantes à la méticilline. Cet anticorps est choisi parmi les immunoglobulines de type G, les immunoglobulines de type M et les immunoglobulines de type A.
Une application particulièrement avantageuse de l'anticorps selon l'invention consiste à l'incorporer dans un réactif spécifique pour la détection de Staphylococcus aureus , y compris les souches résistantes à la méticilline. Par rapport au document EP-A-0 323 331, la sensibilité du réactif de l'invention est supérieure, car la capacité de reconnaissance des serotypes capsulaires est plus importante. Ainsi selon l'invention, on propose et décrit : un anticorps monoclonal ou polyclonal, spécifique d'un épitope commun aux souches de Staphylococcus aureus de différents serotypes capsulaires, notamment des souches résistantes à la méticilline, ledit anticorps étant choisi parmi les immunoglobulines de type G, les immunoglobulines de type M et les immunoglobulines de type A ; cet anticorps reconnait à la fois spécifiquement au moins deux serotypes capsulaires différents desdites souches de Staphylococcus aureus ; de préférence, il est choisi parmi les immunoglobulines de type G et les immunoglobulines de type M ;
- un anticorps monoclonal ou polyclonal tel que défini ci-dessus qui en particulier reconnait au moins le sérotype capsulaire de type 5 et le sérotype capsulaire de type 8 desdites souches de Staphylococcus aureus, un anticorps monoclonal susceptible d'être obtenu selon une technique adaptée de Galfe et al. (Nature, 266, 522-550, (1977)), en utilisant comme lignée cellulaire initiale pour la fusion, la lignée des myélomes SP2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581) ; la fusion est effectuée avec des cellules de rate de souris de l'espèce BALB/C et de la souche BALB/CBYJICO (commercialisée par la Société IFFA Credo) , immunisées par une souche de Staphylococcus aureus de type 5, selon les techniques classiques ; les clones obtenus ont été criblés par techniques immunoenzymatiques (ELISA) ; les clones sélectionnés ont été réinjectés par voie intrapéritonéale à des souris préparées au préalable pour la production de liquide d'ascite ; chaque anticorps monoclonal a été utilisé pour sensibiliser des particules de latex et a été testé pour sa spécificité à reconnaître les polyosides capsulaires de Staphylococcus aureus ; les anticorps monoclonaux dénommés respectivement P2G7A1E5 et P6D8D12E1 ont été choisis en raison de leur spécificité à reconnaître un épitope commun avec différents serotypes capsulaires en particulier de type 5 et 8 ; un anticorps monoclonal susceptible d'être obtenu, ou tel qu'obtenu à partir de la lignée cellulaire hybridome déposée sous le N°96021514, le 15/02/1996 auprès de l'ECACC ; un anticorps monoclonal susceptible d'être obtenu, ou tel qu'obtenu à partir de la lignée cellulaire hybridome déposée sous le N°96021513, le 15/02/1996 auprès de l'ECACC ;
- une lignée cellulaire hybridome, telle que celle déposée sous le N°96021514, le 15/02/1996 auprès de l'ECACC, ou telle que celle déposée sous le N°96021513, le 15/02/1996 auprès de l'ECACC, ou toute autre lignée cellulaire hybridome dérivée, par exemple toute progéniture de cette lignée ; les lignées cellulaires sont revendiquées en tant que telles, ainsi que toute lignée cellulaire dérivée, c'est-à-dire susceptible de produire des anticorps présentant les mêmes caractéristiques immunologiques que celles décrites dans la présente invention ;
- un réactif spécifique de détection des bactéries Staphylococcus aureus et notamment des souches résistantes à la méticilline, comprenant au moins un anticorps reconnaissant spécifiquement au moins un épitope commun des différents serotypes capsulaires des souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méticilline, ledit réactif comprenant au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal tel que défini précédemment ; ledit anticorps peut être fixé ou couplé, ou non, sur un support ou un marqueur ; par anticorps monoclonal ou polyclonal, on entend les anticorps tels que définis précédemment ainsi que tout anticorps présentant une spécificité croisée avec ceux-ci ; - un réactif spécifique, notamment de détection des bactéries Staphylococcus aureus et notamment des souches résistantes à la méticilline, comprenant en outre du fibrinogène ou un composé à base de fibrinogène susceptible d'être reconnu par le facteur d'affinité pour le fibrinogène de Staphylococcus aureus ; le fibrinogène ou composé de fibrinogène peut être fixé ou couplé, ou non, sur un support ou sur un marqueur ;
- un réactif spécifique, notamment de détection des bactéries Staphylococcus aureus et notamment des souches résistantes à la méticilline, comprenant en outre des immunoglobulines ou leur fragment Fc reconnues par la protéine A de Staphylococcus aureus , fixées ou couplées, ou non, sur un support ou sur un marqueur, Toutes sortes de support ou marqueur peuvent être envisagées selon l'invention.
