JPH10510436A

JPH10510436A - ポリアミドを加水分解するアミダーゼ活性を有する酵素および微生物

Info

Publication number: JPH10510436A
Application number: JP9506360A
Authority: JP
Inventors: クルーゼ，ジョエル; フォーシェ，ディディエ; ファーブルビュル，オリビエ; ジュールダ，カトリーヌ; ペートル，ドミニク; ピエラール，ジェローム; ティボー，ドニ; ギトン，カロル
Original assignee: ローヌプーランフィーブルエポリメールソシエテアノニム
Priority date: 1995-07-18
Filing date: 1996-07-17
Publication date: 1998-10-13
Anticipated expiration: 2016-07-17
Also published as: EP0839188A1; US6180388B1; JP3205344B2; FR2736928A1; CN1193348A; AU6618896A; BR9611086A; FR2736928B1; WO1997004083A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、６，６ポリアミドを酵素的加水分解してアジピン酸モノマー及びヘキサメチレンジアミンモノマーを得る方法に関する。本発明は更に、特に６，６ポリアミド及び／又は６ポリアミドに由来するオリゴマー型基質に対してアミダーゼ活性を有する酵素に関する。該酵素は、配列番号１に対応するペプチド配列及び／又はその配列に対して相同性を有するポリペプチド少なくとも一つからなることを特徴とする。本発明は更に酵素をコードするＤＮＡ；その生物学的前駆体；酵素を産生することのできる微生物；及び、酵素及び／又は微生物を用いて加水分解する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ポリアミドを加水分解するアミダーゼ活性を有する酵素および微生物技術分野本発明は概括的にはアミド、特に２次アミドの酵素的加水分解に関する。より詳しくは、本発明は６，６型ポリアミド基質を酵素的加水分解し、２個のコモノマーＡ及びＢを得る方法に関する。本発明は更に、好ましくは少なくとも一個のアミド基を含む基質、例えばポリアミド（ＰＡ）上で、アミド基を酵素的加水分解するのに用いることのできる酵素及び／又は微生物に関する。本発明は更にこれらの酵素を発現する遺伝子ツールに関する。先行技術本発明の分野においては、炭素１４で標識付けしたポリアミド６６をパパイン、トリプシン及びα−キモトリプシン型の酵素と接触させることをSMITH R.他が「Journal of Biomedical Materials Research(1987),vol.21,p.991-1003」に開示している。これら公知のポリペプチドはポリアミド６６を僅かに分解するが、この程度の加水分解では工業規模での利用には不十分である。更に、KINOSHITA他の文献（Eur.J.Biochem.116，547-551，1981）により、フラボバクテリウム（Flabovacterium）ＫＩ７２株は、６−アミノヘキサン酸の環状ダイマーを同じ酸の線状ダイマーに加水分解する触媒反応を有する第一の酵素（Ｅ₁）及びこの線状ダイマーを２分子の６−アミノヘキサン酸又はアミノカプロン酸に変換する第二の酵素（Ｅ₂）を産生することが知られている。この酵素反応の経路は以下のように要約される。線状分子分解アミダーゼＥ₂の活性はダイマーに対して最適であり、重合化の程度が高まるにつれて活性は減少し、重合化程度（ＤＰｎ）が７を超えるオリゴマーでは活性は有為でなくなる。ＤＰｎ≧３（ＰＡ６）である６−アミノヘキサン酸の環状及び線状オリゴマーに対して活性を有する酵素Ｅ₃の存在も知られている。Ｅ₃はNEGORO他により、「J ournal of Bacteriology,Dec.1992,vol.174,no.24,p.7948-7953」に記載されている。Ｅ₃もフラボバクテリウムＫＩ７２株に由来する。「Journal of Bacteriology,June 1989,p.3187-3191,vol.171 no.6」において、T SUCHIYA他はフラボバクテリウムＫＩ７２株に由来する酵素Ｅ₁とシュードモナス（Pseudomonas）ＮＫ８７株に由来する酵素の１つとの間に高度の相同性があることを示唆している。酵素Ｅ₁及びその相同体、並びに酵素Ｅ₂、特に後者は、式 ―CO−[NH―(CH₂)₅−CO]n−NH― （２≦ｎ≦２０）で表わされるオリゴマー又はポリアミド（ＰＡ６）に対して活性を有すると言われている。フラボバクテリウム又はシュードモナス由来のこれら酵素の欠点は、オリゴマーに対する特異的活性が比較的に低く、トリマーからなる基質から産生されるアミノカプロン酸の量は、１分間に１ｍｇの蛋白質あたり、せいぜい１．０５ミクロモルに過ぎない。更に、これらの酵素はホモオリゴマーに対して特異的である。従って、高い遂行性があり、実現可能であり、特に二次アミドを含む様々なアミド、特にコオリゴマー及び／又はホモオリゴマー型アミドに適用できるようなアミド基の酵素的加水分解方法を従来技術は包含していないことは明らかである。本発明の開示長期にわたる研究に努力を注いだ結果、本発明者らは１個以上のポリペプチド、特に同遺伝子個体群（biotype）から単離した新規な微生物及び／又は天然の微生物を用いて得た新規な組換え微生物に由来するポリペプチドからなるアミダーゼ型の新規な酵素を単離・解析することに成功した。従って、本発明は第一に酵素的加水分解方法に関し、第二に酵素に関する。