WO1997004083A1 - Enzymes et micro-organismes a activite amidase hydrolysant les polyamides - Google Patents

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WO1997004083A1
WO1997004083A1 PCT/FR1996/001118 FR9601118W WO9704083A1 WO 1997004083 A1 WO1997004083 A1 WO 1997004083A1 FR 9601118 W FR9601118 W FR 9601118W WO 9704083 A1 WO9704083 A1 WO 9704083A1
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enzyme
ala
gly
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monomers
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PCT/FR1996/001118
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Jôël CROUZET
Didier Faucher
Olivier Favre-Bulle
Catherine Jourdat
Dominique Petre
Jérôme PIERRARD
Denis Thibaut
Carole Guitton
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Rhone Poulenc Fibres Et Polymeres S.A.
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to the enzymatic hydrolysis of amides, in particular secondary amides.
  • the invention relates first of all to a process for the enzymatic hydrolysis of substrates of the polyamide 6.6 type. leading to the two comonomers A and B of said substrates.
  • the invention also relates to enzymes and / or microorganisms capable of being used in the enzymatic hydrolysis of amide functions, preferably on substrates containing at least one, such as for example polyamides (PA).
  • PA polyamides
  • the invention also relates to the genetic tools expressing these enzymes.
  • E 3 active with respect to cyclic and linear oligomers of 6 aminohexanoic acid with DP n > 3 (PA.6).
  • E 3 is described by NEGORO et al. in "Journal of Bacteriology, Dec. 1992, vol. 174, no. 24, p. 7948-7953.
  • E 3 also comes from Flavobacterium sp KI 72.
  • the present invention relates firstly to an enzymatic hydrolysis process and, secondly, to an enzyme.
  • the process according to the invention for hydrolysis of (poly) amides characterized:
  • A, B are monomeric units
  • R 1 , R 3 are divalent radicals, identical or different - preferably different - and representing a (cyclo) alkylene, linear or branched, substituted or not, an arylene, an arylalkylene, the aromatic radicals being optionally polycondensates, the alkylene having a carbon number greater than or equal to 4 and preferably between 4 and 12.
  • R 2 corresponds to radicals, identical or different - preferably identical - and selected from hydrogen and / or alkyl residues having, advantageously, from 1 to 6 carbons,
  • X 1 OH, OM, OR 4 with M chosen from metals, preferably alkali and alkaline-earth metals and R 4 representing a linear or branched alkyl comprising from 1 to 6 carbon atoms,
  • the present invention also relates to a family of enzymes of the amidase type, capable (among others) of being used in the process defined above.
  • the enzyme belonging to the family according to the invention is an amidase, characterized: - ⁇ ⁇ in that it is active, in particular with respect to substrates of (poly) amide type and corresponding to the following formula:
  • R 1 , R 3 are divalent radicals, identical or different - preferably different - and representing a (cyclo) alkylene, linear or branched, substituted or not, an arylene, an arylalkylene, the aromatic radicals being optionally polycondensates, the alkylene having a carbon number greater than or equal to 4 and preferably between 4 and 12,
  • R 2 corresponds to radicals, identical or different - preferably identical - and selected from hydrogen and / or alkyl residues having, advantageously, from 1 to 6 carbons,
  • X 1 OH, OM, OR 4 with M chosen from metals, preferably alkali and alkaline-earth metals and R 4 representing a linear or branched alkyl comprising from 1 to 6 carbon atoms,
  • an enzyme is advantageously isolated having an amidase activity and comprising the peptide sequence as represented in the attached SEQ ID NO: 1, or a homologous peptide sequence having at least 80%, of preferably at least 90% and more preferably still at least 95% homology with SEQ ID NO: 1.
  • this enzyme has amidase activity, in particular with respect to substrates of (poly) amide type and corresponding to the following formula (II):
  • the invention firstly proceeded to the isolation of a wild strain producing the enzyme, namely: Comamonas acidovorans N 12.
  • This wild strain is the result of long-term screening work. This identification was made from morphological, cultural, biochemical and antigenic characters, which could be determined by reference to official and international criteria of microbiological taxonomy.
  • the Applicant's merit is not limited to the isolation of this wild strain, but also extends to the isolation of the amidase defined above.
  • the microorganism Comamonas acidovorans N 12 is not the exclusive biological precursor of this amidase. It is indeed also necessary to consider all the recombinants and any wild strain having a similar enzymatic activity. Recombinant microorganisms are those having in their genome a DNA sequence coding for the amidase considered in the present invention.
  • the invention also relates to an enzymatic hydrolysis process in which the abovementioned enzyme and / or the wild micro ⁇ organism referred to above and / or at least one of its recombinants mentioned above is used. -above.
  • the substrates of the enzyme and / or their biological precursors are polyamides and, more precisely, oligomers whose recurrent polymerization function is a secondary amide function --CO - NH -
  • These oligomers have repeating units of formula (I) and / or (H).
  • the repeating units (I) are advantageously formed of two monomer units A and B, respectively dicarbonyl and diamine and linked to one another by a secondary amine function.
  • a preferred example of a dimer is that formed by:
  • the corresponding polyamide is PA 6.6.
  • the recurring units (II) are preferably formed by noted monomeric units
  • ⁇ and ® are, respectively, carboxylic and amino.
  • a typical example of is a derivative of ⁇ -aminocaproic acid, a polyamide 6 (PA 6) monomer.
  • polyamide-type oligomers which may be suitable for the invention, there may be mentioned:
  • polyamide oligomers obtained by polycondensation of saturated aliphatic dicarboxylic acids having from 6 to 12 carbon atoms with saturated aliphatic primary diamines having from 6 to 12 carbon atoms,
  • polyamino acid oligomers obtained, either by direct homopolycondensation of ⁇ -aminoalkanoic acid comprising a hydrocarbon chain having from 4 to 12 atoms carbon, either by hydrolytic opening and polymerization of lactams derived from these acids,
  • the oligomers of copolyamides obtained from the starting monomers of the abovementioned polyamides possibly also consisting, in part, of aromatic acid, such as terephthalic acid and / or isophthalic acid,
  • polyamides obtained by polycondensation of diacids and diamines there may be mentioned, for example:
  • polyamino acids which may be suitable, mention will be made of: - polyamide 4 (polymer of 4-amino butanoic acid or of ⁇ -butyrolactam),
  • Polyamide 12 (polymer of 12-amino-dodecanoic acid or of laurolactam).
  • copolyamides there may be mentioned, for example: - polyamide 6.6 / 6.10 (copolymer of hexamethylenediamine, adipic acid and sebacic acid),
  • the preferred substrates according to the invention are oligomers of polyamides obtained by polycondensation of diacids A and diamines B and, in particular, of PA 6.6.
  • the number of monomers A and B, on the one hand, or ⁇ ⁇ ⁇ - ', on the other hand, of the substrates (I) and (H) according to the invention is advantageously between 2 and 8, preferably between 2 and 6. It should be noted that this number of monomers A and B in the molecules of oligomers or polymers will also be called DP ⁇ in the present description.
  • Characteristic substrates (I) are, eg, advantageously water-soluble oligomers such as: AB, ABA and ABAB.
  • this number of monomers A and B in the molecules of oligomers or polymers will also be called DP ⁇ in the present description .
  • These particular substrates are part of those (I) and (H) that the enzyme of the invention and / or its biological precursors are capable of hydrolyzing, because they have at least one carboxyl end.
  • the final products of hydrolysis can be monomers A and B.
  • the substrates are oligomers (H) (monomers (a) (ç) - (b ⁇ )
  • the final products of hydrolysis can be monomers (a ⁇ (c) (jT).
  • the enzyme according to the invention can also be characterized through its activity and / or its affinity with respect to some of the above-mentioned substrates.
  • a second advantageous characteristic of this amidase is to be active with respect to a substrate (I), formed by an ABA trimer and to be able to transform this trimer into a monomer A and a dimer AB, and this with a specific enzymatic activity greater than or equal to 1000 ⁇ mol of hydrolyzed substrate.h'l.mg "! of protein.
  • a third advantageous characteristic of this amidase is to be active with respect to a substrate (I) formed with a type AB dimer and to be able to transform this dimer into two monomers A and B, with a specific enzymatic activity greater than 1,500 ⁇ mol of hydrolysed substrate.h "l.mg" l of protein.
  • the amidase enzyme of the invention has at least one of these three non-limiting characteristics.
  • the implementation of the enzyme of the invention in the enzymatic hydrolysis of amides can consist in using only the enzyme per se instead of the biological precursors (wild or recombinant microorganisms) producers of it or even a mixture of the two.
  • the enzyme which is the subject of the invention is also characterized in that it is produced by microorganisms of the type Comamonas acidovorans (N 12), preferably of the type of the strain referenced and deposited in the National collection of Cultures of Microorganisms - Institut Pasteur PARIS under n ° 1 1522 on January 4, 1995, and / or by the recombinants as described supra.
  • N 12 Comamonas acidovorans
  • the present invention also relates to new microorganisms capable of producing the amidase enzyme according to the invention, as defined above. Due to this ability, these microorganisms have in particular the characteristics, on the one hand, of a capacity for hydrolysis of the amide functions of a polyamide compound, comprising at least one amide function and, in particular, of oligomers. More specifically, these microorganisms have a specific selectivity and hydrolysis activity, with respect to the substrates (I) and (H) defined above.
  • the oligomers are, for example, the water-soluble substances mentioned above: ABAB and / or ABA and / or AB among others.
  • these microorganisms can preferably be constituted by the above-mentioned Comamonas acidovorans, preferably by the strain referenced and deposited in the National Collection of Cultures of Microorganisms under the number 1 1522 on January 4, 1995, or by recombinants thereof, as described above.
  • the microorganisms according to the invention are capable of allowing the hydrolysis of at least one substrate formed by a polyamide oligomer and, more precisely, by a dimer AB, dedicated to being transformed into two monomers A and B, the microorganisms being capable of ensuring hydrolysis.
  • the present also relates to the genetic material under the aegis of which, it can be synthesized, via recombinant microorganisms or not.
