JPH10513366A

JPH10513366A - ポリアミドを加水分解するためのアミダーゼ活性を有する酵素及び微生物

Info

Publication number: JPH10513366A
Application number: JP9506361A
Authority: JP
Inventors: クルーゼ，ジョエル; ファーブルビュル，オリビエ; ジュールダ，カトリーヌ; ルコック，アンヌマリー; ペートル，ドミニク
Original assignee: ローヌプーランフィーブルエポリメールソシエテアノニム
Priority date: 1995-07-18
Filing date: 1996-07-17
Publication date: 1998-12-22
Also published as: FR2736927B1; FR2736927A1; CN1193347A; WO1997004084A1; US6214592B1; BR9611100A; EP0839189A1; AU6618996A

Abstract

(57)【要約】本発明は、アミダーゼ活性を持つ酵素、特にＰＡ６，６（式Ｉ）及び（又は）ＰＡ６（式II）から誘導されるオリゴマータイプの基質に対するアミダーゼ活性を持つ酵素であって、比Ｒ_a：

Description

【発明の詳細な説明】ポリアミドを加水分解するためのアミダーゼ活性を有する酵素及び微生物技術分野本発明は、一般的に、アミド、特に第二級アミドの酵素による加水分解に関する。本発明は、より正確には、アミド基［好ましくは少なくとも１個のアミド基を含有する基質｛例えばポリアミド（ＰＡ）｝上のアミド基］の酵素による加水分解に用いることができる酵素及び（又は）微生物に関する。本発明は、さらに、それらの生産における遺伝子物質並びにこの遺伝子物質を含有し且つこのアミダーゼ活性を示す微生物に関する。先行技術この分野において、スミス（SMITH R.）らは、「Journal of Biomedical Mate rials Research」（１９８７年）、第２１巻、第９９１〜１００３頁に発表された論文の著者であり、炭素１４で標識付けされたポリアミド６６のサンプルをパパイン、トリプシン及びα−キモトリプシンタイプの酵素と接触させることを開示している。これらの既知のポリペプチドはポリアミド６６を僅かに分解するが、しかしその加水分解は産業的規模で利用することができるほど充分に有意のものではない。また、フラボバクテリア種（Flavobacterium sp）KI 72は６−アミノヘキサン酸の環状二量体のこの同じ酸の線状二量体への加水分解を触媒する第一の酵素（Ｅ₁）及びこの線状二量体を６−アミノヘキサン酸又はアミノカプロン酸２分子に転化させることができる第二の酵素（Ｅ₂）を生産することができるということも、キノシタらによる論文（「Eur．J．Biochem.」、１１６、第５４７〜５５１頁、１９８１年）によって知られている。懸案の酵素経路を以下にまとめる：線状アミダーゼＥ₂の活性は、二量体については最適であるが、重合度が増すにつれて低下していき、重合度（ＤＰ_n）７のオリゴマー以上ではもはや有意ではなくなる。ツチヤらは、「Journal of Bacteriology」、第１７１巻、第６号（１９８９年６月）、第３１８７〜３１９１頁に発表された彼らの論文において、フラボバクテリア種KI 72からの酵素Ｅ₁とシュードモナス種（Pseudomonas sp）NK 87から誘導された酵素の１種との間に高度の相同性が存在すると教示している。これらの酵素Ｅ₁及び相同物並びに酵素Ｅ₂、より特定的には後者、は次式：（ここで、ｎは２〜２０の範囲である）のオリゴマー又はポリアミド（ＰＡ６）について活性であると言われている。フラボバクテリア又はシュードモナスから誘導されたこれらの酵素の欠点は、それらのオリゴマーに対する特異的活性が比較的低いということである。これらの活性は、三量体から成る基質からの蛋白質１ｍｇにつき１分当たりに製造されるアミノカプロン酸として表してせいぜい１．０５マイクロモルだけである。さらに、これらの酵素は、ホモオリゴマーについて特異的であり、コオリゴマーに対する活性は低いということがわかっている。さらに、フラボバクテリア種KI 72株は、ＰＡ６タイプの基質に対して活性なポリアミダーゼＥ₃をコードする（即ち該ポリアミダーゼＥ₃の遺伝暗号を指定する）nyl-cと称される別の遺伝子の発見に的を絞ったものだった。ネゴロらの「Journal of Bacteriology」、第１７４巻、第７９４８〜７９５３頁（１９９２年）の論文は、nyl-ｃの制御下で生産されたＥ₃に言及した文献の一つである。Ｅ₃はナイロンＰＡ６のオリゴマーと比較してナイロンＰＡ６６のオリゴマーについての特異性が比較的低いようである。結果としての比Ｒ_a：は、約２である。これらの活性は、加水分解する基質の単位使用量につき単位時間当たりに加水分解される基質の量として表わされる。懸案の基質の例は、ＰＡ６６及びＰＡ６の四量体及び三量体である。