WO1996012017A1

WO1996012017A1 - Gene participant a l'apoptose

Info

Publication number: WO1996012017A1
Application number: PCT/JP1995/002090
Authority: WO
Inventors: Yutaka Shindo; Tsutomu Nishida; Masakazu Adachi; Hiroto Naora; Honami Naora
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.; Australian National University
Priority date: 1994-10-14
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 1996-04-25
Also published as: CA2202628A1; EP0781844A1; KR970707282A; AU3673395A; JPH1189573A; MX9702754A; CN1171133A

Description

明細書

アポトーシス関与遣伝子

s Ά n

本発明は，アポトーシス（apoptosis) 関与遣伝子、より詳しくはアポトーシスの前段階過程において高発現する新規な n b l 遺伝子に関する。更に本発明は特定のァポトーシス遺伝子の利用によるアポトーシス関与遺伝子発現物の検出法、アポトーシスの制御法及び該アポトーシス制御に用いるアポトーシス関与遺伝子アンチセンスに関する。

従来技術とその課題

アポトーシスは、細胞及び個体の発生、分化、成熟におけるプログラムされた細胞死において、或は種々の状況下に誘導される細胞死において、認められる細胞が死に至る過程を意味し [Br. J. Cancer, 265, p239 ( 1972)] 、これは生理学上の種々の条件下に起こるとされている。その形想学的特徵としては、周囲の細胞との接触の欠乏、細胞質の濃縮化、エンドヌクレアーゼの活性に関連したクロマチンの凝縮及び核、核の分節化等を挙げることができ、更に細胞表面の微絨毛の消失、細胞表面の水泡形成 ( membranece blebbing) 等も観察される ₀ またェンドヌクレアーゼ活性により D N Aフラグメンテーションも観察され、アポブティック体の細胞の最終断片は、隣接する細胞により貪食される機構として論じられてい

¾ [Immunology Today, 115-119(1986) ； Science,

245, 301-305(1989)] 。

かかるアポトーシスは、各種多様な疾患において重要な係わりを有することが明らかにされてきており、之等の疾患の診断における利用価値及び細胞のアポトーシスを誘導乃至抑制することにより、之等疾患の予防及び治療を図る試みが近年殊に注目されている。

アポトーシスを誘導することが好ましい疾患としては、例えば白血病、メラノーマ等の癌や自己免疫、細胞死を伴わないウィルス疾患等の疾患が挙げられる。また、ァポトーシスを抑制することが好ましい疾患としては、例えばァ.ルツハイマー等の神経細胞死による神経疾患、

Η I V感染疾患（無症候期）、細胞死を伴うウィルス感染等の疾患が挙げられる。

その遣伝子発現或は遗伝子産物によって細胞のアポト一シスを制御するアポトーシス関与 ¾伝子が提供できれば、各細胞での発現レベルやその構造及び機能解析或はその発現物に関する解析等により、上記アポトーシス或は関連疾患の病態解明やその診断と治療方法も確立可能となると^んりれ 6。しかしながら、アポトーシスに関する之等の解析は、現在アポトーシス関与遺伝子が単離されておらず未知であるが故に不可能である。

発明の開示

本発明によれば、アポトーシスに至る過程においてその関与が必要な特定遣伝子明らかにされる。かかる遣伝子はその一過的な発現後にアポトーシスの特徴である D N Aフラグメンテーション（断片化）が観察され、その一時的な発現増大とその後の減少が細胞のアポトーシスの過程に必要であることが明らかにされた。

しかして、本発明はかかる特定のアポトーシス関与遺伝子を提供するものである。

また、本発明はかかる遗伝子或はその発現物の検出やそれらの人工的制御等により、アポトーシスの関与する各種の疾患の診断、病態解、アポトーシスの誘導乃至抑制を行なうための上記遺伝子の利用をも提供するものである。

本発明によれば、配列番号： 1 で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むアポトーシス関与遺伝子の一つとしての遺伝子（以下これを「 n b l 遺伝子」という）が提供される。

更に、本発明によれば、上記配列番号： 1 に示されるァミノ酸配列をコードする塩基配列で特定される n b 1 遺伝子の配列と相同性の高い、 f t e - 1遺伝子、

R P S 3 a遺伝子、 M F T - 1遺伝子、 c y c 0 7遺伝子、 T U— 1 1遗伝子及び K R P - A遣伝子もまた、ァポトーシス関与遺伝子及びその同効物として提供される _c 以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、 I U P A C、 I U Bの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作

- '