  • the present invention relates to a DNA sequence coding for an enzyme having amidase activity, characterized in that it is chosen from the list of the following sequences: ⁇ the DNA sequence, as represented by SEQ ID NO: 2 in the annexed sequence list and coding for at least one enzyme having amidase activity, ⁇ an analogue of this sequence resulting from the degeneration of the genetic code, ⁇ a DNA sequence hybridizing with the above sequence or with minus a fragment thereof and coding for an enzyme having amidase activity.
  • the enzymes resulting from the expression of the above DNA sequence are also included in the scope of the invention.
  • Wild microorganisms eg I 1522
  • recombinant microorganisms isolated by the Applicant each contain at least one expression cassette comprising the DNA sequence SEQ ID NO: 2 referred to above, and optionally, upstream thereof at least a promoter sequence and at least one ribosome binding site.
  • the present invention also relates to a process for the hydrolysis of substrates, at least partly formed by those (I) and / or (H), as defined above, characterized in that it consists in implementing at least one enzyme and / or at least one of the micro ⁇ organisms as presented above. It may be advantageous, in accordance with the invention, to have several enzymes with complementary spectra.
  • one of the variants of the above process can be to use at least one other type of enzyme and / or at least one of its wild and / or recombinant biological precursors.
  • the substrates are, at least in part, constituted by oligomers whose DP n is less than 40, preferably 20 and, more preferably still, 12 and which are derived from polyamides at least derived from polycondensation between diacid (A) and diamine (B) monomers.
  • the hydrolysis process according to this variant is characterized:
  • At least one enzyme and / or at least one microorganism as defined above are provided.
  • enzyme • and at least one other type of enzyme and / or at least one of its wild and / or recombinant biological precursors, said enzyme being: * an enzyme E 3 produced under the aegis of the nyl-c gene of Flavobacterium sp KI 72,
  • PAM I an enzyme called PAM I, such as that defined by the peptide sequence SEQ TD NO: 3 annexed, such an enzyme can, inter alia, be produced by the microorganism referenced and deposited in the National Collection of Cultures of Microorganisms - Institut Pasteur PARIS - under n ° I
  • a carbon source comprising, preferably at least one compound comprising at least one amide function, said carbon source optionally comprising a supplement chosen, advantageously, from carbohydrates, sucrose being particularly preferred,
  • a compound capable of inducing the production of enzymes without being consumed by biological precursors, said compound preferably being chosen from amides.
  • the process for the enzymatic hydrolysis of amides according to the invention can find numerous applications, for example in organic synthesis for the manufacture of compounds from amide compounds or for the treatment of materials containing polyamide. In particular, it could be of interest in the context of the regeneration of raw materials for polyamide polymers.
  • SEQ JO NO: 3 amino acid sequence corresponding to PAM I.
  • SEQ ID NO: 4 DNA coding for the enzyme PAM I.
  • FIG. 1 represents the restriction map of the plasmid pXL2297 containing the gene (pam I) coding for the amidase PAM I.
  • FIG. 2 represents the restriction map of the plasmid pXL2564, containing the gene (pam I) coding for PAM I.
  • EXAMPLE 1 ISOLATION AND IDENTIFICATION OF THE WILD STRAIN COMAMONAS ACIDOVORANS ⁇ 12.
  • MICROBIOLOGICAL SCREENING A vast microbiological screening or screening operation made it possible to select the Comamonas acidovorans N 12 strain, from various biotopes.
  • microorganism was carried out using an amidasic activity test on synthetic oligomers of PA 6.6. The activity evaluation will be seen in detail below.
  • the microorganism selected was then identified on the basis of its morphological, physiological and biochemical and possibly antigenic characters, in a completely traditional way, by the Bacteriology Laboratory of the iNSTITUT PASTEUR.
  • the optimum culture medium is M9YE3 having the following composition:
  • the cultures are carried out in Erlenmeyer flasks filled to 1/5 of their total volume. The media are incubated at 30 ° C and stirred at 150 rpm. The preculture consists of 10 ml of LB medium:
  • the culture is then seeded at 1% with the optimum medium (v / v).
  • the cell production is determined by a dry extract, obtained by drying overnight at 105 ° C. from a cell pellet, obtained after centrifugation (10 min at 12,000 g).
  • the carbon source comprises, together with the soluble substances, a supplement chosen, advantageously, from carbohydrates, sucrose being particularly preferred.
  • the activity measurement is determined at 28 ° C. in a phosphate buffer 10.5 mmol / l, at pH 7.5 and with a final volume of 1 ml. TABLE 1 below gives the results obtained.
  • the activity of this enzyme is monitored by measuring the hydrolysis activity of ABAB into BAB + A.
  • EDTA acid Ethylene Diamine Tetra Acetic CHAPS ⁇ 3 [(3 cholamidopropyl) -dimethylammonio] - 1 -propanesulphonate
  • SDS sodium dodecyl sulphate
  • Comamonas acidovorans cells are resuspended in 75 ml of 100 mM Tris-HCl pH 7.5 buffer containing 1 mM DTE, 5 mM EDTA, 100 mM KC1 and 15% v / v of glyerol.
  • the suspension is then subjected to a discontinuous treatment (10% treatment, 90% rest) by ultrasound in melting ice for 70 min.
  • this pellet which also contains polyamidase II activity which is subsequently treated. It will be noted that it is possible after desalting the 90 ml of supernatant in the same buffer without glycerol and new ultracentrifugation to purify and to reconcentrate in a new very fine pellet the polyamidase II activity apparently soluble during the first centrifugation. In fact, by decreasing the density of the buffer (by eliminating the glycerol), the fall of very fine particles is accelerated.
  • the supernatant (S2) is then collected and subjected to a discontinuous treatment (10% treatment, 90% rest) with ultrasound in melting ice for 20 min. Then, centrifuged again for 2 h at 50,000 g and the supernatant (S3) is collected.
  • Tris-HCl pH 8 containing 1 mM DTE, 8 mM CHAPS, 1.5 M ammonium sulphate and 15% v / v of glycerol. These 10 ml are then chromatographed twice on a Phenylsuperose HR10 / 10 column (Pharmacia) balanced in the 25 mM Tris-HCl pH 8 buffer. containing 2 mM DTE, 8 mM CHAPS, IM ammonium sulphate and 15% v / v glycerol. The elution is done by a linear gradient over 70 min from 1 to OM ammonium sulfate with a flow rate of 1.25 ml / min.
  • the polyamidase activity is eluted at about 0.8 M ammonium sulfate.
  • the active fractions are combined and concentrated to 400 ⁇ l on Centriprep 10 (Amicon).
  • Step 3 The previous 400 ⁇ l is chromatographed twice on a column
  • TSK G3000 SW (Supelco) balanced in 100 mM Tris-HCl pH 7.5 buffer containing 2 mM DTE, 8 mM CHAPS, 150 mM NaCl and 15% v / v glyerol and eluted at 0.5 ml / min.
  • the activity is found from exclusion to a molecular weight of around 30 kDa.
  • sequence SEQ H) NO: 1 was obtained using standard nucleotide sequencing techniques.
  • EXAMPLE 4 ENZYMATIC HYDROLYSIS OF OLIGOMERS FORMED BY MONOMERS A AND B CONNECTED TO EACH OTHER BY SECONDARY AMIDE LINES USING A MIXTURE OF ENZYMES ACCORDING TO THE INVENTION AND HYDROLASE PAM I.
  • the present example it is not the pure enzymes that are used, but their biological precursors, namely the Comamonas acidovorans NI 2 strain according to the invention and a strain harboring the pam I gene (SEQ ID NO: 4 attached) and producing the enzyme PAM I (SEQ D3 NO: 3 attached), said strain being constructed according to the protocol given below.
  • This construction aims to obtain the pam I gene (coding for the enzyme PAM I) which is preceded by the binding site of the ribosomes of the cil gene on page ⁇ and which is expressed from the promoter of the tryptophan érE operon. Coli.
  • an Ndei restriction site was created at the initiation codon of pam I by the PCR technique using as matrix the plasmid pXL2297 (FIG. 1) hosted by the strain I 1495 deposited at the CNCM on 29 November 1994.
  • the amplified Hindlll-Apal fragment was cloned into pUC29 (Benes et al. (1993), Gene 130: 151-152) digested with Hindlll] and Apal and the pam I gene was reconstituted by introducing the Apal fragment of Apal to the Apal site.
  • the plasmid pXL2564 (described in FIG. 2), is a derivative of pBR322 (Sucliffe (1978), Nucleic Acid. Res. 5: 2721) containing a gene conferring resistance to ampicillin and the pam I gene under control of the Pt ⁇ -RBScll expression cassette.
  • the plasmid pXL2564 was introduced into the strain of E. Coli TG1, the selection of microorganisms being done on LB ampicillin.
  • a clone containing pXL2564 (called strain PAM I) was subcultured twice on agar plates and cultured at 37 ° C. in M9 glucose medium containing 100 ⁇ g / ml of ampicillin according to the procedure described in patent FR 2 694 571.
  • the Comamonas acidovorans NI 2 strain was cultivated for 19 hours under the same conditions as those defined in paragraph 2.1 above.
  • oligomers of average DP n 8 are resuspended in 300 ml of water. 200 ml of water containing the cells (ie 3.1 g in total) are added. The whole is stirred for 18 hours under a stream of nitrogen.
  • the solution is centrifuged and the supernatant (400 ml) is recovered. A dry weight of ⁇ 4 g / l is measured on the supernatant. A fraction is given for analysis of the oligomers of adipic acid and HMD.
  • the molar yield of adipic acid monomer formed is 66%, while that of HMD is 58%.
  • the molar yield of monomers and oligomers of Dp of less than 4, expressed in moles of monomers, is 72%.
  • CAAATTGCAT CGAGCCTATT CAGCACAACT CCCGAAAACC GGGCGGCAAC TTTCCGGAAT 180

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'hydrolyse enzymatique de polyamides 6.6. permettant d'obtenir des monomères acide adipique et des monomères hexaméthylènediamine. La présente invention concerne également une enzyme ayant une activité amidase, en particulier vis-à-vis de substrats du type oligomères dérivant de PA 6.6 et/ou de PA 6, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence peptidique correspondant à SEQ ID NO : 1 dans la liste de séquences annexée et/ou par au moins un polypeptide homologue à cette séquence. L'invention concerne également l'ADN codant pour elle, ainsi que les précurseurs biologiques de celle-ci. L'invention concerne également les micro-organismes aptes à produire cette enzyme et le procédé d'hydrolyse faisant application de cette enzyme et/ou de ces micro-organismes.