従って、先行技術は、アミド基の酵素による加水分解のための、高い性能を有し、実行可能であり且つ様々なタイプのアミド、特に第二級アミドを包含するアミド（特にコオリゴマータイプのアミド）に適用できる手段を含まないように思える。発明の開示かくして、本発明の本質的な目的の一つは、アミダーゼ活性を有する新規の酵素、それらを生産するための遺伝子物質及びこの遺伝子物質を含有する微生物を提供することであり、前記酵素及び微生物は共に、コオリゴマー及びホモオリゴマータイプの物質からのアミドの加水分解における収率が満足できるものであること並びにコオリゴマー（例えばＰＡ６６）に対する特異性が著しいものであることを特徴とする。かかる活性は、単量体、特にＰＡ６６の単量体を再生（再循環）するための産業的に価値のある方法へのアクセスを提供することができる。従って、長く労力をかけた研究の後に、本出願人は、１種以上のポリペプチドによって形成されるアミダーゼタイプの新規の酵素、特にこのバイオタイプから単離される新規の微生物及び（又は）これらの天然微生物から得られる新規の組み換え微生物から誘導することができる、１種以上のポリペプチドによって形成されるアミダーゼタイプの新規の酵素を単離し、特徴付けすることに成功した。この酵素は、そのまま又はそれらを発生させる組み換え微生物の形のいずれかで用いられる。従って、本発明は、アミダーゼ活性を有する酵素、特に次の式（Ｉ）及び（II ）の少なくとも一つを有するポリアミドタイプの基質に対するアミダーゼ活性を有する酵素に関する：｛ここで、Ａ及びＢは単量体単位であり、Ｒ¹及びＲ³は同一又は異なる、好ましくは異なる二価基であり、置換又は非置換の直鎖状又は分枝鎖状（シクロ）アルキレン、アリーレン又はアリールアルキレンを表わし、ここで、芳香族基は随意に重縮合されていてもよく、アルキレン中の炭素数は４以上、好ましくは４〜１２の範囲であり、Ｒ²は同一又は異なる、好ましくは同一の基であり、水素及び（又は）アルキル基（有利には１〜６個の炭素原子を有するアルキル基）から選択され、Ｘは次のＸ¹又はＸ²であり、Ｘ¹はＯＨ、ＯＭ又はＯＲ⁴であり、ここで、Ｍは金属、好ましくはアルカリ金属及びアルカリ土類金属から選択され、Ｒ⁴は１〜６個の炭素原子を有する直鎖状又は分枝鎖状アルキルであり、Ｘ²はであり、ここでＲ²及びＲ³は上で定義した通りであり、Ｒ⁵及びＲ⁶は同一又は異なり、Ｒ²について上で与えたものと同じ定義を有し、Ｙは次のＹ¹又はＹ²であり、Ｙ¹は水素であり、Ｙ²はであり、ここで、Ｒ¹は上で定義した通りであり、Ｚは水素、Ｍ¹（ここで、Ｍ¹ はＭと同様に定義される）又はＲ⁴であり、但し、（ａ）ＸがＸ¹である場合にはＹはＹ¹であり、（ｂ）ＸがＸ²である場合にはＹはＹ²又はＹ¹であり、ｐは１．５〜１０の範囲、好ましくは１．５〜５の範囲である｝；（ここで、Ｒ²及びＲ³は上で定義した通りであり、Ｕ及びＶはそれぞれ式（Ｉ）においてＸ¹及びＹ¹について上で与えたものと同じ定義を有し、ｑは１〜２０の範囲である）。本発明に従う酵素の一つの非常に有利な特徴は、その特異的酵素活性（Ｕ_s）が式(II)のホモオリゴマーに対するよりも式（Ｉ）のコオリゴマーに対する方がはるかに大きいという事実である。従って、PAM Iとも称される本発明に従う酵素は、比Ｒ_a：が２よりも大きい、好ましくは１０以上、特に好ましくは５０以上であることを特徴とする。比Ｒ_aにおいて、酵素活性は、用いた酵素を生産する酵素又は乾燥細胞１ｇにつき１時間当たりに加水分解される基質のモル数で表わされる。これらの活性の測定条件を以下に与える：・反応媒体＝１００ｍＭ燐酸塩緩衝液・容量＝４００マイクロリットル・温度＝３０℃ ・ｐＨ＝７・乾燥細胞の濃度＝２．５ｇ／リットル。本発明に従う酵素はまた、添付したアミノ酸配列SEQ ID NO:2によって与えられるその一次構造によっても特徴付けられる。これはまた、この配列SEQ ID NO:2との相同度が少なくとも５０％である任意のポリペプチドをも包含する。本発明に従う酵素の一次構造又は四次構造さえもが、該酵素の数多くの新規の特徴の一つを構成する。しかしながら、本発明に従う酵素は、この構造特徴に加えて、ある種の特定基質に対する活性によっても認識することができる。前記のように、この特定基質は、ポリペプチド、より正確には繰返し単位が前記の式（Ｉ）及び（又は）（II）を有するオリゴマーである。繰返し単位（Ｉ）は、それを形成する２つの単量体単位Ａ及びＢがそれぞれジカルボニル及びジアミン単位であり且つ第二級アミン基によって互いに結合しているのが有利である。本発明の一つの好ましい形態において、・単量体Ａは式：（ここで、ｒは４〜１２の範囲、好ましくは４である）の残基であり、・単量体Ｂは式： −ＨＮ−（ＣＨ₂）_s−ＮＨ− （ここで、ｓは４〜１２の範囲、好ましくは６である）の残基である。かくして、基質（Ｉ）については、二量体の好ましい例は、次式：によって形成されるものである。対応するポリアミドは、ＰＡ６，６である。よって形成されるのが好ましい。ノカプロン酸の誘導体である。