FI119935B - Geeni, joka antaa hiivalle kyvyn flokkuloitua, ja geenituote - Google Patents

Description

Geeni, joka antaa hiivalle kyvyn flokkuloifcua, ja geeni-tuote

Keksinnön alue 5 Esillä oleva keksintö koskee hiivan flokkulaatio- geeniä ja sen käyttöä, Spesiflsemmin esillä oleva keksintö koskee proteiinia, jolla on aktiivisuus/: joka antaa hiivalle oluthiivatyypin flokkulaätio—ominaisuuden, proteiinia koodattavaa DNA:ta, DNA:ta sisältävää plasraidia, menetelmää 10 sellaisen hiivakannan tuottamiseksi, jossa; oluthiiva tyypin flokkuiaatio-ominaisuus on saatu aikaan tai sitä on tehostettu käyttämällä DNA:ta, menetelmää sellaisen hiivakannan tuottamiseksi, josta oluthiivatyypin flokkulaatio-ominai-suus on poistettu tai sitä on vähennetty käyttämällä DNA:ta 15 ja menetelmää oluthiivatyypin flokkulaatio-ominaisuuden poistamiseksi tai sen vähentämiseksi hiivasta inhiboimalla DNA:n ekspressio.

Esillä oleva keksintö koskee myös hiivakantaa, jossa oluthiivatyypin flokkuiaatio-ominaisuus on saatu aikaan, 20 sitä oh tehostettu, se on poistettu tai sitä on vähennetty yhdellä yllä mainitulla menetelmällä.

Lisäksi esillä oleva keksintö koskee menetelmää panimotuotteiden tuottamiseksi, joka sisältää vaiheen, jossa viljellään yllä mainittua hiivakantaa, kuin myös 25 menetelmällä tuotettuja panimotuotteita,

Alan tekninen taso

On hyvin tunnettu tosiasia, että alkoholijuomissa, I

kuten oluessa ja viinissä, käymiseen käytetyn hiivan flok- \ kulaatio-ominaisuus on tärkeä ei ainoastaan, koska se mää- s \ 30 rittää tuloksena syntyneiden tuotteiden aromin ja maun, j mutta myös, koska se vaikuttaa käymisprosessin toimivuu- | teen. Hiivalla, jota käytetään Saksassa, Japanissa ja mo- | nissa muissa maissa laajasti tuotetun lager-oluen valmis- ΐ tuksessa, on sellainen ominaisuus, että solut flokkuloitu- \ 3:5 'vat ja sedimentoituvat fermentoidun vierteen pohjalle iä- \ \ | | 2 hella käymisen loppupistettä; sellaista hiivaa kutsutaan erityisesti pohjahiivaksi. Oluenpanon prosessissa on ominaisuus, jota ei löydetä muista käyrnisprosesseista, se on se, että käymisen lopussa sedimentoituneet hiivasolut ote-5 taan talteen ja käytetään uudelleen myöhemmässä käymisessä. Sen mukaisesti sillä pohjahiivan ominaisuudella:, että se sedimentoituu käymisen myöhäisessä vaiheessa, on erityisen suuri merkitys oluenpanossa,

Koska oluthiiva on yksi päätekijöistä, jotka mää- 10. rittävät lopullisen oluttuotteen laadun, erinomaisten hii-vakantojen jalostaminen on oluenpanijoille tärkeä aihe. Pohjahiivan jalostuksessa on sopivan fl o kku laa ti. ö-Qitiii naisuuden saamisella hiivalle suuri merkitys. Tämä johtuu siitä, että hiivakanta, jolla on liian vahva flokkulaatip-15 ominaisuus, saostuu käymisen aikana fermentaätipviertee-seen, joka johtaa käymisen loppumiseen ja toisaalta hiiva-kanta, jolta puuttuu flokkulaatio-ominaisuus, jää suspensioon jopa käymisen myöhäisissä vaiheissa ja tarvitaan sellaista toimenpidettä, kuten sentrifugaatiota, hiivaso-20 lujen poistamiseksi fermentaatiovierteestä. Sen vuoksi toivottava hiivakanta tämän hetkiseen tuottomenetelinään on kanta, joka dispersoituu käymisen alussa ja saostuu hyvin käymisen myöhäisessä vaiheessa. Jos tuottomenetelmä on erilainen, on tarpeetonta sanoa, että tarvitaan hiivakanta, 25 jolla on menetelmään sopiva flokkulaatio-ominaisuus.

Huolimatta useista tutkimuksista, joissa on tutkittu hiivan teollisesti merkittävää flokkulaatio-ominaisuutta, hiivan flokkulaation mekanismia ei ole vielä selvitetty. On vaikea sanoa, että flokkulaatio-ominaisuuden säätely 30 parantamalla hiivakantaa per se, olisi onnistunut. Vuosien geneettisten tutkimusten tuloksena sellaisten hiivageenien, kuten FLOl, flo3, FL05, FL08, sf11, fsul, fsu2, tupl, cyc8, oka 2, FMCl kuin myös mitokondriaalisen DNA;n geenien o lii ja oxi2, läsnäolo on varmistettu sellaisiksi geeneiksi, 35 jotka ottavat osaa hiivan flokkulaatio-ominaisuuteen. Koska 3 näiden geenien tutkimus koski hiivan £lokkulaatio- ominaisuutta molekyyli tasolla, FL 01 -geenin eritys: ja analyysi on suoritettu [Yeast 9, 423 (1993) ja Yeast 10, 211 (1994)], FLO5-geenin eristys ja analyysi on myös 5: julkaistu. Tässä julkaisussa osoitettiin, että vaikka FL05- geenin -sijainti on erilainen kuin aiemmin julkaistun FLOl-geenin hiivan kromösomin DNA:ssa, FLQ5-geenin restrik-tiokartta ja nukieotidisekvenssi ovat lähes identtisiä FLO’1 -geenin vastaavien kanssa [J. Inst, Brew.» 85, 95 (1979) 10 ja Curr. Genet, 25, 196 (1994)], Näiden geenien analyysi rriolekyylitasölla ei .kuitenkaan ole ollut riittävä eikä vielä ole selvitetty, millä mekanismilla geenit ottavat osaa hiivan flokkulaatio-omi-naisuuteen. Lisäksi mitä tulee muihin, geeneihin kuin FLOl 15 ja FLQ5, jotka ottavat osaa hiivan fiokkulaatiö-ominaisuuteen, edes eristystä ja rakenneanalyysiä ei Ole suoritettu.

Yhtään julkaisua ei ole tehty proteiineista, joita nämä geenit koodittavat·

On julkaistu yritys parantaa hiivan flokkuiaatio-20 ominaisuutta käyttäen yllä kuvattua flokkulaatio-ominai-suuteen osaaottavaa geeniä, jossa flokkulaatio-ominaisuus muodostettiin erilaisiin flokkuioitumattomiin hiivakantoi-hin, sisältäen oluthiivan, viemällä sisään Saccharomyces cerevisiae -hiivan FLOl-flokkulaatlogeeni [Ägric. Biol.

25 Chem, 55, 1547 (1991)]. On kuitenkin julkaistu, että näin transformoidussa oluthiivassa saatu flpkkulaatiokyky eks-pressoxtuu käymisen alusta lähtien ja että käyminen tuntuu viivästyvän [Journal of the Brewing Society of Japan 88, 665 (1993)]. Näin ollen ei voida sanoa, että flokkulaatio-30 ominaisuuden muodostaminen hiivalle tällä FI.Q1 -geenl.11 ä olisi säädeltävissä suotuisalla tavalla ja lisäparannuksia vaaditaan sellaisen menetelmän todelliseksi käyttämiseksi, {

Lisäksi, vaikka FLOl-geenin tiedetään kykenevän muodostamaan hiivalle flokkulaatio-omlnaisuuden, sen geenituotteen 35 roolia hiivan flokkulaatiossa ei ole selvitetty, FLQl-gee- 4 nin nukleotidisekvenssistä ennustetun aminohapposekvenssin analyysin tuloksena on oletettu, että FLOl-geenituote sijaitsee hiivasolujen pintakerroksessa. Tuntuu siltä, että tätä oletusta tukee myös; julkaisu, jonka mukaän flokkuioi-5 tuvien oluthiivasolujen pintakerroksesta spesifisesti saatavan proteiinin (flokkuliini) N-pään 14 tähteen aminohapposekvenssillä on jonkin verran homologiaa sen aminohapposekvenssin kanssa, joka on ennustettu FiQl-geenin nukleöttdisekyenssistä [Appi. Environ. Microbiol. 60, 2754 10 (1994}], mutta yllä olevan proteiinin mekanismia ei ole vielä selvitetty. Sen mukaisesti yritys säädellä hiivan flokkulaatiota FLOl-geeniIlä on saavuttanut rajansa.

Yrityksessä, jossa käytettiin muuta kuin FLOl-gee-niä, hiivalle yritettiin muodostaa perinnöllinen ominaisuus 15 käyttäen FLÖ'5-geeniä ja solufuusiomenetelmää ja pe rinnöllisen ominaisuuden muodostamisen käyttökelpoisuus on esitetty [J. Inst. Brew. 98, 315 (1992)]. Kuitenkin, koska perinnöllisen ominaisuuden sisäänviemismenetelmä on solu-fuusiomenetelmä, oli vaikea saada aikaan sellainen hiiva- 20 kanta, jolla oli haluttu ominaisuus ja lisäksi on noussut \ \ esiin ongelma, että muuhun kuin haluttuun flokkulaatioon \ liittyvän geenin DNÄ-sekvenssit viedään sisään tuloksena j syntyvään hiivakaataan; esim. PÖFl-geeni, joka lisää olu- ! esseen fenolisen aromin ja jonka monet Saccharomyces pere- | 25 vlsiae -kannat sisältävät, viedään sisään samanaikaisesti | [Proc. Eur. Brew. C.onv. 497 (1981]]. Näin ollen käyttökel- | peisten hiivakantojen flokkulaatio-ominaisuuden parantamisen tällä menetelmällä ei voida sanoa olevan säädeltävissä. j

Kuten tähän mennessä on kuvattu, hiivan flokkulaa-30 tiokyvyn parantamiset käyttäen niitä hiivan flokkulaatioon osaa ottavia geenejä, joita tähän mennessä on yritetty, eivät ole käytännöllisiä.

Näin ollen esillä Oleva keksintö koskee seuraavia aiheita: ! 5 .(1) Sellaisen proteiinin esittäminen, jolla on aktiivisuus, joka muodostaa hiivalle Gluthiivatyyppisen flokkulaatio-ominaisuuden; (2) sellaisen DNA-juosteen esittäminen, joka koodittaa S proteiinia, jolla on aktiivisuus, joka muodostaa hiivalle oluthi iva t y yppisen flokkulaatio-ominaisuuden; (3) sellaisen menetelmän esittäminen hiivakannan tuottamiseksi , joka sisältää vaiheen, jossa oluthiivatyyppinen flokkulaatio-ominaisuus muodostetaan tai sitä tehostetaan 10 yllä olevaa DNA-juostetta käyttäen, tai menetelmän esittäminen hiivakannan tuottamiseksi, joka sisältää vaiheen;, jossa oluthiivatyyppinen flokkulaatio-ominaisuus poistetaan tai sitä pienennetään käyttäen yllä olevaa DNA-jnostetta, ja hiivakantaa, johon on muodostettu oluthiivatyyppinen 15 flokkulaatio-ominaisuus, sitä on tehostettu, se on poistettu tai sitä on pienennetty yllä mainitulla menetelmällä; (4) sellaisen menetelmän esittäminen oluthi ivatyyppisen flokkulaatio-ominaisuuden poistamiseksi tai pienentämiseksi 20 hiivakannassa, joka sisältää vaiheen, jossa inhiboidaan yllä olevan DNÄ-juosteen ekspressiota; ja (5) myös sellaisen menetelmän esittäminen panimotuotteiden | ] tuottamiseksi, joka sisältää vaiheen, jossa viljellään yllä kuvattua hiivakantaa, kuin myös menetelmällä saatuja 25 panimotuotteita.

Keksinnön kuvaus

Ratkaistaessa yllä kuvattuja ongelmia, esillä olevat keksijät ovat tutkineet intensiivisesti ja laajasti { olu tpohj ahi ivan flokkulaatio-ominaisuutta. Tuloksena kek- \ 30 sijat varmistivat sellaisen FLOl-geenille homologisen gee- \ nin (tästä eteenpäin viitataan nimellä "Lg-FhQl-geeni") | olemassaolon, joka on spesifisesti flokkulöituyissa pöh- | jakäymishiivoissa, ja selvittivät suhteen Lg-FLOl-geenin ja ]

flokkulaatio-ominaisuuden välillä. Sen jälkeen keksijät J

35 sallivat Lg-FLOl-geeni tuotteen tuoton I,g-FLOl-geenistä ] ] § j 6 sellaisessa hiivakannas-sa,.. joka oli tullut flokkuloitumat-tomaksi· johtuen FLQ1-geenin tuhoutumisesta. Tämän tuloksena keksijät havaitsivat, että oluthiivatyyppinen flokkulaatio-ominaisuus voidaan indusoida viemällä sisään Lg-FL01-geeni.

5 Tämä löytö ei ainoastaan merkitse oluthiivatyyppisen flokkulaatio-Qininaisuuden muodostumista vaan myös sellaisen hiivakannan, jolla: on laboratorighiivatyyppinen f lokkia- laatio-ominaisuus:, muuttumisen hiivakannaksi, jolla on öluthiivaty yppiheh f lokkulaatio-ominaisuus:. Lisäksi 10 keksijät ovat määrittäneet sen Lg-FLQl-geenituotteen alueen, joka säätelee oluthiivatyyppistä flokkulaatiota hiivassa. Keksijät ovat myös onnistuneet muuttämaäh flok-kuloituva oluthiivakänta flokkuloitumattomaksi kannaksi vieniäUä sisään tuhottu Lg-FLQl-geeni. Näin ollen on saatu 15 aikaan esillä oleva keksintö.

