WO1996023877A1 - Gene conferant une capacite de floculation a de la levure et produit genique - Google Patents

Gene conferant une capacite de floculation a de la levure et produit genique Download PDF

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WO1996023877A1
WO1996023877A1 PCT/JP1996/000183 JP9600183W WO9623877A1 WO 1996023877 A1 WO1996023877 A1 WO 1996023877A1 JP 9600183 W JP9600183 W JP 9600183W WO 9623877 A1 WO9623877 A1 WO 9623877A1
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yeast
dna
brewer
gene
amino acid
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PCT/JP1996/000183
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Osamu Kobayashi
Nobuyuki Hayashi
Hidetaka Sone
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Kirin Beer Kabushiki Kaisha
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a yeast agglutinating gene and its use, and more particularly, a protein having an activity of imparting a yeast yeast-type aggregating property to yeast, a DNA encoding the protein, and a plasmid containing the DNA.
  • a method for producing a yeast having the brewer's yeast-type cohesiveness imparted or enhanced by using the DNA a method for producing a yeast having a brewer's yeast-type cohesiveness deleted or reduced, and expression of the DNA to reduce or reduce the brewer's yeast-type agglutinability of yeast by inhibiting the yeast.
  • the present invention also relates to a yeast to which brewer's yeast-type cohesiveness has been imparted, enhanced, deleted or reduced by the above method.
  • the present invention relates to a method for producing a brewed product comprising culturing the yeast, and a brewed product obtained by the production method.
  • yeast used for brewing not only affects the flavor of the product, but is also important in the operation of the brewing process.
  • Yeast used for the production of one type of beer has the property that when the fermentation nears the end, the yeast agglomerates and settles to the bottom of the fermentation broth. It is especially called bottom yeast.
  • Beer yeast is one of the major factors that determine the flavor, etc.
  • yeast which sediments late in fermentation, is particularly important for beer brewing. Has become an important issue. In breeding the bottom yeast, it is important to have proper cohesion. Because for example, yeast that is too cohesive will settle in the fermentation liquor during fermentation, and subsequent fermentation will not proceed.On the contrary, non-cohesive yeast will remain suspended even in the later stages of fermentation. An operation such as centrifugation is required to remove ash from beer. Therefore, yeast that disperses in the fermentation broth at the beginning of fermentation and that sediments well in the late stage of fermentation with good cohesion are suitable for the current production method. Needless to say, different production methods require yeasts that have suitable cohesive properties.
  • yeast flocculation Despite extensive research on yeast flocculation, which is an important property in the industry, the mechanism of yeast flocculation has not yet been elucidated, and control of flocculation by improving yeast itself has been successful. Hard to say. Based on many years of studies at the yeast gene level, genes involved in yeast cohesion, such as FL01, flo3, FL05, FL08, sfll, fsul, fsu2, tupl, cyc8, cka2, and FMC1 The presence of the olil and oxi2 genes in mitochondrial DNA and mitochondrial DNA has been confirmed so far.
  • the FL01 gene has been isolated and analyzed [YEAST, 9, 423 (1993) and YEAST, 10, 211 (1994)].
  • the isolation and analysis of the FL05 gene has also been reported, where the FL05 gene differs from the previously reported FL01 gene in its location on yeast chromosomal DNA, but has a restriction map and DNA bases. Sequences have been shown to be nearly identical [J. Inst. Brew., 85, 95, (1979) and Curr. Genet., 25, 196 (1994)].
  • genes other than the FL01 and FL05 genes involved in the cohesiveness of yeast have not been isolated or structurally analyzed, and the proteins encoded by these genes have not been reported at all. .
  • yeast cohesion attempts to improve yeast cohesion by utilizing genes that are involved in yeast cohesion as described above include the introduction of the FL01 gene, an agglutination gene of Saccharomyces cerevisiae, and the introduction of various yeasts including brewer's yeast. It has been reported that cohesiveness is imparted to non-cohesive yeast [Agric. Biol. Cem., 55, 1547 (1991)]. However, it has been reported that the agglutinating ability of the thus obtained transformant, brewer's yeast, develops from the early stage of fermentation, and fermentation tends to be delayed [Journal of the Brewing Association 88, 665 (1993)]. ] .
  • the present invention provides the following items:
  • the present inventors have conducted intensive studies on the cohesiveness of the bottom brewer's yeast in order to solve each of the above-mentioned problems.
  • Lg-FLOl gene the FL01 homologous gene specifically possessed by the cohesive lower brewer's yeast was found. Clarifying the relationship between the Lg-FL01 gene and the agglutinating ability, and then introducing this Lg-FL01 gene into-the yeast that has become non-aggregating by breaking down the FL01 gene product from the FL01 gene product It was found that it produced yeast brewer's yeast yeast flocculation.
  • the present invention provides an Lg-FL01 gene product substantially having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or substantially having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • a protein having an activity of imparting brewer's yeast-type cohesiveness to yeast comprising a polypeptide having an amino acid sequence containing residues, or at least one of the amino acid sequences substantially represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
  • a protein having an amino acid sequence comprising an amino acid residue from the amino acid residue at position 25 to the amino acid residue at position 97 which has an activity of imparting brewer's yeast-type cohesiveness to yeast
  • the present invention provides a polypeptide having an activity of imparting brewer's yeast-
  • substantially means that some amino acids can be deleted, substituted, added, polymerized, etc. in a part of the amino acid sequence as long as the yeast has an activity of imparting brewer's yeast-type cohesiveness to yeast. Is meant.
  • the present invention relates to a gene DNA comprising a base sequence substantially encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing, or 25% of the amino acid sequence substantially shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
  • a DNA comprising a nucleotide sequence encoding a polypeptide having an amino acid sequence comprising the amino acid residue from position 213 to amino acid residue 213, or at least the amino acid sequence substantially as shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing It is intended to provide a DNA comprising a nucleotide sequence encoding a polypeptide having an amino acid sequence containing amino acid residues at positions 25 to 97.
  • the term "substantially” means that a part of the amino acid sequence can be deleted, substituted, added, polymerized, etc. for some amino acids as long as the yeast has the activity of imparting brewer's yeast-type cohesiveness. It means.
  • the present invention includes a base sequence encoding an amino acid sequence having an activity of imparting brewer's yeast-type cohesiveness to yeast, and comprises a base sequence from the 59th base in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 to 697 SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, including a DNA containing the sequence up to and including the sequence up to the second base, or a DNA that is a complementary chain thereof, or a base sequence encoding a protein having the activity of imparting brewer's yeast-type cohesiveness to yeast.
  • a DNA containing the 131st base to the 697th base or its complementary strand, or in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, the 349th base to the 349th base is DNA or its complementary strand, or a DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing and encoding a polypeptide having an activity of imparting brewer's yeast-type cohesiveness to the yeast or its complement.
  • the present invention also provides a DNA comprising a base sequence which is incorporated into Brasmid KTYT2, YBSKT2.KNWtC3 or KNYES and encodes a protein having an activity of imparting brewer's yeast-type cohesiveness to yeast; provide.
  • the present invention also provides brewer's yeast-type cohesiveness, wherein the DNA is introduced.
  • the present invention provides a method for producing a yeast having a brewer's yeast type agglutinability that has been deleted or reduced, characterized in that
  • the present invention provides a yeast produced by any one of the above methods, which has imparted or enhanced, deleted, or reduced brewer's yeast-type cohesiveness.
  • the present invention also provides a method for deleting or reducing brewer's yeast-type aggregation of yeast by suppressing the expression of the DNA.
  • the present invention provides a method for producing a brewed product comprising culturing the yeast, and a brewed product thereof.
  • FIG. 1 shows the results (photographs) of electrophoresis by Southern and Northern analysis of brewer's yeast and its reduced pair FL01 gene.
  • FIG. 2 shows a restriction map of the Lg-FLOl gene.
  • FIG. 3 shows a conceptual diagram of full-length cloning of the Lg-FL01 gene by inverse PCR.
  • FIG. 4 shows a restriction map of the full-length fragment of the Lg-FL01 gene.
  • FIG. 5 shows a conceptual diagram of the construction of the Sc-chimera FL01 gene.
  • Fig. 6 shows the construction diagram of the plasmid for breaking the Lg-FL01 gene.
  • Figure 7 shows the construction diagram (continued) of the plasmid for Lg-FL01 ⁇ gene disruption.
  • FIG. 8 shows a comparison of the deduced amino acid sequences of the N-terminal part of -FL01 gene and Sc-FLOl gene.
  • FIG. 9 shows the aggregation phenotype of strains having various remodeled FL01 genes.
  • aggregation between yeast cells is caused by sexual aggregation between a-type cells and ⁇ -type cells, unseparated budding daughter cells from mother cells, non-sexual agglutination, etc.
  • the purpose is to control non-sexual aggregation among these.
  • Non-sexual agglutination can be broadly classified into two types, depending on the type of sugar that inhibits it, namely, mannose-specific Folfolve eve and NewFlo type, which is also inhibited by maltose / glucose in addition to mannose. It has been reported [YEAST, 7, 559 (1991)].
  • the present inventors have discovered that the cohesiveness of common bottom brewer's yeast belongs to the NewFlo type. In this specification, these types of cohesiveness are indicated by the following terms for ease of understanding.
  • brewer yeast type cohesiveness brewer yeast added to wort is Agglomeration is inhibited by the saccharides in the juice and can be dispersed in the wort, so that the fermentation proceeds quickly. If the sugar concentration in the fermentation liquor decreases in the latter stage of the fermentation, the aggregation inhibition becomes weaker, and yeast It can be guessed that yeast will be easy to collect because it will aggregate and settle.
  • the Lg-Fol protein is a FL01 homologous gene that is characteristic of a lower brewer's yeast which originally exhibits brewer's yeast-type cohesiveness and its reduced form, that is, a protein encoded by the Lg-FL01 gene.
  • the present invention includes Lg-Fl ol proteins and derivatives.
  • the Lg-Fol protein can be derived from yeast, especially Saccharomyces cerevisiae, and has the property of imparting brewer yeast-type cohesiveness to yeast.
  • the Lg-Fol protein substantially contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing in its amino acid sequence. "Substantially the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing" refers to the "amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing" in addition to the "amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1" as long as yeast is given brewer's yeast-type cohesiveness.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing is modified, that is, amino acid is added, inserted, deleted or substituted to a part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in Sequence Listing. It contains the amino acid sequence.
  • the “amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing” of the present invention has homology with the amino acid sequence deduced from the base sequence of the known experimental yeast FL01 gene.
  • the decisive difference between the two is that the Lg-Flol protein containing the “amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing” of the present invention and the derivative thereof are important properties for the aforementioned brewer's yeast, “beer.
  • the ability to impart "yeast-type cohesiveness" to yeast For the first time after the present invention was completed, it was shown that Lg-Flol protein and its derivatives can impart "brewer yeast-type cohesiveness" to yeast.
  • the region corresponding to the amino acid sequence from the 1st to the 24th amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is necessary for the Lg-Flol protein to be localized on the cell surface. It is very likely that this is a secretory signal sequence. That is, it is inferred that the protein localized on the cell surface of the aggregating yeast and having the activity of imparting the agglutinating property to the yeast is a protein having an amino acid sequence at the 25th position or more of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the present invention includes Lg-FL01 gene DNA.
  • Lg-FL01 gene DNA refers to a DNA containing an Lg-Flol protein having an activity of imparting brewer's yeast-type cohesiveness to yeast and a base sequence encoding the derivative thereof.
  • the present invention encompasses a gene DNA substantially comprising a base sequence encoding a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • base sequence encoding a protein having an amino acid sequence refers to all degenerate base sequences.
  • Lg-FL01 gene refers to the FL (n homologous gene) characteristic of the lower brewer's yeast exhibiting brewer's yeast-type cohesiveness and its reduced form.
  • FL n homologous gene
  • the present invention also includes a DNA that is incorporated into the plasmid KTYT2 and contains a nucleotide sequence encoding a protein having an activity of imparting brewer's yeast-type aggregation to yeast.
  • the Lg-FL01 gene DNA of the present invention may be derived from a natural product, fully synthesized, or synthesized using a part of the natural product, that is, semi-synthesized. ⁇ Transformation>
  • a method for introducing Lg-FL01 gene DNA a method commonly used in the field of genetic engineering may be used, and the method is carried out in accordance with the customary standard [ANALYTICAL B IOCHEMISTRY 16 3.391 (1987), etc.]. do it. Specifically, there may be mentioned a method of incorporating desired DNA into a vector and introducing it into yeast, and a method of directly introducing into yeast without incorporating into a vector.
  • usable vectors include, for example, a YRp type (a yeast multicopy vector having an ARS sequence in the yeast chromosome as a replication origin) and a YEp type (a yeast YCp system (single copy vector for yeast having the ARS sequence of the yeast chromosome as the replication origin and having the centromeric DNA sequence of the yeast chromosome) and Yip system (yeast) All known ones can be used, such as yeast chromosome integration vectors having no replication origin. These vectors are described in the literature [Medical Publishing Center, “New Yeast Biotechno”, p. 284], and can be easily prepared.
  • a typical method for introducing DNA directly into yeast without incorporating it into a vector is a co-transformation method in which yeast is simultaneously transformed with a plasmid having a marker gene such as a drug resistance gene and the DNA sequence to be introduced. (Japanese Patent Publication No. 5-60918).
  • a promoter which is a unit for controlling transcription and translation is added to the 5 ′ of the DMA chain of the present invention.
  • the terminator 3 should be incorporated in the upstream area and the terminator in the downstream area.
  • Examples of the promoter and terminator include those derived from the Lg-FL01 gene itself, alcohol dehydrogenase gene [J. Biol. Chem., 257, 3018 (1982)], and phosphoglycerate.
  • Kinase gene [Nucleic Acids Res., 10, 7791 (1982)]
  • glycerol aldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene J. Biol.
  • ADH also called ADC
  • GAPDH also called GPD
  • PH0 GAL
  • PGK BNO
  • TRP TRP
  • HIP HIP
  • the gene of the DNA strand of the present invention can be controlled and expressed in yeast.
  • expression can be increased by changing the sugar source of the medium from, for example, glucose to galactose.
  • Lg-FL01 gene DNA of the present invention by disrupting the Lg-FL01 gene DNA of the present invention, and introducing a DNA having an ability to express Lg-Flol protein deleted or reduced, agglutination was lost or reduced.