成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。本発明により提供される遣伝子は、細胞のアポトーシスの過程において一過的に発現される遣伝子であることにおいて特徴付けられる。かかる逸伝子の 1具体例は、配列番号： 2に示される塩基配列を有しており、これは例えば配列番号： 3に示される c D N Aクローンの有するものであり、該クローンは 2 6 4 アミノ酸をコードする 7 9 2 ヌクレオチド（核酸）のオープンリーディングフレームを有している。本発明遣伝子は、例えば配列番号： 2及び同配列番号： 3 に示されるように、一本鎖 D N A配列で表されるが. 本発明はかかる一本鎖 D N A配列に相補的な D N A配列や之等の両者を含むコンポーネントもまた包含する。尚配列番号： 2 に示す本発明遺伝子の配列は、これによりコードされる各アミノ酸残を示すコドンの一つの組合わせ例であり、本発明遣伝子はこれに限らず、各ァミノ酸残基に対して任意のコドンを組合わせ選択した D N A 塩基配列を有することも勿論可能である。該コドンの選択は常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮することができる [Ncl. Acids Res. , 9, 43-74 (1981) ] 。

更に本発明遺伝子には、上記配列番号： 1 で示されるァミノ酸配列の一部のァミノ酸乃至ァミノ酸配列を置換、欠失、付加等により改変し^:なり、同様の機能を有する同効物をコードする D N A配列もまた包含される。これらポリペプチドの製造、改変（変異）等は天然に生じることもあり、また翻訳後の修飾により、或は遣伝子工学的手法により天然の遗伝子（本発明遺伝子）を、例えばサイトスぺシフィック · ミュータゲネシス [ Methods in Enzymology, 154. p350, 367-382( 1987) ； m 100, p468 ( 1983) ； Nucleic Acids Research, 12, p9441(1984) ；続生化学実験講座 1 「遺伝子研究法 I I 」、日本生化学会編， pl05( 1986)] 等の方法により改変したり、リン酸ト

- ·.

リエステル法ゃリン酸アミダイト法等の化学合成手段

[ J. Am. Chem. Soc. , 89, ρ4801 ( 1967) ；同 , ρ3350 (1969) ； Science, 150. pl78 (1968) ； Tetrahedron Lett. , 22, pl859 ( 1981 ) ；同， p245( 1983 ) ] により変異させた D N Aを合成したり、それらの組合せにより収得することができる。

卞- - 実際に、 V- fos トランスフォーメーションェフエクタ一遺伝子として知られているラット F t e — 1 遺伝子

[ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 89. 2200 - 2204( 1992 ) ] に対応するヒト F t e - 1 遺伝子 ( GenBank Accession No. M84711 ) は、配列番号： 3 に示される塩基配列においてその 6 2 0番目の塩基が（ A ) である、従って対応する 1 9 6番目のアミノ酸が Aspである、同効物であり、これは本発明におけるアポトーシス関与遣伝子に包含される。

リボゾームの蛋白であるヒト R P S 3 a CMetspalu, A. , et al.， Gene, 9_t 313 - l'6 C 1992 ) 〕遺伝子もまた、 1 9 6番目のアミノ酸残基のみが n b 1 遣伝子と異なるだけであり、本発明におけるアポトーシス関与遺伝子に含まれる。

また、ミトコンドリアへの蛋白の輸送に関連している酵母 M F T — 1 遗伝子と n b 1 遺伝子のアミノ酸レベルでの相同性は、 5 8 96であり、これも本発明におけるァポトーシス関与 ¾伝子に包含される〔 Garrett, et al.. ol. Gen. Genet. , 225, 483-491(1991)〕。更に、 n b 1 遺伝子は、細胞サイクルを調節（制御）する高等植物の c y c 0 7遺伝子とは、 6 2 %のァミノ酸レベルでの相同性を示し〔 Ito, . , et al. , FEBS Letters, 301. 29-33( 1992)〕、これも本発明におけるァポトーシス関与遺伝子に含まれる。

加えて、アミノ酸レベルで n b l 遺伝子とほんの 4 ァミノ酸残基が異なり、 9 8 の相同性を示すマウス T U - 1 1 遺伝子〔 Gordon, H. M. , et al. , J. Immunol.， 148, 4021 -4027( 1992) 〕や、アミノ酸レベルで n b 1 遣伝子と 7 8 %の相同性を有するゥミゥサギ K R P — A C Sea hare； Apl ysia cal ι lomica : Auclair, . , et al. , Eur. J. Biochem. , 220. 997-1003( 1994)〕の遺伝子も、同様に本発明におけるアポトーシス関与遣伝子に包含される。