本発明による（ポリ）アミドの加水分解方法は以下の特徴を有する。酵素的加水分解は、下記式（Ｉ）で表わされる（ポリ）アミドからなる基質について行われ、（ここで、Ａ及びＢはモノマー単位であり、Ｒ¹及びＲ³は同一又は異なる、好ましくは異なる２価の基であり、置換又は非置換で線状又は分枝状の（環状）アルキレン、アリレン又はアリルアルキレンであり、芳香基が重縮合してもよく、アルキレンの炭素数は４以上、好ましくは４から１２であり、Ｒ²は水素及びアルキル基、好ましくは炭素数１から６のアルキル基からなる群から選ばれる、同一又は異なる、好ましくは同一の基であり、ＸはＸ¹又はＸ²のいずれかであり、Ｘ¹はＯＨ、ＯＭ又はＯＲ⁴（ここでＭは金属、好ましくはアルカリ金属及びアルカリ土類金属であり、Ｒ⁴は炭素数１から６の線状又は分枝状アルキルである）であり、Ｘ²は（ここでＲ²及びＲ³は上で定義した通りであり、Ｒ⁵及びＲ⁶はＲ²の定義と同様で、同一又は異なる）であり、ＹはＹ¹又はＹ²のいずれかであり、Ｙ¹は水素であり、Ｙ²は（ここでＲ¹は上で定義した通りであり、Ｚは水素、上で定義したＭと同様のＭ¹ 又はＲ⁴）であり、ＸとＹは下記の条件 −ａ− Ｘ＝Ｘ¹のとき、Ｙ＝Ｙ¹又はＹ² −ｂ− Ｘ＝Ｘ²のとき、Ｙ＝Ｙ² を満たし、ｐは１から４、好ましくは１から３である）；上記した基質（Ｉ）をモノマーＡとモノマーＢに変換することができる。本発明は更に、（とりわけ）上で定義した方法に用いることのできる、アミダーゼ型酵素群に関する。本発明の酵素群に属する酵素は以下の特徴を有するアミダーゼである。（１）下記式によって表わされる（ポリ）アミド型基質に対して特に活性を有する。（ここで、Ａ及びＢはモノマー単位であり、Ｒ¹及びＲ³は同一又は異なる、好ましくは異なる２価の基であり、置換又は非置換で線状又は分枝状の（環状）アルキレン、アリレン又はアリルアルキレンであり、芳香基が重縮合してもよく、アルキレンの炭素数は４以上、好ましくは４から１２であり、Ｒ²は水素及びアルキル基、好ましくは炭素数１から６のアルキル基からなる群から選ばれる、同一又は異なる、好ましくは同一の基であり、ＸはＸ¹又はＸ²のいずれかであり、Ｘ¹はＯＨ、ＯＭ又はＯＲ⁴（ここでＭは金属、好ましくはアルカリ金属及びアルカリ土類金属であり、Ｒ⁴は炭素数１から６の線状又は分枝状アルキルである）であり、Ｘ²は（ここでＲ²及びＲ³は上で定義した通りであり、Ｒ⁵及びＲ⁶はＲ²の定義と同様で、同一又は異なる）であり、ＹはＹ¹又はＹ²のいずれかであり、Ｙ¹は水素であり、Ｙ²は（ここでＲ¹は上で定義した通りであり、Ｚは水素、上で定義したＭと同様のＭ¹ 又はＲ⁴）であり、ＸとＹは下記の条件 −ａ− Ｘ＝Ｘ¹のとき、Ｙ＝Ｙ¹又はＹ² −ｂ− Ｘ＝Ｘ²のとき、Ｙ＝Ｙ² を満たし、ｐは１から４、好ましくは１から３である）；（２）上記した基質（Ｉ）をモノマーＡとモノマーＢに変換することができる。本発明による酵素群の中から、配列番号１に示されるペプチド配列、又は配列番号１に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する相同ペプチド配列を包含する、アミダーゼ活性を有する酵素を単離するのが有利である。本発明の有利な特徴によれば、この酵素は特に下記式（ＩＩ）に示される（ポリ）アミド型基質に対してアミダーゼ活性を有する。ここで、Ｒ²及びＲ³は上で定義した通りであり、Ｕ及びＶはそれぞれ請求項１に示した式（Ｉ）中のＸ¹及びＹ¹と同様の定義であり、ｑは１から８である。本発明は元来、酵素を産生する野生型株、Comamonas acidovorans Ｎ１２の単離から得られたものである。この野生型株の同定は、長期にわたる煩雑なスクリーニングの結果得られた。この同定は、形態、培養、生化学及び抗原性における特性に基づいて、微生物分類の公式国際基準を参照に行った。本発明の有利な点は、この野生型株の単離のみならず、上で定義したアミダーゼの単離にもある。微生物Comamonas acidovorans Ｎ１２はこのアミダーゼの唯一の生物学的前駆体ではない。実際には、同様の酵素活性を有するあらゆる組換え微生物及び野生型株について考慮する必要がある。組換え微生物は、本発明の対象となるアミダーゼをコードするＤＮＡ配列をゲノム内に有する。他の態様によると、本発明は更に、上記した酵素及び／又は上記した野生型株微生物及び／又は少なくとも１つの上記した組換え微生物を用いる酵素的加水分解の方法に関する。本発明によれは、酵素基質及び／又はその生化学的前駆体（微生物／組換え微生物）はポリアミドであり、より詳しくは、繰り返し重合基が２次アミド基−ＣＯ−ＮＨ−であるオリゴマーである。これらのオリゴマーは式（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）で示される繰り返し単位を有する。繰り返し単位（Ｉ）は２つのモノマーＡ及びＢからなる。これらはそれぞれジカルボニル単位及びジアミン単位であり、２次アミン基によって結合している。本発明の一つの好ましい態様にあっては、モノマーＡは残基（ここでｒは４から１２、好ましくは４である）であり、モノマーＢは残基 ―HN―(CH₂)_s―NH― （ここでｓは４から１２、好ましくは６である）である。それゆえ、基質（Ｉ）として好ましいダイマーの例としては、からなるものである。これに相当するポリアミドはＰＡ６，６である。一方、繰り返し単位（ＩＩ）は好ましくはａ−ｃ−ｂで示されるモノマー単位からなり、ここでｃはアミノ酸型の骨格であり、両端のａ及びｂはそれぞれカルボキシル基及びアミノ基である。ａ−ｃ−ｂの典型的な例はポリアミド６（ＰＡ６）のモノマーであるε−アミノカプロン酸の誘導体である。下記のものを、本発明に適したポリアミド型のオリゴマーとして挙げることができる。