  • Yeast can be obtained.
  • Destruction of the Lg-F01 gene DNA can be caused by the addition or deletion of one or more bases to the region involved in the expression of the Lg-Fol protein of the Lg-F L01 gene, such as the promoter region or the coding region. Or by deleting the entirety of these regions.
  • DNA that has lost or reduced its ability to express the Lg-Flol protein by disrupting the Lg-FLO1 gene in this way can be introduced into yeast in the same manner as the MA introduction method described above. Can be done.
  • homologous recombination occurs between the Lg-FL01 gene in the chromosomal DNA of the host yeast and the introduced DNA, and the ability to express the Lg-Fl ol protein by disrupting the -FL01 gene of the host yeast Is thought to be deleted or reduced, and as a result, the aggregation of the host yeast is deleted or reduced.
  • the yeast to be transformed in the present invention may be any taxonomically any of the yeasts, but for the purpose of the present invention, for the production of alcoholic beverages belonging to Saccharomyces cerevisiae Yeast, specifically brewer's yeast, wine yeast, etc., or yeast used for alcohol production is preferred.
  • the present invention also includes a method for suppressing or reducing the expression of the above-described Lg-FL01 gene DNA, thereby deleting or reducing yeast cohesiveness.
  • the present invention provides a method for exchanging Lg-FL01 gene DNA as described in Example 1 (6) with an experimental yeast FL01 ⁇ gene or the like, thereby reducing the experimental yeast-type agglutination to beer yeast-type agglutination. It also includes a method of converting to. The reverse conversion is also possible with the Lg-FL01 gene DNA provided by the present invention.
  • the brewed products including culturing the yeast of the present invention include alcoholic beverages including beer, sake, shochu, wine, whiskey, brandy, and seasonings such as oil, miso, and mirin, and alcohol for fuel and the like. I do.
  • the method for producing a brewed product in the present invention includes a brewing process relating to the brewed product.
  • Yeast Nitrogen-based without amino acids and ammonium sulfate When culturing the transformant, a medium having this composition, to which adenine sulfate, tryptophan, and histidine hydrochloride were added at a concentration of 20 mg / ml, respectively, was used. Southern analysis and Northern analysis were performed on these strains as described below. Total DNA was extracted from cells that had reached stationary phase by shaking culture with YPD medium [2% peptone (Difco), 13 ⁇ 4 yeast extract (Difco), Vk glucose] at 30 ° C. This was performed by the method of Hereford et al. [Cell, 18, 1261-1271, (1979)].
  • DMSO 10mM phosphoric acid
  • PH 7.0 sodium buffer
  • 21 buffer [503 ⁇ 4 (w / v) glycerol, 10 mM phosphate buffer ( PH 7.0), 0.43 ⁇ 4 (w / v) bromniil bromide] and 1 zl of lmg / ml thidium bromide solution in a gel containing 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), 1% agarose was used for electrophoresis.
  • a buffer was constantly circulated in the electrophoresis layer using a peristaltic pump to prevent a pH gradient from occurring.
  • RNA in the gel stained with bromide was observed using an ultraviolet transilluminator. It was confirmed that RNA was not degraded using RNA as an index.
  • the RNA in the gel was blotted on a nylon finole letter Genescreen-Plus (DuPont) according to the attached protocol, and the RNA was blotted at 80 ° C for one filter. , 2 hours processing. This filter was subjected to Northern analysis according to the protocol attached to Genescreen-Plus.
  • a partial DNA fragment of the FL01 gene used as a probe in Southern analysis and Northern analysis was prepared as follows. Two primers, 5, GATGAAACTGTCATTGTTGTCAAA3 ′ and 5 ′ TCGTTTCAGCAGCTAAAGTAT3 ′, were synthesized based on the nucleotide sequence of the FL01 gene reported by Teuni ssen ⁇ > [Yeast, 9, 423-427, (1993)]. Using these primers, PCR was performed with all DNAs of the agglutinating ABXL-1D strain (a, FL01, Yeast Genetic Stock Center) as type III, and all PCR products were electrophoresed in agarose gel and amplified.
  • FL01 partial length fragment A 1045 bp DNA fragment (hereinafter referred to as FL01 partial length fragment) was cut out from the gel, and a DNA fragment recovered using Prep-A-Gene (Bio-Rad) was obtained. This fragment was labeled with [a-32P] dCTP (Amersham) and used as a probe. Radioactivity was detected using X-ray film.
  • Fig. 1 shows the results.
  • HindII fragments having homology to four FL01 ⁇ genes of about 9.5 kb, 5.4 kb, 4.8 kb, and 3.7 kb were detected.
  • the meiotic strain derived from the KI084 strain the two fragments of about 4.8 kb and 3.7 kb were found in all the tested strains.
  • only a common band and a fragment of about 9.5 kb were detected in only the 4 meiotics determined to be agglutinative in the agglutination test.
  • the transcript of the FL01 gene was observed only in the parent strain and in the meiosis of 4 strains determined to be agglutinative in the agglutination test. From these results, in the meiosis derived from KI084, among the three Hindlll fragments homologous to the FL01 gene, the FL01 homologous fragment containing a part or the full length of the HindII fragment of about 9.5 kb was included. Only the gene was transcribed, suggesting that only strains with this homologous gene became agglutinating.
  • the FL01 homologue of the KI084 strain in which the Hindll fragment of about 9.5 kb includes a part or the entire length thereof, is referred to as Lg-FL01 (Lager Type-FLOl).
  • the band specific to this agglutinated meiosis contains a part or the entire length of the Lg-FL01 gene, and the length of this fragment was measured, and a restriction enzyme map as shown in Fig. 2 was created. .
  • a deletion series for the inserted fragment of pKF-Kpnll was prepared according to the attached protocol using a kit for kilosequencing (Takara Shuzo).
  • the nucleotide sequence was determined using a PCR / Sequencing kit (Perkin-Elma) and a DNA sequencer (Perkin-Elma).
  • the nucleotide sequence was analyzed by DNASIS (Hitachi Software Engineering, Inc.).
  • a 2.9 kb base sequence from the Kpnl site to the Hindi 11 site where a coding region similar to the base sequence of the known FL01 gene was found was determined from both directions.
  • the determined base sequence contained a 2.6 kb 0RF from the middle of the coding region of the -FL01 gene to the stop codon.
  • Fig. 3 schematically shows the acquisition of the full length Lg-FL01FL gene by inverse-PCR. From the nucleotide sequence of the partial length of the FL01 gene, which was determined previously [Fig. 3 (1)], primer5 [5, AATACACAACATGGTGTCCT3 ', Fig. 3 (2)] and primer8 [5' ACCAGAGGTGGAACT ACTGG3 ', Fig. 3 ( 3)] was synthesized. The 60 fig DNA of the agglutinating meiosis KMS004 strain is digested with 300 units of Hindi II (Boehringer), collected by ethanol precipitation, dissolved in 301 TE buffer, and scaled to 300 1 scale.
  • Hindi II Boehringer
  • DNA fragments were self-cyclized using Shokitto (Takara Shuzo). As a result, it is expected that the reaction product contains a cyclic molecule linked to the Hindi II site shown in (4) and (5) in FIG.
  • the reaction product was recovered by ethanol precipitation, and 4 g of the reaction product was converted into a ⁇ form, and the above primer 5 [Fig. 3 (2)] and primer 8 [Fig. 3 (3)] were used as primers in the LA-PCR kit. (Takara Shuzo) was used to perform the inverse-PCR reaction.
  • the composition of the reaction solution was in accordance with the attached protocol, and the reaction was performed using DNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer) for 1 cycle at 94 ° C for 1 minute, 98 ° C for 20 seconds, This was carried out by repeating a cycle of 10 minutes at ° C for 30 cycles.
  • DNA Thermal Cycler 480 Perkin-Elmer
  • a DNA fragment of about 8.2 kb [Fig. 3 (6)] was cut out from the gel, and the DNA fragment was purified using Prep-A-Gene (BioRad) according to the attached protocol. Since this fragment had a BamHl site, an EcoRI site, and an Xbal site in the restriction enzyme map shown in Fig. 2, this fragment contained the unacquired portion of the Lg-FL01 gene. It was judged that it was.
  • This DNA fragment was digested with Alul (Boehringer), ligated to the HincII site of PUC118 (Takara Shuzo), and introduced into Escherichia coli strain DH5 (Toyobo).
  • the plasmid could be classified into 24 types, and the nucleotide sequence of the human fragment was determined for these plasmids by the method described above. It was determined. As a result, one clone having an insert of 467 bp, which was highly homologous to the amino terminal end of the known FL01 gene, was obtained, and the plasmid was designated as KF1. The location of the KF1 insert in the chromosome is shown in FIG. 3 (7).
  • primerKN-2 [5 ′ TTGTATCGGAGTATTTATA3 ′, FIG. 3 (8)] was synthesized.
  • the composition of the reaction solution was in accordance with the attached protocol, and the reaction was carried out using a DNA thermal cycler 480, repeating 30 cycles of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 2 minutes, and then to 72 ° C. One 10 minute reaction cycle was performed.
  • a DNA fragment of about 4.4 kb, about 1.1 kb, and about 0.6 kb was amplified.
  • a DNA fragment of about 4.4 kb [Fig.
  • Plasmid KF14 of the obtained transformant had a BamHI site, an EcoRI site and an Xbal site in the restriction map shown in FIG. 2, and thus Lg-FL01 was contained in this fragment. It was determined that the translation initiation site of the gene and its 5 'upstream were included. In order to partially determine the base sequence in the 3 'direction from the EcoRI site shown in Fig.
  • KF14 was digested with EcoRI and then self-cyclized plasmid, KF14.
  • a 14 A EC was constructed. This plasmid has a fragment between the EcoRI site in (10) and the anneal site of primerKN-2 in (8) in FIG.
  • the nucleotide sequence of the KF14 A Ec insert was partially determined from the EcoRI site. Based on the nucleotide sequence, primerKT5 ′ Ec [5 ′ AGCGGTCGACCTAATAAAGGAAAAGGGGAA3 ⁇ FIG. 3 (11)] was synthesized.
  • primerKT3'Hd [5'GG AAGCTTTTTTGTAAAACAGATTTTTTGCCCCGCTT3 ⁇ Fig. 3 (12)] was performed.
  • PCR was performed using the LA-PCR kit with 2 // g of the DNA of the agglutinating meiotic strain KMS004 as type II. The reaction was carried out by repeating one cycle of 94 ° C for 1 minute followed by 30 cycles of 98 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 10 minutes. As a result of electrophoresis of the reaction product using 0.8!
  • FIG. 4 shows a restriction enzyme map of the full-length fragment of the Lg-FLOl gene.
  • a FL01 gene-broken strain and KY644 strain prepared as follows were used.
  • the FL01 partial length fragment was ligated into the BamHI to HindII site of PRS405 (Stratagene). After cutting the BstEII site, which is present only in the insert fragment, into the agglutinating yeast strain KY642 (a, ura3, leu2, FL08) by the lithium method, this plasmid is homologous to the FL01 locus. Non-aggregated strains were obtained by recombination. It was confirmed by Southern analysis that the FL01 gene of this strain was disrupted by insertion of pRS405, and the strain was named KY644 strain.
  • the full-length fragment of the FL01 gene is PCR amplified by a primer designed to have a Sail site at the 5 'end and a Hindi 11 site at the 3' end. This fragment, Sa Digested with II and Hindlll.
  • a cloning vector the base sequence of CEN3 obtained from Entre1 (National Center for Biotechnology Information), a data bank of gene sequences, and all the bases of yeast chromosome 3 were placed at the EcoRI (Boehringer) site of YIp5.
  • PYT37 into which a 1.2 kb fragment containing CEN3 obtained by PCR based on the sequence and a fragment containing the ARS sequence obtained as an EcoRI-Hindi 11 fragment derived from YRP7 were introduced was used.
  • Example 2 Acquisition of coding region of Lg-FL01 gene by PCR, introduction into experimental yeast, and evaluation
  • primerKTF7 [5 'CCCCAAGCTTGCTC TGCAGTAAATTCCGCA3', FIG. 3 (14)] was synthesized in the 3 'direction from the position 58 bp upstream of the 5' start codon.
  • primerKTORFA [5 'CGGAATTCTA AACACTATAAGCGTGATGATAG3', Fig. 3 (15)] was synthesized. Using these two primers, PCR was performed using the LA-PCR kit with 2 ug of the DNA of the aggregating meiosis KMS004 strain as type II.
  • the reaction was performed by repeating 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 3 minutes and 30 seconds. 0.83 ⁇ 4 of the reaction product!
  • this fragment is referred to as Lg-FL010RF fragment.
  • the -FL010RF fragment has been PCR amplified by a primer designed to have a Hindll site at the 5 'end and an EcoRI site at the 3' end.
  • This fragment is digested with HindIII and EcoRI, and ligated to the HindIII to EcoRI sites so that it is inserted in the forward direction downstream of the GAL1 gene promoter in the yeast expression vector PYES2 (Invitrogen). Then, it was directly introduced into the above-mentioned KY644 strain by the lithium method.
  • the DNA of the obtained transformant was subjected to Southern analysis, and one of the strains confirmed to have introduced the Lg-FL010RF fragment was named KY646 strain.
  • the plasmid of KY646 strain was named YESKT2. .
  • the KY649 strain did not show agglutination under any conditions, whereas the KY646 strain containing the FL010RF fragment showed agglutination in the agglutination measurement buffer when no sugar was added.
  • This agglutinability like the agglutinability of the KY650 strain, is brewer's yeast-type agglutinability, i.e., inhibited by mannose, glucose, and maltose, and to some extent by fructose, but not by galactose. Not inhibited. From these results, it was concluded that brewer's yeast-type cohesiveness could be imparted to experimental yeast by introducing the Lg-FL010RF fragment under the control of the GAL1 ⁇ gene promoter. That is, it was concluded that an Lg-FL01RF gene coding region was present in the Lg-FL010RF fragment.
  • Example 3 Identification of a region governing brewer's yeast-type aggregation in Lg-FL01 ⁇ gene
  • Lg-FL01 and Sc-FL01 were digested with Xhol and Kpnl, blunt-ended using Klenow fragment, and cloned into the HincII site of PUC118.