Esillä oleva keksintö esittää Lg-FLOl-geenltuot-teen, jonka aminohapposekvenssi on esitetty sekvenssissä SEQ ID -numero 1 sekvenssiluettelossa; tai proteiinin, joka sisältää peptidin, jolla on aminohapposekvenssi, joka on 20 esitetty sekvenssissä SEQ ID -numero 1 sekvenssiluettelossa ja jolla on Aktiivisuus, joka muodostaa hiivalle o 1 ut hi .iva tyyppi sen f lokku 1 aatio-ominai suuden; tai proteiinin, joka sisältää polypeptidin, jolla on osittainen aminohapposekvenssi, joka on esitetty sekvenssissä SEQ ID -25 numero 1 sekvenssiluettelossa, joka sisältää f aminohappotähteet kohdasta 25 kohtaan 213 ja jolla on j aktiivisuus, joka muodostaa hiivalle oluthiivatyyppisen flokkulaatio-ominaisuuden; tai proteiinin, joka sisältää polypeptidin, jolla on osittainen aminohapposekvenssi, joka 30 on esitetty sekvenssissä SEQ ID -numero 1 sekvenssiluettelossa, joka Sisältää ainakin 1 aminohappotähteet kohdasta 25 kohtaan 97 ja jolla on ] aktiivisuus, joka muodostaa hiivalle oluthiivatyyppisen j

flokkulaatio-ominaisuuden; ja polypeptidin, jolla on I

35 aktiivisuus, joka muodostaa hiivalle oluthiivatyyppisen j i iä 7 flökkulaatio-ominaisuuden ja jolla on aminohapposekvenssi, joka on esitetty sekvenssissä SEQ ID -numero 2 sekvenssi-luettelossa,

Esillä oleva keksintö esittää myös: DNA-juosteen, 5 joka sisältää hukleotidisekvenssln, joka koodittaa aminohapposekvenssiä, joka on esitetty sekvenssissä SEQ ID -numero 1 sekvenssiluettelossa; tai DNA:n, joka sisältää nukleatidisekvenssln, joka koodittaa polypeptidiä, jolla on osittainen aminohapposekvenssi, joka on esitetty 10 sekvenssissä SEQ ID -numero 1 sekvenssiluettelossa ja joka sisältää aminohappotähteet kohdasta 25 kohtaan 213; tai 'DNA.:n, joka sisältää nukleotidisekvenssin, joka koodittaa polypeptidiä, jolla on osittainen aminohapposekvenssi, joka on esitetty sekvenssissä SEQ ID -numero 1 sekvenssiluet-15 helossa, joka sisältää ainakin aminohappotähteet kohdasta 25 kohtaan 97.

Esillä oleva keksintö esittää edelleen DNA:n, joka sisältää nukleotidisekvenssin, joka koodittaa aminohappo-sekvenssiä, jolla on aktiivisuus, joka muodostaa hiivalle i 20 oluthiivatyyppisen flokkulaätiö-ömlnaisuuden ja joka si- f saitaa osittaisen hukleotidisekvenssln sekvenssistä, joka j on esitetty sekvenssissä SEQ ID -numero 3 sekvenssiluette- j lossa, joka sisältää nukleotidisekvenssin kohdasta 59 k oh-· j taan 697, tai sille komplementaarisen DNA:n; DNA:n, joka \ 25 sisältää nukleotidisekvenssin, joka koodittaa proteiinia, f jolla on aktiivisuus, joka muodostaa hiivalle oluthiiva- f tyyppisen flokkulaatio-ominalsuuden ja joka sisältää osit- | täisen nukleotidisekvenssin sekvenssistä, joka on esitetty sekvenssissä SEQ; ID -numerö: 3 sekvenssiluettelossa, joka 3-0 sisältää nukleotidisekvenssin kohdasta 131 kohtaan 697, tai \ sille komplementaarisen DNA: n; DNA: n, joka. sisältää f Λ osittaisen nukleotidisekvenssin sekvenssistä,: joka on esitetty sekvenssissä SEQ ID -numero 3 sekvenssiluettelossa, joka sisältää nukleotidisekvenssin kohdasta 131 kohtaan 35 349, tai sille komplementaarisen DNA:n; ja DNA:n, joka j ] \ 8 sisältää nukleotidisekvenssin, joka on esitetty sekvenssissä SEQ ID -numero 4 sekvenssiluettelossa ja joka koodit taa polypeptidiä, jolla on aktiivisuus, joka muodostaa kiivaile oluthiivatyyppisen flakkulaatiö-öminaisuudpn, tai 5 sille komplementaarisen DNA:n.

Esillä oleva keksintö esittää myös plasmidin, joka sisältää nukleotidisekvenssin, joka koodittaa proteiinia, jolla on aktiivisuus, joka muodostaa hiivalle oluthiiva-tyyppisen flokkulaatio-ominaisuuden, kuin myös plasmidin, 10 joka sisältää yllä kuvatun DNA:n.

Lisäksi esillä oleva keksintö esittää menetelmän sellaisen hiivakannan tuottamiseksi·,·, johon on muodostettu oluthiivatyyppinen flokkulaatio-ominaisuus tai sitä on tehostettu, joka sisältää vaiheen, jossa siihen viedään 15 sisään yllä mainittu DNA. Keksintö esittää myös menetelmän sellaisen hiivakannan tuottamiseksi, josta oluthiivatyyppinen flokkulaatio-ominaisuus on poistettu tai. sitä on pienennetty, joka sisältää vaiheen, jossa siihen viedään sisään DNA, josta kyky ekspressoida sellaista proteiinia, 2 0 jolla on aktiivisuus, j oka muodostaa oluthiivatyyppisen flokkulaatio-ominaisuuden, on poistettu tai sitä on pienennetty tuhoamalla yllä mainittu DNA.

Vielä edelleen esillä oleva keksintö esittää hiiva-kannan, joka tuotetaan millä tahansa yllä mainitulla mene-25: telittä! lä ja johon on muodostettu oluthiivatyyppinen flok- kulaatio-ominaisuus, sitä on tehostettu, se on poistettu ; tai sitä on pienennetty. !

Esillä oleva keksintö esittää myös menetelmän oluthiivatyyppisen flokkulaatio-ominaisuuden poistamiseksi 30 hiivalta tai sen pienentämiseksi hiivassa, joka sisältää vaiheen, jossa inhiboidaan yllä kuvatun DNA:.n ekspressio.

Lisäksi esillä oleva keksintö esittää menetelmän panimotuotteiden tuottamiseksi, joka sisältää vaiheen:, jossa viljellään yllä kuvattua hiivakantaa, kuin myös me-35 netelmällä saadut panimotuotteet, 9

Kuvioiden lyhyt kuvaus

Kuvio 1 esittää oluthiivakannan ja sen meiöottisten segreganttien Southern- ja Nöfthern-analyysien elektrofo-reesitulokset (valokuvat).

5 Kuvio 2 esittää Lg-FLOl-geenin restriktiokartan,

Kuvio 3 esittää täyspitkän Lg-FLQl-geenin kloonauksen suunnittelukaavion käänteis-PCR-menetelmällä.

Kuvio 4 esittää Lg-FLQl-geenin täyspitkän fragmentin restriktiokartan.

10 Kuvio 5 on suunnittelukaavio, joka esittää kimee- risen Lg-Sc-FLOl-geenin rakentamisen.

Kuvio 6 on kaavio, joka esittää plasmidin rakentamisen Lg—FLOl -geenin tuhoamiseksi.

Kuvio 7 on kaavio (jatkoa) , joka esittää plasmidin 15 rakentamisen Lg-FLOl-geenin tuhoamiseksi.

Kuvio 8 esittää Lg-FLQl-geenin ja Se-FLOl-geenin N-pään alueiden ennustettujen aminohapposekvenssien vertailun, vastaavasti.

Kuvio 9 esittää flokkulaatiofenotyypit niissä kan-20 noissa, joissa on erilaiset modifioidut FLQl-geenit.

Keksinnön paras suoritustapa Iässä alla esillä oleva keksintö on kuvattu yksi-tyi s kohta i s esti,

On huomattava, että termeillä "DNA", "nukleotidi -25; sekvenssi", "geeni" ja "DNA-juoste", on tässä käytettynä oleellisesti sama merkitys. On myös huomattava, että termit "aminohapposekvens:si,V, "peptidi" ja "proteiini" tässä käytettynä tarkoittavat oleellisesti samaa asiaa.

Hiivasolujen välinen flokkulaatio 30 Tiedetään, että hiivasolujen välinen flokkulaatio johtuu seksuaalisesta flokkulaatiestä a-solujen ja Gi-solu-jen välillä, emosoluista silmukoituvien tytär-solujen vielä tapähtumattomasta eroamisesta, ei-seksuaalisesta fiokku-laatiosta ja niin edelleen. Näistä tekijöistä esillä oleva 3:5 keksintö koskee ei-sek/suaalisen flokkulaatiQh säätelyä.

10

Mallina, joka selittää ei-seksuaalisen flokkulaation mekanismin, on lektiinihypoceesi vahva, jonka mukaan kaksi viereistä hiivasolua interaktoivat toistensa kanssa lektiinixi kaltaisen proteiinin, joka sijaitsee flokkuloi-5 tuvien hiivasolujen pintakerroksessa, ja sokeriketjujen välisellä liitoksella [J. Baeteriol. 150, 878 (1982)], mutta lektiinin kaltaista proteiinia ei ole vielä tunnistettu. Tämä on yksi syy, jonka vuoksi hiivan flokkulaation säätely on edelleen vaikeaa.

10 On julkaistu, että ei-seksuaalinen flokkulaatio voidaan luokitella raa*asti kahteen tyyppiin riippuen siitä sokerityypistä, joka inhiboi flokkulaation, se on man— noosispesifinen F löi'“tyypin flokkulaatio ja NewFlo—tyypin flokkulaatio, jonka inhiboi maltoosi, glukoosi ja niiden 15 kaltaiset sokerit mannoosin lisäksi [Yeast 7, 559 (1991)].

Esillä ölevät keksijät ovat havainneet, että yleisen poh-jahiivan flokkuläatio-ominaisuus luokitellaan RewFlo-tyyppiin. Ymmärtämisen helpottamiseksi nämä flokkulaatio-omi-naisuuksien tyypit ilmaistaan seuraavin termein.

20 Lyhyesti, yleisten laboratöriohiivoj en flokkulaa- tio-ominaisuus, joka inhiböituu mukanaolevalla mannoosilia, mutta ei inhiboidu maltoosilla ja glukoosilla, ilmaistaan tässä termillä "laboratoriohiivatyyppinen flokkulaatio-ominaisuus", Toisaalta niiden hiivakantojen flokkulaatio-25 ominaisuus, joita edustavat yleiset pohjaoluthiivat, jota inhiboi maltoosi, glukoosi ja niiden kaltaiset sokerit mukanaolevan mannoosin lisäksi, ilmaistaan termillä "olut-hiivatyyppineh flokkul$$tiö-OmnaisuusM. Kummankaan tyyppiset flokkulaatio-ominäisuudet eivät inhiboidu gaiaktoo-30 silla. Esillä olevat keksijät olettavat sen olevan erittäin f tärkeätä ainakin oluenpanossa, että pöhjaoiuthiivalla on: "oluthiivätyyppinen flokkulaatio-ominaisuus" alla kuvattujen syiden vuoksi. Lyhyesti, tämä "oluthiivatyyppinen flokkulaatio-ominaisuus" on suuresti erilainen laborato-35 riphiivan flokkulaatiQ-ominaisuudesta niin, että edellistä 11 inhiboi glukoosi, maltoosi ja niiden kaltaiset sokerit.

Olutta tuotetaan olutvierteellä oiuthiivalia. Koska noin 6 % maltoosista ja noin 1 % glukoosista sijaitsee vierteessä, sillä tosiasialla, että nämä sokerit inhiboivat oluthiivan 5 flokkulaatiota, on tärkeä merkitys. Toisin sanoen voidaan ajatella seuraavasti. Johtuen "oluthiivatyyppisen fiokkulaatio-ominaisuuden" luonteesta vierteeseen lisätyn oluthiivan fIpkkulaation estävät siinä sijaitsevat sokerit, ja hiivasolut kykenevät dispersoitumaan vierteeseen. Näin 10 ollen käyminen etenee nopeasti, ja kun sokerikonsentraatiot käyneessä vierteessä alenevat käymisen myöhäisessä vaiheessa, flokkuläation inhibitio heikkenee. Tämän tuloksena hiivasolut muodostavat flokkeja ja sedimentoituvat, joka tekee niiden talteenoton helpoksi.

15 Lg-Flol-proteiini

Lg-Flol-prote Uni on proteiini, jota koodittaa FLQl-geenille homologinen geeni, nimittäin Lq-FLOl-geeni, joka on ominainen pöhjaoluthiivoille ja sen meioottisille segreganteille, jotka sisältävät oluthiivatyyppisen flok-,2:0 kulaatia-ominaisuuden, f

Esillä oleva keksintö sisältää Lg-Flol-proteiinin ja sen johdannaiset. Lg-Flol-proteiini voi olla peräisin \ hiivasta, erityisesti Saccharomyces cerevisiae -hiivasta, ja sille on ominaista se, että se kykenee muodostamaan 25 hiivalle oluthiivatyyppisen flokkulaatio-ominaisuuden. Lg-Flol-proteiini sisältää aminohapposekvenssissään aminohapposekvenssin, joka on esitetty oleellisesti sekvenssissä SEQ ID -numero i sekvenssiluettelossa. "Ami nohappos e kven s-si, joka on oleellisesti esitetty sekvenssissä SEQ ID -nu- j 30 mero I sekvenssiluettelossa” sisältää ”s e kve ns si1ue 11e1on |

sekvenssissä SEQ ID -numero 1 esitetyn aminohapposekvens- I

sin” lisäksi sekvenssin SEQ ID -numero 1 aminohapposekvens- i sin, jossa on modifikaatioita, se on, jossa on yhden tai j useamman aminohappotähteen lisäys, insertio, deleetio tai | ] i ! § i 12 substituutio niin kauan, kun aminohapposekvenssi muodostaa hiivalle oluthiivatyyppisen flokkulaatio-ominaisuuden.