本発明に適したポリアミドタイプのオリゴマーの中では、次のものを挙げることができる：・６〜１２個の炭素原子を有する飽和脂肪族ジカルボン酸と６〜１２個の炭素原子を有する飽和脂肪族第一級ジアミンとの重縮合によって得られるポリアミドオリゴマー、・４〜１２個の炭素原子を有する炭化水素鎖を含有するω−アミノアルカン酸の直接単独重縮合によって又はこれらの酸から誘導されるラクタムの加水分解的開環及び重合によって得られるポリアミノ酸オリゴマー、・前記のポリアミドの出発単量体から得られるコポリアミドオリゴマー｛これらのコポリアミドの酸成分の一部はテレフタル酸及び（又は）イソフタル酸のような芳香族酸から成っていてもよい｝並びに・これらのポリアミドオリゴマーの混合物。二酸とジアミンとの重縮合によって得られるポリアミドの例示的な例としては、次のものを挙げることができる：・ポリアミド４，６（テトラメチレンジアミンとアジピン酸とのポリマー）・ポリアミド６，６（ヘキサメチレンジアミンとアジピン酸とのポリマー）（ＰＡ６，６）・ポリアミド６，９（ヘキサメチレンジアミンとアゼライン酸とのポリマー）・ポリアミド６，１０（ヘキサメチレンジアミンとセバシン酸とのポリマー）・ポリアミド６，１２（ヘキサメチレンジアミンとドデカン二酸とのポリマー）。好適なポリアミノ酸の例示としては、次のものを挙げることができる：・ポリアミド４（４−アミノブタン酸又はγ−ブチロラクタムのポリマー）・ポリアミド５（５−アミノペンタン酸又はδ−アミロラクタムのポリマー）・ポリアミド６（ε−カプロラクタムのポリマー）・ポリアミド７（７−アミノヘプタン酸のポリマー）・ポリアミド８（カプリルラクタムのポリマー）・ポリアミド９（９−アミノノナン酸のポリマー）・ポリアミド１０（１０−アミノデカン酸のポリマー）・ポリアミド１１（１１−アミノウンデカン酸のポリマー）・ポリアミド１２（１２−アミノドデカン酸又はラウロラクタムのポリマー）。コポリアミドの例示的な例としては、次のものを挙げることができる：・ポリアミド６，６／６，１０（ヘキサメチレンジアミン、アジピン酸及びセバシン酸のコポリマー）・ポリアミド６，６／６（ヘキサメチレンジアミン、アジピン酸及びカプロラクタムのコポリマー）。本発明に従う基質の中で好ましいものは、二酸ＡとジアミンＢとの重縮合によって得られるポリアミドオリゴマー、特にＰＡ６，６のオリゴマーであるが、これに限定されるわけではない。数は、３〜８の範囲であるのが有利であり、２〜６の範囲であるのが好ましい。オリゴマー又はポリマー中の単量体残基のこの数は本明細書の開示の残部においてＤＰ_nとも称されるだろうということが指摘されておくべきである。特徴的な基質（Ｉ）は、例えば三量体ＡＢＡ以外のＢＡＢ及びＡＢＡＢのような水溶性オリゴマーであるのが有利である。基質（Ｉ）及び（II）の中でも、これらの特定的な基質は、本発明の酵素及び（又は）その生物学的先駆体によって非常に高い性能で加水分解することができるものである。酵素の（酵素による加水分解を受ける）基質が単量体Ａ及びＢを含有するオリゴマーである場合には、最終的な加水分解生成物は二量体ＡＢ及び単量体Ｂであることができる。また、本発明に従う酵素は、前記の基質（Ｉ）及び（II）のいくつかに対するその活性及び（又は）親和性によっても特徴付けることができる。かくして、第一の有利な特徴に従えば、懸案のアミダーゼは、・初めに、ＡＢＡＢタイプの四量体によって形成される基質（Ｉ）に対して活性であり、・二番目に、この基質を２個の二量体ＡＢに、所定の条件下で測定して蛋白質１ｍｇにつき１時間当たりに生産されるＡＢのマイクロモル数で表わして６０よりも大きい、好ましくは１００以上、特に好ましくは１０００以上の特異的酵素活性（Ｕ_s）で転化させることができる。このアミダーゼの第二の有利な特徴は、・三量体ＢＡＢによって形成される基質（Ｉ）に対して活性であり、且つ、・この三量体を二量体ＡＢ及び単量体Ｂに、所定の条件下で測定して酵素１ｍｇにつき１時間当たりに生産されるＡＢのマイクロモル数で表わして１００よりも大きい、好ましくは５００以上の特異的酵素活性（Ｕ_s）で転化させることができるということである。このアミダーゼの第三の有利な特徴は、・ＤＰ_nが３〜２０の範囲、好ましくは３〜１０の範囲であるオリゴマーによって形成される基質（Ｉ）に対して活性であり、且つ、・これらのオリゴマーを単量体Ｂ、二量体ＡＢ及び三量体ＡＢＡに転化させることができるということである。純粋なアミダーゼの酵素活性は、次の条件下で測定される：・燐酸塩緩衝液・温度＝３０℃ ・基質濃度＝１．４ｇ／リットル・ｐＨ＝７．５。すでに前記したように、アミドの酵素による加水分解における本発明の酵素の使用は、酵素そのもののみ若しくは該酵素を生産する生物学的先駆体（野生型又は組み換え型微生物）のみ又はそれら両方の混合物を用いることから成ることができる。その起源に関しては、本発明に従う酵素は、特にコリネバクテリア（Coryneba cterium）属の天然微生物から単離した。