  • primerKTF8 (5 'CGGGATCCATCTGGCAATACCACACT AACA3'), was synthesized from the ninth bp 63 'downstream of the start codon of the Lg-FL01 gene in the 5' direction.
  • primerKTF and primerKTF8 PCR was performed using the LA-PCR kit with the DNA of the aggregating meiosis KMS004 strain as the ⁇ type. The reaction was carried out by repeating 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 3 minutes and 30 seconds.
  • Lg-FLOIN fragment As a result of electrophoresis of the reaction product using 0.8% agarose, it was observed that a fragment of about 0.7 kb was amplified. Hereinafter, this fragment is referred to as an Lg-FLOIN fragment.
  • the obtained fragment was cloned into pT7Biue (Novadin), a vector for cloning a PCR product, and the nucleotide sequence of the inserted fragment was determined from four directions for four independent clones. All four clones had the same insert.
  • the obtained base sequence is shown as SEQ ID NO: 3 in the sequence listing. One of these clones was named KNTA1.
  • the Lg-FL01N-terminal fragment was PCR-amplified using a primer designed to have a Hindlll site at the 5 'end and a BamHI site at the 3' end.
  • KNTA1 is digested with HindlH and BamHI, the insert separated from the vector is excised from the gel after electrophoresis, purified by the method described above, and inserted in the forward direction downstream of the promoter of the GAL1 gene of PYES2.
  • the plasmid was cloned from HindIII to BamHI, and the resulting plasmid was named KNYES.
  • Escherichia coli EKB707 containing this plasmid, KNYES was deposited on January 27, 1995 with the Institute of Biotechnology, Industrial Science and Technology Institute (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) on January 27, 1995. And the deposit number FERM BP-4983.
  • PCR was performed. The reaction was carried out by repeating a cycle of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 1 minute, 72 ° C for 3 minutes and 30 seconds for 30 cycles. As a result of electrophoresis of the reaction product using agarose, it was observed that a fragment of about 3.9 kb was amplified. Hereinafter, this fragment is referred to as Sc-FL01C end fragment.
  • the Sc-FL01C terminal fragment has been PCR amplified by a primer designed to have a BamHI site at the 5 'end and an EcoRI site at the 3' end.
  • This fragment was digested with BamHI and EcoRI, and ligated to the BamHI-EcoRI site so as to be inserted in the forward direction downstream of the Lg-FL01N terminal fragment of KNYES previously constructed.
  • a portion corresponding to 339 amino acids from the amino terminal of the coding region of the Sc-FLOl gene was replaced with a portion corresponding to 312 amino acids from the amino terminal of the Lg-FL01 gene. Is expected to be constructed.
  • the ligation product was directly introduced into the above KY644 strain by the lithium method.
  • primerFLIDl (5' CCCCAAGCTTTCGTTTGATGTAAGCTCTCT3 '), was synthesized from the 69' bp 5 'upstream of the start codon of the Sc-FLOl gene.
  • primerFLID4 and primerFUD4 as primers, PCR was performed using the LA-PCR kit with 2 g of ABX-1D DNA as type II. The reaction was carried out by repeating 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 1 minute, 72 ° C for 3 minutes and 30 seconds. As a result of electrophoresis of the reaction product using 0.8 agarose, it was observed that a fragment of about 4.8 kb was amplified.
  • SC-FL010RF fragment This fragment is referred to as SC-FL010RF fragment.
  • the Sc-FL010RF fragment has been PCR-amplified with primers designed to have a Hindii site at the 5 'end and an EcoRI site at the 3' end.
  • This fragment is digested with Hindlll and EcoRI, ligated to the HindII-EcoRI site so that it is inserted in the forward direction downstream of the GAL1 gene promoter of pYES2, and the above-mentioned KY644 is directly ligated by the lithium method. Introduced into the strain.
  • the KY647 strain, KY648 strain, and the aforementioned KY649 strain were cultured in the medium described in Table 1 under shaking conditions at 20 ° C until the stationary phase was reached, and then the agglutinating properties were evaluated by the method described above. Was. Table 4 shows the results.
  • the KY649 strain did not show aggregation under any conditions, whereas the KY648 strain containing the chimeric gene of the Lg-FL01N-terminal fragment and the Sc-FLOIC-terminal fragment and the KY647 strain containing the Sc-FL010RF fragment added sugar. When no agglutination was observed, agglutination was exhibited in the agglutination measurement buffer.
  • the aggregation of the KY648 strain was inhibited by mannose, glucose, and maltose, and was inhibited to some extent by fructose, but was not inhibited by galactose.
  • the aggregation of the KY647 strain was inhibited only by mannose, but not by glucose, maltose, fructose and galactose. That is, the Sc-FLOIORF fragment was In addition to concentrating, replace the portion 5 'upstream from the start codon in the 3' direction with 5 'from the 720 bp to the 639 bp in the 3' direction from the start codon of the Lg-FL01 ⁇ gene.
  • Plasmid PUC18 was digested with Kpnl, and the DNA fragment whose terminal was blunted using Klenow fragment was self-ligated to prepare Brassmid PUC18. After digestion of this plasmid with HincII, Kpnl linker (GGGTACCC) was inserted to produce plasmid PUC18 soil K. A 0.9 kb EcoRI-BamHI fragment (including the 5'-flanking region) obtained from plasmid KF14 was inserted between the EcoRI and BamHI sites of this plasmid to prepare plasmid PKF5B1.
  • a 1.7 kb BamHI-Kpnl fragment was obtained from plasmid pKF3HP obtained by inserting the 1.7 kb Hincl I-Pvul I fragment (including the 3 'flanking region) obtained from plasmid pKF-Kpnll into the Smal site of plasmid PUC118.
  • the plasmid was obtained and inserted between the BamHI-Kpnl sites of the plasmid pKF5Bl to prepare a plasmid PKF53-1.
  • Plasmid pSY114P which contains the yeast GPD (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) gene promoter region (1.0 kb) and the yeast PGK (phosphoglycerate kinase) gene terminator (0.4 kb) After digesting Smal with Hindlll linker (CAAGCTTG) and digesting with HindllI, self-ligation was performed to prepare plasmid PSY114H. A 0.5 kb Hindll I fragment of a plasmid pSV2 bsr (Funakoshi) having a blasticidin S resistance gene was inserted into the Hindlll site of this plasmid to prepare a plasmid pGPDBSR.
  • yeast GPD glycol aldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • yeast PGK phosphoglycerate kinase gene terminator
  • the beer yeast was transformed using the electric pulse method.
  • Cohesive brewer's yeast cultured in 200 ml of YPD medium until 0D600 became about 7 was washed twice with sterile water and twice with 1 M sorbitol, and then resuspended in 1 ml of 1 M sorbitol.
  • To 50/1 of the yeast suspension 2.7 g of DNA fragment obtained by digesting plasmid PKF53BSR with EcoRI and 10 g of salmon sperm DNA (Sigma) were added.
  • Gene Pulser A 1.5 KV, 25 F, 200 ⁇ electric pulse was applied using a 0.2 cm cell (BioRad).
  • Example 3 showed that brewer's yeast-type aggregation was controlled by the sequence of 213 amino acids in the N-terminal region of the Lg-FL01 gene. Therefore, the deduced amino acid sequences of this part of the Lg-FLOl ⁇ gene and the Sc-FL01 gene were compared. As a result, as shown in FIG. 8, the following characteristic differences were observed between the two. 1) The Lg-FL01 gene lacks 27 amino acids corresponding to amino acids 84 to 110 of the Sc-FL01 gene. 2) The homology between the Sc-FL01 gene and the Lg-FL01 gene is relatively low up to the 123rd amino acid in the Sc-FLOl gene. 3) Since the 124th amino acid in the Sc-FLOl gene, the homology between the Sc-FL01 124 gene and the Lg-FL01 gene is high.