Description

Enzymes et microorgani smes a activité amidase hydrolysant l es polyamides
DOMAINE TECHNIQUE :
De manière générale, la présente invention concerne l'hydrolyse enzymatique, d'amides notamment d'amides secondaires.
Plus précisément, l'invention est tout d'abord relative à un procédé d'hydrolyse enzymatique de substrats du type polyamide 6.6. conduisant aux deux comonomères A et B desdits substrats. L'invention concerne également des enzymes et/ou des micro-organismes susceptibles d'être mis en oeuvre dans l'hydrolyse enzymatique de fonctions amides, de préférence sur des substrats en contenant au moins une, comme par exemple les polyamides (PA). L'invention vise également les outils génétiques exprimant ces enzymes.
ART ANTERIEUR :
Dans ce domaine, SMITH R. et al. sont les auteurs d'un article paru dans "Journal of Biomédical Materials Research (1987), vol. 21, p. 991-1003", et divulguent la mise en présence d'échantillons de polyamide 66 marqués au carbone 14, avec des enzymes du genre papaïne, trypsine et α-chymotrypsine. Ces polypeptides connus dégradent légèrement le polyamide 66. Mais l'hydrolyse n'est pas suffisamment significative pour pouvoir être exploitée sur le plan industriel.
On connaît, par ailleurs, au travers de l'article de KJNOSHITA ET AL. (Eur. J. Biochem, 116, 547-551, 1981) l'aptitude de Flavobacterium sp KI 72 à produire, une première enzyme (E,) catalysant l'hydrolyse de dimères cycliques d'acide 6-amino hexanoïque, en dimères linéaires de ce même acide, ainsi qu'une deuxième enzyme (E2) apte à permettre la transformation de ce dimère linéaire en deux molécules d'acide 6-amino hexanoïque ou acide amino caproïque. Le cheminement enzymatique considéré est résumé ci-après.
Figure imgf000003_0001
COOH] x 2
(dimère cyclique d'acide (dimère linéaire d'acide (acide 6 aminohexanoïque)
6-amino hexanoïque) 6 amino hexanoïque) L'activité de l'amidase linéaire E2 est optimale pour les dimères et décroît au fur et à mesure que le degré de polymérisation augmente, pour ne plus être significative à partir des oligomères de degré de polymérisation (DPn) = 7.
On connaît, également, une enzyme E3 active vis-à-vis des oligomères cycliques et linéaires d'acide 6 aminohexanoïque de DPn > 3 (PA.6). E3 est décrite par NEGORO et al. dans "Journal of Bacteriology, Dec. 1992, vol. 174, n° 24, p. 7948-7953. E3 provient, également, de Flavobacterium sp KI 72.
TSUCHIYA ET AL. enseignent, dans leur article paru dans "Journal of Bacteriology,
June 1989, p. 3187-3191, vol. 171 n° 6", qu'il existe une grande homologie entre les enzymes Ej de Flavobacterium sp KI 72 et l'une de celles issues de Pseudomonas sp NK
87. Ces enzymes E, et homologues, ainsi que les enzymes E2, et plus particulièrement ces dernières, seraient actives sur des oligomères ou des polyamides (PA 6) de formule :
-co -£NH— (CH^ -CO]-NH- avec : 2 ≤ n < 20.
Ces enzymes, issues de Flavobacterium ou de Pseudomonas ont l'inconvénient d'avoir des activités spécifiques vis-à-vis des oligomères relativement faibles, puisque celles-ci ne s'élèvent, au maximum, qu'à 1,05 micromoles d'acide amino-caproïque produit par minute et par milligramme de protéine et à partir d'un substrat constitué par un trimère. De plus, ces enzymes sont spécifiques d'homo-oligomères.
Il apparaît ainsi que l'art antérieur ne comprend pas de moyens d'hydrolyse enzymatique de fonctions amides qui soient performants, rentables et qui puissent s'appliquer à des amides, dont notamment des amides secondaires, de natures variées, en particulier du type co-oligomères et/ou homo-oligomères.
EXPOSE DE L'INVENTION :
Aussi, c'est après de longues et laborieuses recherches que la Demanderesse est parvenue à isoler et à caractériser une nouvelle enzyme du genre amidase et formée par un ou plusieurs polypeptides qui peuvent, notamment, être issus de nouveaux micro¬ organismes isolés du biotope et/ou de nouveaux micro-organismes recombinants obtenus à partir de ces micro-organismes naturels.
Il s'ensuit que la présente invention concerne en premier lieu un procédé d'hydrolyse enzymatique et, en second lieu, une enzyme. Le procédé selon l'invention d'hydrolyse de (poly)amides caractérisé :
- en ce que l'on réalise une hydrolyse enzymatique de substrats comprenant des (poly)amides de formule (I) suivante :
Figure imgf000005_0001
dans laquelle :
• A, B sont des motifs monomères,
• R1, R3 sont des radicaux divalents, identiques ou différents - de préférence différents - et représentant un (cyclo)alkylène, linéaire ou ramifié, substitué ou non, un arylène, un arylalkylène, les radicaux aromatiques étant éventuellement des polycondensats, les alkylènes ayant un nombre de carbone supérieur ou égal à 4 et, de préférence, compris entre 4 et 12.
• R2 correspond à des radicaux, identiques ou différents - de préférence identiques - et sélectionnés parmi l'hydrogène et/ou les restes alkyles ayant, avantageusement, de 1 à 6 carbones,
• X représente :
* soit X1 = OH, OM, OR4 avec M choisi parmi les métaux, de préférence les métaux alcalins et alcalino-terreux et R4 représentant un alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 6 atomes de carbone,
* soit X2 =
— N— R— NR5R6
avec R2, R3 tels que définis ci-dessus et R5, R6 identiques ou différents et répondant à la même définition que celle donnée ci-dessus pour R2, « Y représente :
* soit Y1 = hydrogène,
* soit Y2 =
— C -R -C -OZ
O O avec R1 tel que défini supra et Z correspondant à l'hydrogène, à M1 ayant la même définition que M ou à R4, avec les conditions suivantes : -a- si X = X1, alors Y = Y1 ou Y2,
-b- si X = X2, alors Y = Y2,
• et enfin p compris entre 1 et 4, de préférence entre 1 et 3, - en ce qu'elle est apte à transformer les susdits substrats (I) en monomères A d'une part, et en monomères B, d'autre part. La présente invention concerne également une famille d'enzymes de type amidase, susceptibles (parmi d'autres) d'être mises en oeuvre dans le procédé ci-dessus défini.
L'enzyme appartenant à la famille selon l'invention est une amidase, caractérisée : - © → en ce qu'elle est active, notamment vis-à-vis de substrats de type (poly)amide et répondant à la formule suivante :
Figure imgf000006_0001
dans laquelle :
•_ A, B sont des motifs monomères,
• R1, R3 sont des radicaux divalents, identiques ou différents - de préférence différents - et représentant un (cyclo)alkylène, linéaire ou ramifié, substitué ou non, un arylène, un arylalkylène, les radicaux aromatiques étant éventuellement des polycondensats, les alkylènes ayant un nombre de carbone supérieur ou égal à 4 et, de préférence, compris entre 4 et 12,
• R2 correspond à des radicaux, identiques ou différents - de préférence identiques - et sélectionnés parmi l'hydrogène et/ou les restes alkyles ayant, avantageusement, de 1 à 6 carbones,
• X représente :
* soit X1 = OH, OM, OR4 avec M choisi parmi les métaux, de préférence les métaux alcalins et alcalino-terreux et R4 représentant un alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 6 atomes de carbone,
*
avec R2, R3 tels que définis ci-dessus et R5, R6 identiques ou différents et répondant à la même définition que celle donnée ci-dessus pour R2, « Y représente :
* soit Y1 = hydrogène,
* soit Y2 =
— C -R -C -OZ II II
O O avec R1 tel que défini supra et Z correspondant à l'hydrogène, à M1 ayant la même définition que M ou à R4, avec les conditions suivantes :
-a- si X = X1, alors Y = Y1 ou Y2, -b- si X = X2, alors Y = Y2, • et enfin p compris entre 1 et 4, de préférence entre 1 et 3,
- © -» et en ce qu'elle est apte à transformer les susdits substrats (I) en monomères A, d'une part, et en monomères B, d'autre part. Parmi cette famille d'enzymes conformes à l'invention, on isole avantageusement une enzyme ayant une activité amidase et comprenant la séquence peptidique telle que représentée sur la SEQ ID NO : 1 annexée, ou une séquence peptidique homologue présentant au moins 80 %, de préférence au moins 90 % et plus préférentiellement encore au moins 95 % d'homologie avec SEQ ID NO : 1. Suivant une caractéristique avantageuse de l'invention, cette enzyme a une activité amidase, en particulier, vis-à-vis de substrats de type (poly)amide et répondant à la formule (II) suivante :
Figure imgf000007_0001
dans laquelle : * R2, R3 sont tels que définis ci-dessus,
* U et V répondent respectivement aux mêmes définitions que celles données supra pour X1 et Y1 dans la légende de la formule (I), donnée dans la revendication 1,
* et q = 1 à 8.
L'invention a tout d'abord procédé de l'isolement d'une souche sauvage productrice de l'enzyme, à savoir : Comamonas acidovorans N 12.
L'identification de cette souche sauvage résulte d'un travail de screening de longue haleine. Cette identification s'est faite à partir des caractères morphologiques, culturaux, biochimiques et antigéniques, qui ont pu être déterminés par référence aux critères officiels et internationaux de taxonomie microbiologique. Le mérite de la Demanderesse ne se limite pas à l'isolement de cette souche sauvage, mais s'étend également à l'isolement de l'amidase ci-dessus définie. Le micro-organisme Comamonas acidovorans N 12 n'est pas le précurseur biologique exclusif de cette amidase. Il faut en effet également considérer tous les recombinants et toute souche sauvage, présentant une activité enzymatique similaire. Les micro-organismes recombinants sont ceux possédant dans leur génome une séquence d'ADN codant pour l'amidase considérée dans la présente invention.