その出発点から、その制御の下で本発明に従うアミダーゼが合成されるところの遺伝子（換言すれば、本発明に従うアミダーゼの合成を制御する遺伝子）を同定したこともまた本出願人の功績であり、組み換え遺伝子を用いることを可能にするのは正にこの技術の進歩である。従って、本発明のさらなる主題は、アミダーゼ活性、特に前記の基質（Ｉ）及び（II）に対するアミダーセ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列であって、次の配列：・添付した配列SEQ ID NO:1に相当し且つアミダーゼ活性を持つ酵素をコードするＤＮＡ配列、・この配列の相同物であって遺伝子コードの縮重の結果として生じる前記相同物、及び・これらの配列の内の一つ又はそのフラグメントとのハイブリダイズし、これらの配列の内の一つ又はそのフラグメントとの同一性が５０％よりも大きく且つアミダーゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列から選択される前記ＤＮＡ配列にある。前記のタイプのＤＮＡ配列の（過剰）発現（(hyper)expression）の結果として生じる酵素は、当然本発明の範囲に包含される。（過剰）発現は、組み換え微生物（例えば１種以上のプラスミドを含むもの）内で、（過剰）発現を引き起こすリボソーム結合部位１つ以上及びプロモーター１種以上を含む適当な発現カセットを選択することによって得ることができる。組み換えに関しては、本発明に従う好ましい組み換え微生物の一つは、１９９４年１１月２９日にＩ−１４９５番としてCollection Nationale de Cultures d e Microorganismesに言及されて寄託された株の誘導体である、プラスミドpXL25 64を含有する大腸菌株から成るものである。この大腸菌株はプラスミドpXL2564を含有し、このプラスミドはSEQ ID NO:1及び例えば添付した図２に示したものであることができる発現カセット：Ptrp-RBS CIIを有する。より一般的には、本発明は、本発明に従うアミダーゼを生産することができ且つ有利には前記の配列中に含有される遺伝子情報又は本発明の主題を形成する配列を有する新規の組み換え及び非組み換え微生物のすべてに関する。これらの微生物によって生産されるアミダーゼ全体が本発明によってカバーされることは明白である。これらの微生物の特別な特徴は、少なくとも１個のアミド基を含むポリアミド化合物のアミド基を加水分解する能力、並びに、より正確には前記の基質（Ｉ）及び（II）に対して、より特定的には基質（II）と比較して基質（Ｉ）に対して特異的な選択性及び加水分解活性である。基質（Ｉ）の場合においては、これらのオリゴマーは、例えば前記の水溶性オリゴマー、中でもＡＢＡＢ及び（又は）ＢＡＢである。有利なことに、本発明に従う微生物は、ポリアミドオリゴマーによって形成される少なくとも１種の基質、より特定的には単量体Ｂ及び二量体ＡＢに転化させることが予定される四量体ＡＢＡＢ及び（又は）三量体ＢＡＢによって形成される少なくとも１種の基質を加水分解することができ、この微生物は、所定の条件下で測定して乾燥細胞１ｇにつき１時間当たりに加水分解される基質のｇ数で表わして５０以上、好ましくは８０以上、特に好ましくは１００以上の活性で加水分解を達成することができる。この活性は、燐酸塩緩衝液（１００ｍＭ）中でｐＨ７において２．５ｇ／リットルの基質濃度で４００マイクロリットルの反応媒体容量で撹拌しながら約３０ ℃の温度において測定される。これらの微生物の性能特性を最も効果的にするためには、本発明に従えば、これらは、・それらが合成するポリペプチドの折り畳み（folding）、特に前記の酵素の折り畳みを捕助するための少なくとも１種の蛋白質試薬及び（又は）・かかる試薬をコードする遺伝子を備える。これらの試薬は、懸案の微生物のベースレベルに相当する量よりも多い量で存在させる。本発明はさらに、少なくとも一部が前記の基質（Ｉ）及び（又は）（II）によって形成される基質の加水分解方法であって、前記の少なくとも１種の酵素及び（又は）少なくとも１種の微生物を用いることから成ることを特徴とする、前記方法に関する。本発明に従えば、相補的（complementary）スペクトルを備えたいくつかの酵素を有するのが有利である場合がある。従って、前記の方法の変法の一つは、少なくとも１種の別のタイプの酵素並びに（又は）少なくとも１種のその野生型及び（若しくは）組み換え型及び（若しくは）相同型生物学的先駆体を使用することを予定することができる。この変法においては、基質は、その少なくとも一部が、少なくとも二酸単量体（Ａ）とジアミン単量体（Ｂ）との間の重縮合から得られたポリアミドから誘導され且つ４０未満、好ましくは２０未満、特に好ましくは１２未満のＤＰ_nを有するオリゴマーから成るものである。