  • the fragment of the N-terminal region of the modified FL01 gene created in this manner was used for the Hindi II to BamHI site of the plasmid KNWtC3 in Example 3 (between the GAL1 promoter and Sc-FLOl C-terminal fragment). And introduced into the yeast strain KY644.
  • the culture of the obtained transformant and the evaluation of agglutinability were performed in the same manner as in Example 3. The results are shown in FIG.
  • the part of the Lg-FL01 gene involved in brewer's yeast-type aggregation is the part corresponding to 14 amino acids from the 84th amino acid to the 97th amino acid counted in the Lg-FL01 gene, that is, the sequence listing. It was shown to be the sequence shown in SEQ ID NO: 4, which encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • an Lg-Flol protein having an activity of imparting brewer's yeast-type cohesiveness to yeast and an Lg-FL01 gene DNA encoding the protein are provided.
  • yeast Brewer's yeast-type cohesiveness can be imparted to the beer, and yeast's brewer's yeast-type cohesiveness can be enhanced.
  • yeast Brewer's yeast-type cohesiveness can be imparted to the beer, and yeast's brewer's yeast-type cohesiveness can be enhanced.
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Saccharomyces cerevisiae Strain name: KMS004
  • GGC CCA AAT ACT GCC TTT TGG AAT ACT GCC TCT TGG ACT TCT 42 Gly Pro Asn Thr Ala Phe Trp Asn Thr Ala Ser Trp Ser 1 5 10

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Description

明 細 睿
酵母に凝集性を付与する遺伝子及びその遺伝子産物
技術分野
本発明は、 酵母凝集遗伝子およびその利用に関し、 さらに詳細には、 酵母にビ ール酵母型凝集性を付与する活性を有する蛋白、 前記蛋白をコードする DNA 、 前 記 DNA を含むプラスミ ド、 前記 DNA を利用して、 ビール酵母型凝集性を付与また は強化された酵母を製造する方法およびビール酵母型凝集性が欠失または減少し た酵母を製造する方法、 並びに、 前記 DNA の発現を抑制することによって、 酵母 のビール酵母型凝集性を欠失または減少させる方法に関する。
本発明はまた、 前記方法によりビール酵母型凝集性が付与または強化または欠 失または減少した酵母に関する。
さらに、 本発明は、 前記の酵母を培養することを含む醸造製品の製造法、 なら びに当該製造法により得られる醸造製品に関する。 背景技術
ビール、 ワイン等の酒類において、 その醸造に供される酵母の凝集性はその製 品の香味を左右するばかりでなく、 醸造工程の作業上からも重要であることは周 知の事実である。 ドイツを中心に日本、 その他の各国で広く製造されているラガ 一タイプのビールの製造に使用される酵母は、 発酵が終了に近づくと酵母が凝集 して発酵液の底に沈降する特性を持ち、 特に下面酵母と呼ばれている。 ビール醸 造では、 発酵が終了して沈降した酵母を回収して、 さらに次回の発酵に繰り返し て使用するという、 他の醸造では見られない製造上の特徴があるために、 下面酵 母のこの発酵後期に沈降する性質は、 ビール醸造にとつて特に大きな意味を持つ ビール酵母は製品ビールの香味等を決定する大きな要因の一つであるため、 優 秀な酵母を育種することはビール生産者の重要な課題となっている。 その下面酵 母の育種において、 適切な凝集性を持たせることは重要な意味がある。 なぜなら ば、 凝集性が強すぎる酵母は発酵途中に発酵液中で沈降してしまい、 それ以降の 発酵が進まず、 逆に、 凝集性が無い酵母は発酵後期になっても浮遊したままで、 酵母をビールから取り除くために遠心分離などの操作が必要になる。 したがって 、 発酵の初期には発酵液中に分散して、 しかも発酵後期には凝集性が強くなつて 良く沈降する酵母が現在の製造法には相応しい酵母である。 製造法が異なれば、 それに適した凝集性を持つ酵母が必要なのは言うまでもない。
これらの産業上重要な性質である酵母の凝集性に関する膨大な研究にもかかわ らず、 酵母凝集の機構は未だ明らかにされておらず、 酵母自体の改良による凝集 性の制御は成功しているとは言い難い。 長年に渡る酵母の遗伝子レベルの研究か ら、 酵母の凝集性に関与する遺伝子として、 FL01、 f l o3、 FL05、 FL08、 s f l l、 f s ul、 f su2、 tupl、 cyc8、 cka2 FMC1などの遺伝子、 およびミ トコンドリア DNA 中 の ol i l、 ox i 2遺伝子の存在がこれまでに確認されてきた。 これらの酵母の凝集性 に関与する遺伝子の分子レベルの研究としては、 FL01遺伝子の単離とその解析が なされている [YEAST, 9， 423 (1993) および YEAST, 10, 211 (1994)]。 また、 FL 05遺伝子の単離とその解析についても報告されており、 そこでは、 FL05遺伝子は これまで報告されている FL01遺伝子と酵母染色体 DNA 上で存在位置が異なるもの の、 制限地図および DNA塩基配列がほぼ同等であることが示されている [J. I ns t . Brew. , 85, 95， (1979) および Curr. Gene t. , 25， 196 (1994)] 。
しかしながら、 これらの遺伝子の分子レベルでの解析は十分なものではなく、 これらの遺伝子が酵母の凝集にどのようなメカニズムで関与しているのかは明ら かにされていない。 また、 FL01および FL05遺伝子以外の酵母の凝集性に関与する 遗伝子については、 単離やその構造解析すら行われておらず、 これらの遺伝子が コードしている蛋白についても全く報告されていない。
上記のような酵母の凝集性に関与する遗伝子を利用して、 酵母の凝集性を改良 する試みとしては、 サッカロマイセス ·セレピシェの凝集遺伝子である FL01遺伝 子の導入によって、 ビール酵母を含む各種非凝集性酵母へ凝集性を付与するとい う報告がある [Agr i c. B i ol. C em. , 55， 1547 (1991)]。 しかしながら、 このよ うにして取得された形質転換体であるビール酵母の凝集能は発酵の初期から発現 し、 発酵が遅れ気味になることが報告されている [醸造協会誌 88, 665 (1993)] 。 したがって、 この FL01遗伝子による酵母への凝集性付与は好ましい様式で制御 されているとは言い難く、 実用化のためには更なる改良が必要であった。 さらに 、 FL01遗伝子は酵母に凝集性を付与することができることは知られていたが、 そ の遗伝子産物の酵母凝集における役割は、 解明されていない。 FL01遺伝子の DNA 塩基配列から推定されるアミノ酸配列の解析より、 FL01遺伝子産物は酵母細胞表 層に局在すると推定されていた。 このことは、 凝集性ビール酵母特異的に酵母細 胞表層から取得される蛋白 （f l occu l i n)の N末端の 14残基のアミノ酸配列が、 FL 01遺伝子の DNA塩基配列から推定されるアミノ酸配列と相同性が有るという報告
[Appl. Envi ron. Mi crobi ol . , 60, 2754 (1994)] からも支持されると考えられ るが、 この蛋白の機能解明には至っていない。 また、 凝集性酵母特異的な酵母細 胞表層蛋白は他にも幾つか知られているが、 いずれもその役割は解明されていな い。 このため、 FL01遺伝子を改変することによって、 酵母凝集を制御するという 試みは、 行き詰まつていた。
FL01遺伝子以外の遺伝子を利用する試みとしては、 細胞融合法を用いた FL05遺 伝子による酵母への遺伝形質の付与が試みられ、 その遺伝形質付与の有用性が示 された [J. Ins t. Brew. , 98, 315 (1992)] 。 しかしながら、 遺伝形質導入法が 細胞融合法であるために、 目的とする形質をもつ酵母を取得するのが困難である ばかりでなく、 取得された酵母には目的とする凝集関連遺伝子以外の DNA配列も 導入されてしまい、 たとえば、 多くのサッカロマイセス 'セレピシェのもつ、 ビ 一ルにフヱノール臭を付加する P0F1遺伝子も同時に導入される [Proc， Euに Bre . Conv. 497 (1981)]という問題を生じていた。 すなわち、 本方法による実用酵 母の凝集性の改良は、 制御されているものとは言い難い。
以上のように、 これまで試みられてきた酵母の凝集に関与する遺伝子を用いる 酵母の凝集能の改良は、 実用に耐えうるものではなかった。
したがって、 本発明は、 以下の各事項：
(1) 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有する蛋白を提供すること ；
(2) 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有する蛋白をコードする遣伝 子 DNA を提供すること ；
(3) 上記の遺伝子 DNA を利用して、 ビール酵母型凝集性が付与または強化され た酵母、 あるいはビール酵母型凝集性が欠失または減少した酵母の製造方法、 な らびに該方法によりビール酵母型凝集性が付与または強化または欠失または減少 した酵母を提供すること；
(4) 上記の遺伝子 DNA の発現を抑制することによって、 酵母のビール酵母型凝 集性を欠失または減少させる方法を提供すること、 ならびに
(5) 上記の酵母を培養することを含む醸造製品の製造法ならびに該製造法によ り得られた醸造製品を提供することも目的とする。 発明の開示
本発明者らは、 上記の各課題を解決すべく、 下面ビール酵母の凝集性に関して 鋭意研究した結果、 凝集性下面ビール酵母が特異的に持つ FL01相同遺伝子 （以下 、 Lg-FLOl 遺伝子） の存在と、 Lg- FL01 遺伝子と凝集性の関係を明らかにし、 次 いで、 この Lg- FL01 遺伝子を導入することによって - FL01 遺伝子産物を FL01遺 伝子が破壌されて非凝集性になっている酵母内で生成せしめたところ、 ビール酵 母型の酵母凝集が引き起こされることを見い出した。 これは、 ビール酵母型凝集 性の付与のみならず、 実験酵母型凝集性を持つ酵母のビール酵母型凝集性への転 換も意味する。 さらに、 当該遺伝子産物における下面ビール酵母型の酵母凝集を 決定している領域を決定した。 また、 本発明者らは、 Lg- FL01 遺伝子を破壊した ものを凝集性の下面ビール酵母に導入することにより、 その酵母を非凝集性に転 換させることに成功して、 本発明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は、 実質的に配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列を有 する Lg- FL01 遺伝子産物、 あるいは、 実質的に配列表の配列番号 1に示したアミ ノ酸配列を有するぺプチドを含み、 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を 有する蛋白、 あるいは実質的に配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列のうち 、 25番目のァミノ酸残基から 213 番目のァミノ酸残基を含むァミノ酸配列を有す るポリベプチドを含み、 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有する蛋白 、 あるいは実質的に配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列のうち、 少なくと も 25番目のァミノ酸残基から 97番目のァミノ酸残基を含むァミノ酸配列を有する ポリべプチドを含み、 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有する蛋白、 さらには、 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有し、 実質的に配列表の 配列番号 2に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。 尚、 「実質 的に」 とは、 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有する限りアミノ酸配 列の一部にアミノ酸の幾つかについて欠失、 置換、 付加、 重合などを許容するこ とを意味するものである。
また、 本発明は、 実質的に配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列をコード する塩基配列を含む遺伝子 DNA 、 あるいは実質的に配列表の配列番号 1に示した ァミノ酸配列のうち、 25番目のァミノ酸残基から 213 番目のァミノ酸残基を含む アミノ酸配列を有するボリペプチドをコードする塩基配列を含む DNA 、 あるいは 実質的に配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列のうち、 少なくとも 25番目の ァミノ酸残基から 97番目のァミノ酸残基を含むァミノ酸配列を有するポリベプチ ドをコードする塩基配列を含む DNA を提供する。 尚、 「実質的に」 とは、 酵母に ビール酵母型凝集性を付与する活性を有する限りアミノ酸配列の一部にァミノ酸 の幾つかについて欠失、 置換、 付加、 重合などを許容することを意味するもので ある。
さらに、 本発明は、 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有するァミノ 酸配列をコードする塩基配列を含み、 配列表の配列番号 3に示した塩基配列のう ち 59番目の塩基から 697 番目の塩基までの配列を含む DNA またはその相捕鎖であ る DNA 、 あるいは酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有する蛋白をコ一 ドする塩基配列を含み、 配列表の配列番号 3に示した塩基配列のうち、 131 番目 の塩基から 697 番目の塩基を含む DNA またはその相補鎖、 あるいは配列表の配列 番号 3に示した塩基配列のうち、 131 番目の塩基から 349 番目の塩基を含む DNA またはその相補鎖、 さらには、 配列表の配列番号 4に示した塩基配列を含み、 酵 母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有するポリべプチドをコ一ドする DNA またはその相補鎖を提供する。
本発明はまた、 ブラスミ ド KTYT2、 YBSKT2. KNWtC3または KNYES に組み込まれ 、 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有する蛋白をコードする塩基配列 を含む DNA 、 ならびに前記の DNA を含むプラスミ ドを提供する。