On peut ainsi utiliser des particules en suspension. Ces particules sont notamment des particules de latex, telles que des billes de polystyrène ou des particules similaires, ayant de préférence une taille inférieure à 2 μm. A titre d'exemple, on peut citer les particules Estapor, commercialisées par la Société RHONE- POULENC, telles que :
- des particules de polystyrène K080, ayant un diamètre de 0,8 μm,
- des particules de polystyrène K109, ayant un diamètre de 0,8 μm,
- des particules de polystyrène ayant des groupes carboxyliques, PSI 480, ayant un diamètre de 0,8 μm. On peut également utiliser des gels magnétiques, tels que les gels de polyacrylamide et/ou d'agarose contenant des particules magnétiques. On peut en outre utiliser des gels tels que Ultrogel et Magnogel (marques de commerce) de la Société IBF. Le support utilisé dans un réactif selon la présente invention, peut être également des hématies par exemple de mouton.
Le support peut être sous la forme d'une plaque, d'un cône, d'une barrette, par exemple de polystyrène, ou d'un copolymère à base de styrène, d'un tube de verre ou analogue.
La fixation d'anticorps et de fibrinogène sur des particules en suspension, notamment de latex, peut être réalisée selon l'une des techniques suivantes :
- par adsorption passive, la fixation pouvant être spontanée, au cours d'une incubation des particules de latex dans une solution contenant les anticorps et le fibrinogène ; une incubation par exemple d'environ 2 heures à 20°C est souvent suffisante ;
- par covalence, la fixation pouvant être réalisée en créant une liaison covalente entre les anticorps et les groupements réactifs présents sur certaines particules du latex ; il est possible par exemple d'utiliser un carbodiimide pour créer la liaison covalente.
Lorsque le support est constitué d'hématies, celles-ci peuvent au préalable être sensibilisées par du fibrinogène ou toute autre molécule appropriée, selon les techniques classiques. La concentration des anticorps à fixer sur les particules de latex, qui doit être déterminée pour chaque anticorps selon les méthodes connues, est habituellement comprise entre 0,1 μg et 100 μg de protéines anticorps par millilitre de latex en solution. Dans un réactif selon l'invention, les anticorps et le fibrinogène peuvent être fixés sur une suspension unique de particules, par exemple de latex, ou bien être fixés sur des suspensions de particules respectivement différentes, telles que des hématies et des particules de latex, ou différents latex qui sont ensuite mélangés pour constituer le réactif. Le marqueur peut être toute molécule biologique ou chimique, par exemple une enzyme, un haptène, un oligonucléotide, un élément radioactif...
D'autres objets de l'invention sont les suivants ; - un réactif tel que défini précédemment comprenant un anticorps de type immunoglobuline comprenant un fragment Fc susceptible de se fixer sur la protéine A de Staphylococcus aureus et/ou un autre composé à base de fibrinogène ou dérivé, susceptible de réagir avec le facteur d'affinité pour le fibrinogène desdites bactéries, ledit réactif comprenant de plus, au moins un anticorps polyclonal ou monoclonal susceptible de reconnaître spécifiquement différents serotypes capsulaires de Staphylococcus aureus , notamment les serotypes de type 5 et 8 ;
- un procédé pour détecter dans un échantillon biologique des bactéries Staphylococcus aureus , et notamment des souches résistantes à la méticilline, caractérisé en ce que : * on dispose d'un réactif, tel que précédemment défini,
* on met en contact ledit échantillon avec ledit réactif,
* on observe l'obtention d'une agglutination. Les caractéristiques et avantages des objets de l'invention sont ci-après exposés et illustrés dans les Exemples 1-3.