本発明遺伝子は、これを利用して、即ち例えばこれを微生物のベクターに組込み、形質転換された微生物を培養することによって、上記アポトーシス関与蛋白を容易

,

にかつ安定して発現できる。

また本発明の遺伝子を利用して得られるアポトーシス関与蛋白は、これを用いて、特異抗体を作成することもできる。ここで抗原として用いられるコンポーネントは、上記遣伝子工学的手法に従って大量に産生される蛋白を用いることができ、得られる抗体はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれでもよく、之等抗体はアポ卜一シス関与蛋白の精製、測定、識別等に有利に利用できる。

殊に、本発明遺伝子は、その一部又は全部の塩基配列を利用することによって、各種ヒト組織 Z細胞におけるアポトーシス関与遺伝子の発現を検出する上で極めて良好に使用できる点で特徴付けられる。

本発明遣伝子の製造は、本明細書に開示された本発明遺伝子についての配列情報によれば、一般的遣伝子工学的手法により容易に実施で ¾る [Molecular Cloning 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ；続生化学実験講座「遺伝子研究法 I、 I I、 I I I 」、日本生化学会編（ 1986 ) 等参照] 。

これは例えばヒト c D N Aライブラリー（アポト一シス関与遺伝子の発現される適当な起源細胞より常法に従い調製されたもの）から、本発明 ¾伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することによ ^実施できる [ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 78, 6613 (1981) ； Science, 222, 7^8( 1983)等] 。

上記方法において、起源細胞としては、アポト一シス関与遺伝子を発現する各種の細胞、組織や之等に由来する培養細胞等が例示され、之等からの全 R N Aの分雜、 m R N Aの分離や精製、 c D N Aへの変換（合成）とそのクローニング等はいずれも常法に従い実施できる。また、 c D N Aライブラリー^市販されてもおり、本発明においてはそれらの c D N Aライブラリー、例えばクローンテック社（Clontech Lab. Inc. ) より市販の各種の c D N Aライブラリ一等を用いることもできる。

c D N Aライブラリーからの本発明遺伝子のスクリーニングは、前記通常の方法に従い実施することができる, 該スクリーニング方法としては、例えば c D N Aの産生する蛋白に対して、アポトーシス関与蛋白特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより、対応する c D N A クローンを選択する方法、目的の D N A配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイプリダイゼーシヨン、コロニーハイブリダィゼーシヨン等や之等の組合せを例示できる。ここで用いられるプローブとしては、本発明遺伝子の D N A配列に関する情報をもとにして化学合成された D N A配列等を用いるのが一般的であり、勿論既に取得された本発明遗伝子やその断片もかかるプローブとして利用できる。

また、本発明遗伝子の取得に際しては、 P C R法

[Science, 2 , 1350- 1354(1985)] による D N A / R Ν Α増幅法が好適に利用できる。殊にライブラリーから全長の c D N Aが得られ難いような場合にレース法 ( R A C E ： Rapid amplification of cDNA ends ；実験医学、 ϋ(6)， 35- 38( 1994 ))の採用が好適である。かかる P C R法の採用に際して使用されるプライマーは、既に本発明によって明らかにされた本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定するこでき、これは常法に従い合成することができる。

尚、増幅させた D N Aノ R N A断片の単雜精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法等によればよい。

上記で得られる本発明遺伝子或は各種 D N A断片等の塩基配列の決定も、常法に従うことができ、例えばジデォキシ法 [Pro Natl. Acad. Sci. USA. , 74, 5463-5467 ( 1977)] やマキサム -ギルバート法 [Method in

Enzymology, ， 499 ( 1980 等により行なうことができる。かかる塩基配列の決定は、市販のシークェンスキット等を用いても容易に行ない得る。

本発明遣伝子の利用によれば、通常の遺伝子組換え技術 [例えば、 Science, 224. pl431(1984) ； Biochem. Biophys. Res. Comm. , 纖， p692( 1985) ； Proc. Natl.