本発明はまた、 前記の DNA を導入することを特徴とする、 ビール酵母型凝集性 が付与または強化された酵母の製造方法、 ならびに前記の DNA を破壊することに よって、 ビール酵母型凝集性を付与する活性を持つ蛋白を発現させる能力を欠失 または減少させた DNA を導入することを特徴とする、 ビール酵母型凝集性が欠失 または減少した酵母の製造方法を提供する。
さらに、 本発明は、 前記いずれかの方法により製造されたビール酵母型凝集性 が付与または強化または欠失または減少した酵母を提供する。
本発明はまた、 前記の DNA の発現を抑制することによって、 酵母のビール酵母 型凝集性を欠失または減少させる方法も提供する。
さらに、 本発明は、 前記の酵母を培養することを含む醸造製品の製造法、 およ びその醸造製品を提供する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 ビール酵母およびその減数対の FL01遺伝子に関するサザンおよびノ ザン解析による電気泳動の結果 （写真） を示す。
第 2図は、 Lg-FLOl 遺伝子の制限酵素地図を示す。
第 3図は、 i nverse PCR による Lg-FL01 遣伝子の全長クローニングの概念図を 示す。
第 4図は、 Lg- FL01 遺伝子全長断片の制限酵素地図を示す。
第 5図は、 - Sc-キメラ FL01遺伝子構築の概念図を示す。
第 6図は、 Lg-FL01 遣伝子破壊用プラスミ ドの構築図を示す。
第 7図は、 Lg-FL01 遗伝子破壊用プラスミ ドの構築図 （続き） を示す。
第 8図は、 - FL01 遺伝子と Sc-FLOl 遺伝子の N末部分の推測されるアミノ酸 配列の比較を示す。
第 9図は、 各種の改造型 FL01 遺伝子を持つ株の凝集の表現型を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。 なお、 本明細書では、 「DNA」 、 「塩基配列 」 、 「遺伝子」 および 「遺伝子 DNA」 という用語を実質的に同義のものとして用 いることとする。 また、 本明細耆では、 「アミノ酸配列」 、 「ペプチド」 、 およ び 「蛋白」 という用語を実質的に同義のものとして用いることとする。 〈酵母細胞間凝集〉
酵母細胞間の凝集は、 a型細胞と α型細胞間の性的凝集、 出芽娘細胞の母細胞 からの未分離、 非性的凝集などに起因することが知られているが、 本発明は、 こ れらのうちの非性的凝集の制御を目的とする。
非性的凝集の機構を説明するモデルとしては、 凝集性酵母の細胞表層にあるレ クチン様蛋白と糖鎖の結合で隣り合う酵母が結合しているとするレクチン仮説 [ J. Bacter i o l. , 150, 878 (1982)] が有力であるが、 レクチン様蛋白の同定は成 されていない。 このことが、 酵母凝集の制御が未だ困難である要因でもある。 非性的凝集は、 それを阻害する糖の種類によって、 マンノース特異的な Fl ol夕 イブと、 マンノースの他にマルトースゃグルコース等によっても阻害される NewF l oタイプの、 大きく 2つに分類できることが報告されている [YEAST, 7， 559 (19 91)]。 本発明者らは、 一般的な下面ビール酵母の凝集性は NewFl oタイプに属する ことを発見した。 本明細書では、 理解を容易にするため、 これらのタイプの凝集 性を以下のような用語で示す。
すなわち、 一般的な実験酵母が示す凝集性である、 共存するマンノースにより 阻害される力《、 マルトース、 グルコースなどでは阻害されない凝集性を、 本明細 書では 「実験酵母型凝集性」 という用語で示す。 また、 一般的な下面ビール酵母 に代表される酵母が示す凝集性である、 共存するマンノースの他にマルト一ス、 グルコース等によっても阻害される凝集性を、 「ビール酵母型凝集性」 という用 語で示す。 両タイプの凝集性は共にガラク ト一スでは、 凝集が阻害されない。 本 発明者らは、 下面ビール酵母が 「ビール酵母型凝集性」 という形質を持つことは 、 以下の理由から、 少なくともビール製造において、 非常に重要であると推察す る。 すなわち、 この 「ビール酵母型凝集性」 力 実験酵母の持つ凝集性と大きく 異なるのは、 グルコース、 マルトースなどでも阻害されることである。 ビールは 、 麦汁をビール酵母で発酵して製造されるものであるが、 この麦汁中には、 約 6 %のマルトースおよび約 1 %のグルコースが含まれていることから、 これらの糖 によって凝集阻害がかかるということは、 重要な意義を持つ。 言い換えれば、 こ の 「ビール酵母型凝集性」 の性質のために、 麦汁に添加されたビール酵母は、 麦 汁中の糖類により凝集が阻害され、 麦汁中に分散できるため、 発酵が速やかに進 行する、 そして、 発酵後期に発酵液中の糖濃度が低くなると、 凝集阻害が弱くな つて、 酵母は凝集塊となり沈降するために、 酵母回収が容易になると推察できる
〈Lg— Fl ol蛋白〉
Lg-Fl ol 蛋白は、 本来、 ビール酵母型凝集性を示す下面ビール酵母およびその 減数体に特徴的な FL01相同遺伝子、 すなわち、 Lg-FL01 遺伝子がコードする蛋白 、、ある。
本発明は Lg- Fl ol 蛋白および誘導体を包含する。 Lg- Fl ol 蛋白は、 酵母、 特に サッカロマイセス ·セレビシェ (Saccharomyces cerev i s iae) カヽら誘導されうる ものであり、 酵母にビール酵母型凝集性を付与できる性質を有する。 Lg-Fl ol 蛋 白は、 実質的に配列表の配列番号 1に示したァミノ酸配列をそのァミノ酸配列中 に含む。 「実質的に配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列」 とは、 「配列表 の配列番号 1に示したァミノ酸配列」 に加えて、 酵母にビール酵母型凝集性を付 与する限りにおいて、 配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列が改変されたァ ミノ酸配列、 すなわち配列表の配列番号 1に示したァミノ酸配列の一部にァミノ 酸が付加、 挿入、 欠失または置換されたアミノ酸配列を含むものである。
本発明の 「配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列」 は、 公知の実験酵母 FL 01遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列と相同性が有る。 しかしながら 、 両者の決定的な違いは、 本発明の 「配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列 」 を含む Lg- Fl ol 蛋白およびその誘導体は、 前述したビール酵母にとって重要な 性質である 「ビール酵母型凝集性」 を酵母に付与できることである。 本発明が完 成して初めて、 Lg-Fl ol 蛋白およびその誘導体が、 「ビール酵母型凝集性」 を酵 母に付与できることが示された。
凝集性ビール酵母の細胞表層から取得された蛋白である f l occul i n はその生物 学的機能については解明されていないが、 N末端の 16残基のアミノ酸配列が決定 されている（*TQACLPVG*RKNGMN: * は同定出来なかったアミノ酸残基 [Appl. Env i ron.， Mi crobi ol. , 60, 2754 (1994)]。 本発明により、 初めて機能が解明された Lg-Fl ol 蛋白は、 この配列を含んでいる （配列表の配列番号 1の 25番目から 40番 目） 。 本発明の Lg-Fl ol 蛋白と f l occu l i n が同一であるという証拠は現時点では ない。 しかしながら、 本発明の Lg- Fl ol 蛋白でも、 配列表の配列番号 1の 1番目 から 24番目のアミノ酸配列の相当する領域は、 Lg- Fl ol 蛋白が細胞表層に局在す るために必要な分泌シグナル配列である可能性は極めて高い。 すなわち、 凝集性 酵母の細胞表層に局在し、 酵母に凝集性を付与する活性をもつ蛋白は、 配列表の 配列番号 1の 25番目以降のァミノ酸配列をもつ蛋白であると推察される。
〈し g-FLOl 遗伝子〉
本発明は Lg- FL01 遺伝子 DNA を包含する。 ここで、 「Lg-FL01 遺伝子 DNA 」 と は、 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を持つ Lg-Fl ol 蛋白およびその誘 導体をコードする塩基配列を含む DNA をいうものとする。
具体的には、 本発明は、 実質的に配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列を 有する蛋白をコードする塩基配列を含む遺伝子 DNA を包含する。 なお、 ここでい う 「アミノ酸配列を有する蛋白をコードする塩基配列」 とは、 縮重関係にある全 ての塩基配列を意味している。
本発明を完成するために不可欠であつたのは、 実施例 1に記載した、 ビール酵 母型凝集性を示す下面ビール酵母およびその減数体は、 特徴的な FLOけ目同遺伝子 を持っていることの発見であった。 明細書中では、 この 「ビール酵母型凝集性を 示す下面ビール酵母およびその減数体に特徴的な FL(n相同遺伝子」 を 「Lg- FL01 遗伝子」 という用語で示している。 しかしながら、 この発見だけでは、 「Lg-FL0 1 遺伝子」 が 「ビール酵母型凝集性」 を付与する活性を持つことには、 全く IIが らない。 本発明完成には、 更なる工夫が必要であった。
また別の見地からすると、 本発明は、 プラスミ ド KTYT2 に組み込まれ、 酵母に ビール酵母型凝集性を付与する活性を有する蛋白をコードする塩基配列を含む DN A も包含する。
以上に記載した本発明の DNA を総称して、 以下、 「 - FL01 遺伝子 DNA 」 とい うこととする。
本発明の Lg-FL01 遺伝子 DNA は、 天然物由来のものでも、 全合成したものでも 、 あるいは天然物由来のものの一部を利用して合成を行ったもの、 すなわち半合 成のものでもよい。 〈形質転換〉
本発明の Lg-FL01 遺伝子 DNA を導入することにより、 ビール酵母型凝集性が付 与あるいは強化された酵母を得ることができる。
Lg-FL01 遗伝子 DNA を導入する方法としては、 遺伝子工学の分野において慣用 されているものを用いればよく、 それを慣用基準 [ANALYTICAL B IOCHEMISTRY 16 3. 391 (1987)等] に準じて実施すればよい。 具体的には、 所望の DNA をべクタ 一に組み込んでこれを酵母に導入する方法、 ベクタ一に組み込まずに直接酵母に 導入する方法などを挙げることができる。
上記の DNA をベクターに組み込んでこれを酵母に導入する方法において、 使用 可能なベクターとしては、 たとえば、 YRp 系 （酵母染色体の ARS 配列を複製起点 とする酵母用マルチコピーベクター） 、 YEp 系 （酵母の DNA の複製起点を 持つ酵母用マルチコピーベクター） 、 YCp 系 （酵母染色体の ARS 配列を複製起点 として持ち、 かつ酵母染色体のセントロメァの DNA配列を持つ酵母用シングルコ ピーベクター） 、 Yip 系 （酵母の複製起点を持たない酵母染色体組み込み用べク ター） 等、 知られているもの全てのものを用いることができる。 これらのベクタ —は文献に記載されており [医学出版センター刊、 「酵母のニューバイオテクノ 口ジ一」 、 p. 284]、 容易に作製することができる。
ベクターに組み込まずに直接酵母に DNA を導入する手法の代表的なものとして は、 薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を持つプラスミ ドと導入する DNA 配列と で同時に酵母を形質転換する共形質転換法をあげることができる （特公平 5- 6091 8 号公報） 。
上記のような方法において、 導入した遺伝子 DNA を酵母中で発現させるために 、 あるいは発現を増加もしくは減少させるためには、 転写および翻訳を制御する ユニッ トであるプロモーターを本発明 DMA鎖の 5 ' —上流域に、 ターミネータ一 を 3 ' —下流域にそれぞれ組み込めば良い。 このプロモーターおよびターミネ一 ターとしては、 Lg- FL01 遺伝子それ自身に由来するものの他、 アルコールデヒ ド 口ゲナーゼ遗伝子 [J. Bi ol. Chem. , 257, 3018 (1982)] 、 ホスホグリセレート キナーゼ遺伝子 [Nucl e i c Aci ds Res. , 10， 7791 (1982)]、 グリセロールアルデ ヒ ドー 3—燐酸デヒ ドロゲナーゼ遺伝子 [J. Bi ol. Chem. , 254, 9839 (1979)] 等既に知られている遗伝子由来のもの、 もしくは、 人工的にそれを改良したもの の使用が可能である。 より具体的には、 ADH (別名 ADC ) 、 GAPDH (別名 GPD)、 PH0 、 GAL 、 PGK 、 BNO 、 TRP 、 H I P 等のプロモーターやターミネータ一を使用 することができる。
さらに、 適当なプロモーターを選択することにより、 本発明 DNA 鎖の遺伝子を 酵母中で制御して発現させることも可能である。 例えば、 ガラク トキナーゼ遺伝 子のプロモーターを使用すれば、 培地の糖源をたとえばグルコースからガラク 卜 —スに変えることにより発現を增加させることができる。
また、 本発明の Lg-FL01 遗伝子 DNA を破壌することによって、 Lg- Fl ol 蛋白を 発現させる能力を欠失または減少させた DNA を導入することにより、 凝集性が欠 失または減少した酵母を得ることができる。 Lg-Fし 01 遺伝子 DNA の破壊は、 Lg- F L01 遣伝子の Lg- Fl ol 蛋白発現に関与する領域、 たとえば、 プロモーター領域や コード領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるいは欠失させたり、 これ らの領域全体を欠失させることにより行うことができる。 このようにして Lg- FLO 1 遗伝子を破壊することによって、 Lg-Fl ol 蛋白を発現させる能力を欠失または 減少させた DNA は、 上記した MA導入法と同じ手法で酵母に導入することができ る。 その導入によって、 ホスト酵母の染色体 DNA 中の Lg- FL01 遗伝子と導入した DNA との間で相同組換えが起こり、 ホスト酵母の - FL01 遺伝子が分断されて Lg -Fl ol 蛋白を発現する能力が欠失または減少し、 その結果、 ホスト酵母の凝集性 が欠失または減少すると考えられる。
本発明において形質転換すべき酵母、 すなわちホスト酵母、 は分類学上、 酵母 の範疇に人りうる任意のものでありうるが、 本発明の目的からすれば、 サッカロ マイセス ·セレピシェに属する酒類製造用酵母、 具体的にはビール酵母、 ワイン 酵母等、 あるいは、 アルコール製造に用いられる酵母等が好ましい。
本発明は、 上記の Lg-FL01 遺伝子 DNA の発現を抑制することによって、 酵母の 凝集性を欠失または減少させる方法をも包含する。 このような方法の例としては 、 Lg-FL01 遗伝子 DNA を破壊することによって、 Lg- Fl ol 蛋白を発現させる能力 を欠失または減少させた DNA を導入する方法、 アンチセンス R N A法等を挙げる ことができる。 本発明は、 実施例 1 ( 6 ) に示したような、 上記の Lg-FL01 遺伝子 DNA を実験 酵母型の FL01遗伝子などと入れ替えることによる、 実験酵母型凝集性をビール酵 母型凝集性に転換する方法をも包含する。 また、 この逆の転換も本発明により提 供された Lg- FL01 遺伝子 DNA により可能である。
本発明の酵母を培養することを含む醸造製品は、 ビール、 清酒、 焼酎、 ワイン 、 ウィスキー、 ブランデーを含むアルコール飲料、 また醬油、 味噌、 みりんなど の調味料、 さらには、 燃料用アルコールなどを包含する。 本発明における醸造製 品の製造法としては、 前記醸造製品に係わる醸造過程を包含する。
以下、 実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、 本発明はこれらの実施例に よって限定されるものではない。
〔実施例 1〕 ビール酵母型凝集に深く関与する FL01相同遺伝子のクローニング ( 1 ) ビール酵母の凝集性に関与する遺伝子の探索
ビール酵母の凝集性に関与する遺伝子を探索する目的で、 以下の実験を実施し た。 凝集性ビール酵母、 K I 084株から、 S tewar tの方法 [J. I ns t. Brew.， 93, 21 6-219, (1987) ]によって胞子を形成させ、 染色体数の減少した株 （以降、 このよ うな株を減数体と呼ぶ） を作成した。 得られた減数体の内、 6株に関して、 第 1 表に記載した培地を用いて 20°Cで静置条件下で 48時間培養した。 培養後の細胞は 遠心にて集菌し、 0. 1M EDTAで 2回洗浄後、 滅菌水で 2回洗浄し、 滅菌水に再懸 濁した。 この細胞の凝集性判定を以下の方法によって行なった。 すなわち、 最終 0D600=2. 0となるように、 凝集測定用緩衝液 （50mM酢酸ナトリウム、 0. 1 ¾!塩 化カルシウム、 pH4. 6) に懸濁し、 室温で 30分間置いた後、 20秒間激しく攪拌し 、 さらに 5分間静置した後、 目視によって凝集、 非凝集の別を判定した。 この結 果、 供試した 6株の減数体は、 2株の非凝集性株と 4株の凝集性株に分類された 第 1表