Keksinnön "sekvenssilaett:a.;l:ö.ssa: sekvenssissä SEQ ID -numero 1 esitetyllä aminohapposekvenssillä" on j; onkin-5: verran homologiaa aminohapposekvenssiin,: joka on ennustettu iaboratoriohiivan FLOl-geenin tunnetusta nukleotidisekyens-sistä. Ratkaiseva ero näiden kahden välillä on kuitenkin se, että ig-Flol-proteiini ja sen johdannaiset, jotka sisältävät keksinnön "sekvenssiluettelon sekvenssissä SEQ 10 ID -numero 1 esitetyn aminohapposekvenssin", voivat: muodostaa hiivalle yllä kuvatun "oluthiivatyyppisen flokku-laatio-ominaisuuden", joka on tärkeä ominaisuus oluthii-valie. Esillä olevan keksinnön valmistuksen aikana on. osoitettu ensimmäistä kertaa, että Lg-Flol-proteiini ja: sen 15 johdannaiset voivat muodostaa hiivalle "oluthiivatyyppisen f lokkulaa tio-ominaisouden.

Mitä tulee flokkuliihiin, joka on proteiini, jota saadaan flokkuloituvien: oluf.hl ivasolujen pintakerroksesta, sen biologisia toimintoja ei ole vielä selvitetty, mutta 20 sen N-pään 16 tähteen aminohapposekvenssi on määritetty \ (^TQACLRVG^RKNGMN: * edustaa tunnistamatonta aminohappo- j tähdettä) [Appi. Environ. Microbiol. 60, 2754 (1994}]. Lg- j

Flol-proteiini, jonka toiminnat on selvitetty esillä ole- I

vassa keksinnössä ensimmäistä kertaa, sisältää tämän ami- I

25 nohapposekvenssin (kohdasta 25 kohtaan 40 sekvenssiluettelon sekvenssissä SEQ ID -numero 1). Iällä hetkellä ei ole | mitään todistetta, joka osoittaisi, että keksinnön mukainen Lg-Flol-proteiini on identtinen flokkuliinin kanssa.

Kuitenkin myös keksinnön Lg-Fiol-proteiinissa on erittäin j 30 korkea mahdollisuus, että sekvenssissä SEQ ID -numero 1 j kohdasta 1 kohtaan; 24 ulottuva aminöhapposekvenssialue on | eritys signaali,. joka on tarpeen sille, että Lg-Flol- ] proteiini kulkee solujen pintakerroksiin. Sen mukaisesti :| arvellaan, että proteiini;, joka sijaitsee flokkuloituvien: j 35 hiivasolujen pintakerroksessa ja jolla on aktiivisuus, joka | i \ 13 muodostaa hiivalle flokkulaatio-ominaisuuden on proteiini, jolla on aminohapposekvenssi,: joka sisältää sekvenssiluettelon sekvenssin SEQ ID -numero 1 kohdasta 25 loppuun Saakka.

5 Lg-FLOl-geeni

Esillä oleva keksintö sisältää Lg-FX^-DNÄ-juös-teen. Termi "Lg-FLQl-DNA-juöste'1 tässä käytettynä tarköit-taa DNA:ta, joka sisältää nukleotidisekvenssin, joka koodi tt aa Lg-Floi^proteiinia tai sen johdannaista, jolla on 10 aktiivisuus, joka muodostaa hiivalle oluthiivatyyppisen flokkulaatio-ominaisuuden.

Spesifisemmin esillä oleva keksintö sisältää DNA-jnosteen, joka sisältää nukleotidisekvenssin, joka koodit-taa proteiinia, jolla on aminohapposekvenssi, joka on esi-15 tetty oleellisesti sekvenssiluettelon sekvenssissä SEQ ID -numero 1. Tässä on huomattava, että ilmaisu "nukleotidi-sekvenssi, joka koodittaa proteiinia, jolla on aminohappo-sekvenssi" tarkoittaa kaikkia erilaisia nukleotidi sekvens'-sejä, jotka voidaan muodostaa geneettisen koodin degene-20 raatiosta johtuen.

Se, mikä oli korvaamatonta esillä olevan keksinnön muodostamiselle oli se esimerkissä 1 kuvattu havainto, että pöhjahiivakannalla ja sen meioöttisilla segreganteilla, joilla On oluthiivatyyppinen flokkulaätio-Qminaisuus, on 25 ominainen FLO1-geenili e homologinen geeni. Esillä olevassa patenttihakemuksessa tämä "FLQl-geenille homologinen geeni, joka on ominainen pohjahiivaile ja sen meioottisille segreganteille, jotka sisältävät oluthiivatyyppisen flokkulaatio-ominaisuuden”, ilmaistaan termillä "Lg-FLOl-30 geeni". Yllä oleva havainto yksinään ei kuitenkaan olisi voinut ollenkaan johtaa siihen tosiseikkaan, että "Lg-FLOl-geenillä" on aktiivisuus, joka muodostaa hiivalle "oluthiivatyyppisen flokkulaatio-ominaisuuden". Lisätutkimuksia tarvittiin esillä olevan keksinnön loppuun saat-35 tamiseksi.

14

Toisesta näkökulmasta esillä oleva keksintö sisältää myös DNA:n, joka on inkorporoitu plasmidiin KTYT2, ja joka sisältää nukleotidisekvenssin, joka koodittää proteiinia, jolla on aktiivisuus, joka muodostaa hiivalle olut-5 h i i va t y y pp .is en f 2 a kku1aat i o- omi n a i suu de n.

Tästä lähtien yllä kuvattuja esillä olevan keksinnön mukaisia DNÄ-molekyylejä kutsutaan yhteisesti nimellä "Lg-FL01-DNA - jUO s te".,

Keksinnön mukainen Lq-FL01-DNA-juoste voi olla 10 luonnollisesti esiintyvää DNA;ta, kokonaan syntetisoitua DNAj ta. tai osittain syntetisoitua DNA itä, joka on syntetisoitu käyttäen osaa luonnollisesti esiintyvästä DNA:sta.

Transformaatio

Viemällä soluun sisälle keksinnön mukaisen Lg-FLOl-15 geenin DNA-juosteen on mahdollista saada aikaan hiivakanta, johon on muodostettu oluthiivatyyppinen flokkulaatio-ominaisuus tai sitä on tehostettu.

Menetelmänä Lg-FLOi-DNA-j nosteen sisäänviemiseksi voidaan käyttää standardimenetelmiä, joita tavallisesti 20 käytetään yhdistelmä-DNÄ-tekiniikan alalla, yhdessä sopi vien standardien kanssa [katso esim. Analytical Biochemistry 163, 391 (1987)]. Spesifiset esimerkit sellaisista menetelmistä sisältävät esim;, menetelmän, jossa haluttu DNA | inkörporoidaäh vektoriin, joka sitten viedään sisään 25 hiiväsoluihiri, ja menetelmän, jossa haluttu DNA viedään suoraan sisään hiivasoluihin ilman inkorporoinnista vektoriin.

Edellisessä menetelmässä, jossa haluttu DNA inker- j poröidaari vektoriin, joka sitten: viedään sisään hiivaa o- f 3:0 luihin, käytettäväksi mahdolliset vektorit sisältävät esi- j \ merkiksi YRp-vektorin (hiivan mönikopiövektorin, jossa 1 käytetään hiivan kromosomin ARS·-sekvenssiä sen repiikaatio- j origona), YEp-vektorin (hiivan monikopiovektori, jossa on j hiivan 2 μ m -DNA:n replikaatio-origo), YCp-vektorin j 35 (hiivan yksikopiovektori, jossa on hiivan kromosomin ARS- j ! } 15 sekvenssi repi i Raatio-origona ja joka myös sisältää hiivan kromosomin sentromeerisekvenssin) ja Ylp-vektorin (vektori, joka integroidaan hiivan kromosomiin, ei ole hiivan replikaatio-origga); mitä tahansa tunnettua vektoria voi-5 da an käyttää. Nämä vektorit on kuvattu kirjallisuudessa (katso "New Biotechnology of Yeast", Medical Publication Center, s. 284) ja ne voidaan helposti valmistaa.

Edustavana menetelmistä, joissa DNA viedään suoraan sisään hiivasoluihin ilmän DNA:n ihkorporaatiota vektoriin/ 10 voidaan antaa yhteistransformaatiomenetelmä, jossa hiiva-solut transformoidaan yhtäaikaa, plasmidilla, jossa on merkkigeeni (kuten lääkeresistenssigeeni) , ja DNA-sekvens-sillä, joka on tarkoitus viedä sisään (JP-patenttijulkaisu numero 5-60 918).

15 Sellaisissa menetelmissä, kuten yllä kuvatuissa, sisäänviedyn DNA-sekvenssin ekspressoimiseksi hiivassa tai sen ekspression tehostamiseksi tai vähentämiseksi, promoottori (joka on yksikkö, joka säätelee transkriptiota ja translaatiota) ja terminaattori inkorporeidaan keksinnön 20 mukaisen DNA-ketj un 5'-ylävirta-alueelle ja 3 *-alavirta-alueelle, vastaavasti. Promoottorina ja terminaattori na yllä olevia tarkoituksia varten voidaan käyttää sellaisia, jotka ovat peräisin tunnetuista geeneistä, kuten alkoholi-dehydrogenaasigeenistä [ J. Bioi. Chem. 257, 3018 (1982)], 25 fosfoglyseraattikinaasigeenistä [Nucleic Acids Res. 10, 7791 (1982) ] , glyseraldehyäi-3-fosfaattidehydrogenaasigee- nistä [J. Biol. Chem. 254, 9839 (1979) ] tai niistä, jotka on saatu aikaan keinotekoisesti parantamalla yllä kuvattuja, niiden lisäksi/ jotka ovat peräisin Lg-RlOl-geenistä 30 itsestään. Spesifisemmin promoottoreita ja terminaattorei-ta, kuten ADH (tunnetaan myös nimellä ADC), GAPDH {tunnetaan myös nimellä GPD) , PHO, GAL, PGK, ENO, TRP ja HIP, voidäan käyttää.

Lisäksi valitsemalla sopiva promoottori on myös 35 mahdollista sallia geenin, jolla on keksinnön mukainen DNA- 16 ketju, ekspressoituminen hiivasoluissa säädellyllä tavalla. Esimerkiksi, kun käytetään gaiaktokinaasigeenin promoottoria, geenin ekspressiota voidaan kohottaa muuttamalla alustan sokerinlähdetta esimerkiksi glukoosista 5 galaktoosiksi.

Lisäksi viemällä sisään DNA, josta kyky ekspres-soida Lg-Flol-proteiinia on poistettu täi sitä on pienennetty hajottamalla Lg-FLOI -geeni, on mahdollista saada aikaan hiivakanta, josta fiokkuiaatio-ominaisuus on pois-10 tettu tai sitä on vähennetty. Lg-FLOi-geenin hajotus voidaan suorittaa lisäämällä tai poistamalla yksi tai useampi emäs Lg-FLOl-geenin alueelta, joka ottaa osaa Lg-Flol-pro-teiinin ekspressioon (kuten promoottorialueelta tai koodit ta vai ta alueelta), tai poistamalla sellainen alue koko-15 näen. DMA, josta kyky ekspressoida Lg-Flol-proteiinia on poistettu tai sitä on vähennetty hajottamalla Lg-FLOl-gee-ni, voidaan viedä sisään hiivasoluihin käyttäen samaa menetelmää, jota käytettiin yllä mainitussa DNA:n sisään-viennissä. Sen ajatellaan tapahtuvan seuraavasti. Tämän 20 DMA:n sisäänviennin jälkeen tapahtuu homologinen rekombinaatio: isäntähiivasolujen kromosomaalisen DMA:n ja sisään-viedyn DNA:n Lg-FLOl-geenin välillä ja isäntäsolujen Lg- | FLÖ1-geeni tuhoutuu. Tämä johtaa Lg-Flol-proteiinin eks- | pressiokyvyn poistumiseen tai vähenemiseen ja sen tuloksena j 25: isäntähiivasolujen flokkulaatio-ominaisuus poistuu tai se.

vähenee.

Keksinnössä transformoitava hiivakanta, se on isän-tähiivakanta, voi olla mikä tahansa hiivakanta, joka voi- j daah taksonomisesti luokitella hiivaksi. Keksinnön tarkoi- f

30 tuksia varten teollisuushiiva, joka kuuluu Saccnaromyces cerevisiae -lajiin, spesifisenimin oluthiiväm viinihiiva tai hiiva, jota käytetään alkoholin tuottoon, on suositeltava. I

Esillä oleva keksintö sisältää myös menetelmän hii- j van flokkulaatio-Ominaisuuden poistamiseksi tai vähentämi- f 35 seksi, joka sisältää vaiheen, jossa inhiboidaan yllä mai- ! 17 nitun Lg-FLOl-geenin ekspressio. Spesifiset esimerkit tästä menetelmästä sisältävät menetelmän sellaisen DNA:n si-säänviemiseksi, josta kyky ekspressoida Lg-Flo1-pro te i i n ia on poistettu tai sitä on vähennetty hajottamalla Lg-FLQl-5 geeni, antisense—RNA-menetelmän ja niiden kaltaiset menetelmät .

Esillä oleva keksintö sisältää myös menetelmän, joka on kuvattu kohdassa (6) esimerkissä 1, joka sisältää vaiheen, jossa muutetaan iaboratoriohiivatyyppinen flok-10 kulaatio-omiaaisuus oluthiivatyyppiseksi flokkulaatio-ominaisuudeksi substituQimalla yllä mainitulla Lg-FLOl-geenillä laboratoriahiiyatyyppinen FLQ1-geeni. Myöskin käänteinen muutos on mahdollinen käyttämällä Lg-FLOl-geenin DNA:ta, jonka keksintö esittää.

15 Menetelmällä, joka sisältää vaiheen:, jossa viljel lään keksinnön hiiväkantaa, tuotetut panimotuotteet sisältävät alkoholijuomat, kuten oluen, japanilaisen saken, huonolaatuisen tislatun alkoholin, viinin, viskin ja konjakin; mausteet, kuten soijakastikkeen, mison ja makean 20 saken; ja polttoainealkoholit. Keksinnön menetelmään panimotuotteiden tuottamiseksi on sisällytetty yllä mainittujen panimotuotteiden tuottamiseksi käytettyihin menetelmiin liittyvät prosessit.