この変法に従う加水分解方法は、 −重合度（ＤＰ_n）が８以下、好ましくは４以下であるオリゴマー、特に好ましくは単量体Ａ及びＢを生産すること、並びに −次のもの：・前記の少なくとも１種の酵素及び（又は）少なくとも１種の微生物、並びに・少なくとも１種の別のタイプの酵素並びに（又は）少なくとも１種のその野生型及び（若しくは）組み換え型生物学的先駆体（前記酵素は、フラボバクテリア種KI 72のnyl-B遺伝子の制御下で生産される酵素Ｅ₂であるのが好ましい）を用いることを特徴とする。 nyl-Bによって生産される相補的酵素Ｅ₂は、キノシタらの論文（「Eur．J．Bi ochem.」、１１６、第５４７〜５５１頁、１９８１年）又はツチヤらの論文｛「 Journal of Bacteriology」、第１７１巻、第６号（１９８９年６月）、第３１８７〜３１９１頁｝に記載されている。酵素Ｅ₂の不在下では、この方法は実際上はＤＰ_nが４以下のオリゴマー、非常に特定的には二量体ＡＢを優先的にもたらすだろう。前記の酵素によって加水分解可能なオリゴマーは、アミドタイプの基の熱分解及び（又は）化学（酸）分解によって、特に高ＤＰ_nのポリマー又はオリゴマーのの分解によって得ることができる。本発明に従う方法のその他の有利な形態は、特に酵素の生物学的先駆体並びに例えば・炭素源、好ましくは少なくとも１個のアミド基を含有する少なくとも１種の化合物を含む炭素源（この炭素源は随意に、補体、有利には炭水化物から選択される補体、特に好ましくはショ糖を含んでいてよい）及び・随意としての、生物学的先駆体によって消費されることなく酵素の生産を引き起こすことができる化合物（この化合物は、アミドから選択されるのが好ましい）を含む培地を用いるものである。アミドの酵素による加水分解のための本発明に従う方法は、多くの用途、例えばアミド化合物からの化合物の製造のため又はポリアミドを含有する物質の処理のための有機合成における用途を有し得る。特に、本方法は、ポリアミドポリマーの出発原料の再生の枠内で価値があることができた。以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく本発明の特徴、変法及び利点の例示を与えるものである。添付した図面の説明ＷＩＰＯ標準ＳＴ２３に従って確立された配列一覧表は、次の配列を含む：・SEQ ID NO:1 本発明に従うアミダーゼをコードするＤＮＡ・SEQ ID NO:2 本発明に従うアミダーゼを形成するポリペプチド図１は、本発明に従うアミダーゼをコードする遺伝子を含有し、１９９４年１１月２９日にＩ−１４９５番としてＣＮＣＭに寄託された株によって適応させたプラスミドpXL2297のリストリクションマップ（restriction map）を示す。図２は、本発明に従うアミダーゼをコードするpam I遺伝子、アンピシリン耐性を授与する遺伝子及びアミダーゼ遺伝子を制御するPtrp-RBScII発現カセットを含有するプラスミドpXL2564のリストリクションマップを示す。記載の残りの部分において用いた略号の意味を以下に与える：・ＳＳＣ：ハイブリダイゼーションのために一般的に用いられる、クエン酸ナトリウム及びＮａＣｌを含有する緩衝液（２０×ＳＳＣ＝ＮａＣｌ３Ｍ − ｐＨ７クエン酸ナトリウム０．３Ｍ）・ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム・ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム及びポリアクリルアミドを基とする電気泳動ゲル・ＩＰＴＧ：イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド・ＨＰＬＣ：高性能液体クロマトグラフィー。実施例オリジナルの株の単離、この発明によるポリアミドヒドロラーゼ（ＰＡＭＩ＝SEQ ID NO:２）の精製及びペプチド配列決定、並びにＰＡＭＩをコードするｐａｍＩ遺伝子のクローニングを、現在の慣用技術により行なった。実施例Ｉ：組換え：ＰＡＭＩの大腸菌における発現 λファージＣ１１遺伝子のリボソーム結合部位が先行するｐａｍＩ遺伝子（酵素ＰＡＭＩをコードする）が大腸菌トリプトファンオペロンプロモーターから発現される構築物を生成した。これを行なうために、１９９４年１１月２９日にＣＮＣＭに寄託された１１４９５株により提供されるプラスミドｐＸＬ２２９７（図１）をテンプレートとして用いるＰＣＲ技術によって、Ｎｄｅ１制限部位をｐａｍＩ開始コドンに造った。ヌクレオチドプライマーの対（5'-AGCAAGCTTGGAG GCCATATGAATACGAC-3’）及び（5'-CACCGGTGGGCCCCTC-3'）により、Ｎｄｅ１部位の上流にＨｉｎｄ１１１部位を導入するように、ｐａｍＩ遺伝子の５’末端を含む２０８ｂｐのＮｄｅｌ−Ａｐａｌ断片をＰＣＲにより増幅した。増幅したＨｉｎｄ１１１−Ａｐａｌ断片を、Ｈｉｎｄ１１１及びＡｐａｌにより消化したｐＵＣ２９（Benes 等(1993)、Gene 130:151-152）中にクローン化し、ｐＸＬ２２９７の８６７ｂｐのＡｐａｌ断片をＡｐａｌ部位に導入することによりｐａｍＩ遺伝子を再構築した。従って、Ｎｃｏｌ部位が、ｐａｍＩ停止コドンの約３０ヌクレオチド下流に位置する。