凝集測定用培地 ガラク トース 50 g/1
YNB w/o AA & AS * 1.7 g/1
アミノ酸
ァスパラギン酸 100 mg/ml
グルタミン酸 100 mg/ml
スレオニン 100 mg/ml
セリ ン 100 mg/ml
リ ジン塩酸塩 100 mg/ml
アルギニン 100 mg/ml
* ： アミノ酸および硫酸アンモニゥムを含まないイースト .ナイ トロジェン - ベース。 形質転換体の培養に際してはこの組成の培地に、 硫酸アデニン、 トリプ トフアン、 ヒスチジン塩酸塩をそれぞれ 20mg/ml となるように添加した培地を用 いた。 これらの株から、 以下に述べるようにサザン解析およびノザン解析を行なつた 。 全 DNAの抽出は、 YPD培地 [2% パク 卜ペプトン （ディフコ社） 、 1¾酵母抽 出物 （ディフコ社） 、 Vk グルコース] で 30°Cで振とう培養し、 静止期に達した 細胞から、 Herefordらの方法 [Cell, 18， 1261-1271, (1979)]によって実施した 。 抽出された DNAは 2tzg相当を Hindlll (ベーリ ンガー社） で消化し、 1%了ガ ロースゲルを用いて電気泳動後、 ナイロンフィルター Hybond N+ (アマシャム社 ) に、 そのプロトコールに従ってブロッテイングを行ない、 その後のサザン解析 に供試した。 また、 全 RNAの抽出は、 これらの株に関し、 第 1表に記載の培地を 用いて 48時間、 20°Cで静置培養を行なった細胞から、 Villeneveと Meyerの方法 [Cell, 48, 25-37 (1987)] によって実施した。 得られた RNAの 10 gを、 16 1のグリオキサール · DMS0溶液 [1M グリオキサール、 50¾！ DMSO, 10mM りん酸 ナトリウム緩衝液 （PH7. 0)] 中で、 1時間、 50°Cの処理によってグリオキサール 化を行なった後、 2 1のアプライ用緩衝液 [50¾ (w/v) グリセロール、 10mM りん酸緩衝液 （PH7. 0) 、 0. 4¾ (w/v) ブロムフ ニルブル一] および 1 z lの lmg/ml 臭化工チジゥム溶液を加え、 10mM りん酸ナトリウム緩衝液 （pH7. 0) 、 1% ァガロースを含むゲル中で電気泳動を行なった。 電気泳動中は、 ペリスタ ポンプを用いて、 電気泳動層中の緩衝液を常に循環させ、 PHの勾配が生ずること を防いだ。 ブロムフユニルブルーがゲルの長さの 70%程度まで達したときに電気 泳動を中止し、 紫外線トランスイルミネーターを用いて臭化工チジゥムで染色さ れたゲル中の RNAを観察し、 リポゾ一マル RNAを指標に RNAが分解されていない ことを確認した。 その後に、 ゲル中の RNAを、 その添付されたプロ トコールに従 つて、 ナイロンフイノレター Genescreen-Pl us (デュポン社） にブロッテイ ングし 、 RNAがブロッテイングされたフィルタ一に対し、 80°C、 2時間の処理を行なつ た。 このフィルタ一は、 Genescreen-Pl usに添付されたプロ トコールに従ってノ ザン解析に供試した。
サザン解析およびノザン解析にプローブとして用いた FL01遺伝子の部分長の DN A断片は、 以下のように調製した。 Teuni ssen ζ> [Yeas t, 9, 423-427, (1993)] の報告した FL01遺伝子の塩基配列をもとに、 5， GATGAAACTGTCATTGTTGTCAAA3'と 5' TCGTTTCAGCAGCTAAAGTAT3'の 2種のプライマ一を合成した。 これらのプライマー を用い、 凝集性 ABXL- 1D株 （a， FL01, Yeas t Genet i c Stock Center) の全 DN Aを铸型として PCRを行ない、 全 PCR産物を ァガロースゲル中で電気泳動し、 増幅された 1045bpの DNA断片 （以降、 FL01部分長断片と呼ぶ） をゲルから切り出 し、 Prep-A-Gene (バイオラッ ド社） を用いて回収した DNA断片を得た。 この断 片は、 [ a -32P] dCTP (アマシャム社） で標識し、 プローブとして用いた。 放射 能の検出は、 X線フィルムを用いて行なった。
結果を第 1図に示す。 サザン解析の結果、 親株 KI 084には、 約 9. 5kb、 5. 4kb 、 4. 8kb、 3. 7kbの 4本の FL01遗伝子と相同性のある H i nd i I I断片が検出された 。 KI084株に由来する減数体株では、 約 4. 8kbと 3. 7kbの 2本の断片に関しては 供試した全ての株に見られた。 また、 凝集性判定試験で凝集性と判定された 4株 の減数体についてのみ、 共通なバンドに加えて約 9. 5kbの断片が検出された。 ま た、 ノザン解析の結果から、 親株および凝集性判定試験で凝集性と判定された 4 株の減数体についてのみ、 FL01遺伝子の転写産物が観察された。 これらの結果か ら、 KI084に由来する減数体では、 FL01遺伝子と相同な 3本の Hi nd l l l断片の内 、 約 9. 5kbの Hi nd i I I断片に一部もしくは全長が含まれる FL01相同遗伝子のみが 転写され、 この相同遺伝子を持つ株のみが凝集性となることが示唆された。 以降 、 この K I 084株の約 9. 5kbの Hi nd l l l断片に一部もしくは全長が含まれる FL01相 同遺伝子を、 Lg-FL01 (Lager Type-FLOl)と呼ぶ。
( 2 ) Lg- FL01遗伝子の制限酵素地図の作成
KI 084株に由来する減数体の内、 凝集性の KMS004株および、 非凝集性の KMS001 株の各 1株ずつを選び、 前述の方法で DNAを調製し、 数種類の制限酵素 （ベーリ ンガ一社） を単独で、 もしくは 2種の酵素を組み合わせて用い、 前述の FL01部分 長断片をプローブとしたサザン解析を実施した。 その結果、 凝集性の KMS004株に は常に、 非凝集性の減数体と共通な 2本のバンドの他に、 非凝集性の減数体には 観察されない 1本のバンドが検出された。 この凝集性減数体に特異的なバンドに Lg- FL01遺伝子の一部、 もしくは全長が含まれると考えられ、 この断片の長さを 測定し、 第 2図に示すような制限酵素地図を作成した。
( 3 ) Lg-FL01遺伝子の部分長を含む Kpn l断片のクロ一ニング
第 2図に示した制限酵素地図をもとに、 約 5. 6kbの Kpn l断片のクローニングを 試みた。 K I084株に由来する凝集性の減数体 KMS004株の DNAを Kpnl (ベーリンガ 一社） で完全消化後、 0. 81¾ァガロース電気泳動法により分画し、 約 5. 6kbに相当 する DNA断片ミックスをゲルより切り出し、 透析チューブ中で電気溶出すること により精製した。 前述の FL01遺伝子の部分長をプローブとしたサザン解析により 、 精製した DNA断片ミックス中に、 目的の DNA断片が含まれているのを確認した 後に、 Kpn lで完全消化したプラスミ ド pUC18 (宝酒造） と精製 DNA断片ミックス を DNAライゲーシヨンキッ ト （宝酒造） を用いて連結し、 大腸菌 DH5 （BRL社 ) を形質転換した。 得られた形質転換体のうち、 5000株について、 ナイロンフィ ルター Hybond N+ (アマシャム社） に添付プロ トコールに従ってブロッティ ング し、 前述の FL01部分長断片をプローブとしたコロニーハイブリダイゼーションを 実施し、 10株の陽性株を取得した。 これらの陽性株からアルカリ法によってブラ スミ ドを調製し、 制限酵素解析を行なった結果、 これらの株がもつプラスミ ドは 同一の挿入断片を持っていることが確認できた。 その中の 1株のプラスミ ド、 pK F- Kpnllの挿入断片について、 凝集性減数体 KMS004株と非凝集性減数体 KMS001株 の DNAをコントロールとするサザン解析をした結果、 挿入断片は目的の Lg- FL01 遺伝子の一部であることが確認できた。
( 4 ) Lg-FL01遺伝子の部分長を含む Kpnl断片の一部の塩基配列決定
pKF-Kpnllの揷入断片の塩基配列を決定するために、 キロシーケンス用 デレ ーシヨンキッ ト （宝酒造） を用い、 添付プロトコールに従って pKF- Kpnllの挿入 断片のデレ一シヨンシリーズを作成した。 塩基配列の決定は、 PCR/Sequencing キッ ト （パーキン 'エルマ一社） を用い、 DNAシーケンサ （パーキン 'エルマ一 社） によって行なった。 塩基配列の解析は、 DNASIS (日立ソフ トウヱァェンジニ ァリング社） によって行なった。 既知の FL01遗伝子のコード領域の塩基配列と相 同なコード領域が見出された Kpnl部位から Hindi 11部位までの 2.9kbの塩基配列 を両方向から決定した。 決定された塩基配列中には、 - FL01遺伝子のコード領 域の途中から、 終止コドンに至る 2.6kbの 0RFが存在していた。
( 5 ) inverse-PCRによる Lg-FL01遗伝子の全長の取得
inverse- PCRによる Lg-FL01遗伝子の全長の取得を模式的に第 3図に示す。 先 に決定した - FL01遺伝子の部分長 [第 3図 （1)] の塩基配列より、 primer5 [ 5， AATACACAACATGGTGTCCT3'、 第 3図 (2)] および primer8 [5' ACCAGAGGTGGAACT ACTGG3' 、 第 3図 （3)] を合成した。 凝集性減数体 KMS004株の DNA 60 fig を 300 ュニッ 卜の Hindi II (ベーリンガー社） で消化し、 エタノール沈殿で回収後、 30 1の TE緩衝液に溶解し、 300 1のスケールで0 八ラィゲ一ションキッ ト （宝 酒造） を用いて DNA断片の自己閉環化を行なった。 その結果反応物中に、 第 3図 中の（4)および（5)に示された Hindi II部位が連結した環状分子が存在している ことが期待される。 この反応生成物をエタノール沈殿で回収し、 その 4 g相当 を铸型として、 上記の primer5 [第 3図 （2)] および primer8 [第 3図 （3)] を プライマーとして、 LA-PCRキッ 卜 （宝酒造） を用い、 inverse-PCR反応を行なつ た。 反応液の組成は添付プロ トコールに従い、 反応は DNAサーマルサイクラ一 48 0 (パーキン ·エルマ一社） を用いて、 94°C1分を 1サイクル後、 98°C20秒、 68 °C 10分のサイクルを 30サイクル繰り返すことによって行なった。 その反応生成物 を 0. 8!¾ァガロースを用いて電気泳動した結果、 約 8. 2kb、 約 3. 6kb、 約 3. Okbの DNA断片が増幅されているのが観察された。
この内、 約 8. 2kbの DNA断片 [第 3図 （6)] をゲルから切り出し、 Prep-A-Gen e (バイオラッ ド社） を用いて添付プロトコールに従って DNA断片を精製した。 この断片は第 2図に示された制限酵素地図中の BamH l部位、 EcoR I部位、 Xba l部 位を有していたので、 この断片中に Lg-FL01遺伝子の未取得の部分が含まれてい ると判断した。 この DNA断片を、 Al u l (ベーリンガー社） で消化し、 PUC118 (宝 酒造） の Hi nc I I部位に連結し、 大腸菌 DH5株 （東洋紡） に導入した。 出現した形 質転換体の内、 30株のプラスミ ドを調製し、 挿入断片の大きさを調べたところ、 24種類に分類できたため、 これらのプラスミ ドに関して前述の方法で揷人断片の 塩基配列を決定した。 その結果、 既知の FL01遺伝子のアミノ基末端付近と相同性 の高い断片 467bpの挿入断片を持つ 1クローンを得、 そのプラスミ ドを KF1と命 名した。 KF1の挿入断片の染色体中の位置を第 3図中（7)に示す。
しかしながら、 KF1の挿入断片には翻訳開始部位と思われる配列は、 含まれて いなかった。 KF1の塩基配列をもとに、 pr imerKN-2 [5' TTGTATCGGAGTATTTATA3' 、 第 3図（8)]を合成した。 次いで上記の i nverse- PCR反応に用いた铸型を用い、 上述の pr imer5 [第 3図 （2)] および pr imerKN-2 [第 3図 （8)] をプライマーと して、 ジーンアンプ PCRリージヱントキッ ト （宝酒造） によって i nverse-PCRを 行なった。 反応液の組成は添付プロ 卜コールに従い、 反応は DNAサーマルサイク ラー 480を用いて、 94°C 1分、 55°C2分、 72°C2分のサイクルを 30サイクル繰り 返した後、 72°C 10分の反応を 1サイクル行なった。 その反応生成物を 0. 8%ァガロ ースを用いて電気泳動した結果、 約 4. 4kb、 約 1. lkb、 約 0. 6kbの DNA断片が増 幅されているのが観察された。 この内、 約 4. 4kbの DNA断片 [第 3図 （9)] をゲ ルから切り出し、 上述の方法で精製し、 クレノウフラグメント （宝酒造） を用い て平滑末端化し、 PUC118の Hi nc I I部位に連結し、 大腸菌 DH5株に導入した。 得ら れた形質転換体のプラスミ ド、 KF14は、 第 2図に示された制限酵素地図中の BamH I部位、 EcoR I部位、 Xbal部位を有していたので、 この断片中に Lg- FL01遺伝子 の翻訳開始部位およびその 5'上流部分が含まれているものと判断された。 KF14の挿入断片中、 第 3図（10)に示した EcoRI部位から 3'方向の塩基配列を部 分的に決定する目的で、 KF14を EcoR Iで消化後、 自己閉環化したプラスミ ド、 KF 14 A ECを構築した。 このブラスミ ドは第 3図中、 （10)の EcoR I部位から（8)の pr imerKN- 2のァニール部位までの間の断片を持つ。 KF14 A Ecの挿入断片の塩基配列 を EcoRI部位から部分的に決定した。 その塩基配列をもとに、 pr imerKT5' Ec [5' AGCGGTCGACCTAATAAAGGAAAAGGGGAA3\ 第 3図 （11)]を合成した。 また、 すでに決 定した pKF-Kpnl lの挿入断片の部分的な塩基配列をもとに、 primerKT3' Hd [5' GG AAGCTTTTTTGTAAAACAGATTTTTTGCCCCGCTT3\ 第 3図 （12)]の合成を行なった。 こ れら 2種のブライマーを用いて、 凝集性減数体 KMS004株の DNAの 2 // gを铸型と して、 LA- PCRキッ トを用いて PCRを行なった。 反応は、 94°C 1分を 1サイクル後 、 98°C20秒、 68°C 10分のサイクルを 30サイクル繰り返すことによって行なった。 その反応生成物を 0. 8!¾ァガロースを用いて電気泳動した結果、 約 9kbの断片 [第 3図 （13)]が増幅されているのが観察された。 この断片には、 第 2図に示された 制限酵素地図中の BamHI部位および Xbal部位が含まれていたので、 この断片中に Lg-FL01遺伝子の全長が含まれているものと判断された。 以降、 この PCRによる 断片を Lg- FL01遺伝子全長断片と呼ぶ。 - FL01遺伝子全長断片を、 数種の制限 酵素で消化し、 0. 8!«ァガロースゲルを用いて電気泳動を行ない、 制限酵素断片長 を測定し、 制限酵素地図を作成した。 第 4図に Lg-FLOl遺伝子全長断片の制限酵 素地図を示す。
( 6 ) Lg-FL01遺伝子全長断片の酵母への導入と凝集性の性格付け
-FL01遺伝子の導入による表現型の変化を調べる酵母宿主としては、 以下の ようにして作成した FL01遺伝子破壤株、 KY644株を用いた。 FL01部分長断片を、 PRS405 (ストラタジーン社） の BamH l〜Hind I I I部位に連結した。 このプラスミ ドを、 挿入断片中にのみ一ヶ所存在する Bs tE I I部位を切断後、 凝集性酵母 KY642 株 （a、 ura3、 l eu2、 FL08) にリチウム法にて導入し、 FL01遺伝子座の相同組換 えによって非凝集性となった株を得た。 この株の FL01遺伝子が pRS405の挿入によ つて破壊されていることを、 サザン解析によって確認し、 KY644株と命名した。