Tässä alla esillä oleva keksintö on kuvattu yksi-25: tyiskphtaisemmin viitaten seuraayiin esimerkkeihin, jolta ei tule pitää keksinnön piiriä rajoittavina. j

Esimerkki 1 i

Oluthiivatyyppiseen flokkulaatioon vahvasti osaaottavan FLOl-geenille homologisen geenin kloonaus 30 (il) Oluthiivan flokkulaatio-ominaisuuteen osaaotta vien geenien etsintä

Niiden geenien etsimiseksi, jotka ottavat osaa oluthiivan flokkulaatio-ominaisuuteen, suoritettiin seu-raava koe. Flokkuloituvasta ©luthiivakannasta KI084 annet-35 tiin muodostua itiöt menetelmällä, jonka ovat kuvanneet : 18

Stewart et ai. [J. Inst. Brew. 93, 216 - 219 (1987)] niin, että tällä tavalla valmistettiin kannat, joissa kromosomi-määrä aleni (tästä lahtien sellaisia kantoja: kutsutaan nimellä ’'meiöQttisat segregantit") . Tuloksena syntyneistä 5 meioottisista segreganteista kuutta kantaa viljeltiin alustassa, joka: on esitetty taulukossa 1, 20 °G:ssa staattisissa olosuhteissa 48 tuntia. Viljelyn jälkeen solut kerättiin sentrifugoimalla, pestiin 0,1 M ΈΡΓΑ:1la kahdesti ja steriloidulla vedellä kahdesti, ja sitten ne suspen-10 soitiin uudelleen steriloituun veteen. Solujen flokkulaa- tio-ominaisuuden määrittely suoritettiin seuraavalla menetelmällä. hyhyesti, solut suspensoitiin flokkulaatiomääri-tyspuskuriin (50 mM natriumasetaatti, 0,1 % kalsiumkloridi, pH 4,6) niin, että lopulliseksi OD-arvoksi tuli 00600= 15 2,0, jätettiin huoneenlämpötilaan 30 minuutiksi ja sitten sekoitettiin voimakkaasti 20 sekuntia. Solut jätettiin liikkumattomiksi vielä viideksi minuutiksi ja sitten määritettiin flokkuloltuminen tai flokkuioitumattomuus 1 silmin. Tuloksena kuusi testattua meiocttista segreganttia 20 ryhmiteltiin kahteen flokkuloitumattömaan ja neljään flok- | kulöituvaan kahtaän. \

Alusta flokkulaation määritykseen j

Galaktoosi 50 g/litra I

YNB: W,/e M & AS * g/lltra 1

Aminohapot

Asparägiinihappo 100 mg/i

Glutamiinihappo löö mg/i 2g Treeniini 1G0 mg/i j

Seriini 100 mg/i hysiinivetykloridi 100 jng/l

Arginiini iqq mg/i.

$ * | ] ::¾ 19

Hiivatyppiaiusta, joka ei sisällä aminohappoja tai amino-hiumsulfaattia. Transformanttien viljelyssä käytettiin yllä olevaa alustaa, johon lisättiin adeniinisuifaattia, 5 tryptofaania ja histidiinivetykloridia kutakin määränä 20 mg/i.

Nämä kannat altistettiin Southern- ja Morthern-analyyseille, kuten alla on kuvattu. Kokonais-DNÄ:n eristys 10 suoritettiin viljelemällä soluja ravistelussa YPD-alustässä [2 % bacto-peptoni (Difco) , 1 % hiivauute {Difco), 2 % glukoosi], 30 °C:ssa ja uuttamalla kokonais-DNÄ stationaarisen vaiheen saavuttaneista soluista menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Hereford et ai. [Cell 18, 1261 - 1271 15 (1979)]. Kaksi mikrogrammaa uutettua DNA:ta digestoitiin

Hindlll-entsyyrnillä (Boehringer Mannheim) ja se altistettiin elektroforeesille käyttäen 1 f agaroosigeeliä. Sitten DNA hiotettiin Hybond N+ -nailonsuodattimelle (Amersham) sen mukana olevan protokollan mukaisesti ja sitten altis-20 tettiin seuraavalle Southern-analyysille. Toisaalta koko-nais-RNA:n uuttaminen suoritettiin näissä kannoissa viljelemällä niitä staattisissa olosuhteissa alustassa, joka on esitetty taulukossa 1, 20 °C:ssa 48 tuntia ja uuttamalla kokonais-RNA sen menetelmän mukaisesti, jonka ovat kuvan-25 neet Villeneve ja Meyer [Ceil 48, 25 - 37 (1987)]. Kymmenen

mikrogrammaa näin saatua RNA.:ta glyoksaloltiin käsittele- I

mällä 16 piissä glyoksaali/DMSO-iiuosta '[1 M glyoksaali, 50 ; % DMSD, 10 mM natriumf os.f aattipuskuri (pH 7,0)] yhden tunnin ajan 50 0C:ssa. Sen jälkeen siihen lisättiin 2 μΐ 30 lätauspuskuria [50 % (w/v) glyseroli, 10 mM fosfaattipuskuri (pH 7,0), 0,4 % (w/v) bromfenolisini] ja 1 μΐ etidi-umbromidiliuosta, jonka konsentraatiö oli 1 mg/ ml, ja tuloksena syntynyt liuos ajettiin elektroforeesissa geelissä, joka sisälsi 10 mM natriumfosfaattipuskuria (pH 7,0) 3S ja 1 % agaroosia. Tämän elektroforeesin aikana elekt- | § § 20 roforeesikammion puskuria kierrätettiin koko ajan käyttäen päristälitistä pumppua näin välttäen pH-gradientin muodostuminen, Kun bromfenolisini oli kulkeutunut noin 70 % geelin pituudesta, elektroforeesi lopetettiin. Sitten geelissä 5 oleva etidiumbromidilla värjäytynyt RNA tarkastettiin käyttäen UV-läpivalaisinta ja varmistettiin, että RNA ei ollut hajonnut käyttäen ribosomaalista RNA:ta indikaattorina. Sen jälkeen geelissä oleva RNA blotattiin Genescreen-Plus~nailonsuodattimelle (DuPont) sen mukana olevan ohjeen 10 mukaisesti ja tätä suodatinta, jolle RNA oli b.lotettu, käsiteltiin 80 °C:ssa kaksi tuntia. Sitten suodatin altistettiin Northern-analyysille Genescreen-Plus- suodattimen mukana tulleiden ohjeiden mukaisesti.

FL01-geenin osittaiset DNA-fragmentit, joita käy-15 tettiin Southern- ja Northern-analyyseissä koetuimina, valmistettiin seuraavasti. Perustuen FLOl-geenin nukleo-tidisekvenssiin, jonka ovat julkaisseet Teunissen et ai. [Yeast 9, 423 - 427 (1993)], syntetisoitiin kaksi aluketta, jotka olivat 5' GATGÄÄACTGTCÄTTGTTGTCAAA 3' ja 5' TCGTTT-20 CAGCAGCTAMGTAT 3T. Näillä alukkeilla suoritettiin PCR käyttäen flokkuloituvan kannan ABXL-1D (a, FLOl, Yeast Genetic Stock Center) kokonais-DNA:ta terapiaa ttina ja ko-konais-PCR-tuötteet ajettiin elektroforeesissa 1 % agaröo-sigeelissä. Geelistä leikattiin irti 1 045 emäsparin pitui-25 nen amplifioitunut DNA-fragmentti (tästä lähtien viitataan nimellä "osittainen FLOl-fragmentti”) ja tämä fragmentti Otettiin taiteen käyttäen Prep-A-Gene-käyttöpakkausta (Bio-Rad). Tämä fragmentti leimattiin [of-32P] dCTP-leimalla (Ämerham) ja sitä käytettiin koettimena. Radioaktiivisuuden 30 tunnistus suoritettiin käyttäen röntgenfilmiä.

Tulokset on esitetty kuviossa 1. Southern-analyysin tuloksena tunnistettiin KI08 4-emokannas sa neljä Hindlll-fragment tia, jotka olivat pituudeltaan noin 9, 5 kb, 5,4 kb, 4,8 kb ja 3,7 kb, joilla oli hcmologiaa FLOl-geeni in. 35 Näistä fragmenteista kaksi fragmenttia, noin 4,8 kb ja 3,7 21

Jcb pituisten, havaittiin kaikissa tutkituissa KI084-kannasta peräisin olevissa meioottisissa segreganteissa.

Lisäksi, ainoastaan neljässä meioottisessa: segregantissa, joiden määriteltiin olevan flokkuloituvia flokkulaatiomää-5 ritystestissä, noin 9;, 5 kb fragmentti tunnistettiin myös yleisten rintamien lisäksi:.. Myös Northern-aoalyysin tuloksena FLOl-geenin transkripiiotuote havaittiin ainoastaan emokannassa ja niissä neljässä meioottisessa segregantissa, joiden määriteltiin olevan flokkuloituvia flokkulaatio-10 määritystestissä. Näiden tulosten perusteella on ehdotettu, että ainoastaan ELO!-geeni!le homologinen geeni, josta ori osa tai joka on kokonaan siinä noin 9,5 kb Hindi II-fragmentissa, joka on yksi niistä kolmesta Hindlli-fragmentis-ta, jotka ovat homologisia FLOl-geenille, transkriptoituu 15 ΚΓΘ 8 4-kannasta peräisin olevissa meioottisissa segregan teissa, ja että ainoastaan ne kannat, joilla on tämä homologinen geeni, sisältävät flokkulaatio-ominaisuuden.

Tämän jälkeen FLOl-geenille homologiselle geenille, josta on osa tai joka on kokonaan KIO84-kannan noin 9,5 kb 20: HindllX'-fragmentissa, annettiin nimi Lg-FLQl (lagertyyppi nen FLOl).

(2) Lg-FLOl-geenin restrikfciokartan valmistus KIÖ84-kännasta peräisin olevista meioottisista seg-reganteista valittiin kaksi, yksi flokkuloituva KMSD04- i 25 kanta ja yksi flokkuloitumaton KMSQÖl-kantä. Niiden DNA:t valmistettiin, kuten yllä on kuvattu, ja altistettiin Southern-analyysille käyttäen useita restriktioentsyymejä toisistaan riippumattomasti tai kahta entsyymiä yhdessä, ja käyttäen yllä kuvattua osittaista FLOl-fragmenttia 30 koettimena. Tämän tuloksena yksi rintama, jota ei havaittu fiokkuloitumattomassa meioottisessa segregantissa, havait^ tiin aina flokkuloituvassa KMS004-kannassa niiden kahden ] rintaman lisäksi, jotka olivat yhteisiä flokkuiditumättoman j meiööttisen segfegantin kanssa. Pääteltiin, että Lg-F101- | 35 geenistä on osa tai se on kokonaan tässä rintamassa, joka j $ i | | 22 on spesifinen flokkuloituvalle meioott.i se.l Ie segreganLille.

Näin ollen tämän fragmentin pituus määriteltiin ja valmistettiin re s t r i kt i o kar t ta, joka on esitetty kuviossa

O

5 (3) Osittaisen Lq-FLOl-geenin sisältämän Kpnl-frag- mentin kloonaus

Perustuen kuviossa 2 esitettyyn restriktiokarttaan yritettiin noin 5,6 kb pituisen Kpnl-fragmentin kloonausta. Kl084-kannasLa peräisin olevan flokkuloituvan me.i.oottisen 10 segregantin KMS004 DNA digestoitiin täydellisesti Kpnl-entsyymillä {Boehringer Mannheim) ja sitten se fraktioitiin ajamalla elektroforeesissa käyttäen 0,8 % agaroosia, Noin 5,6 kb pituisten DNA-f ragmen11 i en seos leikattiin irti geelistä ja puhdistettiin elektroeluoimalla dialyysilet-15 kussa. Tuloksena Southern-analyysistä, jossa käytettiin yllä mainittua osittaista FLOl-fragmenttia koettimena varmistettiin, että haluttu DNA-fragmentti sisältyi puhdistettuun DNÄ-fragmenttiseokseen. Sitten ΚρηI-entsyymi1lä täydellisesti digestoitu plasmidi pUC18 (Takara Shuzo) 20 ligoitiin puhdistettuun DNA-fragmenttiseokseen käyttäen DNA Ligation -täyttöpakkausta (Takara Shuzo), ja sitten EL coli DH5a -solut (BRL) transformoitiin tuloksena syntyneellä plasmidilla. Saaduista tuloksena syntyneistä transformanteista 5 000 kantaa hiotettiin Hybond N+ —nai-25 lonsuqdattimelle (Amersham) suodattimen mukana tulleen ohjeen mukaisesti ja pesäkehybridisaatio suoritettiin käyttäen yllä mainittua osittaista FLOl-fragmenttia koettimena saaden näin 10 positiivista kantaa. Näistä kannoista { valmistettiin plasmidit alkalimenetelmällä ja ne analysoi-3 0 tiin reStriktipentsyyTneiilä. Tämän tuloksena varmistettiin, että plasmideissa, jotka nämä kannat sisälsivät, oli sama insertiofragmentti. Plasmidin pKF-Kpnll, joka oli yhdestä yllä olevasta kannasta, insertiofragmentti altistettiin Southern-analyysille käyttäen verrokki-DNAtna flokkuloi-35 tuvaa meioottistä segreganttia KMSÖ04 ja f1okku1oitumatonta 23 meioottista segregahttia KMSÖP1, Taman tuloksena voitiin varmistaa, että insertiofragmeritti on osa tutkittavasta Lg-FLOl-geenistä.