Acad. Sci. USA.. 80. p5990(1983)及び前記引用文献等参照 ] に従うことにより、組換え体アポトーシス関与蛋白を得ることができる。該アポトーシス関与蛋白の製造は、より詳細には、本発明遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換え D N Aを作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養することにより行なわれる。

ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいずれも用いることができる。該真核生物の細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサルの細胞である C 0 S細胞 [Cell, 23. 175- 182(1981)] やチャイニーズ · ハムスター卵巣細胞及びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株 [Pro Natl. Acad. Sci. USA. , 77. 4216-4220( 1980)] 等がよく用いられているが、之等に限定される訳ではない。

脊椎動物の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遣伝子の上流に位置するプロモーター、 R N Aのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用でき、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現べクタ一の例としては、例えば、 S V 4 0の初期プ" ¾ 'モーターを保有する p S V

2 dhfr [ Mol. Cell. Biol. , 1, 854-764] 等を例示できる。また、真核微生物としては、酵母が一般によく用いられ、中でもサッカロミセス厲酵母を有利に利用できる。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例えば酸性ホスフターゼ遺伝子に対するプロモータ一を有する

p A 8 2 [ Proc. Natl. Aca¾. Sci. USA. , 80, 1-5(1983)] 等を利用できる。

原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく用いられる。之等を宿主とする場合、本発明では例えば該宿主菌中で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及び S D (シャイン ' アンド • ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えば A T G ) を付与した発現プラスミドを利用するのが好ましい。上 '宿主大腸菌としては、ェシエリヒア · コリ（ Escherichia coli) K 1 2株等がよく用いられ、ベクターとしては一般に p B R 3 2 2及びその改良ベクターがよく用いられる力之等に限定されず公知の各種の菌株及びベクターをも利用できる。プロモ一ターとしては、例えばトリブトファン（trp) プロモーター、 lpp プロモーター、 lac プロモーター、 PL/PR プ口モーター等を使用できる。

かくして得られる所望の組換え D N Aの宿主細胞への導入方法及びこれによる形転換方法としては、一般的な各種方法を採用できる。また得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により本発明遗伝子によりコードされる目的のアポトーシス関与 _ 白が生産、発現される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、その培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施で

- 、

さる。

上記により、形質転換体の細胞内、細胞外乃至は細胞膜上に目的とする組換えアポトーシス関与蛋白が発現、生産、蓄積乃至分泌される。

組換えアポトーシス関与蛋白は、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作

[ 「生化学データーブック I I 」、 1175 - 1259 頁、第 1 版第 1 刷、 1980年 6月 23日株式会社東京化学同人発行； Biochemistry, 25(25), 8274-8277(1986) ； Eur. J.

Biochem. , 163. 313-321 ( ί¾'7) 等参照] により分雔、精製できる。該方法としては、具体的には例えば通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分雔、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外滤過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル逋過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二テイク口マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ H P L C ) 等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、之等の組合せ等を例示できる。本発明は、アポトーシスの過程において、その発現によって関与する特定遺伝子を明らかにするものであり、かかる新規な機能の解明にその貢献の基礎をおくものである。

しかして、本発明遣伝子は、殊に診断及び医薬分野において有用である。

例えば、本発明によつてかにされた本発明遺伝子の配列情報を基にすれば、該遺伝子の一部又は全部の塩基配列を利用することにより、各種のヒト組織におけるアポトーシス関与遺伝子の発現の検出を行なうことができる。これは常法に従い行なうことができ、例えば

R T - P C R [ Kawasaki, E. S. , Amplification of RNA.

In PCR Protocol, A Guide to methods and

applications, Academic Press, Inc. , SanDiego, 21- 27( 1991 )] による R N A増幅により、またノーザンプロッティン 7解析 [ Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)] 等 {こより tヽずれも良好（こ実施し得る。

ここで各種細胞に生じたアポトーシスの細胞の形態的変化は、例えば細胞表面上の突起物や、細胞の萎縮、屈折等の細胞の変化により確認することができる。一方、アポトーシスにおける細胞内変化は、例えばトリパンブル一染色等の各種の細胞染色やサイトスピン法等によつて得られる塗抹標本の顕微鏡検査にて観察される核膜周囲のクロマチン凝縮や、核の断片化等によって確認することができる。

更に、エンドヌクレアーゼ活性による D N Aフラグメンテーシヨン分析により、アポトーシスの誘導及び抑制を確認することもできる。該分析方法は、例えば組織をトリスー塩酸、 E D T A、 S D S等を含む適当な緩衝液でホモジナイズした後、プロティネース Kの存在下にィンキュペートし、得られる D N Aを適当な溶媒にて抽出後、ァガロースゲルで電気泳動を行なって、 D N Aフラグメンテーシヨンの存在を確認する方法等に従って、実施することができる。更に、上記 D N Aフラグメンテ一シヨンの量は、適当な定量機器にてこれを定量化することもできる。