-FL01遺伝子全長断片は、 5'末端に Sai l部位、 3'末端に Hindi 1 1部位を持つ ようにデザインされたプライマーによって PCR增幅されている。 この断片を、 Sa IIおよび Hindlllで消化した。 クローニングのベクタ一としては、 YIp5の EcoRI (ベーリンガー社） 部位に、 遺伝子配列のデータバンクであるアントレ一 （ナシ ョナルセンター フォー バイオテクノロジーインフォメーション社） から得た CEN3の塩基配列および酵母第 3染色体の全塩基配列をもとに PCRにて取得した 1. 2kbの CEN3を含む断片と、 YRP7由来の EcoRI- Hindi 11断片として取得した ARS配 列を含む断片を導入した、 PYT37を用いた。 丫 37の5&11〜^11(1111部位に1^^ L01遺伝子全長断片を連結し、 リチウム法によって直接、 KY644株に導入した。 得られた形質転換体の DNAのサザン解析を実施し、 1株に関して Lg- FL01遗伝 子全長断片が導入されていることを確認した。 この株 （KY650と命名） の持つプ ラスミ ドを KTYT2と命名した。 KY650株および、 ベクタ一である pYT37のみが KY 644株に導入されている株 （KY652株と命名） に関して、 第 1表に記載した培地 で 20°C、 振とう条件下で静止期に達するまで培養後、 前述の方法で凝集性の性格 付けを行なった。 糖による凝集性の阻害を調べるためには、 最終濃度 1Mの糖を凝 集測定用緩衝液に加えた。 その結果を第 2表に示す。
第 2表
L g-F LO 1遺伝子全長断片を導入した酵母の凝集性 株名 K Y 6 5 0 KY 6 5 2 (対照） 糖なし +
マンノース
グルコース
マルトース
ガラク トース +
フラク トース
+は凝集性、 一は非凝集性を示す c KY652株ではどの条件においても凝集性を示さなかったのに対し、 Lg- FL01遗 伝子全長断片を含む KY650株では、 糖を加えない場合に凝集測定用緩衝液中で凝 集性を示した。 この凝集性は、 マンノース、 グルコース、 マルト一スによって阻 害され、 フラク トースによってもある程度阻害されたが、 ガラク ト一スによって は阻害を受けなかった。 これらのことから、 Lg-FL01遣伝子全長断片を導入する ことによって、 実験酵母にビール酵母型凝集性を付与することができると結論さ れた。
〔実施例 2〕 Lg-FL01 遺伝子のコード領域の PCRによる取得と実験酵母への導 入および評価
KF14の挿入断片のベクターに連結された部分の近傍に関し、 上記の方法で塩基 配列の決定を行なった。 その結果、 KF1の挿入断片の 5'上流 49bpの部分に Lg-Fし 0 1遺伝子の翻訳開始部位と思われる部位が存在していた。 この開始コドンの 5'上 流 58bpの位置から 3'方向への PCR用プライマー、 primerKTF7 [5' CCCCAAGCTTGCTC TGCAGTAAATTCCGCA3'、 第 3図 （14)]を合成した。 また、 先に決定した pKF-Kpnl l の挿入断片の塩基配列をもとに、 Lg-FL01遺伝子のコード領域の終始コドンの 3' 下流 53bpの位置から 5'方向への PCR用プライマ一、 primerKTORFA [5' CGGAATTCTA AACACTATAAGCGTGATGATAG3'、 第 3図 （15)] ) を、 合成した。 これら 2種のプライ マーを用い、 凝集性減数体 KMS004株の DNAの 2 u gを铸型として、 LA- PCRキッ ト を用いて PCRを行なった。 反応は、 94°C30秒、 60°C 1分、 72°C3分 30秒のサイク ルを 30サイクル繰り返すことによって行なった。 その反応生成物を 0. 8¾！ァガロー スを用いて電気泳動した結果、 約 5. 8kbの断片 [第 3図 （16)]が増幅されている のが観察された。 以降、 この断片を Lg-FL010RF断片と呼ぶ。 -FL010RF断片は 5' 末端に Hi nd l l l部位、 3'末端に EcoRI部位が存在するようにデザィンされたブラ イマ一によつて PCR増幅されている。 この断片を、 Hi nd l l lおよび EcoRIで消化 し、 酵母発現用べクタ一 PYES2 (インビトロジヱン社） の GAL1遺伝子のプロモー ターの下流に正方向に挿入されるよう、 Hi nd I I I〜EcoR I部位に連結し、 りチウ ム法によって直接上述の KY644株に導入した。 得られた形質転換体の DNAのサザ ン解析を実施し、 Lg-FL010RF断片が導入されていることが確認された株の内の 1 株を KY646株と命名した。 また、 KY646株の持つプラスミ ドを YESKT2と命名した 。 KY646株と、 ベクタ一である pYES2のみが KY644株に導入されている株 （KY64 9株と命名） に関して、 第 1表に記載した培地で 20°C、 振とう条件下で静止期に 達するまで培養後、 前述の方法で、 凝集性の性格付けを行なった。 その結果を第 3表に示す。
第 3表
G A L 1プロモーターに制御された L g— F L O 1 O R F断片を
導入した酵母の凝集性 株 K Y 6 4 6 K Y 6 4 9 (対照） 糖なし +
マンノース
グルコース
マノレトース
ガラク トース +
フラク トース
+は凝集性、 一は非凝集性を示す。
KY649株ではどの条件においても凝集性を示さなかったのに対し、 - FL010RF 断片を含む KY646株では、 糖を加えない場合に凝集測定用緩衝液中で凝集性を示 した。 この凝集性は、 KY650株の凝集性と同様、 ビール酵母型凝集性であり、 す なわち、 マンノース、 グルコース、 マルトースによって阻害され、 フラク ト一ス によってもある程度阻害されたが、 ガラク トースによっては阻害を受けなかった 。 これらのことから、 GAL1遗伝子のプロモーターの制御を受けた Lg-FL010RF断片 を導入することによって、 実験酵母にビール酵母型凝集性を付与することができ ると結論された。 すなわち、 Lg-FL010RF断片中に、 Lg-FL01遗伝子のコード領域 が存在していると結論された。
〔実施例 3〕 Lg-FL01 遗伝子中のビール酵母型凝集を支配する領域の特定 Lg-FL01遺伝子中のビール酵母型凝集を支配する領域を特定するために、 第 5 図に示すような方法で、 Lg-FL01と Sc-FL01[Watari ら （Yeast, 10, 211-225 ( 1994)) の公表した実験酵母型 FL01遺伝子] のキメラ遗伝子を作成し、 その凝集 性を調査した。 Lg- FL010RF断片を Xholおよび Kpnlで消化し、 クレノウフラグメン トをもちいて末端を平滑化後、 PUC118の HincII部位にクローニングした。 得られ た形質転換体の内、 約 lkbの挿入断片を持つ 1クローンを選び、 挿入断片の塩基 配列を決定した。 その結果をもとに、 Lg-FL01遺伝子の開始コ ドンより 3'下流 63 9bp目から 5'方向へのプライマ一、 primerKTF8 (5' CGGGATCCATCTGGCAATACCACACT AACA3' ) を合成した。 primerKTF および primerKTF8を用い、 凝集性減数体 KMS004 株の DNAの を铸型として、 LA-PCRキッ トを用いて PCRを行なった。 反応は 、 94°C30秒、 60°C1分、 72°C3分 30秒のサイクルを 30サイクル繰り返すことによ つて行なった。 その反応生成物を 0.8%ァガロースを用いて電気泳動した結果、 約 0.7kbの断片が増幅されているのが観察された。 以降、 この断片を Lg-FLOIN末断 片と呼ぶ。 得られた断片を、 PCR産物クローニング用ベクタ一である pT7Biue ( ノヴァジヱン社） にクローニングし、 4つの独立なクローンについて、 挿入断片 の塩基配列を両方向から決定した。 4つのクローンは全て同一の挿入断片を有し ていた。 得られた塩基配列を配列表の配列番号 3に示す。 この中の 1クローンを KNTA1と命名した。 Lg- FL01N末断片は 5'末端に Hindlll部位、 3'末端に BamHI部 位が存在するようにデザィンされたプライマ一によって PCR増幅されている。 KN TA1を HindlHおよび BamHIで消化し、 ベクターから分離された挿入断片を電気 泳動後のゲルから切り出し、 上述の方法で精製し、 PYES2の GAL1遺伝子のプロモ 一ターの下流に正方向に挿入されるよう、 HindIII〜BamHI部位にクロ一ニング し、 得られたブラスミ ドを KNYESと命名した。 このプラスミ ド KNYES を含む大腸 菌（Escherichia coli) EKB707 は、 平成 7 年 1 月 27日付けで工業技術院生命工学 工業技術研究所 （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号） に寄託され、 寄託番 号 FERM BP-4983が付与されている。
Watariら [Yeast, 10, 211-225 (1994)]の公表した実験酵母型 FL01遺伝子 （以 降、 Sc-FLOl遗伝子と呼ぶ） の塩基配列をもとに、 開始コドンから 3'下流 721bp 目より、 3，方向へのプライマー、 rimerWtFlN (5' CGGGATCCACTGTAAGTGATGACTTC GAAG3' ) および、 終始コドンの 3，下流 58bp目より、 5，方向へのブライマー、 pr im erFLID4 (5' CGGAATTCTCAGCGTATAATTAGCAAAGAA3' ) を合成し、 これら 2種のブラ イマ一を用い、 ABXL- 1D株の DNAの 2 / gを鋅型として、 LA- PCRキッ トを用いて
PCRを行なった。 反応は、 94°C30秒、 60°C 1分、 72°C3分 30秒のサイクルを 30サ ィクル繰り返すことによって行なった。 その反応生成物を 0. ァガロースを用い て電気泳動した結果、 約 3. 9kbの断片が増幅されているのが観察された。 以降、 この断片を Sc- FL01C末断片と呼ぶ。 Sc- FL01C末断片は、 5'末端に BamH I部位、 3' 末端に EcoR I部位が存在するようにデザインされたプライマ一によつて PCR増幅 されている。 この断片を、 BamHIおよび EcoRIで消化し、 先に構築した KNYESの Lg- FL01N末断片の下流に正方向に挿入されるよう、 BamHI〜EcoRI部位に連結し た。 この結果、 Sc-FLOl遗伝子のコード領域のアミノ基末端から 339アミノ酸に 相当する部分が、 Lg- FL01遺伝子のァミノ基末端から 312ァミノ酸に相当する部 分と置き変わった、 キメラ FL01タンパクをコードする遺伝子が構築されることが 期待される。 連結反応生成物を、 リチウム法によって直接上述の KY644株に導入 した。 得られた形質転換体の DNAのサザン解析を実施し、 Lg- FL01N末断片と Sc-F L01C末断片のキメラ遺伝子が導入されていることが確認された株の内の 1株を KY 648株と命名した。 また、 この株の持つプラスミ ドを KNWtC3と命名した。
また、 Sc-FLOl遺伝子の開始コドンの 5'上流- 69bp目より、 3'方向へのプライ マー、 pr imerFLIDl (5' CCCCAAGCTTTCGTTTGATGTAAGCTCTCT3' ) を合成した。 pr im erFL IDlおよび primerFUD4をプライマーとして用い、 ABXい 1D株の DNAの 2 gを铸型として、 LA- PCRキッ トを用いて PCRを行なった。 反応は、 94°C30秒、 60 °C 1分、 72°C3分 30秒のサイクルを 30サイクル繰り返すことによって行なった。 その反応生成物を 0. 8¾ァガロースを用いて電気泳動した結果、 約 4. 8kbの断片が 増幅されているのが観察された。 以降、 この断片を SC-FL010RF断片と呼ぶ。 Sc-F L010RF断片は、 5'末端に Hind i I I部位、 3'末端に EcoRI部位が存在するようにデ ザインされたプライマーによって PCR増幅されている。 この断片を、 Hind l l lお よび EcoR Iで消化し、 pYES2の GAL1遗伝子のプロモーターの下流に正方向に挿入 されるよう、 HindI I I〜EcoRI部位に連結し、 リチウム法によって直接上述の KY 644株に導入した。 得られた形質転換体の DNAのサザン解析を実施し、 Sc-FLOIO RF断片が導入されていることが確認された株の内の 1株を KY647株と命名し、 凝 集性の比較のために用いた。 また、 この株の持つプラスミ ドを YESWt lと命名した
KY647株、 KY648株および先述の KY649株に関し、 第 1表に記載した培地で 20 °C、 振とう条件下で静止期に達するまで培養後、 前述の方法で、 凝集性の性格付 けを行なった。 その結果を第 4表に示す。
第 4表
G A L 1プロモーターに制御された L g— S cキメラ F L 0 1遗伝子を 導入した酵母の凝集性 株名 K Y 6 4 8 K Y 6 4 9 (対照） K Y 6 4 7 (比較） 糖なし + +
マンノース
グノレコース +
マノレトース +
ガラク トース + +
フラク トース +
+は凝集性、 -は非凝集性を示す。
KY649株ではどの条件においても凝集性を示さなかつたのに対し、 Lg-FL01N末 断片と Sc-FLOIC末断片のキメラ遺伝子を含む KY648株および、 Sc- FL010RF断片を 含む KY647株では、 糖を加えない場合に凝集測定用緩衝液中で凝集性を示した。
KY648株の凝集性は、 KY650株と同様、 マンノース、 グルコース、 マルトースに よって阻害され、 フラク トースによってもある程度阻害されたが、 ガラク トース によっては阻害を受けなかった。 これに対し、 KY647株の凝集性は、 マンノース によってのみ阻害され、 グルコース、 マルトース、 フラクトースおよびガラク ト ースによっては阻害を受けなかった。 すなわち、 Sc-FLOIORF断片は実験酵母型凝 集性を付与するのに対し、 その開始コ ドンから 3'方向へ 720bp目より 5'上流の部 分を、 Lg- FL01遗伝子の開始コ ドンから 3'方向へ 639bp目までと置き換えること によって、 作られたキメラ遺伝子が付与する凝集性はビール酵母型へと転換され た。 これらのことから、 ビール酵母型凝集性の付与に深く関与しているのは、 Lg -FL010RF断片の中の、 Lg- FL01N末断片、 すなわち、 配列表の配列番号 3に示され た配列であると結論された。
〔実施例 4〕 Lg-FL01遗伝子破壊ビール酵母の評価
( 1 ) Lg-FL01遺伝子破壊用プラスミ ドの作製
Lg-FL01遗伝子破壊用プラスミ ドは、 第 6図、 第 7図に示すように作製した。 プラスミ ド PUC18を Kpnlで消化後、 クレノウフラグメントを用いて末端を平滑化 した DNA断片をセルフライゲーシヨンし、 ブラスミ ド PUC18厶 Κを作製した。 こ のブラスミ ドを HincIIで消化後、 Kpnlリンカ一 （GGGTACCC) を挿入し、 プラスミ ド PUC18土 Kを作製した。 このプラスミ ドの EcoRI〜BamHI部位間に、 プラスミ ド KF14から取得した 0.9kbの EcoRI- BamHI断片 （5'隣接領域を含む） を挿入し、 プラスミ ド PKF5B1を作製した。
プラスミ ド pKF-Kpnllから取得した 1.7kb Hincl I-Pvul I断片 （3'隣接領域を含 む） をプラスミ ド PUC118の Smal部位に挿入して得たプラスミ ド pKF3HPから、 1.7k b BamHI-Kpnl断片を取得し、 プラスミ ド pKF5Blの BamHI- Kpnl部位間に挿入して、 プラスミ ド PKF53-1を作製した。
酵母の GPD (グリセルアルデヒ ド— 3—ホスフヱートデヒ ドロゲナーゼ） 遺伝 子のプロモーター領域 （1.0 kb) と酵母の PGK (ホスホグリセレートキナーゼ） 遗伝子のターミネータ一領域 （0.4kb) を有するプラスミ ド pSY114P (特開平 2- 265488号公報) を Smal消化後、 Hindlllリンカ一 (CAAGCTTG) を連結し、 Hindll I消化後セルフライゲ一シヨンしてプラスミ ド PSY114Hを作製した。 このプラス ミ ドの Hindlll部位に、 ブラストサイジン S耐性遺伝子を有するプラスミ ド pSV2 bsr (フナコシ） の 0.5kb Hindll I断片を挿入し、 プラスミ ド pGPDBSRを作製し た。 このプラスミ ドを Sailで消化後、 クレノウフラグメントで末端を平滑化し、 1.9kbの DNA断片を取得した。 この DNA断片と、 プラスミ ド pKF53- 1を BamHI消 化後、 クレノウフラグメントで末端を平滑化した DNA断片を連結し、 ブラスミ ド PKF53BSR19を作製した。
( 2 ) ビール酵母の形質転換