(4) Osittaisen Lg-FLOl-geenin sisältämän Kpnl-frag-5 mentin nukleotidisekvenssin osittainen sekvensointi

Plasmidin pKF-Kpnll insertiofragmentin nukleotidi-sekvenssin määrittämiseksi valmistettiin plasmidin pKF-Knpll insertiofragmentin deleetiosarja käyttäen kilosek-venssille tarkoitettua deleetiokäyttöpakkäusta (Takara 10 Shuzo) käyttöpakkauksen ohjeiden mukaisesti. Nukleotidi-sekvenssi määritettiin DNA-sekvenaattorilia (Perkin Elmer) käyttäen PCR/Sequencing -käyttöpakkausta (Perkin Elmer). Nukleotidisekvenssi analysoitiin käyttäen DNASIS-ohjelmaa (Hitachi Software Engineering). 2,9 kb pituinen nukieoti-15 disekvenssi Kpnl-kohdasta Hindlll-kohtaan, josta on löydetty koodittava alue, joka on homologinen tunnetulle FLOl-geenin koodattavalle alueelle, määritettiin molempiin suuntiin. Määritetystä nukleotidisekvenssistä löydettiin 2, 6 kb pituinen avoin lukuraami, joka ulottui FLOl-geenin 20 koodattavan alueen keskikohdalta lopetuskodoniin.

(5) Täyspitkän Lg-FLOl-geenin saaminen käänteis-PCR-menetelmällä Täyspitkän Lg-FLOl-geenin saaminen käänteis-PCR-menetelmällä on esitetty tyypillisesti kuviossa 3;.: M emmin 25 osittaiselle Lg-FLOl-geenilie määritellyn nukleotidisekvenssin [ (1) kuviossa 3] perusteella syntetisoitiin aluke 5 [5’ äATÄCäCÄÄCäTGGTGTCCT 3', (2) kuviossa 3] ja aluke 8 [5' äGGäGÄGGTGGääCTäCTGG 3', (3) kuviossa 3], Flokkglöituvan j meioottisen segreganttikannan KMS0Ö4 DNA (60 pg) 30 digestoitiin 300 yksiköllä Hindlll-entsyymiä (Boehringer Mannheim), otettiin taiteen etanolisaostuksella ja liuotettiin 30 μΐ:aan TE-puskuria. DNA-fragmenttien ligaatio itsensä kanssa suoritettiin käyttäen DNA Ligation -käyttö-pakkausta (Täkara Shuzo) 300 pl:n mittakaavassa. Tämän 35 tuloksena odotetaan, että sykliset molekyylit,: joissa 24

HindiII-kohdat, joita edustavat (4) ja (5) kuviossa 3, ovat ligoituneet yhteen, ovat läsnä tuloksena syntyneissä reaktiotuotteissa. Nämä reaktiotuotteet otettiin talteen etanolisaostuksella. Käyttäen 4 pg;ää näitä reaktiotuot-5 teitä templaattina ja yllä olevaa aluketta 5 [(2) kuviossa 3] ja aluketta 8 [(3) kuviossa 33 alukkeina suoritettiin kään te i s-PCR-menetelmä LÄ-FCR-käyttöpakkauks elia (Takata

Shuzo). Reaktioliuoksen koostumus oli se, jota käyttöpak-kauksen ohjeissa suositeltiin. Reaktio suoritettiih seu-10 .raavasti käyttäen DNA Thermal Cycler 480 -laitetta (Perkin Elmer): 1 sykli 94 °C:ssa 1 minuutti, jota seurasi 30 kertaa sykli, joka oli 98 °C 20 sekuntia ja 68 °C ID minuuttia. Kun reaktiotuotteet ajettiin elektroforeesissa 0,8 % agaroosigeelissä, tuloksena havaittiin, että noin 8,2 kk, 15 noin 3,6 kb ja noin 3,0 kb pituiset DMA-fragment it olivat amplifi oituneet.

Näistä DNA-fragmenteista noin 8,2 kb [ (6) kuviossa 3] pituinen fragmentti leikattiin irti geelistä ja se puhdistettiin käyttäen Prep-A-gene-käyttöpakkausta (Bio-Rad) 20 siinä olevan ohjeen mukaisesti. Koska tämä fragmentti Sisälsi BaraHI-, EcoRI- ja Xbal-kohdat, jotka on osoitettu kuvion 2 restriktiokartassa pääteltiin, että tässä fragmentissa oli vielä tuntematon osa Lg-FL01-geeniä. Tämä DNA-fragmentti digestoitiin Alul-entsyymillä (Boehringer | 25 Mannheim), ligoitiin HincIJ-kohtaan plasmidissa pUCllB (Takara Shuzo) ja vietiin: sisään e. coli DH5 -kantaan (Toyöbo). Plasmidit valmistettiin tuloksena syntyneiden transformanttien 30 kannasta ja insertiofragmenttien koot tutkittiin. Tämän tuloksena nämä plasmidit voitiin ryhmi-30 telia 24 ryhmään. Mitä tulee näihin plasmideihin, inser-' tiofragmentin nukleotidisekvenssi määritettiin yllä kuvatulla menetelmällä. Tämän tuloksena saatiin yksi klooni, jolla oli 467 emäspärin pituinen insertiofragmentti, joka oli erittäin homologinen tunnetulle FLOl-geenin aminopään 35 osalle. Tälle plasmidille annettiin nimi KF1, KFl-plasmidin 25 insertiöf ragmentin sijaintia kromosomissa edustaa (7) kuviossa 3.

KFl-plasmidin insertiofragmentti ei kuitenkaan sisältänyt sekvenssiä, joka tuntuu olevan translaation aloi-5 tuskohta. RFl-plasmidifi nukleotidi sekvenssiin perustuen syntetisoitiin sluko KN-2 [5' TTGTATCG GAGTATT TÄTÄ 3'V, (8) kuviossa 3] · Sen jälkeen yllä olevassa käänteis-PCR-xeak-tiossa käytettyä templaattia ja yllä olevaa aluketta 5 [(2) kuviossa 3] ja aluketta KN-2 [ (8) kuviossa 3] käyttäen 10 suoritettiin käänteis-PCR-menetelmä GeneAmp PCR Reagent -käyttdpakkauksella (Takara Shusö). Reaktioliuoksen koostumus oli sellainen kuin käyttöpakkaukeen suosittelema protokolla. Reaktio suoritettiin seuraavasti käyttäen DNA Thermal Cycler 480 -laitetta: 30 kertaa sykli, joka oli 15 94 °C 1 minuutti, 5.5 °C 2 minuuttia ja 72 °C 2 minuuttia, joiden jälkeen tehtiin yksi sykli 72 °C:ssa 10 minuuttia.

Tämän tuloksena havaittiin ajamalla reaktiotuotteet elektroforeesissa käyttäen 0,8 % agaroosia, että noin 4,4 kb, noin 1,1 kb ja noin 0,6 kb pituiset DNÄ-fragment it ampli-20 fioitulvat. Näistä fragmenteista noin 4,4 kb pituinen DNA-fragmentti [ (9) kuviossa 3] leikattiin irti geelistä, puhdistettiin yllä kuvatulla menetelmällä, juosteet tehtiin tasapäisiksi Elenow-fragmentilla (Takara Shuzo), ligoitiin pUC118-plasmidin H inc II-kohtaan- ja vietiin sisään E. coli 25 DH5 -kantaan. KF14, joka on yksi näistä transformanteista saatu plasmidi, sisälsi BamHI-, EcoRI- ja Xbal-kohdat, jotka on esitettu kuvion 2 restriktiokartassa. Sen vuoksi pääteltiin, että Lcj-FlOl-geenin translaation aloituskohta ja sen 5'-ylävirta-alue sisältyvät tähän fragmenttiin.

30 RFl4-plasmidin insextiofragmentin nukleotidisek- venssin osittaiseksi määrittämiseksi EcoRI-kohdasta [jota edustaa (10) kuviossa 3] 3'-päähän päin, plasmidi KF14 j digestoitiin EcoRI-entsyymillä ja sitten rakennettiin plasmidi KF14 delta Ec, joka ligoitiin itsensä kanssa 35 kiinni. Tässä plasmidissa on fragmentti, joka ulottuu 26

EeoRi-kohdasta, jota edustaa (10) kuviossa 3, alukkeen KN-2, jota edustaa (8} kuviossa 3, hybridisaatiokohtaan. KF14 delta Ec -plasraidin insertiofragmentin nukleotidisekvenssi määritettiin osittain EcoRI-kohdasta. Perustuen saatuun 5 nukleotidisekvenssiin syntetisoitiin aluke KTS' Ec [ 5' AGCGGTCGACCTAATAAAGGAAÄAGGGGAA 3 ', (11) kuviossa 3] . Myös kin perustuen osaan aiemmin karakterisoitua pKF-Kpnll-plasroidin insertiofragmentin nukleotidisekvenssiä syntetisoitiin aluke KT3'Hd [5' GGAAGCTTTTTTGTAAAACAGATTTTTTG-10 GCGCGCTT 3', (12) kuviossa 3] . Kaita kahta aluketta käyt täen ja käyttäen 2 yg:aa flokkuloituvasta meioottisesta segreganttikannasta KMSÖ04 peräisin olevaa DNA:ta templaat-ti;na/ suoritettiin PGR LA-PCR-käyttöpakkauksella. Reaktio suoritettiin seuraavasti: 1 Sykli 94 °C;ssä 1 minuutin 15 ajan, jota seurasi 30 kertaa sykli, joka oli 98 °C 20 sekuntia ja 68 °C 10 minuuttia. Tuloksena reaktiotuotteiden ajosta 0,8 % agaroösigeeiielektroforeesissa havaittiin, että noin 9 kb pituinen DNA-fragmen11i [ (13) kuviossa 3] amplifioltui, Koska tämä fragmentti sisälsi BamHI- ja Xbal-20 kohdat, jotka on osoitettu kuvion 2 restriktiokartassa pääteltiin, että täyspitkä Lg-FLOl-geeni sijaitsee tässä fragmentissa. Tämän jälkeen tätä PCR-fragmenttia kutsutaan nimellä täyspitkä Lg-FLOl-fragmentti, Täyspitkä Lg-FLOl-fragmentti digestoitiin useilla restriktioentsyymeiilä ja 25 tuloksena syntyneet; digestit ajettiin elektroforeesissa käyttäen 0,8 % agaroösigeeliä. Sitten määritettiin restrik-tiofragmenttien koot ja valmistettiin restriktiokartta. Kuviossa 4 esitetään täyspitkän Lg-FLOl-fragmentin restriktiokartta 30 (6) Täyspitkän Lg-FLOl-fragmentin si säänvieminen hiivaan ja flokkulaatio-ominaisuuden karakterisointi

Lg-FLOl-geenin si säanvieraisen aiheuttamia fenotyyp-pimuutoksia tutkittiin käyttäen isäntähiivakantana KY644-kantaä, josta FLOl-geeni on hajotettu valmistaen seuraa-35 väliä tavalla. Lyhyesti, osittainen FLöl-fragmentti iigoi- 27 tiin piaamidiin pRS405 (Stratagene) RamHI- ja Hindlll-kohtien väliin. Plasmidi katkaistiin ainoasta BstEII-koh-dasta, joka sijaitsee insertiofragmentissa, ja sitten vietiin sisään flokkulöituvaan hiivakantaan KY642 (a, ura3f 5 leu2, FL08) litium-menetelmällä saaden näin kanta, joka oli tullut flokkulöitufflattomaksi johtuen homologisesta rekornbinaatios ta FL01 -1 okukse s s a. Southern-analyysillä varmistettiin, että tämän kannan FLQ1-geeni oli tuhoutunut plasmidin pRS4ÖS sisäänviennillä. Tälle kannalle annettiin 10 nimi KY644-kanta.

Täyspitkä Lg-FtOl-fragmentti amplifioitiin PCR-me-netelmäliä alukkeilla, jotka oli suunniteltu niin, että ne antoivat fragmentin, jossa on Sali-kohta 5'-päässä ja Hindlli-kohtä 3'-päässä. Tämä fragmentti digestoitiin Sallis ja Hindlll-entsyymeillä. Kloonausvektorina käytettiin plasmidia pYT37, joka oli saatu viemällä plasmidin YIpS EcoRI-kohtaan sisään seuraavat kaksi fragmenttia: fragmentti, joka sisältää nukleötidisekvenssin CEN3-geen.ille, joka saatiin Entrez-DNA-sekvenssitietopankista (National Center 20 for Biotechnology Information), kuin myös 1,2 kb pituinen CEN3-fragmentti, joka saatiin PCR-reaktiolla, joka perustui hiivan kromosomin 3 koko nukleotidisekvenssiin, ja fragmentti, joka sisältää ARS-sekvenssin, joka saatiin YRP7-plasmidista peräisin olevana EcoRI-Hindlll- 25 fragmenttina. Täyspitkä Lg-FLOl-fragmentti ligoitiin pläsmidiin pIT37 Sali- ja Hindlll-kohtien väliin ja sitten se vietiin suoraan sisään: KY644-kantaan litiumrmenetelmäl-lä.

Tuloksena syntyneiden transformanttien DNA:t altis-30 tettiin Southern-analyysille. Tämän tuloksena varmistettiin, että täyspitkä Ig-FLOl-fragmentti oli viety sisään yhteen kantaan, Tämän kannan (nimeltään: KY650) sisältämälle f plasmidille annettiin nimi KTYT2. Mitä tulee KY650-kantaan ja kantaan;, joka saat iin viemällä ainoastaan vektori pYT37 35 KY650-kantaan (nimeltään KY652-kanta), flokkulaatio- 28 ominaisuuden karakterisointi suoritettiin menetelmällä, joka on aiemmin kuvattu, jonka jälkeen niitä viljeltiin alustassa, joka on esitetty taulukossa 1, 20 °C:ssa ravistellen, kunnes ne saavuttivat stationäärisen vaiheen.

5 Flokkulaation sokeri-inhibition tutkimiseksi sokerit lisättiin flokkulaatiömittauspuskuriin niin, että lopulliseksi konsentraatioksi tuli 1 M. Tulokset on esitetty taulukossa 2;

Taulukko 2 10 Hiiväkannan, johon on viety sisään täyspitkä Lg- FLQl-fragmentti, flokkulaatio-ominaisuus Kanta KY65Ö ΚΪ652 (verrokki)

Ei sokeria +

Mannoosi 15 Glukoosi Maltoosi

Galaktoosi +

Fruktoosi " + " edustaa flokkuloituvaa ja flokkuloitumatonta 20

Samalla, kun kanta KY652 ei sisältänyt flokkulaa-tio-ominaisuutta missään olosuhteissa, kanta KY650, joka i

Sisälsi täyspitkäö Ig-PLQl-fragmentin, sisälsi flokkulaa- j tio-ominaisuuden flokkulaatiomäärityspuskurissa, kun mitään 2 5 sokeria ei oltu lisätty. Tämän f lokkulaatio-ominaisuuden inhiboi mannoosi,· glukoosi ja maltoosi, ja jonkin verran fruktoosi, mutta sitä ei inhiboinut galaktoosi. Näistä tuloksista pääteltiin, että viemällä sisään täyspitkä Lg-FLOl-fragmentti on mahdollista muodostaa labora-30 toriohiiyalle öluthiiyatyyppineri flokkulaatio-ominaisuus.