このプラスミドの隣接する５００ｂｐのＮｄｅ１−ＥｃｏＲ１及び６００ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｎｃｏｌ断片を、トリプトファンプロモーターの直下流に位置するＮｄｅｌ部位にて消化したｐＸＬ２１５８（特許ＦＲ９２−０９８８２）に挿入した。従って、プラスミドｐＸＬ２５６４（図２に記載）は、アンピシリン耐性を与える遺伝子及びＰｔｒｐ−ＲＢＳｃｌｌ発現カセットの制御下のｐａｍＩ遺伝子を含むｐＢＲ３２２（Sucliffe(1978),Nucleic Acid Res.5:2721）の誘導体である。プラスミドｐＸＬ２５６４を、大腸菌株ＴＧ１に導入した（この微生物はアンピシリンＬＢにて選択される）。ｐＸＬ２５６４を含むクローン（ＰＡＭＩ株と呼ぶ）を、寒天皿上に２回トランスファーして、特許ＦＲ２６９４５７１に記載された手順に従って、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭ９グルコース培地にて３７℃で培養した。ポリアミダーゼＩの可溶性形態を得るためのＧｒｏＥシャペロンの同時発現の効力を、プラスミドｐＸＬ２０３５（特許ＦＲ２６９４５７１）をＴＧ１株（ｐＸＬ２５６４）に導入することにより試験した。その結果の株は、同じ条件下で、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンの存在下で培養された。これらの結果は、この新規な組換え株を用いれば、ポリアミダーゼＩが本質的に可溶性の開裂した形態で生成されることを示す。実施例ＩＩ：Ｅ₃ を発現する組換え株と実施例Ｉで得られたＰＡＭＩを発現する組換え株のアミダーゼ活性の比較ＩＩ．１これらの株の培養：ＰＡＭＩを発現する株を、実施例Ｉに示したようにして培養した。Ｅ₃ を発現する株は、プラスミドｐＵＣＬ３を、参考文献「NEGORO等(1992)-J ournal of Bacteriology，174巻、7948-7953頁」に記載された大腸菌株ＴＧＩに導入することにより得る。この株を、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを補ったＭ９培地にて３７℃で培養し、予備培養を１％（ｖ／ｖ）にて接種した。４時間３０分のインキュベーションの後に、インデューサー（１ｍＭＩＰＴＧ）を加えた。この予備培養は、１００ｍｇ／１のアンピシリンを補った１０ｍｌの同じＭ９培地よりなり、寒天皿に由来するコロニーを接種される。培養の完了時に、遠心分離（１２，０００ｇで１０分間）後に得られた細胞残渣を一晩１０５℃で乾燥することにより得られた乾燥抽出物により、細胞生産量を測定した。Ｍ９培地は、下記よりなる：グルコース４ｇ／ｌＫＨ₂ＰＯ₄ ３ｇ／ｌＮａ₂ＨＰＯ₄ ７ｇ／ｌＭｇＳＯ₄ １ｍ／ＭＮＨ₄Ｃｌ１ｇ／ｌＮａＣｌ０．５ｇ／ｌＣａＣｌ₂ １ｍＭカザミノ酸４ｇ／ｌチアミンＨＣｌ１０ｍｇ／ｌＩＩ．２これらの株の活性：上記のようにして得られた細胞残渣を、１％（ｖ／ｖ）のトルエンを含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）に取り、１時間０℃でインキュベートする。遠心分離の後に、処理された残渣を、０．１Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７）に再懸濁する。Ｅ₃及びＰＡＭＩを発現する株の細胞懸濁液のアミダーゼ活性を、ＰＡ６についてのＤＰ_n２〜６のオリゴマー及びＰＡ６６についてのＤＰ_n２〜４のものについて試験した。ＤＰ_n２〜６のＰＡ６オリゴマーは、それぞれ、ＣＡＰ２〜ＣＡＰ６と呼ばれる。これらの結果を、下記の表Ｉに列記する。この活性は、乾燥細胞１ｇ当り毎時加水分解される基質のｍモルで表されている。操作条件：［Ｅ₃を発現する株］＝２．５ｇ／１の乾燥抽出物；［ＰＡＭＩを発現する株］＝２．５ｇ／ｌのナイロン６オリゴマーに対する乾燥抽出物及び０．１２５ｇ／ｌのナイロン６６オリゴマーに対する乾燥抽出物；［オリゴマー］＃２．５ｇ／１；０．１Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ＝７）；容積４００μｌ；Ｔ＝３０℃；マグネチックスターラーで撹拌。Ｅ₃を発現する株について、ナイロン６及び６６オリゴマーの加水分解について動力学を３時間測定した。ＰＡＭＩを発現する株について、ナイロン６オリゴマーの加水分解について１時間、ナイロン６６オリゴマーの加水分解について１５分間動力学を測定した。Ｅ₃ を発現する株のナイロン６及び６６基質に対する加水分解活性は、同じオーダーの等級である。即ち：０．２６３ｍモルの乾燥細胞１ｇ当り毎時加水分解されるＡＢＡＢ及び０．１４０ｍモルの乾燥細胞１ｇ当り毎時加水分解されるＣＡＰ４（これらの活性の間の約数は２）。ＰＡＭＩは、ナイロン６オリゴマーよりもナイロン６６オリゴマーに対して一層特異的である。即ち：１１７ｍモルの乾燥細胞１ｇ当り毎時加水分解されるＡＢＡＢ及び１．