EXEMPLE 1 : Composition d'un réactif selon l'invention, appelé SLIDEX 5 \PH PLUS
Le réactif comprend un anticorps de type immunoglobuline comprenant un fragment Fc susceptible de se fixer sur la protéine A de Staphylococcus aureus et/ou un autre composé à base de fibrinogène ou dérivé, susceptible de réagir avec le facteur d'affinité pour le fibrinogène desdites bactéries, ledit réactif comprenant de plus, au moins un anticorps polyclonal ou monoclonal susceptible de reconnaître spécifiquement différents serotypes capsulaires de Staphylococcus aureus , notamment les serotypes de type 5 et 8. EXEMPLE 2 : Procédé d'obtention de l'anticorps contenu dans le réactif de l'Exemple 1
a) Préparation de cellules de rate de souris immunisées par une souche de Staphylococcus aureus * Matériel :
Souches de Staphylococcus aureus CIP103313 de sérotype capsulaire 5 et CIP108314 de sérotype capsulaire 8.
Milieu de culture : gélose Columbia + 5 % de sang de mouton.
* Méthode :
Les souches conservées à - 80°C sont cultivées 2 fois sur gélose au sang de mouton.
Les colonies sont mises en suspensions en sérum physiologique à la concentration de 3 x 109 germes/mL.
Une méthode d'inactivation a été utilisée : inactivation à 70°C pendant 1 heure.
Les vaccins sont préparés extemporanément.
* Origine de la culture cellulaire : - Souche de Staphylococcus aureus de sérotype capsulaire 5
Animal d'immunisation : souris femelles de l'espèce BALB/C et de la souche BALB/CBYJICO (fournies par
IFFA Credo) - Lignée myélomateuse SP2/0-AG14.
* Protocole d'immunisation :
J =0 3 x IO8 germes + ACF (1:1) IP
J = 7,14 3 x IO8 germes IP
J = 28,76 3 x IO8 germes IP J = 204 Booster 3 x IO8 germes en NaCl 9 % IV
J = 207 fusion du 29/01/93, souris n°l série 010 * Culture en suspension
* Ploidie : hétéroploïde
* Conditions de culture :
- Milieu de base : Iscove's Modified Dulbecco Médium additionné de bicarbonate de sodium (3024 mg/1) , de
10 % de sérum de veau foetal (SVF) , pH 6,7 à 7,3, température 25°C.
Réactifs additionnels : insuline (5 μg/l) , 2-mercaptoéthanol (10 μM) , éthanolamine (20 μM) , pénicilline (100 U/ml), streptomycine (50 μg/ml) .
- Technique de sub-culture : les cellules sont sub-cultivées tous les 2 ou 3 jours.
* Congélation des cellules :
- Composition du milieu : IMDM additionné de 10 % de SVF et 10 % de DMSO (diméthyl sulfoxyde - Sigma)
- Concentration cellulaire : 3,6 x IO6 cellules par ampoule (2 x 106 cellules/ml)
- Méthode : congélation lente des cellules à -80°C dans du milieu IMDM - SVF 10 % - DMSO 10 %, 24h à 72h, puis conservation dans l'azote liquide -180°C.
b) Identification de 1 'hybridome stable
* Nombre de clonage effectués : 2
* Nom du clone : 6D8D12E1 * Isotypage : IgG2b,K
* Capacité de synthèse : taux d'Ig sécrétées dans le surnageant : ND.
* Spécificité antigénique : ELISA indirect m - plaques NUNC-maxisorb coatées avec 50 μL de germes (IO9 g/ml) STAPH 5, séchés une nuit à 37°C,
- saturer avec 100 μL de PBS-lait 1 % pendant 1 h à 37°C,
- saturer avec 100 μL de PBS-sérum de cheval 1 %, incuber pendant 1 h à37°C, ajouter 100 μl de surnageant ou de liquide d'ascite dilués en PBS-Tween 20 0,05%, puis incubés 1 h à 37°C, ajouter 100 μL d'Ig anti-Ig(H+L) de souris conjuguées à la PAL (Jackson Laboratories lot 24724) dilué au 1/2000 en PBS-BSA 1 % + sérum de cheval 1 %, 1 h à 37°C, ajouter 100 μL de PNPP (BioMérieux réf. 60002990) à la concentration de 2 mg/ml dans de la DEA-HCL (Biomérieux réf. 60002989), pH9,8, incuber 30 min à 37°C, - bloquer la réaction avec 100 μL de NaOH 1 N. NB: 3 lavages sont effectués entre chaque étape avec 300 μL de Pbs-tween 20 0,05% et un lavage supplémentaire en eau distillée avant d'ajouter le PNPP. RESULTATS de (1) : cet anticorps est spécifique de
S . aureus et ne reconnaît ni S . Warneri , ni S. Hominls , ni S . Epidermidis , ni S . Cohnii , ni S . Haemolyticus.