Esimerkki 2

Lq~FLQl-geenin koodittavan aineen saaminen PCR-me-netelmällä, sen vieminen sisään laboratoriohiivaan ja evaluaatio ! j 29

Mitä tulee sen osan viereiseen alueeseen, joka li-goitiin vektoriin piasmidin KF14 insertiofragmenttina, nukleotidisekvenssi määriteltiin yllä kuvatulla menetelmällä. Tämän tuloksena löydettiin kohta, joka tuntui olevan 5 lg-FLOl -geenin translaation aloituskohta, 49 einäsparia ylävirtaan KFl-inseftiofragmentin 5’-päästä.. Syntetisoitiin aluke KTF7 [5' CCCCAAGCTTGCTCTGCÄGTAÄÄTTCCGCA 3', (14) kuviossa 3] 58 emäsparia ylävirtaan tämän aloituskodonin 5'-puolelta 3'-päähän päin menevään suuntaan käytettäväksi 10 ?CR-reäktiossa. Perustuen aiemmin määriteltyyn piasmidin pKF-Kpnll insertiofragmentin nukleotidisekvenssiin, syntetisoitiin myös aluke KTORFA [5' CGGAATTCT-AAACAGTATAAGCGTGATGATAG 3 ’ , (15) kuviossa 3) 53 emäsparia alavirtaan Lg-FLOl-geenin koodittavan alueen 1opetuskodonin 15 3’-puolelta 5'-päähän päin menevään suuntaan käytettäväksi PCR-reaktiossa. Käyttäen näitä kahta aiuketta ja käyttäen tempiaattina 2 pg:aa DNA:ta, joka oli flokkuloituvasta meioottisesta segreganttikannästa KMSÖ04, suoritettiin PCR-reaktio LA-PCR-käytt.öpäkkauksella. Reaktio suoritettiin 20 toistamalla 30 kertaa sykli, joka oli 94 °C 30 sekuntia, 60 °C 1 minuutti ja 72 °G 3,5 minuuttia. Ajettaessa reaktiotuotteet: elektroforeesissa 0,8 % agaroosissa havaittiin tuloksena, että noin 5,8 kb [(16) kuviossa 3] pituinen DNA-fragmentti amplifioitui. Tämän jälkeen tätä PGR-fragmenttia 25 kutsutaan nimellä Lg-FL.Q1QRF-fragmentti» Lg-FLOIQRF- fragmentti ampiifioiti in P€R-reaktiolla alukkellla, jotka [

oli suunniteltu niin, että ne: muodostivat fragmentin, jolla oli 5'-päässä RindllJ-kahta ja EcoRI-kohta 3'-päässä. Tämä fragmentti digestoitiin Hindin- ja EcoRI-entsyymeillä ja I

30 ligoitiin hiivaekspressiovektoriin pYES2 (Invitrogen)

Hindlll- ja EcoRI-kohtien väliin niin, että fragmentti insertoitiin alavirtaan GALl-promoottorista sense-suuntaan.

Sitten vektori vietiin suoraan KY644-kantaan, joka on kuvattu yllä,: litium-menetelmällä. Tuloksena syntyneiden 35 tiäns formaattien. DNA:t altistettiin Southern-analyysille ja 30 yhdelle niistä kannoista, jossa hg-FLOIORF-fragment in sisäänvienti oli varmistettu, annettiin nimi KY646-kanta.

Myöskin, kannan KYS46 sisältämä plasmidi nimettiin ΥΈ3ΚΤ2-pLasmidiksi. Mitä tulee KT646-kantaan ja kantaan, joka 5 saatiin viemällä sisään ainoastaan vektori pYES2 KY 6,44- kantaan (nimettiin KY649-kannaksi), fiokkulaatio-ominai- suuden karakterisaatio suoritettiin käyttäen aiemmin kuvattua menetelmää sen jälkeen, kun niitä Oli viljelty niin kauan, että: ne saavuttivat statiönääri vaiheen alus— 10: tässä, joka on esitetty taulukossa 1, 2,0 °C:ss,a ravistel len. Tulokset on esitetty taulukossa 3.

Taulukko 3

Hiivakannan, johon on viety sisään GM.1 -promootto-15 rin sääteleviä Lp-FLOIORF-fragmentti, flokkulaatio-ominai- suus

Kanta KY65Q KY652 (verrokki)

Ei Sokeria +

Mannoosi - 20 Glukoosi Maltoosi

Galaktoosi + -

Fruktoosi "+" edustaa flokkuloituvaa ja fiokkuloitumatonta 25

Samalla, kun kanta KY649 ei sisältänyt flokkulaa- s tio-ominaisuutta missään olosuhteissa, kanta KY646, joka sisälsi Lq-FLOIORF-f ragmentin, sisälsi flokkulaatic-omi-naisuuden flokkulaatiomäärityspuskurissa, kun mitään soke-30 ria ei oltu lisätty. Tämä flokkulaatio-ominaisuus oli, samoin kuin KY650-kannalla, oluthiivatyyppinen flokkulaatio-ominaisuus . Toisin sanoen, tämän flokkulaatio-ominai-suuden inhiboi mannoosi, glukoosi ja maltoosi, ja jonkin verran fruktoosi, mutta sitä ei inhiboinut galaktoosi.

35 Mäistä tuloksista pääteltiin, että viemällä sisään Lg- | 31 FLO 10RF-fragmen1t..1, jota sääteli GAL!-promoottori, on mahdollista muodostaa laboratoriohiivalle oluthiivatyyppinen flokkulaa.tiö~cSr>iriäi.ä»u:ä. Toisin sanoen pääteltiin, että Lg-FLQl-geenin koodi ttava alue on Lg-FLO 1ORF- f r agmen t Is s a..

5 Esimerkki 3

Oluthiivatyyppistä flokkulaatiota Lg-FLOl-qreenissä säätelevän alueen määritys

Sen alueen määrittelemiseksi Lg-FLOl-geenissä, joka: säätelee oluthiivatyyppistä flokkulaatiota, muodostettiin 10 kimeerinen geeni, joka koostui lg-FLQl- ja Sc-FLOl-gee-neistä riaboratoriGhiiyatyyppinen FLOl-geeni, jonka ovat kuvanneet Watari et ai., Yeast 10, 211 - 225 {1994)] menetelmällä, jonka on esitetty kuviossa 5, ja tutkittiin sen f iokkul aat i o - omi n a i s u u t ta, Lg-FL0l0:RF- f r agmen 11 i diges to i -1| t-iin Xitel- ja Kpnl-entsyymeillä:, juosteet tehtiin yhtäpit-kiksi Klenow-fragmentilla ja sitten kloonattiin: pUClil 8-plasmidin lincll-kohtaan. Tuloksena syntyneistä transfor-manteista valittiin yksi klooni, jossa oli noin 1 kb pituinen insertiofragmentti, ja insertiofragmentin nukleoti-20 disekvenssi määritettiin. Tulokseen perustuen syntetisoi tiin aXuke RTFS {5' CGGGATCCATCTGGCAATÄCCACACTAACÄ 3’ ) , joka ulottuu alueelle, joka on 639 emäsparia alavirtaan Lg-FLOl-geenin aloituskodönin 31-puole11a 51-suuntaan.

Käyttäen aluketta KTF7 ja aluketta KTF8 ja käyttäen temp-25 laattina 2 pg:aa DNA:ta, joka oli tlokkuloituvasta meioot-tisesta segreganttikannastä KMS0Q4, suoritettiin PCR-reak-tio TÄ-PCR-käyttöpakkauksella. Reaktio suoritettiin toistamalla 30 kertaa sykli, joka oli 94 °C 30 sekuntia, 60 °C 1 minuutti ja 72 °G 3,5 minuuttia. Kun reaktiotuotteet | 30 ajettiin elektroforeesissa 0,8 % agaroosissa, tuloksena \ havaittiin, että noin 0,7 kb pituinen fragmentti [(16) \ kuviossa 3] arnplifioitui. Tämän jälkeen tätä PCR-fragment- ] tia kutsutaan nimellä Lg-FLO1-N-pään fragmentti. Saatu i fragmentti kloonattiin plasmidiin pT7Blue (Novagen), joka | 35 on kloonausvektori PCR-tuotteilie. Käyttäen neljää saatua 1 i | 32 erillistä kloonia, niiden insertiofragmenttien nukleotidi-sekvenssit määritettiin molempiin suuntiin. Kaikkien neljän kloonin havaittiin sisältävän saman insertiofragmentin.

Saatu nukleotidisekvenssi on esitetty sekvenssissä SEQ ID -5 numero 3, yhdelle näistä klooneista annettiin nimi KNTÄl. hq-FL01-M-pään fragmentti amplifioitiin alukkeilla, jotka oli suunniteltu niin, että ne muodostivat fragmentin, jossa oli 5'-päässä Hindi XX-'koht a ja 3'-päässä BamHI-kohta.

Plasmidi KNTÄl digestoitiin Hindlll- ja BamHI-entsyymeillä 10 ja altistettiin elektroforeesille. Sitten vektorista erotettu insertiofragmentti leikattiin irti geelistä, puhdistettiin yllä kuvatulla menetelmällä ja kloonattiin pYES2-plasmidin Hindlll-BamHI-kohtaan niin, että fragmentti insertoitui alavirtaan GAL!-promoottorista sense—suuntaan. l.$ Saadulle plasmidi lie annettiin nimi KNYES, Tämän KNYES-plasmidin sisältävä Escherichia coll EKB707 -kanta talletettiin kokoelmaan National Institute of Bioseience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1 - 3, Higashi 1-Chome, Tsukuba City, Ibaragi 20 Pref., Japani) 27,1,1995 koodinumerolla FERM BP-4983.

Perustuen laboratoriohiivatyyppisen FLQi-geenin (tästä lähtien nimitetään ”Sc-FLOl-geeniksi”) nukleotidi-sekvenssiin, jonka Watari et ai, ovat kuvanneet [Yeast 10, 211 - 225 {1994) ], syntetisoitiin aluke WtFlZv (5' CGGGÄXG-25 CACTGTAÄGTGATGACTTCGAAG 31, joka sijaitsi 721 emäsparia alavirtaan aloitesködonin 3'-puolella 3’-suuntaan,: ja aluke j FLID4 (5' CGGääTTCTCAGCGTATAATTÄGCAAäGAA 3'), joka sijaitsi 58 emäspäria alavirtaan lopetuskodonin 3'-puolella 5'-suuntaan. Käyttäen näitä alukkeita ja käyttäen; 2 pg;aa 30 ABXL-ID-kannan DNA templaattina, suoritettiin PCR-reaktio LA~PCR-käyttö:päkkauksellä, Reaktio suoritettiin toistamalla 30 kertaa sykli, joka oli 94 °C 30 sekuntia, 60 °C 1 | minuutti ja 72 °C 3,5 minuuttia, Kun reaktiotuotteet ajet- | tain elektroforeesissa 0,8 % agaroosissa, tuloksena ha- j 35 'Väittiin, että noin 3,9 kb pituinen fragmentti amplifioi- \ j 33 tui. Tämän jälkeen tätä fragmenttia kutsutaan nimellä Sc-FLOl-C-pään fragmentti. Sc-FLOl-C-pään fragmentti amplifi-oltiin PCR-menetelmällä a liikkeillä, jotka oli Suunniteltu niin, että syntyneeseen fragmenttiin tuli BamHI-kohta 5'-5 päätin ja EeoRI-kohta 3’-päähän. Tämä fragmentti digestoi-tiin BamHI- ja EcoRI-entsyymeillä ja ligoitlin aiemmin rakennettuun KNYES-plasmidiin BamHI- ja EcoRl-kohtien väliin niin, että fragmentti inserhoitui alavirtaan Lg-FLOl-N-pään fragmentista sense-suuntaan. Tämän tuloksena odote-lÖ taan, että muodostetaan geeni, joka koodittaa kimeeristä FLQ1-proteiinia, jossa sellainen osa Sc-FLOl-geenin koo-dittavaa aluetta, joka vastaa aminohapposekvenssiä, joka ulottuu aminopäästä kohtaan 240:, on korvattu sellaisella osalla Lg-FLOl-geeniä, joka vastaa aminohapposekvenssiä 15 aminopäästä kohtaan 213. Ligaatioreaktiotuote vietiin si-* sään suoraan yllä kuvattuun KY644-kautaän litium-menetelmällä, Tuloksena syntyneiden tränsformanttieii DNA: t altistettiin Southern-analyysille. Niistä kannoista, joissa Lg-FLOl-N-pään fragmentin ja Sc-FLOl-C-pään fragmentin muo-20 dostaman kimeerisen geenin sisäänmeno oli varmistettu, yhdelle kannalle annettiin nimi KY648-kanta. Myöskin, tämän kannan sisältämälle plasmidille annettiin nimi KNWtC3.