Conformément à un autre de ses aspects l'invention vise également un procédé d'hydrolyse enzymatique dans lequel on met en oeuvre la susdite enzyme et/ou le micro¬ organisme sauvage visé supra et/ou au moins l'un de ses recombinants cités ci-dessus. Conformément à l'invention, les substrats de l'enzyme et/ou de leurs précurseurs biologiques (micro-organismes/recombinants) sont des polyamides et, plus précisément, des oligomères dont la fonction de polymérisation récurrente est une fonction amide secondaire -CO -NH - Ces oligomères ont des unités récurrentes de formule (I) et/ou (H). Les unités récurrentes (I) sont, avantageusement, formées de deux motifs monomères A et B, respectivement dicarbonyle et diamine et reliés l'un à l'autre par une fonction amine secondaire.
Selon une modalité préférée de l'invention : « le monomère A est un reste :
Figure imgf000008_0001
avec r compris entre 4 et 12 et, de préférence égal à 4, • et le monomère B est un reste :
— HN— (CHj^NH- avec s compris entre 4 et 12 et, de préférence égal à 6 ;
Ainsi, pour les substrats (I), un exemple préféré de dimère est celui formé par :
Figure imgf000008_0002
Acide Adipique Hexaméthy 1lène diamine
Le polyamide correspondant est le PA 6.6.
S'agissant des unités récurrentes (II), elles sont préférablement formées par des motifs monomères notés
^ ^ ^ et dans lesquels c est un squelette du genre aminoacide dont les terminaisons
© et ® sont, respectivement, carboxylique et aminée. Un exemple typique de est un dérivé de l'acide ε-aminocaproïque, monomère du polyamide 6 (PA 6).
Parmi les oligomères de type polyamide, susceptibles de convenir pour l'invention, on peut citer :
- les oligomères de polyamides obtenus par polycondensation de diacides carboxyliques aliphatiques saturés ayant de 6 à 12 atomes de carbone avec des diamines primaires aliphatiques saturées ayant de 6 à 12 atomes de carbone,
- les oligomères de polyaminoacides obtenus, soit par homopolycondensation directe d'acide ω-aminoalcanoïque comportant une chaîne hydrocarbonée ayant de 4 à 12 atomes de carbone, soit par ouverture hydrolytique et polymérisation des lactames dérivés de ces acides,
- les oligomères de copolyamides obtenus à partir des monomères de départ des polyamides précités, le composant acide de ces copolyamides pouvant consister, en outre, en partie en acide aromatique, tel que l'acide téréphtalique et/ou l'acide isophtalique,
- et les mélanges de ces oligomères de polyamides.
A titre d'illustration des polyamides obtenus par polycondensation de diacides et de diamines, on citera, par exemple :
- le polyamide 4,6 (polymère de tétraméthylène diamine et d'acide adipique), - le polyamide 6,6 (polymère d'hexaméthylènediamine et d'acide adipique) (PA 6.6),
- le polyamide 6,9 (polymère d'hexaméthylènediamine et d'acide azélaïque),
- le polyamide 6, 10 (polymère d'hexaméthylènediamine et d'acide sébacique),
- le polyamide 6,12 (polymère d'hexaméthylènediamine et d'acide dodécanedioïque).
A titre d'illustration des polyaminoacides qui peuvent convenir, on citera : - le polyamide 4 (polymère d'acide amino-4 butanoïque ou de γ-butyrolactame),
- le polyamide 5 (polymère d'acide amino-5 pentanoïque ou de δ-amylolactame),
- le polyamide 6 (polymère d'ε-caprolactame),
- le polyamide 7 (polymère d'acide amino-7 heptanoïque),
- le polyamide 8 (polymère de capryllactame), - le polyamide 9 (polymère d'acide amino-9 nonanoïque),
- le polyamide 10 (polymère d'acide amino- 10 décanoïque),
- le polyamide 11 (polymère d'acide amino- 11 undécanoïque),
- le polyamide 12 (polymère d'acide amino- 12 dodécanoïque ou de laurolactame).
A titre d'illustration des copolyamides, on citera, par exemple : - le polyamide 6,6/6,10 (copolymère d'hexaméthylènediamine, d'acide adipique et d'acide sébacique),
- le polyamide 6,6/6 (copolymère d'hexaméthylènediamine, d'acide adipique et de caprolactame).
Sans que cela ne soit limitatif, les substrats préférés conformément à l'invention sont des oligomères de polyamides obtenus par polycondensation de diacides A et de diamines B et, en particulier, de PA 6.6.
Le nombre des monomères A et B, d'une part, ou ^ ^ Φ-', d'autre part, des substrats (I) et (H) selon l'invention est, avantageusement, compris entre 2 et 8, de préférence entre 2 et 6. II est à noter que ce nombre de monomères A et B dans les molécules d'oligomères ou de polymères sera également dénommé DPπ dans le présent exposé. Des substrats (I) caractéristiques sont, e. g., des oligomères avantageusement hydrosolubles tels que : AB, ABA et ABAB.
Il est à noter que ce nombre de monomères A et B dans les molécules d'oligomères ou de polymères sera également dénommé DPπ dans le présent exposé. Ces substrats particuliers font partie de ceux (I) et (H) que l'enzyme de l'invention et/ou ses précurseurs biologiques sont aptes à hydrolyser, car ils possèdent au moins une extrémité carboxyle.
Lorsque les substrats enzymatiques sont des oligomères contenant des monomères A et B, les produits finaux de l'hydrolyse peuvent être des monomères A et B. Quand les substrats sont des oligomères (H) (monomères (a) (ç) — (b~)), les produits finaux de l'hydrolyse peuvent être des monomères (a} (c) (jT).
L'enzyme conforme à l'invention peut également être caractérisée au travers de son activité et/ou son affinité vis-à-vis de certains des susdits substrats.
Ainsi, selon une première caractéristique avantageuse, l'amidase considérée est : - en premier lieu, active vis-à-vis d'un substrat (I) formé par un tétramère de A et de B (DPn = 4, i. e. p = 2, X = X1 et Y = Y*),
- et, en second lieu, apte à transformer ce substrat, d'une part, en un oligomère de DPn = 3 et, d'autre part, en monomère A, avec une activité enzymatique spécifique (Us) - exprimée en μmoles de ABAB hydrolysé.h .mg-1 de protéine et mesurée dans des conditions données, supérieures ou égales à 1000.
Une deuxième caractéristique avantageuse de cette amidase est d'être active vis-à-vis d'un substrat (I), formé par un trimère ABA et d'être apte à transformer ce trimère en un monomère A et un dimère AB, et ce avec une activité enzymatique spécifique supérieure ou égale à 1000 μmoles de substrat hydrolysé.h'l.mg"! de protéine. Une troisième caractéristique avantageuse de cette amidase est d'être active vis-à-vis d'un substrat (I) formé par un dimère de type AB et d'être apte à transformer ce dimère en deux monomères A et B, avec une activité enzymatique spécifique supérieure à 1 500 μmoles de substrat hydrolysé.h"l.mg"l de protéine.
L'activité enzymatique de l'amidase pure est mesurée dans les conditions suivantes : tampon phosphate, pH 6 à 8 et température = 30 °C.
L'enzyme amidase de l'invention présente au moins l'une de ces trois caractéristiques non limitatives.
Comme déjà indiqué supra, la mise en oeuvre de l'enzyme de l'invention dans l'hydrolyse enzymatique d'amides, peut consister à utiliser uniquement l'enzyme per se au lieu des précurseurs biologiques (micro-organismes sauvages ou recombinants) producteurs de celle-ci ou bien encore un mélange des deux.
A propos de producteurs d'enzyme, il est à souligner que l'enzyme objet de l'invention est également caractérisée en ce qu'elle est produite par des micro-organismes du type Comamonas acidovorans (N 12), de préférence du type de la souche référencée et déposée dans la collection Nationale de Cultures de Micro-organismes - Institut Pasteur PARIS sous le n° 1 1522 le 4 janvier 1995, et/ou par les recombinants comme décrits supra.
La présente invention concerne, également, de nouveaux micro-organismes aptes à produire l'enzyme amidase selon l'invention, telle que définie supra. De par cette aptitude, ces micro-organismes ont notamment pour caractéristiques, d'une part, une capacité d'hydrolyse des fonctions amides d'un composé polyamide, comprenant au moins une fonction amide et, en particulier, des oligomères. Plus précisément, ces micro-organismes ont une sélectivité et une activité d'hydrolyse spécifiques, vis-à-vis des substrats (I) et (H) définis supra. Dans le cas des substrats (I), les oligomères sont, par exemple, les hydrosolubles cités ci-dessus : ABAB et/ou ABA et/ou AB entre autres.
Plus précisément, ces micro-organismes peuvent être, de préférence, constitués par Comamonas acidovorans sus-visé, de préférence par la souche référencée et déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes sous le n° 1 1522 le 4 janvier 1995, ou par des recombinants de celle-ci, tels que décrits supra.