炭素数６−１２の飽和脂肪族カルボキシル二酸と炭素数６−１２の飽和脂肪族１次ジアミンとの重縮合により得られるポリアミドオリゴマー；炭素数４−１２の炭化水素鎖を含むω−アミノアルカン酸の直接ホモ重縮合により得られる、又はこれらの酸に由来するラクタムの加水分解開裂及び重合により得られるポリアミノ酸；上記ポリアミドの出発モノマーから得たコポリアミドオリゴマー（これらのコポリアミドの酸部分が、部分的にテレフタル酸及び／又はイソフタル酸などの芳香酸であってもよい）；及びこれらのポリアミドオリゴマーの混合物。二酸とジアミンの重縮合によって得られるポリアミドの例として、下記のものを挙げることができる。ポリアミド４，６(テトラメチレンジアミンとアジピン酸の重合体)、ポリアミド６，６(ヘキサメチレンジアミンとアジピン酸の重合体)(ＰＡ６．６)、ポリアミド６，９(ヘキサメチレンジアミンとアゼライン酸の重合体)、ポリアミド６，１０(ヘキサメチレンジアミンとセバシン酸の重合体)、及びポリアミド６，１２(ヘキサメチレンジアミンとドデカン二酸の重合体)。適当なポリアミノ酸として、下記のものを挙げることができる。ポリアミド４(４−アミノブタン酸とγ−ブチロラクタムの重合体)、ポリアミド５(５−アミノペンタン酸とδ−アミロラクタムの重合体)、ポリアミド６(ε−カプロラクタムの重合体)、ポリアミド７(７−アミノヘプタン酸の重合体)、ポリアミド８(カプリルラクタムの重合体)、ポリアミド９(９−アミノノナン酸の重合体)、ポリアミド１０(１０−アミノデカン酸の重合体)、ポリアミド１１(１１−アミノアンデカン酸の重合体)、及びポリアミド１２(１２−アミノドデカン酸とラウロラクタムの重合体)。コポリアミドとして、以下のものを挙げることができる。ポリアミド６，６／６，１０(ヘキサメチレンジアミン、アジピン酸及びセバシン酸の共重合体)、及びポリアミド６，６／６(ヘキサメチレンジアミン、アジピン酸及びカプロラクタムの共重合体)。制限を付けずに言うと、本発明で好ましい基質は、二酸ＡとジアミンＢの重縮合によって得られるポリアミドオリゴマー、特にＰＡ６．６のオリゴマーである。本発明における基質（Ｉ）及び（ＩＩ）中にそれぞれ含まれるモノマーＡ・Ｂ、ａ−ｂ−ｃの数は、有利には２から８、好ましくは２から６である。オリゴマー又はポリマー分子中のモノマーＡ・Ｂの個数を、本開示においてＤＰｎと称する。特徴的な基質（Ｉ）の例としてはＡＢ，ＡＢＡ及びＡＢＡＢなどの水溶性オリゴマーが挙げられる。オリゴマー又はポリマー分子中のモノマーＡ・Ｂの個数を、本開示においてＤＰｎと称する。これらの特殊な基質は基質（Ｉ）及び（ＩＩ）に含まれ、カルボキシル末端基を少なくとも１個有するため本発明の酵素及び／又はその生物学的前駆体によって加水分解される。酵素的基質がモノマーＡ・Ｂを含むオリゴマーである場合、加水分解の最終産物はモノマーＡ・Ｂとなりうる。基質がオリゴマー（ＩＩ）（モノマーａ−ｃ−ｂ）である場合、加水分解の最終産物はモノマーａ−ｃ−ｂとなりうる。本発明の酵素は、上記した基質のいくつかに対する活性及び／又は親和性によっても特徴付けられる。従って、第一の有利な特徴によれば、対象となるアミダーゼは：第一に、テトラマーＡ・Ｂにより形成される基質（Ｉ）（ＤＰｎ＝４，すなわちｐ＝２、Ｘ＝Ｘ¹及びＹ＝Ｙ¹）に対して活性を有し、第二に、特異的な酵素活性（Ｕ_E）の値が１，０００以上でこの基質をＤＰｎ＝３のオリゴマー及びモノマーＡに変換することができる[酵素活性は蛋白質１ｍｇにつき１時間に加水分解された基質の量、すなわちＡＢＡＢｘｈ^-1ｘｍｇ^-1 （単位：μｍｏl）で表わされ、所与の条件下で測定する]。第二の有利な特徴によれば、このアミダーゼは、トリマーＡＢＡにより構成される基質（Ｉ）に対して活性を有し、特異的な酵素活性の値（加水分解された基質ｘｈ^-1ｘｍｇ^-1）が１，０００μｍｏｌ以上で、このトリマーをモノマーＡ及びダイマーＡＢに変換することができる。第三の有利な特徴によれば、このアミダーゼは、ダイマーＡＢにより構成される基質（Ｉ）に対して活性を有し、特異的な酵素活性の値（加水分解された基質ｘｈ^-1ｘｍｇ^-1）が１，５００μｍｏｌ以上で、このダイマーをモノマーＡ及びＢに変換することができる。精製したアミダーゼの酵素活性の測定はリン酸緩衝液、ｐＨ６−８及び３０℃ の条件で行われる。本発明のアミダーゼ酵素は上記三つの特徴のうち少なくとも一つの特徴を有する。上で示したように、加水分解における本発明の酵素の使用は、酵素のみ又は酵素それ自体と酵素を産生する生物学的前駆体（野生型又は組換え微生物）との混合物を用いることからなる。酵素の産生については、本発明の酵素が、Comoamonas acidoborans(Ｎ１２)、好ましくはCollection Nationale de Cultures de Microorganismes−Institut Pasterur PARISに、Ｎｏ．Ｉ１５２２として１９９５年１月４日に寄託された株と同じタイプのもの及び／又は上記した組換え微生物により産生される、ということにも注目すべきである。本発明は更に、上で定義したアミダーゼ酵素を産生することのできる新規な微生物に関する。従って、少なくとも１個のアミド基、特にオリゴマーを包含するポリアミド化合物のアミド基を加水分解する能力がこれらの微生物の特殊な特徴である。より詳しくは、これら微生物は上で定義した基質（Ｉ）及び（ＩＩ）に対して特異な選択性及び加水分解活性を有する。基質（Ｉ）の場合、オリゴマーは例えばとりわけＡＢＡＢ及び／又はＡＢＡ及び／又はＡＢのような上記した水溶性オリゴマーである。