Syntetisoitiin lisäksi aluke FLID1 {5 ’ CCCCAAGCTT-TCGTTTGATGTAAGCTCTCT 3 ’), joka sijaitsi kohdassa -69 emäs-25 paria ylävirtaan Sc-FLÖl-geenin alpituskodonin 5'-puolella 3'-suuntaan. Käyttäen aluketta FLID1 ja aluketta F1ID4 ja | käyttäen 2 ggraa ÄB:XL-lD-kannan DNA templaattina, suoritettiin PCR-reaktio LA-PCR-käyttöp:akkauksella. Reaktio suoritettiin toistamalla 30 kertaa sykli, joka oli 94 °C 30 30 sekuntia, 60 °C: 1 minuutti ja 72 °C 3,5 minuuttia.. Kun reaktiotuotteet ajettiin elektroforeesissa 0,8 % agaroo-sissa, tuloksena havaittiin, että noin 4,8 kb pituinen fragmentti amplifioitui. Tämän jälkeen tätä fragmenttia kutsutaan nimellä Sc-FLOIORP-fragmentti. Sc-FLOj. ORF-frag-35 mentti amplifioitiin RCR-menetelmällä alukkeilla, jotka oli ] | | 34 suunniteltu niin, että syntyneeseen fragmenttiin tuli HindllT-kohta 5'-päähän ja EcoRI.-'kohta 3'-päähän. Tämä fragmentti dig.es toi ti in Hindi il- ja EcoRl-entsyymeillä ja ligoitiin pYESE-pIasmidiin Hindin- ja EdoRI-kohtieri väliin 5 niin, että fragmentti insertoitui alavirtaan GAL1-promoottorista sense-suuntaan. Tuloksena syntynyt vektori vietiin sisään suoraan yllä kuvattuun KY644-kantaan litium-menetelmällä. Tuloksena syntyneiden transformänfctien DNA:t altistettiin Southern-analyysiile. Niistä kannoista, joissa 10 Sc-FLOl ORF - f r agrtien t i n sisäänmeno oli varmistettu, yhdelle kannalle annettiin nimi KY647-kanta, ja sitä käytettiin flokkulaafio-ominaisuuksien vertailussa. Myöskin, tämän kannan sisältämälle plasmidille annettiin nimi YESWtl.

Mitä tulee KY 64 7-, KY648- ja aiemmin kuvattuun 15 KY649-kantaan, flokkulaatio-ominaisuuden karakterisointi suoritettiin aiemmin kuvatulla menetelmällä sen jälkeen, kun niitä oli viljelty niin kauan, kunnes ne saavuttivat stationaarisen vaiheen alustassa, joka on esitetty taulukossa 1, 20 °C:ssa ravistelussa. Tulokset on esitetty tau-20 lukossa 4, 5 3 | 3 | 35

Taulukko 4

Sellaisen hiivan flokkuläafcio-ominaisuus, johon on viety sisään G&Ll-promoottorin säätelemä kimeerinen Lg-Sc-FLOl-geeni 5 Kanta 10648 KY649 (verrokki) KY647 (vertailu)

Ei sokeria + +

Mannoosi - -

Glukoosi - - +

Maltoosi - + 10 Galaktoosi + - +

Fruktoosi - + “ edustaa flokkuloituvaa ja flokkulGitumatonta

Samalla, kun; kanta KY649 ei sisältänyt flokkulaa-15 tio-ominaisuutta· missään olosuhteissa;, kanta KY648, joka sisälsi kimeerisen geenin, joka koostui Lg-FLOl-M-pään fragmentista ja So-FLQl-C-pään fragmentista, ja K¥M7-kan- ta, joka sisälsi Sc-FLÖlORF—fragmentin, sisälsi flökkulaa-tio-ominaisuuden flokkulaatiomäärityspuskurissa, kun mitään 20 sokeria ei oltu lisätty. KY.648-kannan flokkulaatio-ominai-suutta, samoin kuin KY6.50-- kannan, inhiboi mannoosi, glukoosi ja maitoosi, ja jonkin verran fruktoosi, mutta sitä ei inhiboinut galaktoosi. Toisaalta KY647-kannan flokkulaatio-ominaisuutta inhiboi ainoastaan mannoosi, 25 mutta ei glukoosi, maltoosi, fruktoosi eikä galaktoosi.

Toisin sanoen samalla, kun Sc-FtOlORF-fragmentti muodostaa 1 laboratoriohiivatyyppisen flokkulaatio-orninaisuuden, ki- | rneerisen geenin, joka valmistettiin korvaamalla sellainen \ osa tätä fragmenttia, joka ulottuu sen aloituskodönista 720 30 emäsparia 3'-suuntaän sellaisella osalla hg-FLOl-geeniä, joka ulottuu aloituskodonista 639 emäsparia 3'-suuntaan, muodostaa oluthiivatyyppisen flokkulaation. Näistä tuloksista pääteltiin, että se mikä ottaa vahvasti osaa oluthiivatyyppi sen flokkulaatio-ominaisuuden muodostumi- 3.5 seen, on Lg-FLQ1 -N-pään fragmentti Lq-FLOlORF-fragmentissa, 36 se on sekvenssi/ joka on esitetty sekvenssissä SEQ ID ~ numero 3 sekvenssiluettelossa.

Esimerkki 4

Oluthiivan, josta Lg-FLOl-geeni on tuhoutunut, eva- 5 luaatio (1) Lg-FLOl-geenin hajottavan plasmidin valmistus

Plasmidi Lg-FLOl-geenin hajottamiseksi valmistettiin), kuten on esitetty kuvioissa 6 ja 7. Lyhyesti, plasmidi pOClfi digestoitiin Kpnl-entsyymillä ja sitten Klenow-10 fragmentilla tasapäisiksi tehdyt DNA-fragmentit ligoitiin itsensä kanssa niin, että valmistettiin plasmidi pUC18 delta K. Tämä plasmidi digestoitiin HinclJ-entsyymiilä ja sitten siihen liitettiin Kpnl-iinkkeri (GGGTACCC) näin valmistaen plasmidin pUCl8 ± K. Tämän plasmidin EcoRI- ja 15 BamMI-kohtien väliin insertoitiin 0,9 kb pituinen EcoRI-BamHI-fragmentti (sisälsi 5'-alueen), joka saatiin plas-midista KF14 niin, että valmistettiin plasmidi pKFSBi.

Plasmidista pKF3EP, joka saatiin insertoimalia 1.7 kb pituinen HinoII-PvuII-fragmentti (sisälsi 3'-pään 20 viereisen alueen) plasmidin pUC118 Smal-kohtaan, saatiin 1.7 kb pituinen BamH I -Κρη I. - f ragmen tt .1 ja se insertoitiin BainHI- ja Κρηΐ-kohtien väliin plasmidiln pKFSBl niin, että häin valmistettiin plasmidi pKF53-l.

Plasmidi pSY114P (tarkastamaton JP-patenttijulkaisu 25 numero 2-265 488), joka sisältää promoottorialueen (1,0 kb) hiivan GPD-geenistä (glyseraldehydi-3-fosfaattidehyd-rogenaasi) ja lopetusalueen (0,4 kb) hiivan PGK-geenistä [ (fosfogiyseraattikinaasi), digestoitiin Smäl-entsyymillä ja sitten siihen ligoitiin HindTII-linkkeri (CAAGCTTG). Sen 30 jälkeen plasmidi digestoitiin HindiIl-entsyymillä ja lisoitiin itsensä kanssa näin valmistaen plasmidi pSYlI4H.

Tämän plasmidin Hindlll-kohtaan insertoitiin 0,5 kb pituinen HindiII-fragmentti pSV2bsr-plasmidista (Funakoshi), joka sisältää blastisldiini S -resistenssigeenin, valmis- j 35 taen näin plasmidi pGPDBSR. Tämä plasmidi digestoitiin j j $ 37

Sali-entsyymillä ja sitten tehtiin tasapäiseksi Klenow-fragmentilla niin, että näin saatiin 1,9 kb pituinen DNA-fragmentti. Tämä DNA-fragmentti ligoitiin DNA-fragmenttiin, joka saatiin digestoimalla plasmiäi pKF53-l BarriHT-entsyy-5 millä ja sitten tekemällä se tasapäiseksi K1enow-fragmentilla näin valmistaen plasmidi pKF53BSRl9.

(2) Oluthiivan transformaatio

Oluthiivan transformaatio suoritettiin elektropo-raati.ol.la? Flokku.loituvaa.: oluthiivan viljeltiin 2D0 mlr.ssa.

10 YPD-alustaa, kunnes 0P6QQ-arvoksi tuli noin 7, ne pestiin kaksi kertaa steriloidulla vedellä ja kahdesti 1 M sorbitolilla, ja sitten ne suspensoitiin uudelleen 1 mitään 1 M: sorbitolia. 50 pliaan tätä hiivasuspensiota lisättiin 2,7 pg DNA-fragmentteja, jotka saatiin digestoimalla plas-15 midi pKFSSBSR EcoRT-entsyymillä, ja 10 pg lohen sperman DNA;ta {Sigma), ja annettiin seistä 5 minuuttia. Sitten käyttäen Gene Pulser -laitteen 0,2 cm kyvettiä (Bio-Rad), annettiin sähköpulssi, joka oli 1,5 kV, 25 gF ja 200 Ω.

Tuloksena syntyneeseen suspensioon lisättiin 1 ml 1 M sor-20 bitolia ja 400 pl YPD-alustaa, ja niitä viljeltiin 30 °C:ssa 4 tuntia ravistellen. Sen jälkeen suspensio mal-jattiin YPD-agaralustaan, joka sisälsi 50 pg blastisidiini S: -yhdistettä/.ml (Funakoshi) ja niitä viljeltiin- 30 °C:ssa ;

3 vuorokautta. Tuloksena syntyneet transformantit altis- I

25 tehtiin Southern-analyysille ja sen tuloksena varmistettiin, että Lg-FLQl-geeni oli hajonnut. Näin saatua Lg-FLOl-geenin suhteen tuhoutunutta oluthiivaa evaluoitiin sen flokkulaatio-ominaisuuden suhteen ja sen havaittiin muuttuneen flokkuloitumattomaksi,

30 Esimerkki 5 I

$

Lg-FLQl- ja Sc-FLOl-geenien N~pään alueen ennustet- j tujen aminohapposekvenssien vertailu j

Esimerkissä 3 on esitetty, että oluthiivätyyppistä | flokkulaatiG-ominäisuutta säätelee 213 aminohappotähteen | 35 pituinen sekvenssi Lg-FLOl-geenin N-pään alueella. Sitten j i 38 vertailtiin Lg-FLOl-geenin ja Sc-PLOi-geenin tämän alueen ennustettuja äffiihohapposekvehsse j ä. Tämän tuloksena, kuten on esitetty kuviossa 8, havaittiin seuraavat ominaisuuserot näiden kahden sekvenssin välillä. 1) Lq-FLOl-sekvenssis sä 5 27 aminohappotähdettä, jotka vastaavat S c-FLO1-s e kven s s1n vastaavia kohdalla 84 - 110, ovat deletoituneet. 2) Kohtaan 123 asti Sc-FLQl-sekvenssissä homologia Sc-FLOl- ja Lg-FLQ1-se kv en s s ien välillä on suhteellisen matala. 3)

Kohdassa 124 ja siitä ylöspäin Sc-FT.,01-sekvenssissä 10 homologia Sc-FLOl- ja Lg-FLOl-sekvenssien välillä on korkea.

Häihin tuloksiin perustuen valmistettiin kimeerinen geeni, joka koostui Sc-FLOl- ja Lg-FLOl-sekvensseistä, ja modifioitu Sc-FLOl, jossa oli 27 aminohappo tähteen deleetio 15 kohdasta 84 kohtaan 110. Näiden modifioitujen FLOl-geenien N-pään alueet valmistettiin käyttäen rekombinantti-PCR-menetelmää, joka on kuvattu sivuilla 155 - 160 teoksessa PCR Experiment Manual [M.A. Tnhis et ai. (toim.), jonka on editoinut ja kääntänyt Takashi Saito, HBJ Shuppan Go., Ltd.

2 0 {1991)] .: Näin valmistettu modifioidun FLOl-geenin N-pään alueen fragmentti ligoitiin plasmidin ;KNWtC3 (kuvattu esimerkissä 3) HindiII- ja BamHX-kohtien väliin (se on, j GAL1-promoottorin ja Sc-FLQl-C-pään fragmentin väliin) sense-suuntaan, ja sitten se vietiin sisään KY644-25 hiivakant£an> Tuloksena syntyneiden transformanttien viljely ja flökkulaatio-ominaisuuden evaluaatio suoritettiin oleellisesti samalla tavalla kuin esimerkissä 3.

Tulokset on esitetty kuviossa 9. Ne kannat (KY707, ΚΥ.7Ό8. ja | KY7Q9), joissa oli kimeerinen FLOl-geeni, joka koostui Lg- j 3Ö FLQl-geenistä peräisin olevasta osasta, joka ulottui \ kohtaan 46, 68 tai 83 (perustuen Se-PLO1-sekvenss1in) ja |

Sc-FLQl-geenistä peräisin olevasta alueesta, joka sijaitsi \ yllä olevan alueen perässä, sisälsivät vahvan laboratorio- j hiivatyyppisen flokkulaation samalla tavalla kuin kanta, | 35 jolla oli 5c-FLOl-geeni (KY706). Toisaalta kanta, jolla oli j ! | 39 kimeerinen FLQl-geeni, joka koostui Lg-FLOl-geenistä peräisin olevasta alueesta? joka ulottui aminohappotähteeseen 124 perustuen S c-FLOl-s e kvens s i1n (kohta 97 perustuen Lg-FLOl-sekvens siiri) ja Sc-FLOl-gee-5 nistä peräisin olevan alueen, joka sijaitsi yllä olevaa aluetta, sisälsi heikon oluthiivatyypplsen flokkulaation samalla tavalla kuin esimerkissä 3 esitetyt kannat KY648 ja KY64 6:. Lisäksi kanta KY711, jolla on modifioitu FLQl-geeni, jossa on 27 aminohappotähteen pituinen deleetio kohdasta 84 10 kohtaan 110 S c-FL01-sekven s s I s s ä, sisälsi heikon laböratoriohiivatyyppisen flokkulaation. Näiden tulosten perusteella on esitetty, että se osa Lg-FLOl-gereniä, joka ottaa osaa oluthiivatyyppiseen fIgkkulaatioon, on osa, joka vastaa 14 aminohappotähdettä kohdasta 84 kohtaan 97 15 perustuen Lg-FLQl-sekvenssiin, se on sekvenssi, joka on esitetty sekvenssissä 3EO ID -numero. 4, joka koodittaa sekvenssiluettelon aminohapposekvenssiä SEQ ID -numero 2,

Teollinen sovellus

Esillä olevan keksinnön mukaisesti on esitetty Lg-20 Flol-proteiini, jolla on aktiivisuus, joka muodostaa hiivalle oluthiivatyyppisen flokkulaatio-omlnaisuuden, kuin myös Lg--FLOl-DNA-j uoste, joka koodittaa tätä proteiinia.