Il reconnaît les souches S . aureus type 5, type 8, type B, type A, type MC31, et les souches non 5, non 8 (Ex: souches 1033, K8, 16N15) .
Technique d'agglutination directe ( 2 )
Dans des plaques à fond rond (Biomérieux M220 24A réf. 96350) mettre 50 μL de surnageants dilués en
PBS + 50 μL de germes à 5 x IO8 g/ml ; agiter les plaques puis incuber à 22°C. La lecture est effectuée à l'oeil, 15 heures plus tard environ.
RESULTATS de ( 2 ) : agglutination visible à l'oeil (4+).
c) Production d'anticorps in vivo
* Animal utilisé : souris femelles ayant de 4 - 6 semaines, de l'espèce BALB/C, de la souche BALB/CBYJICO (IFFA Credo) .
* Préparation de l' inoculum : la suspension cellulaire est centrifugée à 200 g, 10 minutes, 25°C. Les cellules sont resuspendues dans du NaCl 9 % à raison de IO6 cellules/ml,
* injection de 106 cellules/souris par voie intrapéritonéale, pour 20 souris, * Temps de récolte du liquide d'ascite : 10 jours + 2 jours,
* Volume d'ascites : 245,5 ml,
* Volume du pool : 230,5 ml,
* Rendement : 93.9 %,
EXEMPLE 3 : Comparaison de la sensibilité et de la spécificité du réactif SLIDEX STAPH PLUS et de celles de divers réactifs commercialisés, dans la détection de différentes souches de Staphylococcus aureus Le réactif SLIDEX STAPH PLUS a été comparé aux réactifs suivants :
- SLIDEX STAPH KIT: réf. 7 311 2 lot 674145 B (exp. 4/96) , commercialisé par la Demanderesse,
- STAPHYSLIDE: réf. 5 508 1 lot 674775 A (exp. 9/96) , commercialisé par la Demanderesse,
PASTOREX STAPH PLUS commercialisé par
Diagnostic Pasteur : réf. 56356 lot 4L042R (exp 2/96) et lot SE 047 R (exp. 7/96) ,
STAPHAUREX PLUS commercialisé par Murex : Réf ZL 33 lot K61691 0 (exp. 1 1/95) et lot K9251 1 0 (exp.
8/96) .
Pour déterminer la sensibilité de chacun de ces réactifs, les 346 souches de Staphylococcus aureus suivantes ont été testées : - 118 souches S . aureus résistantes à la méticilline et n'ayant pas le facteur d'affinité pour le fibrinogène (dumping Factor négatif) (origine : France,
Allemagne, Angleterre, Bénélux, Italie, Espagne, USA, USA
Kansas) - 131 souches S. aureus résistantes à la méticilline et ayant le facteur d'affinité pour le fibrinogène (dumping Factor positif) (origine : France, Allemagne, Angleterre, Bénélux, Italie, Espagne, USA, Australie, Hong-Kong)
97 souches S . aureus sensibles à la méticilline (origine : France, Angleterre, Bénélux, Italie, Espagne, Pologne, Australie, Hong Kong)
En outre, pour déterminer la spécificité de chacun de ces réactifs, 155 souches Staphylococcus non aureus ont été testées (origine : France, Allemagne, Angleterre, Bénélux, Italie, Espagne, Pologne, USA, Australie, Hong- Kong) .
Les souches ont été cultivées sur gélose Columbia + 5 % de sang de mouton.
a) Résultats de sensibilité obtenus avec les 118 souches S . aureus résistantes à la méticilline et n'ayant pas le facteur d'affinité pour le fibrinogène
Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 1 ci-dessous : Tableau 1
Figure imgf000013_0001
inint signifie "ininterprétable" Conformément au Tableau 1, SLIDEX STAPH PLUS a montré une sensibilité significativement supérieure (98,30 %) à celle de SLIDEX STAPH KIT (79.67 %) , de PASTOREX STAPH PLUS (90,6 %) et STAPHAUREX PLUS (82,9 %) .
b) Résultats obtenus avec les 131 souches S . aureus résistantes à la méticilline et ayant le facteur d'affinité pour le fibrinogène
Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 2 ci-dessous :
Tableau 2
Figure imgf000014_0001
* agglutination lente inint signifie "ininterprétable".
c) Résultats obtenus avec les 97 souches S . aureus sensibles à la méticilline
Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 3 ci-dessous :
Tableau 3
Figure imgf000014_0002
inint signifie "ininterprétable" Conformément à ce tableau, l'ensemble des souches a été détecté, ce qui donne une sensibilité de 100 % pour chacun des réactifs.
d) Résultats obtenus avec les 155 souches S . non aureus
Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 4 ci-dessous :
Tableau 4
Figure imgf000016_0001
Les espèces S . epidermidis , S . simulans , S . hyicus peuvent posséder une capsule.