より詳しくは、これらの微生物は好ましくは上記したComoamonas acidovorans からなり、より好ましくは上記したCollection Nationale de Cultures de Micr oorganismes−Institut Pasterur PARISに、Ｎｏ．Ｉ１５２２として１９９５年１月４日に寄託されたもの、又は上記したように、その組換え微生物である。本発明による微生物は、ポリアミドオリゴマー、より詳しくはダイマーＡＢ（２個のモノマーＡ及びＢに変換される）により構成される基質を少なくとも一つ加水分解することができる。上記したアミダーゼの生物学的前駆体に加え、本発明は更に、組換え又は非組換え微生物を用いて合成できる遺伝物質に関する。従って、本発明は、以下の配列から選ばれることを特徴とする、アミダーゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡに関する。配列リストの配列番号２により表わされ、アミダーゼ活性を有する酵素を少なくとも一つコードするＤＮＡ配列、遺伝子コードの変性に由来する、この配列の類似体、上記の配列又はその断片の少なくとも一つとハイブリダイズし、アミダーゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列。上記のＤＮＡ配列の発現により得られる酵素も本発明の範囲に含まれる。野生型微生物（例えばＩ１５２２）及び本出願者により単離された組換え微生物はそれぞれ上記した配列番号２のＤＮＡ配列を包含する発現カセットを少なくとも１個含有するが、さらに、上流に少なくとも１個のプロモーター及び少なくとも１個のリボソーム結合部位を有していてもよい。本発明は更に、上で定義した基質（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）で少なくとも一部分が構成される基質を加水分解する方法に関し、上述した酵素のうち少なくとも１個及び／又は微生物のうち少なくとも１個からなることを特徴とする。本発明によると、相補的なスペクトルを有する複数の酵素を準備するのが有利である。従って、上記した方法の改変の一つとしては、少なくとも一つの他型の酵素及び／又は少なくとも一つの野生型酵素及び／又は組換え生物学的前駆体を用いるものが挙げられる。この改変の基質は、少なくともＤＰｎが４０未満、好ましくは２０、より好ましくは１２であり、二酸モノマー（Ａ）及びジアミンモノマー（Ｂ）の重縮合から少なくとも得たポリアミドに由来するオリゴマーの部分からなる。この改変による加水分解の方法は、以下のことを特徴とする。まず、重合度（ＤＰｎ）が３以下のオリゴマーを産生し、好ましくはモノマーＡ及びＢを産生する。次に、下記のものを用いる。上で定義した少なくとも一つの酵素及び／又は少なくとも一つの微生物；少なくとも一つの他型の酵素及び／又は少なくとも一つの野生型及び／又は組換え生物学的前駆体。ここで、酵素は、フラボバクテリウムＫＩ７２株のｎｙｌ−ｃ遺伝子の制御下で産生した酵素Ｅ₃、及び／又は配列番号３のペプチド配列により定義される、ＰＡＭＩと呼ばれる酵素(このような酵素はとりわけ、Collection Nationale de Cultures de M icroorganismes−Institut Pasterur PARISに、Ｎｏ．Ｉ１４９５として１９９４年１１月２９日に寄託された微生物によって産生することができる)。上記の酵素によって加水分解されたオリゴマーはアミド型基の加熱及び／又は化学(酸)分解によって得ることができる。本発明の方法の他に有利な改変では、酵素の生物学的前駆体及び例えば下記の材料を包含する培養基を用いる。好ましくは、アミド基を少なくとも１個含有する化合物を少なくとも１個包含する炭素源であって、炭水化物、特に好ましくはスクロースから選ばれる補体を更に包含してもよい炭素源；さらに、生物学的前駆体を消費すること無く酵素産生を促進することのできる化合物であって、好ましくはアミドから選ばれる化合物を加えてもよい。本発明によるアミドの酵素的加水分解方法には、多くの適用が考えられる。例えば、アミド化合物から他の化合物を製造する有機合成において用いることや、ポリアミドを含有する材料を処理する有機合成において用いることが挙げられる。特に、ポリアミド重合体の出発原料の再生工程に有用である。以下に実施例を挙げて本発明の特徴、改変や長所を例証するが、本発明の範囲を制限するものではない。図の説明配列リストはＷIＰＯ規格ＳＴ２３に拠る。配列番号１は本発明の酵素ＰＡＭＩＩに対応するアミノ酸配列である。配列番号２はアミダーゼＰＡＭＩＩをコードするＤＮＡ（ｐａｍＩＩ）である。配列番号３はＰＡＭＩに対応するアミノ酸配列である。配列番号４は酵素ＰＡＭＩをコードするＤＮＡである。図１は、アミダーゼＰＡＭＩをコードする遺伝子（ｐａｍＩ）を含有するプラスミドｐＸＬ２２９７の制限酵素地図である。図２は、アミダーゼＰＡＭＩをコードする遺伝子（ｐａｍＩ）を含有するプラスミドｐＸＬ２５６４の制限酵素地図である。実施例実施例１：Comoamonas acidovorans Ｎ１２野生型株の単離及び同定１．１微生物学的スクリーニング大量の微生物学的スクリーニングを行い、様々な同遺伝子個体群からComoamon as acidovorans Ｎ１２を集めた。１．２微生物の選択及び同定この微生物を、ＰＡ６．６の合成オリゴマーについてのアミダーゼ活性テストを用いて選択した。活性の評価の詳細を下に記す。選択した微生物を、形態、生理、生化学及び抗原性の特徴に基づいて、Bacter iology Laboratory of the INSTITUT PASTEURの公知の方法を用いて同定した。これらの結果並びにオリゴマーＡＢ、ＡＢＡ、ＢＡＢ及びＡＢＡＢの混合物に対する加水分解活性に基づいて、選択した天然株について更なる特徴付けを行った。