Viemällä keksinnön: mukainen DNA sisään hiivaan vieraana DNAina, se on viemällä tämä DNA hiivasoluihin tuman ulko-25 puolisena geeninä ja/tai tumageeninä/ on mahdollista muodostaa hiivalle oluthiivatyyppinen flokkulaatlo-orninaisuus tai tehostaa sitä ominaisuutta hiivassa. Tälle päinvastaisesta viemällä hiivasoluihin sisään DNA, joka saatiin hajottamalla keksinnön mukainen DNA, tai inhiboimalla kek-30 sinnon mukaisen DNA:n ekspressio on mahdollista muuttaa [ flokkuloituva hlivakanta flokkuloitumattomaksi hiivakan- | naksi tai vähentää sen flokkulaatio-ominaisuutta.

40

Sekvenssilistaus

Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 1

Sekvenssin ominaisuudet:

Pituus: 213 aminohappoa Tyyppi: aminohappoj a Topologia: lineaarinen Molekyylityyppi: peptidi Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 1:

Met Thr Ile Ala His His Cys Ile Phe Leu Vai Ile Leu Ala Phe Leu 1 5 10 15

Glu Leu Leu Asn Vai Ala Ser Gly Ser Thr Gin Ala. Cys Leu Pro Vai 20 25 30

Gly Ser Arg Lys Asn Gly Met Asn Vai Asn Phe Tyr Lys Tyr Ser Leu 35 40 45

Gin Asp Ser Thr Thr Tyr Ser Asp Pro Gin Tyr Met Ala Tyr Lys Tyr 50 55 ' 60

Ser Asp Thr Lys Lys Leu Gly Ser Vai Ser Gly Gin Thr His Leu Ser 65 70 75 80

Ile Tyr Tyr Gly Pro Asn Thr Ala Phe Trp Asn Thr Ala Ser Trp Ser 85 90 95

Ser Asp Leu Phe Gly Phe Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Vai Thr Vai Glu 100 105 110

Met Thr Gly Tyr Phe Leu Pro Pro Gin Thr Gly Ser Tyr Thr Phe Lys j 115 120 125 j

Phe Ala Thr Vai Asp Asp Ser Ala Ile Leu Ser Vai Gly Gly Ser Ile j j 41 1.30 135 140 Älä Pha Glu Cys Cys Ala Gin Glu Gin Pro Pro Ile Thr Ser Thr Asp 145 ISO 155 160

Phe Thr Ile Asti Gly Ile Gys Pro Trp Asp Ala Ala Ala Pro Thr Asp 165 170 175

Ile Uv s Gly Ser Thr Tyr Met Tyr Ala Gly Tyr Tyr Tyr Pro Ile Lvs 180 185 190

Ile Vai Tyr Ser Äsn Ala Lys Vai Leu Ala Ärg Leu Pro Vai Ser Vai 195 200 205

Vai LeU Pro Asp Gly 210

Tiedot sekvenssille SEQ: ID -numero 2

Sekvenssin ominaisuudet:

Pituus: 14 aminohappoa

Tyyppi: aminohappoja

Topologia: lineaarinen

Molekyylityyppi: peptidi

Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 2:

Gly Pro Äsn Thr Ala Phe Trp Asn Thr Ala Ser Trp Ser Ser 1 5 10

Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 3

Sekvenssi n omina1s uudet: j

Pituus: 697 emäsparia Tyyppi: nukleiinihappoja Juosteisuus: kaksijuosteinen Topologia: lineaarinen 42

Molekyylityyppi: genominen DNA Alkuperäinen lähde:

Laji; Sacoharomyces cerevisiae Kanta: KMS0Q4 Ominaisuus:

Nimi/tunnusGDS Sijainti: 59.. . 697 Tunnist.usmenetelmä: E Sekvenssin kuvaus; SEQ ID -numero 3: GCTCTGCAGT AÄÄTTCCGGA: ÄÄTGÄTTTtG TTTäAATTGÄ TTAGCACCAC TAAAAAAA 5:8 ATG ACA ATT GGÄ. CAC CÄG TGG ATA TTT TTG GTA ATC TTG GCC TTT CTG 106

Met Thr Ile Ala. H.is His Cys Ile Phe Leu Vai Ile Leu Ala Phe Leu 1 5 10 15 GAG CTA CTT AftC GTA GCA TCA GGÄ AGT ACA CAA GCA TGC CTG CCA GTG 154

Glu Leu. Leu: Asn Vai Ala Ser Gly Ser Thr Gin Ala Cys Leu ero Vai 20 25 30 GGC TCG AGG .AAA. AAT GGG ATG AAT GTC AAC TTT TAT AAA TAC TCA TTA 202

Gly Ser Arg Lys Asn Gly Met Asn Vai Asn Phe Tyr Lys Tyr Ser Leu 35 40 45 CÄG GAT TCA ACA AGG TAT TCC GAC GGG CAA TAT ATG GCC TAT AAA TAC 250

Gin Asp Ser Thr Thr Tyr Ser Asp Pro Gin Tyr Met Ala Tyr Lys Tyr 50: 55 60 TCC GAT ACA AAG MG TTA GGT TCC GTT ÄGC GGA CAG ACC CAT GTC TCC 298

Ser Asp Thr Lys Lys Leu Gly Ser Vai Ser Gly Gin Thr His Leu Ser 65 70 75 80 ATA TAC: TAT GGC CCA AAT ACT GCC TTT TGG AAT ACT GCC TCT TGG AGT 346

Ile Tyr Tyr Gly Pro Asn Thr Ala Phe Trp Asn Thr Ala Ser Trp Ser 43 Θ5 90 95 TCT GAT CTT TTT GGT TTC TAT ACT ACT CCA ACT AAT GTA ACT; GTG GAA 394

Ser Asp Leu Phe Gly Phe Tyr Thr Thr Pro Thr Äsn Vai Thr Val Glu :100 iqs no ATG ACA GGG TAC TTT TTA CCA CCA CAG ACG GGT TCT TAG ACA TTC AAG 442

Met Thr Gly Tyr Phe Leu Pro Pro Gin Thr Gly Ser Tyr Thr Phe Lys 115 120 125 TTT GCT AGA GTT GAC GAC TCT GCA ATT TTA TCG GTT GGT GGT AGC ATT 490

Phe Ala Thr Vai Asp Asp Ser Ala He Sea Ser Val Gly Gly Ser lie 130 135 140 GCG TTC GAA TGT TGT GCA CAA GAA CAA CCT CCT ATC ACA TCA ACG GAT 538

Ala Phe Glu Cys Cys Ala Gin Glu Gin Pro Pro He Thr Ser Thr Asp 145 150 155 160 TTC ACT ATT A AC GGT ATT AAA CCA TGG GAC GCA GCT GCA CCT ACC GAC 586

Pile Thr lie Asn Gly lie Lys Pro Trp Asp Ala Ala Ala Pro Thr Asp 165 170 175 ATA AAG GGG; TCA ACG TAG ATG TAC GCC GGT TAC TAT TAC CCG ATC AAA 634

He Lys Gly Ser Thr Tyr Met Tyr Ala Gly Tyr Tyr Tyr Pro lie Lys 180 185 190 ATT GTT TAT TCA AAT GCT AAA GTC TTG GCT ÄGG CTT CCT GTT AST GTG 682 lie Val Tyr Ser Asn Ala Lys Val Leu Ala Arg Leu Pro Val Ser Val 195 200 205 GTA TTG CCA GAT GGA 697

Val Leu Pro Asp Gly ; 210 j 44

Tiedot sekvenssille SEQ ID -numero 4

Sekvenssin ominaisuudet:

Pituus: 42 emäsparia Tyyppi: nukleiinihappoja Ju.östeisuus: kaksijuosteinen Topologia: lineaarinen Molekyyli tyyppi·: genominen DNA Alkuperäinen lähde:

Laji: Saccharomyces cerevisiae Kanta: KMS00.4 Ominaisuus:

Nimi/tunnus: CDS Sijainti; 1. .42

Tunnistusmenetelmä: E Sekvenssin kuvaus: SEQ ID -numero 4: GGC CCA AAT ACT GCC TTT TGG AAT ACT GCC TCT TGG AGT TCT 42 Gly Pro Äsn Thr Ala Phe Trp Asn Thr Ala Ser Trp Ser Ser 1 5 10 | 5

Claims (18)

45 Patentt ivaatimukset

1. Proteiini, tunnettu siitäettä se käsittää polypeptidin, jolla on aminohapposekvenssi, joka on esitet- 5 ty sekvenssi luet telon sekvenssissä nro 2., ja jolla on aktiivisuus, joka muodostaa hiivalle oluthiiyatyyppisen flok-kulaatio-oininaisuuden.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteiini, tunnettu siitä, että se käsittää polypeptidin, jolla on ami- 10 nohapposekvenssi, joka on esitetty sekvenssiluettelon sekvenssissä nro 1, ja jolla on aktiivisuus, joka muodostaa hiivalle oluthi iva tyyppisen flokkulaatio-omihaisuuden.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteiini, tunnettu siitä, että se käsittää polypeptidin, jolla on 15 osittainen sekvenssiluettelpn sekvenssissä nro 1 esitetty aminohapposekvenssi, mikä sisältää aminohappotähteet kohdasta 25 kohtaan 213, ja jolla on aktiivisuus, joka muodostaa hiivalle oluthiivatyyppisen flokkulaatio-ominaisuuden.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteiini, tun- 20 nettu siitä, että se käsittää polypeptidin, jolla on osittainen sekvenssiluettelon sekvenssissä nro 1 esitetty aminohapposekvenssi, mikä sisältää aminohappo tähteet kohdasta 25 kohtaan 97, ja jolla on aktiivisuus, joka muodostaa hiivalle oluthiivatyyppisen flokkulaatio-ominaisuuden.

5. DNA, tunnettu siitä, että se käsittää nuk- leotidisekvenssin, joka on esitetty sekvenssiluettelon sekvenssissä nro 4, ja joka koodittaa polypeptidiä, jolla on aktiivisuus, joka muodostaa .hiivalle, oluthiivatyyppisen flokkulaatiQ-ominai suuden.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA, tunnettu siitä, että se käsittää nukleofcidisekvenssin, joka koodit-taa polypeptidiä, jolla on aminohapposekvenssi, joka on esitetty sekvenssiluettelon sekvenssissä nro 1,

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA, tunnettu 35 siitä, että se käsittää nukleotidisekvenssin, joka koodit-taa polypeptidiä, jolla on osittainen sekvenssiluettelon 46 sekvenssissä nro 1 esitetty aminohapposekvenssi, mikä sisältää aminohappotähteet kohdasta 25 kohtaan 213.

8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA, tunnettu siitä, että se käsittää nukleotidisekvenssin, joka koodit- 5 taa polypeptidiä, jolla on osittainen sekvenssiluettelon sekvenssissä nro 1 esitetty aminohapposekvenssi, mikä sisältää aminohappotähteet kohdasta 25 kohtaan 97.

9. Patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA, tunnettu siitä, että se käsittää sekvenssiluettelon sekvenssissä nro 10. esitetyn nukleotidisekvenssin sisältäen emäkset: kohdasta 59 kohtaan 697.

10. Patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA, tunnettu siitä, että se käsittää osittaisen sekvenssin nukleotidi sekvenssistä, joka on esitetty sekvenssiluettelon sek- 15 venssissä SEQ ID -numero 3, sisältäen emäkset kohdasta 131 kohtaan 697.

11. Patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA, tunnettu siitä, että se käsittää osittaisen sekvenssin nukleoti-disekvenssistä, joka on esitetty sekvenssiluettelon sek- 20 venssissä nro 3, sisältäen emäkset kohdasta 131 kohtaan 349, tai sille komplementaarinen DNA.

12. Plasmidi, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksen 5-11 mukaista DNA;ta.

13. Menetelmä sellaisen hiivakahnan tuottamiseksi, 25 johon on muodostettu oluthiivatyyppinen flokkulaatio-omi- naisuus tai sitä on tehostettu, tunnet tu siitä, että menetelmä sisältää vaiheen, jossa hiivakantaan viedään sisään minkä tahansa patenttivaatimuksen 5-11 mukainen DNA.

14. Menetelmä sellaisen hiivakannan tuottamiseksi, 30 josta on poistettu oluthiivatyyppinen flokkulaatio-ominaisuus tai sitä on pienennetty, tunnettu siitä, että menetelmä sisältää; vaiheen,,: jossa hiivakantaari viedään sisään DNA, josta kyky ekspressoida proteiinia, jolla on aktiivisuus , joka muodostaa oluthiivatyyppisen flokkulaatio-omi- 35 naisuuden, on poistettu tai sitä: on vähennetty hajottamalla minkä tahansa patenttivaatimuksen 5-11 mukainen DNA. 47

15. Menetelmä oluthiivatyyppisen flokkulaatlo-omi-naisuuden poistamiseksi hiivasta tai sen vähentämiseksi hiivassa, tunnettu siitä, että menetelmä sisältää vaiheen, jossa inhiboidaan minkä tahansa patenttivaatimuksen 5 5 - 11 mukaisen DNA:n ekspressiota.

16. Hiivakanta, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimusten 5 -11 mukaista DNA: ta, muun kuin LgFLOl-prömootterin mainitun DNA:n 5'-ylävirta-alueella ja terminaattorin mainitun DNA:n 31-alavirta-alueella.

17. Menetelmä panimotuotteen tuottamiseksi, tun nettu siitä, että menetelmä sisältää vaiheen, jossa viljellään patenttivaatimuksen 16 mukaista hiivakantaa.

18. Panimotuote, tunnettu siitä, että se käsittää hiivaa, joka sisältää patenttivaatimusten 5 - 11 mukais-15 ta DNA: ta ja tuotetaan patenttivaatimuksen 17 mukaisella menetelmällä. 48