尚、 P C R法を採用する場合において、プライマーは, 本発明遣伝子のみを特異的に增幅できる本発明遺伝子に特有のものである限りにおいて何等制限はなく、本発明情報に基づき適宜設定することができる。これは常法に従い、通常、 2 0〜 3 0 ヌクレオチド程度の部分配列を有するものであることができる。

しかして、本発明はかかるアポトーシス関与遣伝子の検出に有用なプライマー及び Z又はプローブをも提供するものである。

また、本発明遺伝子の発魂制御或は遺伝子産物の活性の制御によれば、アポトーシスを制御することができ、アポトーシスが関与する各種の疾患の処置に利用できる _c 各種の病態 · 病因に関する組織，細胞において、本発明遣伝子（産物）の発現が高い場合には、これを阻害することによりアポトーシスを誘導することができる。例えば、本発明遺伝子の発現が高い腫瘍に対しては、この発現を抑制することにより、或はこの遣伝子産物の活性を阻害することにより、腫瘍に対して所望のアポトーシスを誘導することができる —方、アポトーシスが病態 • 病因であり、該アポトーシスの抑制が治療に結びつく場合は、本発明遣伝子（産物）の減少を抑制することにより、従って、本発明遗伝子の発現を誘導或は促進することにより、或はこの遺伝子産物の活性を保持することにより、アポトーシスを抑制することができる。

上記アポトーシス誘導のより具体的な一実施態様としては、例えば各種細胞乃至組織（標的細胞）における本発明のアポトーシス関与 ¾伝子の発現レベルをある閾値以上に上昇させた後、或いは本発明アポトーシス関与遣伝子の発現が最高量となるターニングポィントまで上昇させた後、該遺伝子の発現レベルを閾値以下に抑制する態様を例示することができ、これによつて、強力にアポトーシスを誘導することができる。

ここで標的細胞におけるアポトーシス関与遺伝子の発現を刺激するものとしては、目的とするアポトーシス関与遺伝子の発現ができるものであれば、いずれでもよく、その例としては例えばステロイド剤等を例示することができる。

また、高発現レベルにあるアポトーシス関与遺伝子の発現を抑制できるものとしては、アポトーシス関与遣伝子に対するアンチセンスヌクレオチドを使用することができる。その具体例としては、例えば n b 1 遣伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを例示することができる。

上記目的とするアポト一"^ 'ス関与遗伝子の発現閩値とは、標的細胞の種類に応じて適宜決定されるが、例えば後述する実施例を参考にすれば、正常組織中の m R N A の発現の約 5倍以上であるのがよい。また、目的とするアポトーシス誘導のためのアポトーシス関与遺伝子の発現の抑制は、アポトーシス関与遗伝子の発現閾値以下、より好ましくは正常組織中の m R N Aの発現レベル以下であるのかよい。上記アポ卜一シス関与遺伝子の発現を抑制するためには、アポトーシス関与遣伝子の発現蛋白に対する抗体や抗体断片を使用することもできる。

これら本発明遺伝子の発現の抑制及び誘導乃至促進は、常法に従うことができ、対象とする遺伝子が明らかにされている以上、当業者が適宜選択採用し得るであろう。例えば、遣伝子抑制には、アンチセンスヌクレオチドによる方法、例えば m R N A 、,らの翻訳を阻害する方法

[Science, 261. 1004- 1012( 1993)] や D N Aから R N A への転写を阻害するトリプルへリックス法 [Trend Biot ech.， 10, 132- 136( 1992)] 等による手段が、また、誘導乃至促進には、ウィルスベクター等による遣伝子導入

[ Science, 260, 926-932( 1993)] 等により本発明遺伝子を発現させる手段等が採用し得る。遣伝子産物の活性阻害には、前記した特異抗体の使用も有利であろう。

しかして、本発明は、本発明遣伝子を人工的に制御することを特徴とするアポトーシスの制御方法をも提供するものである。

更に、本発明はアポトーシス関与遺伝子アンチセンスヌクレオチド或いはアポトーシス関与遗伝子の発現蛋白に対する抗体乃至該抗体断片を用いたアポトーシス関連疾患の治療剤並びに治療方法をも提供するものである。本発明によれば、アポトーシス関与遺伝子が提供され、該遺伝子を用いれば、アポトーシス関与遣伝子の各組織での発現の検出やアポトーシス関与蛋白の遺伝子工学的製造ができ、之等により各種アポトーシス関与疾患の診断及びアポトーシス誘導剤或は抑制剤のスクリーニング並びに評価を良好に行ない得る。