７９ｍモルの乾燥細胞１ｇ当り毎時加水分解されるＣＡＰ４（これらの活性の間の約数は６５）。この特徴は、ｎｙｌＣの制御下で生成される公知の酵素と比較して、この発明による酵素の新規性を示している。実施例ＩＩＩ：この発明によるＰＡＭＩ酵素とｎｙｌ−Ｂ遺伝予により発現されるアミダーゼＥ₂の混合物の助けによるＰＡ６６オリゴマーの酵素的加水分解これらの酵素の代りに、本実施例では、それらの生物学的前駆体即ち：＊ＰＡＭＩを発現する実施例Ｉの組換え株＊及びFlavobacterium sp KI72のｎｙｌ−Ｂ遺伝子を含み、Ｅ₂ を発現する組換え株を利用する。ＩＩＩ．１これらの株の培養：ＰＡＭＩを発現する株を、実施例Ｉに示したようにして培養した。Ｅ₂ を発現する株は、Ｅ₃ を発現する株を得るため記載された手順により得られる（但し、ネゴロらの「Journal of Biol．Chem.」（１９８４年）２５９、１３６４８〜１３６５１頁」に記載されたプラスミドｐＨＫ４を導入することによる）。この株を、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを補ったＭ９培地にて３７℃で培養し、予備培養を１％（ｖ／ｖ）にて接種した。この予備培養は、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを補った１０ｍｌの同じＭ９培地よりなり、寒天皿由来のコロニーを接種する。培養の完了時に、遠心分離（１２，０００ｇで１０分間）の後に得られる細胞残渣を一晩１０５℃で乾燥することにより得られる乾燥抽出物により、細胞生産量を測定する。ＩＩＩ．２これらの株の活性：上記のようにして得られた細胞残渣を、１％（ｖ／ｖ）のトルエンを含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）に取り、１時間０℃でインキュベートする。遠心分離の後に、処理した残渣を、０．１Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７）中に再懸濁させる。Ｅ₂ 及びＰＡＭＩを発現する株の細胞懸濁液のアミダーゼ活性を、オリゴマーＡＢＡＢ、ＢＡＢ、ＡＢＡ及びＡＢについて試験した。これらの結果を、下記の表ＩＩに列記する。活性は、乾燥細胞１ｇ当りの毎時加水分解される基質のｍモルで表される。操作条件：［ＰＡＭＩを発現する株］＝０．１２５ｇ／ｌの乾燥抽出物；［オリゴマー］＝２．５ｇ／ｌ；０．１Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ＝７）；容積４００ μｌ；Ｔ＝３０℃；マグネチックスターラーで撹拌。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ジュールダ，カトリーヌフランス国エフ69003 リヨン，リュエティエンヌリシュラン，55 (72)発明者ルコック，アンヌマリーフランス国エフ92130 イシレムリノー, アレアシュマティス，３ (72)発明者ペートル，ドミニクフランス国エフ69006 リヨン，リュデュケーヌ，43

Claims

【特許請求の範囲】１．アミダーゼ活性を有する酵素、特に次の式（Ｉ）及び（II）の少なくとも一つを有する（ポリ）アミドタイプの基質に対するアミダーゼ活性を有する酵素であって、比Ｒ_a：が２よりも大きい、好ましくは１０以上、特に好ましくは５０以上であることを特徴とする、前記酵素：｛ここで、Ａ及びＢは単量体単位であり、Ｒ¹及びＲ³は同一又は異なる、好ましくは異なる二価基であり、置換又は非置換の直鎖状又は分枝鎖状（シクロ）アルキレン、アリーレン又はアリールアルキレンを表わし、ここで、芳香族基は随意に重縮合されていてもよく、アルキレン中の炭素数は４以上、好ましくは４〜１２の範囲であり、Ｒ²は同一又は異なる、好ましくは同一の基であり、水素及び（又は）アルキル基（有利には１〜６個の炭素原子を有するアルキル基）から選択され、Ｘは次のＸ¹又はＸ²であり、Ｘ¹はＯＨ、ＯＭ又はＯＲ⁴であり、ここで、Ｍは金属、好ましくはアルカリ金属及びアルカリ土類金属から選択され、Ｒ⁴は１〜６個の炭素原子を有する直鎖状又は分枝鎖状アルキルであり、Ｘ²はであり、ここでＲ²及びＲ³は上で定義した通りであり、Ｒ⁵及びＲ⁶は同一又は異なり、Ｒ²について上で与えたものと同じ定義を有し、Ｙは次のＹ¹又はＹ²であり、Ｙ¹は水素であり、Ｙ²はであり、ここで、Ｒ¹は上で定義した通りであり、Ｚは水素、Ｍ¹（ここで、Ｍ¹ はＭと同様に定義される）又はＲ⁴であり、但し、（ａ）ＸがＸ¹である場合にはＹはＹ¹であり、（ｂ）ＸがＸ²である場合にはＹはＹ²又はＹ¹であり、ｐは１．５〜１０の範囲、好ましくは１．５〜５の範囲である｝；（ここで、Ｒ²及びＲ³は上で定義した通りであり、Ｕ及びＶはそれぞれ式（Ｉ）においてＸ¹及びＹ¹について上で与えたものと同じ定義を有し、ｑは１〜８の範囲である）。２．添付した配列SEQ ID NO:2によって与えられるペプチド配列、及び（又は）この配列との相同度が少なくとも５０％であるポリペプチドから成ることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の酵素。