実施例２：Comoamonas acidovorans Ｎ１２の詳細にわたる特徴づけ２．１培養条件の最適化下記成分の最適培養基Ｍ９ＹＥ３を用意した。 KH₂PO₄ 0.75ｇ／ｌ K₂HPO₄・3H₂O 1.00ｇ／ｌ Na₂HPO₄・12H₂O 1.00ｇ／ｌ (NH₄)₂SO₄ 2.50ｇ／ｌ酵母エキス 3.00ｇ／ｌ MgSO₄・7H₂O 1.00ｇ／ｌ FeSO₄・7H₂O 2.30ｇ／ｌ MnSO₄・7H₂O 2.70ｇ／ｌ CoCl₂・2H₂O 2.30ｇ／ｌ CaCl₂・2H₂O 1.50ｇ／ｌ CuSO₄・5H₂O 0.25ｇ／ｌ _PH 7.2 更に、アジビン酸塩１０ｇ／ｌを追加した。培養を、エルレンマイアーフラスコ内にフラスコ全容量の５分の１の量だけ用意した。培養基を３０℃でインキュベートし、１５０ｒｐｍで攪拌した。Ｍ９ＹＥ３寒天培養基及びアミド基（例えばＰＡ６．６のペンタマーからデカマーのオリゴマー等）を含有する化合物５ｇ／ｌを含有するペトリ皿に由来するコロニーを、１０ｍｌのＬＢ培養基（トリプトン：１０ｇ／ｌ、酵母エキス：５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ：１０ｇ／ｌ）に植え、準備培養とした。この培養を最適培養基に１％（ｖ／ｖ）で植えた。培養が成熟したら、遠心分離（１２，０００ｇで１０分間）して細胞片を得て、１０５℃で一晩乾燥し、得られた乾燥抽出を用いて細胞産生量を決定した。加水分解の効率を最大にするため、アミド基を少なくとも１個含有する化合物を培養基に加えた。本発明の他に好ましい特徴によれば、炭素源が、炭水化物、特にスクロースから選ばれる補体を、可溶性の成分と共に含有しているのが好ましい。加水分解の効率を最大にするため、アミド基を少なくとも１個含有する化合物を培養基に加えた。２．２酵素的加水分解−野生型微生物の活性の測定ｐＨ７．５、最終体積１ｍlのリン酸緩衝液１０．５ｍｍｏｌ／ｌ中、２８℃ で活性を測定した。得られた結果を表１に示す。実施例３：Comoamonas acidovorans Ｎ１２のポリアミド加水分解酵素の精製標準プロトコル：酵素（ＰＡＭＩＩ）の活性を、ＡＢＡＢからＢＡＢ＋Ａへの加水分解活性を調べることによってモニターした。３．１用語ＤＴＥ＝１，４−ジチオエリトリトールＥＤＴＡ酸＝エチレンジアミン四酢酸ＣＨＡＰＳ＝３−［(３−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ］プロパン−１−スルホン酸ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム３．２酵素的抽出物の調製出発原料は、実施例２で述べたＭ９ＹＥ３を５００ｍｌ含み、更にアジピン酸塩１０ｇ／ｌを迫加した２．５Ｌフラスコ内で２０時間培養したものに由来する細胞からなる。超音波処理による第一の抽出２５ｇのComoamonas acidovorans細胞を、１ｍＭＤＴＥ、５ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＫＣｌ及び１５％ｖ／ｖのグリセロルを含有する、ｐＨ７．５の１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液７５ｍｌ中に再懸濁した。懸濁液について、氷水中で不連続超音波処理(１０％処理、９０％非処理)を７０分間行った。この懸濁液を５０，０００ｇで１時間３０分間遠心分離した(ベックマン超遠心分離器使用)。これにより以下のものが得られた。まず、２１ｍｇ／ｍｌの蛋白質、すなわち６μｍｏｌ／ｈ／ｍｇ（計１１，３４０ユニット）の特異的活性を有する１，８９０ｍｇの蛋白質を含有する上澄み（Ｓ１）９０ｍｌ；及び２ｍＭＤＴＥ、８ｍＭＣＨＡＰＳ及び１５％ｖ／ｖのグリセロルを含有する、ｐＨ８の２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液３０ｍｌ中に再懸濁した残さ(Ｃ１)。ポリアミダーゼＩＩ活性を有するこの残さを更に処理した。ここで、グリセロルを含まないが他は同じ成分の緩衝液を用いた上澄み９０ｍｌから塩を除去し、超遠心分離を行った後に、明らかに第一の遠心沈殿に可溶性であるポリアミダーゼＩＩを精製し、新たに微粒残さに再凝縮することができる、ということを指摘しておく。実際に、緩衝液の濃度を（グリセロルを除去することによって）減少させると、微粒子の沈降が促進される。これは、勾配に渡って活性が見られるため、例えばＭｏｎｏＱカラムを用いたクロマトグラフィーでは第一の上澄みは単離できないという事実に一致する。第一の遠心分離で得た残さの補助処理再懸濁した残さ（Ｃ１）を４，０００ｇで３０分間遠心分離し、第一の超音波処理で溶解しなかった細胞を沈降させた。上澄み（Ｓ２）を回収し、氷水中で不連続超音波処理（１０％処理、９０％非処理）を２０分間行った。これを５０，０００ｇで２時間遠心分離し、上澄み（Ｓ３）を回収した。クロマトグラフィーによる精製第１段階：上澄みＳ３を３つの画分に分け、２ｍＭＤＴＥ、８ｍＭＣＨＡＰＳ及び１５％ｖ／ｖのグリセロルを含有する、ｐＨ８の２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液で平衡させたＭｏｎｏＱＨＲ１０／１０カラム（ファルマシア）を用いてクロマトグラフィーにかけた。０から０．６ＭＮａＣｌの線形勾配で、３ｍｌ／分の速度で、６０分に渡り溶出を行った。ポリアミダーゼＩＩ活性を、０．２ＭＮａＣｌでかなり広いピークとして溶出した。活性のある画分を回収し、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ１０（Ａｍｉｃｏｎ）で５ｍｌに濃縮した。