Avantageusement, les micro-organismes selon l'invention sont aptes à permettre l'hydrolyse d'au moins un substrat formé par un oligomère de polyamide et, plus précisément, par un dimère AB, voué à être transformé en deux monomères A et B, les micro-organismes étant aptes à assurer l'hydrolyse. Outre les précurseurs biologiques de l'amidase considérée, la présente vise également le matériel génétique sous l'égide duquel, elle peut être synthétisé, via des microorganismes recombinants ou non. Il s'ensuit que la présente invention conceme une séquence d'ADN codant pour une enzyme ayant une activité amidase, caractérisé en ce qu'elle est choisie parmi la liste des séquences suivantes : Δ la séquence d'ADN, telle que représentée par SEQ ID NO : 2 dans la liste de séquence annexée et codant pour au moins une enzyme ayant une activité amidase, Δ un analogue de cette séquence résultant de la dégénérescence du code génétique, Δ une séquence d'ADN hybridant avec la susdite séquence ou avec au moins un fragment de celle-ci et codant pour une enzyme ayant une activité amidase. Les enzymes résultant de l'expression de la susdite séquence d'ADN, sont également comprises dans le champ de l'invention. Les microorganismes sauvages (e.g. I 1522) et les microorganismes recombinants isolés par la Demanderesse contient chacun au moins une cassette d'expression comprenant la séquence d'ADN SEQ ID NO : 2 visée supra, et éventuellement, en amont de celle-ci au moins une séquence promotrice et au moins un site de fixation des ribosomes. La présente invention a également pour objet un procédé d'hydrolyse de substrats, au moins en partie formés par ceux (I) et/ou (H), tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en oeuvre au moins une enzyme et/ou au moins l'un des micro¬ organismes tels que présentés supra. II peut être intéressant, conformément à l'invention, de disposer de plusieurs enzymes à spectres complémentaires. Aussi, l'une des variantes du susdit procédé peut être d'avoir recours à au moins un autre type d'enzyme et/ou à au moins l'un de ses précurseurs biologiques sauvages et/ou recombinants. Dans cette variante, les substrats sont, au moins en partie, constitués par des oligomères dont le DPn est inférieur à 40, de préférence à 20 et, plus préférentiellement encore, à 12 et qui dérivent de polyamides au moins issus de polycondensation entre des monomères diacide (A) et diamine (B). Le procédé d'hydrolyse selon cette variante est caractérisé :
- en ce qu'il conduit à des oligomères de degré de polymérisation (DPn) inférieur ou égal à 3 et, de préférence, aux monomères A et B, - et en ce que l'on met en oeuvre :
• au moins une enzyme et/ou au moins un micro-organisme tels que définis ci- dessus,
• et au moins un autre type d'enzyme et/ou à au moins l'un de ses précurseurs biologiques sauvages et/ou recombinants, ladite enzyme étant : * une enzyme E3 produite sous l'égide du gène nyl-c de Flavobacterium sp KI 72,
* et/ou une enzyme dénommée PAM I, telle que celle définie par la séquence peptidique SEQ TD NO : 3 annexée, une telle enzyme pouvant, entre autres, être produite par le micro-organisme référencé et déposé dans la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes - Institut Pasteur PARIS - sous le n° I
1495, le 29 novembre 1994.
Pour obtenir des oligomères hydrolysables par les enzymes ci-dessus, il est possible de faire intervenir une lyse thermique et/ou chimique (acide) des fonctions de type amide.
Selon d'autres modalités avantageuses du procédé selon l'invention, on met en oeuvre, notamment des précurseurs biologiques de la (ou des) enzyme(s) et un milieu de culture comprenant, par exemple :
- une source de carbone comportant, de préférence au moins un composé comprenant au moins une fonction amide, ladite source de carbone comportant éventuellement un complément choisi, avantageusement, parmi les hydrates de carbones, le saccharose étant particulièrement préféré,
- et, éventuellement, un composé apte à induire la production des enzymes, sans être consommé par les précurseurs biologiques, ledit composé étant préférablement choisi parmi les amides. Le procédé d'hydrolyse enzymatique d'amides selon l'invention peut trouver de nombreuses applications, par exemple en synthèse organique pour la fabrication de composés à partir de composés amides ou pour le traitement des matériaux contenant du polyamide. En particulier, il pourrait être intéressant dans le cadre de la régénération des matières premières des polymères polyamides.
Les exemples qui suivent permettent d'illustrer les caractéristiques, les variantes et les avantages de la présente invention, sans toutefois en limiter la portée.
DESCRIPTION DES FIGURES ANNEXEES
-Xa liste des séquences, est établie selon la norme ST 23 de l'OMPI et comprend :
* SEQ ID NO : 1 : séquence d'acides aminés correspondant à l'enzyme PAM II conforme à l'invention, * SEQ ID NO : 2 : ADN (pam II) codant pour l'amidase PAM II,
* SEQ JO NO : 3 : séquence d'acides aminés correspondant à PAM I.
* SEQ ID NO : 4 : ADN codant pour l'enzyme PAM I.
- La fig. 1 représente la carte de restriction du plasmide pXL2297 contenant le gène (pam I) codant l'amidase PAM I. - La fig. 2 représente la carte de restriction du plasmide pXL2564, contenant le gène (pam I) codant pour PAM I.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DE LA SOUCHE SAUVAGE COMAMONAS ACIDOVORANS^ 12.
1.1 CRIBLAGE MICROBIOLOGIQUE : Une vaste opération de criblage ou screening microbiologique a permis de sélectionner la souche Comamonas acidovorans N 12, à partir de divers biotopes.
1.2 SELECTION-IDENTIFICATION DE CE MICRO-ORGANISME :
La sélection de ce micro-organisme a été effectuée à l'aide d'un test d'activité amidasique sur des oligomères de synthèse du PA 6.6. L'évaluation d'activité sera vue en détail ci-après. Le micro-organisme sélectionné a ensuite été identifié sur la base de ses caractères morphologiques, physiologiques et biochimiques et éventuellement antigéniques, de façon tout à fait traditionnelle, par le Laboratoire de Bactériologie de l'iNSTITUT PASTEUR.
Sur la base de ces résultats et des activités d'hydrolyse sur un mélange d'oligomères AB, ABA, BAB et ABAB, la souche naturelle sélectionnée a été soumise ensuite à une caractérisation plus poussée.
EXEMPLE 2 : CARACTERISATION POUSSEE DE COMAMONAS ACIDOVORANS N 12
2.1 OPTIMISATION DES CONDITIONS DE CULTURE :
Le milieu de culture optimum est le M9YE3 présentant la composition suivante :
- KH2PO4 0,75 g/l
- K2HPO4.3H2O 1,00 g/l
- Na2HPO4.12H2O 1,00 g/l - (NH4)2SO4 2,50 g/l
- Extrait de levure 3,00 g/l
- MgSO4.7H2O 1,00 g/l
- FeSO4.7H2O 2,30 mg/1
- MnSO4.7H2O 2,70 mg/1 - CoCl2.2H2O 2,30 mg/1
- CaCl2.2H2O 1,50 mg/1
- CuSO4.5H2O 0,25 mg/1
- pH 7,2 et additionné de sel d'acide adipique à 10 g/l. Les cultures sont réalisées dans des fioles Erlenmeyers remplies au 1/5 ème de leur volume total. Les milieux sont incubés à 30 °C et agités à 150 t/min. La préculture se compose de 10 ml de milieu LB :
- Tryptone 10 g/l
- Extrait de levure 5 g/l - NaCl 10 g/l ensemencées par une colonie venant d'une boîte de Pétri contenant du milieu M9YE3 gélose et 5 g/l d'un composé comprenant une fonction amide, tel que des oligomères penta aux décamères du PA 6.6.
La culture est ensuite ensemencée à 1 % avec le milieu optimum (v/v). En fin de culture, la production cellulaire est déterminée par un extrait sec, obtenu par séchage d'une nuit à 105 °C d'un culot cellulaire, obtenu après centrifugation (10 min à 12 000 g).
Pour obtenir une efficacité maximale dans l'hydrolyse, il est avantageux d'introduire, dans le milieu, un composé contenant au moins une fonction amide. Selon une autre caractéristique préférentielle de l'invention, la source de carbone comporte, conjointement aux solubles, un complément choisi, avantageusement, parmi les hydrates de carbone, le saccharose étant particulièrement préféré.
Pour obtenir une efficacité maximale dans l'hydrolyse, il est avantageux d'introduire, dans le milieu, un composé contenant au moins une fonction amide.
2.2 HYDROLYSE ENZYMAΉQUE - MESURE D'ACTIVITÉ DU MICRO-ORGANISME SAUVAGE :
La mesure d'activité est déterminée à 28 °C dans un tampon phosphate 10,5 mmol/l, à pH 7,5 et avec un volume final de 1 ml. Le TABLEAU 1 ci-dessous donne les résultats obtenus.
TABLEAU 1
Figure imgf000015_0001
EXEMPLE 3 : PURIFICATION DE LA POLYAMIDE HYDROLASE DE COMAMONAS ACIDOVORANS N 12 SELON L'INVENTION.
Protocole type :
Le suivi de l'activité de cette enzyme (PAM II) se fait en dosant l'activité d'hydrolyse de ABAB en BAB + A.
3.1. GLOSSAIRE : DTE = 1,4 dithioerythritol,
Acide EDTA = Ethylène Diamine Tetra Acétique CHAPS ≈ 3 [(3 cholamidopropyl)-diméthylammonio]- 1 -propanesulphonate SDS = sodium dodecyl sulphate
3.2 PREPARATION DES EXTRAITS ENZYMATIQUES :
On part de cellules issues d'une culture âgée de 20 h en flasque de 2,5 1 remplis par 500 ml de milieu M9YE3 décrit dans l'exemple 2 et additionné de sel d'acide adipique à 10 g/l. PREMIERE EXTRACTION PAR TRAITEMENT AUX ULTRA-SONS :
On remet en suspension 25 g de cellules de Comamonas acidovorans dans 75 ml de tampon 100 mM Tris-HCl pH 7,5 contenant 1 mM DTE, 5 mM EDTA, 100 mM KC1 et 15 % v/v de glyeérol. On soumet ensuite la suspension à un traitement discontinu (10 % de traitement, 90 % de repos) aux ultrasons dans la glace fondante pendant 70 min.
Puis on centrifuge pendant 1 h 30 à 50 000 g (ultracentrifùgeuse Beckman). On obtient: enfin :
→ d'une part 90 ml de surnageant (SI) à 21 mg/ml de protéines, soit 1 890 mg de protéines d'activité spécifique 6 μmoles/h/mg (11340 unités au total).
— > d'autre part un culot (Cl) qui est remis en suspension dans 30 ml de tampon ,, 25 mM Tris-HCl pH 8 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS et 15% v/v de glyeérol.
C'est ce culot qui contient également de l'activité polyamidase II qui est traité par la suite. On notera qu'il est possible après dessalage des 90 ml de surnageant dans le même tampon sans glyeérol et nouvelle ultracentrifugation de purifier et de reconcentrer dans un nouveau culot très fin l'activité polyamidase II apparemment soluble lors de la première centrifugation. En effet en diminuant la densité du tampon (par élimination du glyeérol) on accélère la chute des très fines particules. Ces données sont en accord avec le fait que le premier surnageant n'est pas isolable par chromatographie, par exemple sur colonne MonoQ, puisque l'on retrouve l'activité tout au long du gradient.