Les espèces S . lugdunenεis , S . schleiferi , S . hyicus , S . intermedius peuvent comporter le facteur d'affinité pour le fibrinogène.
Les spécificités de PASTOREX STAPH PLUS et STAPHAUREX sont identiques (88,44 %) mais inférieures à celles de STAPHYSLIDE (91,37 %) et de SLIDEX STAPH PLUS (92,57 %) .
e) Performances des réactifs
Le tableau 5 ci-dessous indique les résultats de sensibilité et de spécificité de chacun des réactifs.
Tableau 5
Figure imgf000017_0001
Dans ce tableau, ainsi que dans les tableaux suivants où elles apparaissent, les mentions meti R, meti S, signifient respectivement "résistantes à la méticilline" et "sensibles à la méticilline".
Il ressort de ce tableau que la sensibilité de SLIDEX STAPH PLUS (99,2 %) est significativement supérieure aux autres réactifs ; cette supériorité est essentiellement due à une meilleure performance sur les souches S . aureus résistantes à la méticilline et n'ayant pas le facteur d'affinité pour le fibrinogène.

Claims

REVENDICATIONS
1. Anticorps monoclonal ou polyclonal spécifique d'un épitope commun aux souches Staphylococcus aureus de différents serotypes capsulaires, notamment des souches résistantes à la méticilline, ledit anticorps étant choisi parmi les immunoglobulines de type G, les immunoglobulines de type M, et les immunoglobulines de type A.
2. Anticorps selon la revendication 1, reconnaissant au moins le sérotype capsulaire de type 5 et le sérotype capsulaire de type 8 desdites souches de Staphylococcus aureus .
3. Anticorps monoclonal selon la revendication 1 ou 2, susceptible d'être obtenu par fusion entre la lignée de myélomes SP2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581) et des cellules de rate de souris de l'espèce BALB/C et de la souche BALB/CBYJICO, immunisées par une souche de Staphylococcus aureus .
4. Anticorps monoclonal selon la revendication 1 ou 2, susceptible d'être obtenu à partir de la lignée cellulaire hybridome déposée sous le N°96021514, le 15/02/1996 auprès de l'ECACC.
5. Anticorps monoclonal selon la revendication 1 ou 2, susceptible d'être obtenu à partir de la lignée cellulaire hybridome déposée sous le N°96021513 , le 15/02/1996 auprès de l'ECACC.
6. Lignée cellulaire hybridome, telle que celle déposée sous le N°96021514, le 15/02/1996 auprès de l'ECACC, ou telle que celle déposée sous le N°96021513, le 15/02/1996 auprès de l'ECACC, ou toute autre lignée cellulaire hybridome dérivée, par exemple toute progéniture de cette lignée.
7. Réactif spécifique de détection des bactéries Staphylococcus aureus et notamment des souches résistantes à la méticilline, comprenant au moins un anticorps reconnaissant spécifiquement un épitope commun des différents serotypes capsulaires des souches de Staphylococcus aureus , ledit anticorps étant un anticorps monoclonal ou polyclonal tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
8. Réactif selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'anticorps est fixé ou couplé, sur un support ou un marqueur.
9. Réactif selon la revendication 7 ou 8, comprenant en outre du fibrinogène ou un composé à base de fibrinogène, susceptible d'être reconnu par le facteur d'affinité pour le fibrinogène de Staphylococcus aureus , le fibrinogène ou le composé à base de fibrinogène étant éventuellement fixé ou couplé sur un support ou un marqueur.
10. Réactif selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, comprenant en outre un ou des anticorps, reconnus par la protéine A de Staphylococcus aureus et étant éventuellement fixés ou couplés sur un support ou un marqueur.
11. Procédé pour détecter dans un échantillon biologique des bactéries Staphylococcus aureus et notamment des souches résistantes à la méticilline, selon lequel :
- on dispose d'un réactif selon l'une quelconque des revendications 7 à 10,
- on met en contact ledit échantillon avec ledit réactif,
- on observe l'obtention d'une agglutination.
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