第２段階：得られた５ｍｌの濃縮物に、１ｍＭＤＴＥ、８ｍＭＣＨＡＰＳ、１．５Ｍ硫酸アンモニウム及び１５％ｖ／ｖのグリセロルを含有する、ｐＨ８の２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液５ｍｌを加えた。得られた１０ｍｌの混合物を２つの画分に分け、２ｍＭＤＴＥ、８ｍＭＣＨＡＰＳ、１Ｍ硫酸アンモニウム及び１５％ｖ／ｖのグリセロルを含有する、ｐＨ８の２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液で平衡させたＰｈｅｎｙｌｓｕｐｅｒｏｓｅＨＲ１０／１０カラム（ファルマシア）を用いてクロマトグラフィーにかけた。１から０Ｍ硫酸アンモニウムの線形勾配で、１．２５ｍｌ／分の速度で、７０分に渡り溶出を行った。ポリアミダーゼ活性を、約０．８Ｍ硫酸アンモニウムで溶出した。活性のある画分を回収し、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ１０（Ａｍｉｃｏｎ）で４００μｌに濃縮した。第３段階：得られた４００μｌの濃縮物を２つの画分に分け、２ｍＭＤＴＥ、８ｍＭＣＨＡＰＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ及び１５％ｖ／ｖのグリセロルを含有する、ｐＨ７．５の１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液で平衡させたＴＳＫＧ３０００ＳＷカラム（Sｕｐｅｌｃｏ）を用いてクロマトグラフィーにかけ、０．５ｍｌ／分の速度で溶出を行った。溶出物中、分子量約３０ｋＤａまで活性が見られた。最も活性のある画分を５ｍｌ回収し、２ｍＭＤＴＥ、８ｍＭＣＨＡＰＳ及び１５％ｖ／ｖのグリセロルを含有する、ｐＨ８の２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液で平衡させたＰＤ１０セファデックスＧ２５カラム（ファルマシア）（カラム１個あたり２．５ｍｌ）を用いて塩を除去した。第４段階：ＰＤ１０で塩を除去して得られたもの７ｍｌについて、２ｍＭＤＴＥ、８ｍＭＣＨＡＰＳ及び１５％ｖ／ｖのグリセロルを含有する、ｐＨ８の２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液で平衡させたＭｏｎｏＱＨＲ５／５カラム（ファルマシア）を用いてクロマトグラフィーにかけた。０から０．６ＭＮａＣｌの線形勾配で、１ｍｌ／分の速度で、３０分に渡り溶出を行った。ポリアミダーゼ活性を、０．１５ＭＮａＣｌでかなり広いピークとして溶出した。活性のある画分を回収し、０．０５％ＳＤＳを加えた後、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ１０及びＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１０（Ａｍｉｃｏｎ）で２００μｌに濃縮した。第５段階：得られた２００μｌの濃縮物を、４０ｍＭ硫酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８、０．２５％ｗ／ｖＳＤＳ含有）で平衡させたＴＳＫＧ３０００ＳＷカラムを用いてクロマトグラフィーにかけ、０．２５ｍｌ／分の速度で溶出を行った。電気泳動でモニターしたところ、ポリアミダーゼは狭いピークとして現れた。この物質を配列決定に用いた。電気泳動による分子量の測定ポリアミダーゼＩＩ試料の調製方法に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量は異なってくる。２．５％ＳＤＳ及び５％メルカプトエタノールの存在下では、バンドは３６− ４０ｋＤａに現れるが、９０℃で５分間加熱された場合、同じ試料は分子量約１５０ｋＤａ付近へしか移動しない。精製プロトコルに応じたこのような現象は、膜に関連した蛋白質においてよく見られる。配列決定６０ｇの細胞を用い、Ｐｈｅｎｙｌｓｕｐｅｒｏｓｅの段階を第二のＭｏｎｏＱＨＲ１０／１０の段階に置き換えたことを除いては、標準プロトコルに従って、約６０μｇのポリアミダーゼを調製した。このポリアミダーゼを、０．２５％ｗ／ｖＳＤＳの存在下、５μｇの酵素ＬｙｓＣで直接に消化した。得られた断片をＶｙｄａｃＣ１８カラムで精製した。公知のヌクレオチド配列決定法を用いて、配列番号１の配列を得た。実施例４：２次アミド結合によって連結したモノマーＡ及びＢから構成されるオリゴマーの、本発明の酵素とＰＡＭＩ加水分解酵素との混合物による酵素的加水分解本実施例では純粋な酵素を用いる代わりに、生物学的前駆体、すなわち本発明によるComoamonas acidovorans N12及び以下のプロトコルにより作成した、ｐａｍＩ遺伝子（配列番号４）を有し酵素ＰＡＭＩ（配列番号３）を産生する株を用いた。上記のものを作成した目的は、ファージλｃｌｌ遺伝子のリボソーム結合部位で始まりE.coliトリプトファンオペロンプロモーターから発現する、ｐａｍＩ遺伝子（酵素ＰＡＭＩをコードする）を得ることである。そのために、１９９４年１１月２９日にＣＮＣＭに寄託された株Ｉ１４９５に収容されたプラスミドｐＸＬ２２９７（図１参照）を鋳型としたＰＣＲ法により、ｐａｍＩ開始コドンにＮｄｅｌ制限酵素部位を作成した。Ｎｄｅｌ部位の上流に、一対のヌクレオチドプライマー（５‘−ＡＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＣＧＡＣ−３'）（５‘−ＣＡＣＣＧＧＴＧＧＧＣＣＣＣＴＣ−３'）を用いてＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入しながら、ｐａｍＩ遺伝子の５'末端を含む２０８ｂｐのＮｄｅｌ−Ａｐａｌ断片をＰＣＲにより増幅した。