TRAITEMENT COMPLÉMENTAIRE DU CULOT DE PREMIÈRE CENTRIFUGATION : On centrifuge le culot (Cl) remis en suspension pendant 30 min à 4 000g, pour faire tomber les cellules non lysées par le premier traitement aux ultra-sons.
On recueille ensuite le surnageant (S2) et on le soumet à un traitement discontinu (10 % de traitement, 90 % de repos) aux ultra-sons dans la glace fondante pendant 20 min. Puis, on centrifuge à nouveau 2 h à 50 000 g et on recueille le surnageant (S3).
ETAPES DE PURIFICATION PAR CHROMATOGRAPHIE :
1ère Etape : Le surnageant S3 est chromatographie en trois fois sur une colonne de MonoQ HR10/10 (Pharmacia) équilibrée dans le tampon 25 mM Tris-HCl pH 8 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS et 15 % v/v glyeérol. L'élution se fait par un gradient linéaire sur 60 min de O à O,6 M NaCl avec un débit de 3 ml/min. L'activité polyamidase II est éluée à environ 0,2 M NaCl en un pic assez large. Les fractions actives sont regroupées et concentrées à 5 ml sur Centriprep 10 (Amicon). 2ème Etape : Aux 5 ml recueillis précédemment sont ajoutés 5 ml de tampon 25 mM
Tris-HCl pH 8 contenant 1 mM DTE, 8 mM CHAPS, 1,5 M sulfate d'ammonium et 15 % v/v de glyeérol. Puis ces 10 ml sont chromatographies en deux fois sur une colonne de Phenylsuperose HRlO/10 (Pharmacia) équilibrée dans le tampon 25 mM Tris-HCl pH 8 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS, IM sulfate d'ammonium et 15% v/v glyeérol. L'élution se fait par un gradient linéaire sur 70 min de 1 à O M sulfate d'ammonium avec un débit de 1,25 ml/min. L'activité polyamidase est éluée à environ 0,8 M sulfate d'ammonium. Les fractions actives sont regroupées et concentrées à 400 μl sur Centriprep 10 (Amicon). 3ème Etape : Les 400 μl précédents sont chromatographies en deux fois sur colonne
TSK G3000 SW (Supelco) équilibrée dans le tampon 100 mM Tris-HCl pH 7,5 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS, 150 mM NaCl et 15 % v/v glyeérol et éluée à 0,5 ml/min. L'activité est retrouvée depuis l'exclusion jusqu'à un poids moléculaire d'environ 30 kDa. Les fractions les plus actives sont regroupées, amenées à un volume de 5 ml et dessalées sur colonnes (2,5 ml par colonne) de PD 10 Sephadex G25 (Pharmacia) équilibrées et éluées dans le tampon 25 mM Tris-HCl pH 8 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS et 15 % v/v glyeérol.
4ème Etape : Les 7 ml issus du dessalage sur PD10 sont chromatographies sur colonne MonoQ HR 5/5 (Pharmacia) équilibrée dans le tampon 25 mM Tris-HCl pH 8 contenant 2 mM DTE, 8 mM CHAPS et 15 % v/v glyeérol. L'élution se fait par un gradient linéaire sur 30 min de O à O,6 M NaCl avec un débit de 1 ml/min. L'activité polyamidase est éluée à environ 0,15 M NaCl en un pic assez large. Les fractions actives sont regroupées et après ajout de 0,05 % SDS sont concentrées à 200 μl sur Centriprep 10 puis Centricon 10 (Amicon). 5ème Etape : Les 200 μl recueillis sont injectés sur colonne de TSK G3000 SW équilibrée dans le tampon 40 mM sulfate de sodium, 20 mM phosphate de sodium pH 6,8 contenant 0,25 % p/v SDS et éluée à un débit de 0,25 ml/min. La polyamidase sort en un pic fin contrôlé par électrophorèse. Ce matériel est utilisé pour le séquençage. DETERMINATION DU POIDS MOLECULAIRE PAR ELECTROPHORESE Le poids moléculaire déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide varie selon le mode de préparation de l'échantillon de polyamidase II.
En présence de 2,5 % de SDS et 5 % de mercaptoéthanol, on trouve une bande située entre 36 et 40 kDa mais le même échantillon s'il est chauffé 5 min à 90 °C ne migre plus qu'à un poids moléculaire d'environ 150 kDa. D'après son protocole de purification, ce phénomène est caractéristique de certaines protéines associées aux membranes.
SEQUENÇAGE
Un lot de 60 μg environ de polyamidase préparé par le protocole type, mais en partant de 60 g de cellules et en remplaçant l'étape de Phénylsuperose par une deuxième étape de MonoQ HR10/10), est digéré directement par 5 μg d'enzyme LysC, en présence de 0,25 % p/v SDS. Les fragments obtenus ont été purifiés sur colonne Vydac Cl 8.
La séquence SEQ H) NO : 1 a été obtenue en mettant en oeuvre des techniques classiques de séquençage nucléotidique. EXEMPLE 4 : HYDROLYSE ENZYMATIQUE D'OLIGOMERES FORMES PAR DES MONOMERES A ET B RELIES LES UNS AUX AUTRES PAR DES LUISONS AMIDES SECONDAIRES A L'AIDE D'UN MELANGE D'ENZYMES SELON L'INVENTION ET D'HYDROLASE PAM I.
Dans le présent exemple, ce ne sont pas les enzymes pures que l'on met en oeuvre, mais leurs précurseurs biologiques, à savoir la souche Comamonas acidovorans NI 2 selon l'invention et une souche hébergeant le gène pam I (SEQ ID NO : 4 annexée) et produisant l'enzyme PAM I (SEQ D3 NO : 3 annexée), ladite souche étant construite selon le protocole donné ci-après.
Cette construction vise à obtenir le gène pam I (codant pour l'enzyme PAM I) qui est précédé du site de fixation des ribosomes du gène cil du page λ et qui est exprimé à partir du promoteur de l'opéron tryptophane άE. Coli. Pour ce faire, un site de restriction Ndeï a été créé au codon d'initiation de pam I par la technique de la PCR en utilisant comme matrice le plasmide pXL2297 (fig. 1) hébergé par la souche I 1495 déposée à la CNCM le 29 Novembre 1994. Le fragment Ndel-Apal de 208 pb, contenant la partie 5' du gène pam I, a été amplifié par PCR en prenant soin d'introduire un site HindIII en amont du site Nde\ grâce au couple d'amorces nucléotidiques (5'- AGCAAGCTTGGAGGCCATATGAATACGAC-3')) et (5'-CACCGGTGGGCCCCTC-3'). Le fragment amplifié Hindlll-Apal a été clone dans pUC29 (Benes et al. (1993), Gène 130 : 151-152) digéré par Hindll] et Apal et le gène pam I a été reconstitué par introduction au site Apal du fragment Apal de 867 pb de pXL2297. Un site Ncol se trouve ainsi placé à une trentaine de nucleotides en aval du codon stop de pam I. Les fragments adjacents Ndel- EcόRl de 500 pb et EcoRl-Ncol de 600 pb de ce plasmide ont été insérés dans pXL2158 (Brevet FR 92-09 882) digéré au site Ndel situé immédiatement en aval du promoteur trytptophane.
Ainsi, le plasmide pXL2564 (décrit sur la fig. 2), est un dérivé de pBR322 (Sucliffe (1978), Nucleic Acid. Res. 5 : 2721) contenant un gène conférant la résistance à l'ampicilline et le gène pam I sous contrôle de la cassette d'expression Ptφ-RBScll.
Le plasmide pXL2564 a été introduit dans la souche d'E. Coli TG1, la sélection des micro-organismes se faisant sur LB ampicilline. Un clone contenant pXL2564 (appelée souche PAM I) a été repiqué deux fois sur boîtes gélosées et mis en culture à 37 °C en milieu M9 glucose contenant 100 μg/ml d'ampicilline selon la procédure décrite dans le brevet FR 2 694 571.
La souche Comamonas acidovorans NI 2 a été cultivée 19 heures dans les mêmes conditions que celles définies au paragraphe 2.1 supra. Un lot d'oligomères, constitués par des monomères A = acide adipique et B = HexaMéthylèneDiamine (HMD) et de DPπ moyen 4 a été mis en oeuvre.
25,25 g d'oligomères de DPn moyen 8 sont resuspendus dans 300 ml d'eau. 200 ml d'eau contenant les cellules (soit 3,1 g au total) sont ajoutés. Le tout est agité 18 heures sous courant d'azote.
La solution est centrifugée et le surnageant (400 ml) est récupéré. Un poids sec de τ4 g/l est mesuré sur le surnageant. Une fraction est donnée pour analyse des oligomères de l'acide adipique et de l'HMD.
Les résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 2 ci-après.