ビール酵母の形質転換は、 電気パルス法を用いた。 200mlの YPD培地で 0D600 が約 7になるまで培養した凝集性ビール酵母を、 無菌水で 2回、 1Mソルビトール で 2回洗浄後、 1 mlの 1Mソルビトールに再懸濁した。 このうちの 50 / 1の酵母懸 濁液に、 プラスミ ド PKF53BSRを EcoR Iで消化した DNA断片 2. 7 gと 10 gのサ ケ精子 DNA (シグマ） を加え、 5分放置後、 ジーンパルサー （バイオラッ ド社） の 0. 2cmセルを用いて、 1. 5KV、 25 F、 200 Ωの電気パルスをかけた。 この懸 濁液に、 1mlの lmソルビトールと 400 /tz lの YPDを加え、 30°Cで 4時間振通培養 した後、 50 g/mlのブラストサイジン S (フナコシ） を含む YPD寒天培地に塗布 し、 30°Cで 3日間培養した。 出現した形質転換体について、 サザン解析を実施し 、 Lg-FLOl遺伝子が破壌されていることを確認した。 このようにして得られた Lg -FL01遺伝子が破壊されたビール酵母の凝集性を評価したところ、 非凝集性へと 転換していた。
〔実施例 5〕 Lg-FL01 遗伝子と Sc-FLOl 遺伝子の N末端領域の推測されるアミ ノ酸配列の比較
実施例 3によって、 Lg-FL01 遺伝子の N末端領域 213 アミノ酸の配列によって 、 ビール酵母型凝集性は支配されていることが示された。 そこで、 Lg-FLOl 遗伝 子と Sc- FL01 遺伝子のこの部分の推測されるアミノ酸配列を比較した。 その結果 、 第 8図に示す通り、 以下の特徴的な差異が両者の間に観察された。 1) Lg-FL01 遗伝子では、 Sc- FL01 遗伝子の 84番目のアミノ酸から 110 番目のアミノ酸に相当 する 27ァミノ酸が欠失している。 2) Sc-FLOl遺伝子で数えて 123 番目のァミノ酸 までは、 Sc- FL01 遺伝子と Lg- FL01 遗伝子の相同性は比較的低い。 3) Sc-FLOl遺 伝子で数えて 124 番目のアミソ酸以降は、 Sc- FL01 遗伝子と Lg-FL01 遺伝子の相 同性は高い。
これらの結果を踏まえて、 Sc- FL01 と - FL01 のキメラ遣伝子及び、 Sc- FL01 の 84番目のァミノ酸から 110 番目のァミノ酸に相当する 27ァミノ酸の部分を欠失 させた遗伝子を作成した。 これらの改変 FL01遺伝子の N末端領域は、 「P C R実 験マニュアル」 （M. A. Inn i sら編、 斉藤 隆監訳、 HBJ 出版、 1991) の p. 155〜 160 に記載された、 リコンビナント PCR 法を用いて作成した。 このようにして作 成された改変 FL01遺伝子の N末端領域の断片を、 実施例 3中のブラスミ ド KNWtC3 の Hi nd i I I 〜BamH I 部位（GAL1 のプロモーターと Sc-FLOl C末断片の間） に正方 向に連結し、 酵母 KY644 株に導入した。 得られた形質転換体の培養及び凝集性の 評価は、 実施例 3と同様の方法で行った。 結果を第 9図に示す。 Sc-FLOl 遗伝子 で数えて 46、 68、 83番目のアミノ酸に相当する部分までが Lg-FL01 遺伝子由来で 、 それ以降が Sc- FL01 遗伝子由来であるキメラ FL01遺伝子を持つ株 （それぞれ、 KY707、 KY708、 KY709)は、 Sc-FLOl 遺伝子を持つ株（KY706) と同様、 強い実験 酵母型凝集を示したのに対し、 Sc-FLOl 遺伝子で数えて 124 番目のアミノ酸（Lg_ FL01遺伝子で数えた場合は 97番目のアミノ酸） に相当する部分までが Lg- FL01 遺 伝子由来で、 それ以降が Sc-FLOl 遗伝子由来であるキメラ FL01遺伝子を持つ株は 、 実施例 3に示した KY648 株や KY646株と同様の、 弱いビール酵母型凝集を示し た。 一方、 Sc- FL01 遺伝子の 84番目のァミノ酸から 110 番目のァミノ酸に相当す る 27アミノ酸の部分を欠失させた改変 FL01遺伝子を持つ KY711 株は、 弱い実験酵 母型凝集を示した。 以上の結果から、 Lg-FL01 遺伝子のビール酵母型凝集に関与 する部分は、 Lg-FL01 遺伝子で数えて 84番目のアミノ酸から 97番目のアミノ酸ま での 14ァミノ酸に相当する部分、 すなわち配列表の配列番号 2に示されたァミノ 酸配列をコードする、 配列番号 4に示された配列であることが示された。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有する Lg-Fl ol 蛋白、 ならび該蛋白をコードする Lg- FL01 遗伝子 DNA が提供される。 本発明の DN A を外来遺伝子として遗伝子工学的手法によって酵母に導入すること、 即ち、 こ の DNA を核外および （または） 核内遺伝子として酵母細胞内に導入することによ つて、 酵母にビール酵母型凝集性を付与したり、 酵母のビール酵母型凝集性を強 化することができる。 また逆に、 この DNA を破壊したものを酵母細胞内に導入し たり、 この DNA の発現を抑制することにより、 凝集性の酵母を非凝集性に転換し たり、 凝集性を減少させることができる。 dsy J Ml OJd BIV BIV ¾IV dsy dJi OJJ sXq
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180 185 190
lie Val Tyr Ser Asn Ala Lys Val Leu Ala Arg Leu Pro Val Ser Val
195 200 205
Val Leu Pro Asp Gly
210 配列番号： 2
配列の長さ ： 14
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Gly Pro Asn Thr Ala Phe Trp Asn Thr Ala Ser Trp Ser Ser
1 5 10 配列番号： 3
配列の長さ ： 697
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名：サッカロマイセス セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) 株名： KMS004
配列の特徵
特徴を表す記号： CDS s 9qa Jqi J8S ιο J Ml uio OJd OJd na aqa JAl A19 J¾ ]9W 2 OVV 311 VOV OVI 101 100 OOV OVO V33 VOO Vil 丄丄丄 OVI 090 VOV OIV
0Π 90ΐ 001 nio 1¾Λ JMl 1¾Λ usv OJd jqi jqx J 9qd λ]0 9Md naq dsy J9S 6S VVO 010 13V VIO IVV 10V VOO 13V 13V IVl Oil 100 丄丄丄 113 IVO 丄：)丄
S6 06 58
J9S dJl J9S ¾IV JM1 usv dJi 3qd BIV J Ml usv OJd ^IO 丄 911
9^8 10V 001 101 330 IOV IVV 001 ILL 330 IOV IVV VOO 300 IVl OVI VIV
08 5L Oi S9
■I9S "31 siH JMl UIO ^IO ^ 1¾Λ ^ η3Ί s s/iq J¾ dsy J3S
86Z 331 013 IVO 33V 9VD VOO OOV 110 03X 100 Vll OVV OVV VOV XVO 331
09 S9 09
JA丄 ΛΑι ¾iv 19W JAl uio OJd dsy J9S 丄 JM1 J¾ J9S dsy uio
092 3V1 VVV IVl 030 OIV IVl VV3 003 OVO 301 IVl 03V VOV V31 IVO OVO
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nan J3S J sA JAi 3ijd usv 1¾Λ usv WW A19 usv s 3JV J9S ^ΪΟ
202 VXI VOX OVI VVV IVI 1X1 OVV 010 IVV OIV 030 IVV VVV OOV 031 390 οε 02
1¾Λ OJd naq SAQ BIV UIO JMI J9S ^IO J9S ^IV Ι¾Λ usv nai nai nio m 010 VOO 013 301 V39 VVO VOV 10V V90 VOI VOO VIO OVV 110 V13 OVO
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90 ΐ 013 111 330 Oil 31V VIO 0X1111 VIV 301 3V3 OVO VOO 11V VOV OIV
89 VVVVVVV丄 3VD3V30V11 V011VVV111 DlillVOlVV VOOODilVVV IOVDOIOIOO
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69 VOO IVO VOO Oil VIO 902 002 96Ϊ
\ \ J3S Ι¾Λ OJd Π9ΐ 3JV ¾IV naq \2\ sAq ¾yv usy J3S 丄 八 3 Π 289 010 10V 110 103 113 09V 100 9X1 0X0 VVV 130 IVV V3I IVX XI0 丄丄 V
06ΐ 98ΐ 081 sAl an OJd Ui J/tx JA A IO BIV J i3W J JM1 J8S ^10 sAq d\\ S9 VVV 31V 003 OVI IVI 3V1 100 030 3V1 OXV OVl 03V VOI 000 OVV VIV
SiT Oil S9T
dsy JM1 OJd ¾IV BIV ¾iV dsv dJX OJd s/i an Ai9 usy an Jqi 9qd 98S OVO 33V 103 V09 100 VOO DVO 001 VOO VVV XXV 100 OVV 11V 13V Oil 091 991 091
dsv Jm J9S 丄 an OJj OJd uio "10 "10 BIV sXo SAQ nio 9qd ¾IV 889 IVO 03V V31 VOV 01V 1D3 100 WO WO WO VDO 101101 WO Oil 030 on ssi οετ
3Π J9S iiO ^ IO Ϊ^Λ J3S ngq an BIV J3S dsy dsy l¾A J MX ¾IV ^Md 06 丄丄 V OOV 130 100 110 001 Vll LLV VOO 101 DVO OVO 110 VDV 100 111
92t 021 SH 00/96df/X3d LL8€Z/96 OAA. 配列の特徵
特徵を表す記号： CDS
存在位置： 1. . 42
特徴を決定した方法： E
配列
GGC CCA AAT ACT GCC TTT TGG AAT ACT GCC TCT TGG ACT TCT 42 Gl y Pro Asn Thr Ala Phe Trp Asn Thr Ala Ser Trp Ser Ser 1 5 10

Claims

請 求 の 範 囲
1. 実質的に配列表の配列番号 1に示したァミノ酸配列を有するポリぺプチドを 含み、 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有する蛋白。
2. 実質的に配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列のうち、 25番目のァミノ 酸残基から 213 番目のァミノ酸残基を含むァミノ酸配列を有するポリぺプチドを 含み、 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有する蛋白。
3. 実質的に配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列のうち、 少なくとも 25番 目のァミノ酸残基から 97番目のァミノ酸残基を含むァミノ酸配列を有するポリベ プチドを含み、 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有する蛋白。
4. 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有し、 実質的に配列表の配列番 号 2に示したァミノ酸配列を有するポリべプチド。
5. 実質的に配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列を有するポリべプチドを コードする塩基配列を含む DNA 。
6. 実質的に配列表の配列番号 1に示したアミノ酸配列のうち、 25番目のァミノ 酸残基から 213 番目のァミノ酸残基を含むァミノ酸配列を有するポリぺプチドを コードする塩基配列を含む DNA 。
7. 実質的に配列表の配列番号 1に示したァミノ酸配列のうち、 少なくとも 25番 目のァミノ酸残基から 97番目のァミノ酸残基を含むァミノ酸配列を有するポリべ プチドをコ一ドする塩基配列を含む DNA 。
8. 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有する蛋白をコードする塩基配 列を含み、 配列表の配列番号 3に示した塩基配列のうち、 59番目の塩基から 697 番目の塩基を含む DNA またはその相補鎖。
9. 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有する蛋白をコードする塩基配 列を含み、 配列表の配列番号 3に示した塩基配列のうち、 131 番目の塩基から 69 7 番目の塩基を含む DNA またはその相補鎖。
10. 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有する蛋白をコ一ドする塩基配 列を含み、 配列表の配列番号 3に示した塩基配列のうち、 131 番目の塩基から 34 9 番目の塩基を含む DNA またはその相補鎖。
11. 配列表の配列番号 4に示した塩基配列を含み、 酵母にビール酵母型凝集性を 付与する活性を有するポリべプチドをコ一ドする DNA またはその相補鎖。
12. ブラスミ ド KTYT2、 YESKT2, または KNWtC3に組み込まれ、 酵母にビール酵母 型凝集性を付与する活性を有する蛋白をコードする塩基配列を含む DNA。
13. プラスミ ド KTYT2 に組み込まれ、 以下の制限地図を有する約 9 k bの DNA 断 片である請求項 12記載の DNA。
SI Bm Xb Pt Sh Sp Hd
図中の略夸は以下を示す。 Bm:BamHI，Pt:PstI,Sl:SalI，Sp:SpeI，
Sh:SphI,Xb:XbaI
14. プラスミ ド KNYES に組み込まれ、 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性 を有する蛋白をコードする塩基配列を含む DNA。
15. 請求項 5ないし 14のいずれかに記載の DNA を含むプラスミ ド。
16. 請求項 5ないし 14のいずれかに記載の DNA を導入することを特徵とする、 ビ 一ル酵母型凝集性が付与または強化された酵母の製造方法。
17. 請求項 5ないし 14のいずれかに記載の DNA を破壊することによって、 ビール 酵母型凝集性を付与する活性を持つ蛋白を発現させる能力を欠失または減少させ た DNA を導入することを特徴とする、 ビール酵母型凝集性が欠失または減少した 酵母の製造方法。
18. 請求項 5ないし 14のいずれかに記載の DNA の発現を抑制することによって、 酵母のビール酵母型凝集性を欠失または減少させる方法。
19. 請求項 16ないし 17のいずれかに記載の方法で製造された酵母。
20. 請求項 19に記載の酵母を培養することを含む醸造製品の製造法。
21. 請求項 20に記載の方法で製造された醸造製品。 要 約 睿
本発明は、 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有する蛋白、 前記蛋白 をコ一ドする DNA 、 前記 DNA を含むプラスミ ド、 前記 DNA を利用して、 ビール酵 母型凝集性を付与または強化された酵母を製造する方法およびビール酵母型凝集 性が欠失または減少した酵母を製造する方法、 並びに、 前記 DNA の発現を抑制す ることによって、 酵母のビール酵母型凝集性を欠失または減少させる方法に関す 本発明はまた、 前記方法によりビール酵母型凝集性が付与または強化または欠 失または減少した酵母に関する。
さらに、 本発明は、 前記の酵母を培養することを含む醸造製品の製造法、 なら びに当該製造法により得られる醸造製品に関する。
本発明によれば、 酵母にビール酵母型凝集性を付与する活性を有する -Flol 蛋白、 ならび該蛋白をコ一ドする Lg-FL01 遺伝子 DNA が提供される。 本発明の DN A を外来遗伝子として遗伝子工学的手法によって酵母に導入すること、 即ち、 こ の DNA を核外および （または） 核内遺伝子として酵母細胞内に導入することによ つて、 酵母にビール酵母型凝集性を付与したり、 酵母のビール酵母型凝集性を強 化することができる。 また逆に、 この DNA を破壊したものを酵母細胞内に導入し たり、 この DNA の発現を抑制することにより、 凝集性の酵母を非凝集性に転換し たり、 凝集性を減少させることができる。
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