３．ＡＢＡＢタイプの四量体によって形成される基質（Ｉ）に対して活性であり、且つ、この基質を２個の二量体ＡＢに、所定の条件下で測定して蛋白質１ｍｇにつき１時間当たりに生産されるＡＢのマイクロモル数で表わして６０よりも大きい、好ましくは１００以上、特に好ましくは１０００以上の特異的酵素活性（Ｕ_s）で転化させることができることを特徴とする、請求の範囲第１又は２項記載の酵素。４．三量体ＢＡＢによって形成される基質（Ｉ）に対して活性であり、且つ、この三量体を二量体ＡＢ及び単量体Ｂに、所定の条件下で測定して酵素１ｍｇにつき１時間当たりに生産されるＡＢのマイクロモル数で表わして１００よりも大きい、好ましくは５００以上の特異的酵素活性（Ｕ_s）で転化させることができることを特徴とする、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の酵素。５．ＤＰ_nが３〜２０の範囲であるオリゴマーによって形成される基質（Ｉ）に対して活性であり、且つ、これらのオリゴマーを単量体Ｂ、二量体ＡＢ及び三量体ＡＢＡに転化させることができることを特徴とする、請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の酵素。６．アミダーゼ活性、特に請求の範囲第１項記載の基質（Ｉ）及び（II）に対するアミダーゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列であって、・添付した配列SEQ ID NO:1に相当し且つアミダーゼ活性を持つ酵素をコードするＤＮＡ配列、・この配列の相同物であって遺伝子コードの縮重の結果として生じる前記相同物、及び・これらの配列の内の一つ又はそのフラグメントとハイブリダイズし、これらの配列の内の一つ又はそのフラグメントとの同一性が５０％よりも大きく且つアミダーゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列から選択されることを特徴とする、前記ＤＮＡ配列。７．請求の範囲第６項記載のＤＮＡ配列の（過剰）発現の結果として生じ且つアミダーゼ活性を有する酵素。８．１９９４年１１月２９日にＩ−１４９５番としてCollection Nationale d e Cultures de Microorganismesに言及されて寄託された株のである、プラスミドpXL2564を含有する大腸菌株から成る微生物。９．請求の範囲第１〜５及び７項のいずれかに記載の少なくとも１種の酵素を生産することができる微生物。１０．請求の範囲第６項記載のＤＮＡ配列を含有することを特徴とする、請求の範囲第９項記載の微生物。１１．請求の範囲第８〜１０項のいずれかに記載の微生物であって、 −・それらが合成するポリペプチド、特に請求の範囲第１〜５及び７項のいずれかに記載の酵素の折り畳みを補助するための少なくとも１種の蛋白質因子及び（又は）・かかる因子をコードする遺伝子を含有すること、並びに −この因子が懸案の微生物のベースレベルに相当する量よりも多い量で存在することを特徴とする、前記微生物。１２．前記因子が大腸菌のGroEシャペロン（Chaperone）又はその真核生物若しくは原核生物を起源とする相同物であることを特徴とする、請求の範囲第１１項記載の微生物。１３．請求の範囲第８〜１１項のいずれかに記載の微生物によって生産されることを特徴とする、酵素。１４．少なくとも一部が請求の範囲第１項記載の基質（Ｉ）及び（又は）（II ）によって形成される基質の加水分解方法であって、請求の範囲第１〜５、７及び１３項のいずれかに記載の少なくとも１種の酵素並びに（又は）請求の範囲第８〜１２項のいずれかに記載の少なくとも１種の微生物を用いることから成ることを特徴とする、前記方法。１５．少なくとも二酸単量体（Ａ）とジアミン単量体（Ｂ）との間の重縮合から得られたポリアミドから誘導され且つ４０未満、好ましくは２０未満、特に好ましくは１２未満のＤＰ_nを有するオリゴマーから少なくとも一部が成る基質を加水分解する方法であって、 −重合度（ＤＰ_n）が８以下、好ましくは４以下であるオリゴマー、特に好ましくは単量体Ａ及びＢを生産すること、並びに −次のもの：・請求の範囲第１〜５、７及び１２項のいずれかに記載の少なくとも１種の酵素及び（又は）請求の範囲第８〜１１項のいずれかに記載の少なくとも１種の微生物、並びに・少なくとも１種の別のタイプの酵素並びに（又は）少なくとも１種のその野生型及び（若しくは）組み換え型生物学的先駆体（前記酵素は、フラボバクテリア種KI 72のnyl-B遺伝子の制御下で生産される酵素Ｅ₂であるのが好ましい）を用いることを特徴とする、前記加水分解方法。１６．請求の範囲第１４又は１５項記載の酵素的方法によって加水分解可能であるようなＤＰ_nを有する基質を得るための熱分解及び（又は）化学分解を含むことを特徴とする、請求の範囲第１４又は１５項記載の方法。