増幅したＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｐａｌ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａｌで消化したｐＵＣ２９［Ｂｅｎｅｓ他( １９９３)、Ｇｅｎｅ１３０：１５１−１５２］内に挿入・クローニングし、Ａｐａｌ部位にｐＸＬ２２９７の８６７ｂｐのＡｐａｌ断片を挿入してｐａｍＩ遺伝子を再構築した。従って、Ｎｃｏｌ部位はｐａｍＩ停止コドンの約３０ヌクレオチド下流に位置する。このプラスミドの、隣接する５００ｂｐのＮｄｅｌ−ＥｃｏＲＩ断片及び６００ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｎｃｏｌ断片を、トリプトファンプロモーターのすぐ下流に位置するＮｄｅｌ部位で消化したｐＸＬ２１５８（特許ＦＲ９２−０９８８２）に挿入した。得られたプラスミドｐＸＬ２５６４（図２参照）はアンピシリン耐性を与える遺伝子及びＰｔｒｐ−ＲＢＳｃｌl発現カセットの制御下にあるｐaｍＩ遺伝子を含有するｐＢＲ３２２［Ｓｕｃｌｉｆｆｅ(１９７８)、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．５：２７２１］の誘導体である。プラスミドｐＸＬ２５６４を、アンピシリンＬＢで選択したE.coliＴＧ１株に導入した。特許ＦＲ２６９４５７１に記載の手順に従って、ｐＸＬ２５６４を含むクローン（ＰＡＭＩ株と称する）を寒天皿に二度移植し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭ９グルコース培養基に３７℃で培養した。 Comoamonas acidovorans N12を、上記項２．１で記したのと同じ条件で１９時間培養した。アジピン酸（モノマーＡ）及びヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤ）（モノマーＢ）から成り、平均ＤＰｎが４であるオリゴマーを用いた。平均ＤＰｎが８であるオリゴマー２５．２５ｇを３００ｍｌの水に再懸濁した。細胞（計３．１ｇ）を含む２００ｍｌの水を加えた。混合物を窒素流下で１８時間攪拌した。溶液を遠心分離にかけ、４００ｍｌの上澄みを得た。上澄みの乾燥重量は１４ｇ／ｌであった。画分をとり、アジピン酸とＨＭＤのオリゴマーについて分析した。分析の結果を表２に示す。アジピン酸のモル産出量は６６％、ＨＭＤのモル産出量は５８％であった。モノマーとＤＰｎ４未満のオリゴマーのモル産出量は、モノマーのモル量で７２％であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ファーブルビュル，オリビエフランス国エフ69007 リヨン，リュデュペールシュブリエ，22 (72)発明者ジュールダ，カトリーヌフランス国エフ69003 リヨン，リュエティエンヌリシュラン，55 (72)発明者ペートル，ドミニクフランス国エフ69006 リヨン，リュデュケーヌ，43 (72)発明者ピエラール，ジェロームフランス国エフ69009 リヨン，リュエクトルベルリオーズ，３ (72)発明者ティボー，ドニフランス国エフ75013 パリ，リュジャンコリ，28 (72)発明者ギトン，カロルフランス国エフ69009 リヨン，シュマンデュプティモンテスュイ，23

Claims

【特許請求の範囲】１．酵素的加水分解を、下記式（Ｉ）で表わされる（ポリ）アミドからなる基質について行い、（ここで、Ａ及びＢはモノマー単位であり、Ｒ¹及びＲ³は同一又は異なる、好ましくは異なる２価の基であり、置換又は非置換で線状又は分枝状の（環状）アルキレン、アリレン又はアリルアルキレンであり、芳香基が重縮合してもよく、アルキレンの炭素数は４以上、好ましくは４から１２であり、Ｒ²は水素及びアルキル基、好ましくは炭素数１から６のアルキル基からなる群から選ばれる、同一又は異なる、好ましくは同一の基であり、ＸはＸ¹又はＸ²のいずれかであり、Ｘ¹はＯＨ、ＯＭ又はＯＲ⁴（ここでＭは金属、好ましくはアルカリ金属及びアルカリ土類金属であり、Ｒ⁴は炭素数１から６の線状又は分枝状アルキルである）であり、Ｘ²は（ここでＲ²及びＲ³は上で定義した通りであり、Ｒ⁵及びＲ⁶はＲ²の定義と同様で、同一又は異なる）であり、ＹはＹ¹又はＹ²のいずれかであり、Ｙ¹は水素であり、Ｙ²は（ここでＲ¹は上で定義した通りであり、Ｚは水素、上で定義したＭと同様のＭ¹ 又はＲ⁴）であり、ＸとＹは下記の条件 −ａ− Ｘ＝Ｘ¹のとき、Ｙ＝Ｙ¹又はＹ² −ｂ− Ｘ＝Ｘ²のとき、Ｙ＝Ｙ² を満たし、ｐは１から４、好ましくは１から３である）；モノマーＡとモノマーＢを得る（ポリ）アミドの加水分解方法。２．下記式（Ｉ）で表わされる（ポリ）アミド型の基質に対して特に活性を有し、（ここで、Ａ及びＢはモノマー単位であり、Ｒ¹及びＲ³は同一又は異なる、好ましくは異なる２価の基であり、置換又は非置換で線状又は分枝状の（環状）アルキレン、アリレン又はアリルアルキレンであり、芳香基が重縮合してもよく、アルキレンの炭素数は４以上、好ましくは４から１２であり、Ｒ²は水素及びアルキル基、好ましくは炭素数１から６のアルキル基からなる群から選ばれる、同一又は異なる、好ましくは同一の基であり、ＸはＸ¹又はＸ²のいずれかであり、Ｘ¹はＯＨ、ＯＭ又はＯＲ⁴（ここでＭは金属、好ましくはアルカリ金属及びアルカリ土類金属であり、Ｒ⁴は炭素数１から６の線状又は分枝状アルキルである）であり、Ｘ²は（ここでＲ²及びＲ³は上で定義した通りであり、Ｒ⁵及びＲ⁶はＲ²の定義と同様で、同一又は異なる）であり、ＹはＹ¹又はＹ²のいずれかであり、Ｙ¹は水素であり、Ｙ²は（ここでＲ¹は上で定義した通りであり、Ｚは水素、上で定義したＭと同様のＭ¹ 又はＲ⁴）であり、ＸとＹは下記の条件 −ａ− Ｘ＝Ｘ¹のとき、Ｙ＝Ｙ¹又はＹ² −ｂ− Ｘ＝Ｘ²のとき、Ｙ＝Ｙ² を満たし、ｐは１から４、好ましくは１から３である）；該基質（Ｉ）をモノマーＡとモノマーＢに変換することができる特徴を有するアミダーゼ活性を有する酵素。