TABLEAU 2
Figure imgf000019_0001
Le rendement molaire en monomère acide adipique formé est de 66 %, tandis que celui en HMD est de 58 %. Le rendement molaire en monomères et oligomères de Dp inférieur à 4, exprimé en moles de monomères, est de 72 %.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC FIBRES ET POLYMERES SA
(B) RUE: 25, Quai Paul Doumer
(C) VILLE: Courbevoie
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 92400
(G) TELEPHONE: (33~1) ^7 68 123^ (H) TELECOPIE: (33~1) ^7 68 1656
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Procédé d'hydrolyse enzymatique d'amides,enzymes à activité amidase, et précurseurs génétiques (ADN) et microbiologiques (micro-organismes) susceptibles de produire de telles enzymes
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: k
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 95 08917
(B) DATE DE DEPOT: 18-JUL-1995
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 421 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Met Asn Arg Thr Tyr His Arg Arg Asp Val Leu Arg Ile Leu Gly Val
1 5 10 15
Gly Thr Ala Leu Gly Gly Ala Ala Leu Leu Gly Ala Cys Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Asn Glu Ala Pro Arg Glu Gin Ile Ala Ser Ser Leu Phe Ser
35 40 45
Thr Thr Pro Glu Asn Arg Ala Ala Thr Phe Arg Asn Ala Asp Arg Ile
50 55 60
Val Tyr Ser Arg Thr Ile Lys Arg Gly Ala Thr Thr Met Pro Leu Lys 65 70 75 80
Pro His His Val Ser Leu Ala Ser Leu Thr Tyr Asp Tyr Ala Gly Lys
85 90 95
Thr Thr Asn Val Asp Asp Tyr Met Gin Arg Asn Arg Thr Ala Gly Leu
100 105 no
Leu Ile Leu Lys Gly Gly Ala Val Ala Leu Glu Arg Tyr Gly Met Gly
115 120 125
Asn Thr Glu Thr Ser Arg Trp Thr Ser Trp Ser Val Ala Lys Ser Val
130 135 1^0
Thr Ser Thr Leu Val Gly Ala Ala Leu Lys Asp Gly His Ile Ala Ser 145 150 155 160
Lêu Asp Asp Pro Val Thr Arg Tyr Val Thr Ala Leu Lys Gly Ser Ala"-
165 170 175
Tyr Glu Gin Asn Thr Ile Arg Glu Leu Leu Arg Met Thr Ser Gly Val
180 185 190
Arg Trp Ile Glu Ala Tyr Ser Glu Thr Gly Asn Ser Asp Ile Ala Arg
195 200 205
Leu Arg Glu Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Ser Gly Ser Val Met Glu Leu
210 215 220
Met Arg Thr Arg Pro Arg Ala Ala Ala Pro Gly Ser Val Phe Asn Tyr 225 230 235 240
Ser Thr Gly Glu Ser Tyr Val Leu Gly Ala Val Val Ala Ala Ala Thr
245 250 255
Gly Thr Thr Leu Ser Asp Tyr Phe Ser Arg Lys Val Trp Ala Pro Phe
260 265 270
Gly Met Glu Ala Asp Gly Tyr Trp Gin Leu Asp Ser Glu Gly Gly Leu
275 280 285
Glu Met Gly Gly Ala Asn Phe Ser Ala Thr Leu Arg Asp Tyr Gly Arg
290 295 300
Phe Gly Leu Phe Phe Ser Arg Glu Gly Val Val Asn Gly Thr Ala Val 305 310 315 320
Leu Pro Leu Gly Trp Arg Ala Leu Ala Ser His Pro Asp Ser Pro Val
325 330 335
Thr Asn Tyr Gly Ala Leu Tyr Lys Asp Tyr Pro Leu Gly Tyr Gly Tyr
340 3^5 350
Gin Trp Trp Ala Leu Pro Gly Lys Asp Thr Thr Ile Pro Ala Gin Asp
355 360 365
Arg Pro Phe Thr Ala Gin Gly Ile Tyr Gly Gin Phe Ile Tyr Ile Asp
370 375 380
Pro Lys Glu Asp Val Val Ala Val Val Trp Ser Ala Trp Asn Asn Ser 385 390 395 ^00 Trp Val Asp Ser Ala Glu Phe Glu Thr Phe Ala Leu Leu Ser Lys Ala
405 410 415
Val Glu Met Leu Lys 420
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1263 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
ATGAACAGGA CATACCACCG TCGCGATGTG CTGAGAATTT TGGGTGTTGG AACTGCACTT 60
GGAGGCGCGG CGCTTCTCGG CGCCTGTGGC GGCAGTGGAG GCAACGAAGC GCCTCGGGAA 120
CAAATTGCAT CGAGCCTATT CAGCACAACT CCCGAAAACC GGGCGGCAAC TTTCCGGAAT 180
GCCGACCGAA TTGTTTACTC ACGCACCATC AAGCGTGGCG CCACGACCAT GCCTCTGAAG 240
CCGCACCATG TCTCGCTGGC GTCCCTCACA TATGACTATG CGGGGAAAAC CACTAACGTG 300
GATGACTACA TGCAGCGCAA TCGCACAGCT GGATTGCTTA TCTTGAAAGG CGGAGCAGTC 360
GCGCTGGAGC GCTATGGCAT GGGCAACACC GAAACGTCCC GGTGGACTTC ATGGTCAGTC 420
GCCAAATCTG TCACCTCCAC CTTGGTTGGC GCAGCGCTGA AGGATGGGCA CATTGCCAGC 480
CTAGACGACC CTGTGACGAG GTATGTGACG GCTTTAAAAG GCAGCGCGTA TGAACAGAAC 540
ACAATACGTG AGCTGCTACG GATGACTTCC GGCGTACGTT GGATTGAAGC CTACAGCGAG 600
ACGGGCAACT CCGACATTGC CCGACTGAGA GAGGCGTATA GTTCCGGGAA AAGCGGCAGC 660
GTGATGGAGC TGATGCGCAC ACGCCCGCGT GCGGCAGCCC CTGGCAGTGT GTTTAACTAC 720
AGCACAGGGG AGAGTTACGT GCTAGGCGCA GTAGTTGCAG CGGCCACTGG CACAACTTTG 780
AGTGATTATT TCTCCCGGAA AGTATGGGCA CCGTTCGGCA TGGAGGCCGA TGGCTATTGG 840
CAGCTGGATT CCGAAGGAGG ACTGGAAATG GGGGGCGCAA ATTTCAGCGC GACCTTGCGA 900
GACTACGGGA GGTTCGGCTT GTTCTTCTCG CGCGAAGGCG TCGTCAATGG CACTGCTGTT 960
CTGCCGCTTG GGTGGCOGGC TCTTGCTAGC CATCCCGATT CGCCAGTAAC CAACTACGGA 1020
GCTCTTTACA AAGACTACCC GCTTGGCTAT GGATACCAAT GGTGGGCACT CCCGGGCAAA 1080
GATACAACAA TTCCAGCTCA AGACCGCCCC TTCACCGCTC AAGGCATCTA CGGTCAGTTC 1140
ATTTACATCG ATCCCAAGGA GGATGTTGTT GCCGTAGTGT GGAGTGCGTG GAACAACTCA 1200
TGGGTCGACA GCGCCGAGTT TGAAACGTTT GCACTTCTCT CGAAGGCCGT AGAAATGTTG 1260
AAA 1263
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 355 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Met Asn Thr Thr Pro Val His Ala Leu Thr Asp Ile Asp Gly Gly Ile
1 5 10 15
Ala Val Asp Pro Ala Pro Arg Leu Ala Gly Pro Pro Val Phe Gly Gly
20 25 30
Pro Gly Asn Asp Ala Phe Asp Leu Ala Pro Val Arg Ser Thr Gly Arg
35 40 45
Glu Met Leu Arg Phe Asp Phe Pro Gly Val Ser Ile Gly Ala Ala His
50 55 60
Tyr Glu Glu Gly Pro Thr Gly Ala Thr Val Ile His Ile Pro Ala Gly 65 70 75 80
Ala Arg Thr Ala Val Asp Ala Arg Gly Gly Ala Val Gly Leu Ser Gly
85 90 95
Gly Tyr Asp Phe Asn His Ala Ile Cys Leu Ala Gly Gly Ala Cys Tyr
100 105 no
Gly Leu Glu Ala Gly Ala Gly Val Ser Asp Ala Leu Leu Glu Arg Leu
115 120 125
Glu His Arg Thr Gly Phe Ala Glu Leu Gin Leu Val Ser Ser Ala Val
130 ^ 135 140
Ile Tyr Asp Phe Ser Ala Arg Ser Thr Ala Val Tyr Pro Asp Lys Ala 145 150 155 160
Leu Gly Arg Ala Ala Leu Glu Phe Ala Val Pro Gly Glu Phe Pro Gin
165 170 175
Gly Arg Ala Gly Ala Gly Met Ser Ala Ser Ala Gly Lys Val Asp Trp
180 185 190
Asp Arg Thr Glu Ile Thr Gly Gin Gly Ala Ala Phe Arg Arg Leu Gly
195 200 205
Asp Val Arg Ile Leu Ala Val Val Val Pro Asn Pro Val Gly Val Ile
210 215 220
Val Asp Arg Ala Gly Thr Val Val Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Gin Thr 225 230 235 240
Gly Val Arg Arg His Pro Val Phe Asp Tyr Gin Glu Ala Phe Ala Glu
245 250 255
Gin Val Pro Pro Val Thr Glu Ala Gly Asn Thr Thr Ile Ser Ala Ile
260 265 270
Val Thr Asn Val Arg Met Ser Pro Val Glu Leu Asn Gin Phe Ala Lys 275 280 285 Gin Val His Ser Ser Met His Arg Gly Ile Gin Pro Phe His Thr Asp
290 295 300
Met Asp Gly Asp Thr Leu Phe Ala Val Thr Thr Asp Glu Ile Asp Leu 305 310 315 320
Pro Thr Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Arg Leu Ser Val Asn Ala Thr
325 330 335
Ala Leu Gly Ala Ile Ala Ser Glu Val Met Trp Asp Ala Val Leu Glu
340 345 350
Ala Gly Lys 355
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1068 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
ATGAATACGA CACCGGTCCA CGCACTCACC GACATCGACG GCGGGATCGC CGTCGATCCC 60
GCACCCCGGC TGGCCGGCCC TCCGGTCTTC GGGGGTCCGG GCAACGACGC CTTCGATCTC 120
GCGCCGGTCA GGAGCACGGG CCGCGAGATG CTGCGGTTCG ACTTCCCCGG GGTCAGCATC 180
GGCGCGGCGC ACTACGAGGA GGGGCCCACC GGTGCGACCG TGATCCACAT CCCCGCCGGC 240
GCCCGCACCG CGGTGGACGC GCGGGGCGGG GCGGTGGGGC TCTCCGGCGG CTACGACTTC 300
AACCACGCCA TCTGCCTGGC CGGCGGAGCC TGCTACGGGC TCGAGGCGGG CGCCGGGGTG 36O
AGCGACGCGC TCCTGGAACG CCTCGAGCAT CGCACCGGCT TCGCCGAGCT CCAGCTGGTG 420
TCGTCGGCGG TCATCTACGA CTTCTCGGCG CGCTCCACCG CGGTCTACCC CGACAAGGCG 480
CTCGGCCGCG CGGCGCTCGA ATTCGCCGTT CCCGGTGAGT TCCCGCAGGG GCGGGCGGGC 540
GCGGGCATGA GCGCGTCCGC GGGCAAGGTG GACTGGGACC GCACCGAGAT CACCGGGCAG 600
GGCGCGGCGT TCCGTCGTCT CGGCGACGTG CGCATCCTCG CCGTCGTCGT GCCGAACCCG 660
GTCGGTGTGA TCGTGGACCG CGCGGGCACG GTGGTGCGCG GCAACTACGA CGCGCAGACC 720
GGGGTCCGGC GCCACCCGGT GTTCGACTAC CAGGAGGCGT TCGCCGAGCA GGTCCCGCCC 78O
GTCACCGAGG CCGGCAACAC CACGATCAGC GCGATCGTCA CGAACGTGCG GATGAGCCCC 840
GTCGAGCTGA ACCAGTTCGC CAAGCAGGTG CACAGTTCGA TGCACCGCGG CATCCAGCCG 900
TTCCACACCG ACATGGACGG CGACACGCTC TTCGCCGTCA CCACCGACGA GATCGATCTG 96O
CCGACGACCC CGGGGTCGTC GCGCGGGCGG CTGTCGGTGA ACGCGACCGC GCTCGGCGCG 1020
ATCGCCTCCG AGGTGATGTG GGACGCCGTC CTCGAGGCCG GCAAGTAG 1068

Claims

REVENDICATIONS :
1 - Procédé d'hydrolyse de (poly)amides caractérisé -> en ce que l'on réalise une hydrolyse enzymatique de substrats comprenant des (poly)amides de formule (I) suivante :
Figure imgf000025_0001
dans laquelle :
• A, B sont des motifs monomères,