３．配列番号１に示されるペプチド配列、又は配列番号１に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する相同ペプチド配列を包含することを特徴とする、請求項２に記載のアミダーゼ活性を有する酵素。４．式（ＩＩ）に示される（ポリ）アミド型基質に対してアミダーゼ活性を有する請求項２又は３に記載の酵素。（ここで、Ｒ²及びＲ³は上で定義した通りであり、Ｕ及びＶはそれぞれ請求項１に示した式（Ｉ）中のＸ¹及びＹ¹と同様の定義であり、ｑは１から８である。）５．少なくとも１個のカルボキシル末端基を含む基質（Ｉ）及び（ＩＩ）を加水分解できることを特徴とする、請求項２から４のいずれかに記載の酵素。６．ＡＢＡＢ型のテトラマーで構成される基質（Ｉ）に対して活性を有し；特異的な酵素活性（Ｕ_E）の値が１，０００以上でこの基質をトリマーＡＢＡ及びモノマーＡに変換することができる［酵素活性は蛋白質１ｍｇにつき１時間に加水分解された基質の量、すなわちＡＢＡＢｘｈ^-1ｘｍｇ^-1（単位：μｍｏｌ）で表わされ、所与の条件下で測定する］ことを特徴とする、請求項２から５のいずれかに記載の酵素。７．ＡＢＡ型のトリマーで構成される基質（Ｉ）に対して活性を有し；特異的な酵素活性（Ｕ_E）の値が１，０００以上でこのトリマーをダイマーＡＢ及びモノマーＡに変換することができる［酵素活性は蛋白質１ｍｇにつき１時間に加水分解された基質の量、すなわちＡＢＡｘｈ^-1ｘｍｇ^-1（単位：μｍｏｌ）で表わされ、所与の条件下で測定する］ことを特徴とする、請求項２から６のいずれかに記載の酵素。８．ＡＢ型のダイマーで構成される基質（Ｉ）に対して活性を有し；特異的な酵素活性（Ｕ_E）の値が１，５００以上でこの基質をモノマーＡ及びＢに変換することができる［酵素活性は蛋白質１ｍｇにつき１時間に加水分解された基質の量、すなわちＡＢｘｈ^-1ｘｍｇ^-1（単位：μｍｏｌ）で表わされ、所与の条件下で測定する］ことを特徴とする、請求項２から７のいずれかに記載の酵素。９．微生物Comoamonas acidovorans、より好ましくはCollection Nationale de Cultures de Microorganismes−Institut Pasterur PARISに、Ｎｏ．Ｉ１５２２として１９９５年１月４日に寄託されたものと同型の株、及び／又はその組換え微生物から産生されることを特徴とする、請求項２から８のいずれかに記載の酵素。１０．請求項２から９のいずれかに記載の酵素を産生可能であることを特徴とする微生物。１１． Comoamonas acidovorans、より好ましくは上記したCollection Nationa le de Cultures de Microorganismes−Institut Pasterur PARISに、Ｎｏ．Ｉ１５２２として１９９５年１月４日に寄託されたもの、又はその組換え微生物であることを特徴とする、請求項10に記載の微生物。１２．配列リストの配列番号２により表わされ、アミダーゼ活性を有する酵素を少なくとも一つコードするＤＮＡ配列；及び遺伝子コードの変性に由来する、この配列の類似体、から選ばれることを特徴とする、アミダーゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列。１３．請求項１２に記載のＤＮＡが発現して得られる酵素。１４．請求項１２に記載のＤＮＡ配列を包含する発現カセットを少なくとも１個含有し、さらに、上流に少なくとも１個のプロモーター及び少なくとも１個のリボソーム結合部位を有していてもよいことを特徴とする微生物。１５．請求項２から９及び１３のいずれかに記載の酵素の少なくとも一つ及び／又は請求項１０、１１及び１４のいずれかに記載の微生物の少なくとも一つを用いることを特徴とする、請求項１、２及び請求項３でそれぞれ定義した基質（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）で少なくとも一部分が形成される基質の加水分解方法。１６．ＤＰｎが４０未満、好ましくは２０、より好ましくは１２であり、請求項１及び２で定義した二酸モノマー（Ａ）及びジアミンモノマー（Ｂ）の重縮合から少なくとも得たポリアミドに由来するオリゴマーの部分から少なくともなる基質を加水分解する方法であって、重合度（ＤＰｎ）が３以下のオリゴマーを産生し、好ましくはモノマーＡ及びＢを産生し；請求項２から９及び１３のいずれかに記載の酵素の少なくとも一つ及び／又は請求項１０、１１及び１４のいずれかに記載の微生物の少なくとも一つと、少なくとも一つの他型の酵素及び／又は少なくとも一つの野生型及び／又は組換え生物学的前駆体を使用し、該酵素は、フラボバクテリウムＫＩ７２株のｎｙｌ−ｃ遺伝子の制御下で産生した酵素Ｅ₃、及び／又は配列番号３のペプチド配列により定義される、ＰＡＭＩと呼ばれる酵素（このような酵素はとりわけ、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes−Institut Pasterur PARISに、Ｎｏ．Ｉ１４９５として１９９４年１１月２９日に寄託された微生物によって産生することができる）である；ことを特徴とする加水分解方法。