• _ R1, R3 sont des radicaux divalents, identiques ou différents - de préférence différents - et représentant un (cyclo)alkylène, linéaire ou ramifié, substitué ou non, un arylène, un arylalkylène, les radicaux aromatiques étant éventuellement des polycondensats, les alkylènes ayant un nombre de carbone supérieur ou égal à 4 et, de préférence, compris entre 4 et 12,
• R2 correspond à des radicaux, identiques ou différents - de préférence identiques - et sélectionnés parmi l'hydrogène et/ou les restes alkyles ayant, avantageusement, de 1 à 6 carbones,
• X représente :
* soit X1 = OH, OM, OR4 avec M choisi parmi les métaux, de préférence les métaux alcalins et alcalino-terreux et R4 représentant un alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, * soit X2 =
— N— R3— NR5R6
avec R2, R3 tels que définis ci-dessus et R5, R6 identiques ou différents et répondant à la même définition que celle donnée ci-dessus pour R2,
• Y représente : * soit Y1 = hydrogène,
* soit Y2 =
— C -R -C -OZ Il II
O O avec R1 tel que défini supra et Z correspondant à l'hydrogène, à M1 ayant la même définition que M ou à R4, avec les conditions suivantes :
-a- . si X ≈ X1, alors Y = Y1 ou Y2, -b- si X = X2, alors Y = Y2, • et enfin p compris entre 1 et 4, de préférence entre 1 et 3, — » et en ce que l'on obtient des monomères A et B.
2 - Enzyme ayant une activité amidase, caractérisée - © — » en ce qu'elle est active, notamment vis-à-vis de substrats de type (poly)amide et répondant à la formule suivante :
Figure imgf000026_0001
dans laquelle :
•_ A, B sont des motifs monomères,
• R1, R3 sont des radicaux divalents, identiques ou différents - de préférence différents - et représentant un (cyclo)alkylène, linéaire ou ramifié, substitué ou non, un arylène, un arylalkylène, les radicaux aromatiques étant éventuellement des polycondensats, les alkylènes ayant un nombre de carbone supérieur ou égal à 4 et, de préférence, compris entre 4 et 12,
• R2 correspond à des radicaux, identiques ou différents - de préférence identiques - et sélectionnés parmi l'hydrogène et/ou les restes alkyles ayant, avantageusement, de 1 à 6 carbones,
• X représente :
* soit X1 ≈ OH, OM, OR4 avec M choisi parmi les métaux, de préférence les métaux alcalins et alcalino-terreux et R4 représentant un alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 6 atomes de carbone,
* soit X2 =
— N— R— NR5R6
avec R2, R3 tels que définis ci-dessus et R5, R6 identiques ou différents et répondant à la même définition que celle donnée ci-dessus pour R2, « Y représente :
* soit Y1 = hydrogène,
* soit Y2 =
— C -R -C -OZ II II
O O avec R1 tel que défini supra et Z correspondant à l'hydrogène, à M1 ayant la même définition que M ou à R4, avec les conditions suivantes : -a- si X = X1, alors Y = Y' ou Y2, -b- si X = X2, alors Y = Y2,
• et enfin p compris entre 1 et 4, de préférence entre 1 et 3,
- © -> et en ce qu'elle est apte à transformer les susdits substrats (I) en monomères A, d'une part, et en monomères B, d'autre part. 3 - Enzyme, en particulier selon la revendication 2, ayant une activité amidase, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence peptidique telle que représentée sur la SEQ ID NO : 1 annexée, ou une séquence peptidique homologue présentant au moins 80 %, de préférence au moins 90 % et plus préférentiellement encore au moins 95 % d'homologie avec SEQ ID NO : 1. 4 - Enzyme selon la revendication 2 ou 3, ayant une activité amidase, en particulier, vis-à-vis de substrats de type (poly)amide et répondant à la formule (H) suivante :
Figure imgf000027_0001
dans laquelle :
* R2, R3 sont tels que définis ci-dessus, * U et V répondent respectivement aux mêmes définitions que celles données supra pour X1 et Y1 dans la légende de la formule (I), donnée dans la revendication 1,
* et q = 1 à 8.
5 - Enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est apte à hydrolyser des substrats (I) et (H), comprenant au moins une extrémité carboxyle. 6 - Enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée :
- en ce qu'elle est active vis-à-vis d'un substrat (I) formé par un tétramère de type ABAB,
- et en ce qu'elle est apte à transformer ce substrat en trimère ABA + A, avec une activité enzymatique spécifique (Us) - exprimée en μmoles de ABAB hydrolyse. h"1. mg*1 et mesurée dans des conditions données - supérieure ou égale à 1 000.
7 - Enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée :
- en ce qu'elle est active vis-à-vis d'un substrat (I) formé par un trimère ABA,
- et en ce qu'elle est apte à transformer ce trimère en un dimère AB et un monomère A, avec une activité enzymatique spécifique (Us) - exprimée en μmoles de AB hydrolysé/h.mg d'enzyme et mesurée dans des conditions données - supérieure ou égale à 1 000.
8 - Enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée : - en ce qu'elle est active vis-à-vis d'un substrat (I) formé par un dimère de type AB,
- et en ce qu'elle est apte à transformer ce dimère en deux monomères A et B, avec une activité enzymatique spécifique (Us) - exprimée en μmoles de AB hydrolysé/h.mg d'enzyme et mesurée dans des conditions données - supérieure ou égale à 1 500.
9 - Enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle est produite par des micro-organismes du type Comamonas acidovorans (N 12), de préférence du type de la souche référencée et déposée dans la collection Nationale de Cultures de Micro-organismes sous le n° I 1522 le 4 janvier 1995 et/ou par leurs recombinants.
10 - Micro-organisme, caractérisé en ce qu'il est apte à produire l'enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
11 - Micro-organisme selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est constitué par Comamonas acidovorans, de préférence par la souche référencée et déposée à la
Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes - Institut Pasteur PARIS - sous le n° I 1522 le 4 janvier 1995 ou par des recombinants de celle-ci.
12 - Séquence d'ADN codant pour une enzyme ayant une activité amidase, caractérisé en ce qu'elle est choisie parmi la liste des séquences suivantes : Δ la séquence d'ADN, telle que représentée par SEQ ID NO : 2 dans la liste de séquence annexée et codant pour au moins une enzyme ayant une activité amidase, Δ un analogue de cette séquence résultant de la dégénérescence du code génétique, Δ une séquence d'ADN hybridant avec la susdite susdite séquence ou avec au moins un fragment de celle-ci et codant pour une enzyme ayant une activité amidase.
13 - Enzymes résultant de l'expression de la susdite séquence d'ADN selon la revendication 12. 14 - Microorganisme caractérisé en ce qu'il contient au moins une cassette d'expression comprenant la séquence d'ADN selon la revendication 12, et éventuellement, en amont de celle-ci au moins une séquence promotrice et au moins un site de fixation des ribosomes.
15 - Procédé d'hydrolyse de substrats, au moins en partie formés par ceux (I) et/ou (ET), tels que définis dans les revendications 1-2 et la revendication 3 respectivement, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en oeuvre au moins une enzyme selon l'une quelconque des revendications 2 à 9 et 13 et/ou au moins un micro-organisme selon l'une des revendications 10, 11 ou 14. 16 - Procédé d'hydrolyse de substrats, au moins en partie constitués par des oligomères de DPn inférieur à 40, de préférence à 20 et, plus préférentiellement encore, à 12 et dérivant de polyamides au moins issus de polycondensation entre des monomères diacide (A) et diamine (B), tels que définis dans les revendications 1 et 2, caractérisé :
- en ce qu'il conduit à des oligomères de degré de polymérisation (DPn) inférieur ou égal à 3 et, de préférence, à des monomères A et B,
- et en ce que l'on met en oeuvre :
• au moins une enzyme selon l'une quelconque des revendications 2 à 9 et 13 et/ou au moins un micro-organisme selon l'une des revendications 10, 11 ou 14,
• et au moins un autre type d'enzyme et/ou à au moins l'un de ses précurseurs biologiques sauvages et/ou recombinants, ladite enzyme étant :
* une enzyme E3 produite sous l'égide du gène nyl-c de Flavobacterium sp K 172,
* et/ou une enzyme dénommée PAM I, telle que celle définie par la SEQ ID NO : 3 annexée, une telle enzyme pouvant, entre autres, être celle produite sous l'égide du micro-organisme référencé et déposé dans la Collection National de Cultures de Micro-organismes - Institut Pasteur PARIS - sous le n° 1 1495, le 29 novembre 1994.
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