更に、本発明遣伝子の発現を制御することにより、ァポトーシスの誘導又は抑制ができ、これによりアポトーシスが関与する各種疾患の予防及び治療に有用である。

図面の簡単な説明

第 1 図は、本発明実施例の（ 5 ) の①に従うデキサメサゾン誘導アポトーシスを D N Aフラグメンテーション、 n b 1 m R Nの発現レベル及び m y c m R N Aの発現レベルにて調べた結果を示すグラフである。

第 2 図は、本発明実施例 1 の（ 6 ) の④に従う A c t D処理による H L — 6 0細胞におけるアポトーシス誘導と細胞の生存能力の時間的推移との関係を示すグラフでの。

第 3 図は、本発明実施例 1 の（ 6 ) の⑤に従う種々のヒト細胞株における A c t^)処理 6時間及び 2 4 時間後の細胞の生存能力に対する影響を調べた結果を示すグラフである。第 4 図は、本発明実施例 1 の（ 6 ) の⑥に従う各種ヒト細胞株における恒常的 n b ] m R N Aの発現レベルと D N A断片化の関係を調べた結果を示すグラフである。

第 5図は、本発明実施例の（ 6 ) の⑦に従う各種ヒト細胞株における A c t D添加 6時間後の残存 n b 1 m R N Aの発現レベルと D N Aの断片化の関係を調べた結果を示すグラフである。

第 6図は、本発明実施例 1 の（ 6 ) の⑦に従う各種ヒト細胞株における n b 1 と m y c m R N Aの半減期を比較した結果を示すグラフである。

第 7図は、本発明実施例 1 の（ 6 ) の⑧に従う H L - 6 0細胞のアポトーシスと生存能力に関する n b 1 アンチセンス · オリゴマーの影饗を調べた結果を示すグラフである。

第 8図は、本発明実施例 1 の（ 6 ) の⑧に従う H L — 6 0細胞のアポトーシスと生存能力に関する n b 1 アンチセンス · オリゴマーの時間と濃度依存性の影響を調べた結果を示すグラフである。

第 9図は、本発明実施例 1 の（ 6 ) の⑧に従う H L - 6 0細胞に対して n b 1 アンチセンス ' オリゴマーにより誘導されたアポトーシス形態と D N A断片化への結果を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げる。

実施例 1

( 1 ) n b I c D N Aのクローニング：

① ナマノレノ、 ' · ノーキッ卜 · リンノヽ⁰腫 ( Namalwa Burkitt Lymphoma) 細胞より、グァニジゥム ' セシウムクロライド法により全 R N Aを抽出後、オリゴ（ d T ) -セル口ースのカラムクロマトグラフィーにより、ポリ（ A ) + R N Aを調整した（Molecular Cloning, p.196 - 198, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 ) a

上記ポリ（ A ) + R N Aからオリゴ（ d T ) をプライマーにして、逆転写酵素及び D N Aポリメラーゼ I を用いて 2本鎖 c D N Aを調整し、 d C . d Gティル法に従い c D N Aのクローニングを行なった（ Molecular Cloning, p.239-242. Cold^Spring Harbor Laboratory, 1982 ) 。

即ち、 2本鎖 c D N Aの 3 ' 末端にターミナル ' デォキシヌクレオチジノレ · トランスフェラーゼを用いて d Cティリングを行ない、一方、プラスミドベクター

8 3 2 2 を制限酵素 3 1 1 で切断後 3 ' 末端に夕一ミナル · デォキシヌクレオチジル · トランスフェラーゼを用いて d Gティリングを行なった。かくして得た d Cティリング c D N A と d Gティリング p B R 3 2 2 を了ニー、) ングさせた後、大腸菌 H B 1 0 1 のコンビテント · セルに形質転換し、テトラサイクリン耐性クローンを 1 7 0 0個得た。

この中から c D N Aの長さ力、' 0. 3 k b以上のクローンをランダムに 1 4 9個選択し、それらについて制限酵素 H i n f I で切断し、その切断断片のパターンより最も多い c D N Aクローン（、1 4 9 クローン当り 8 クローン）を選択しこれを「 n b 1 」と命名した。また、該 n b 1 の内で c D N Aの長さが約 8 8 0 b pのクローンを「 N a 8 8 0」と命名した。

該 N a 8 8 0 は、配列番号： 3 の塩基配列において、 6 5番目の塩基から 3 ' 末端までの配列を有することが確認された。

② 前記ポリ（ A ) + R N Aのよりオリゴ（ d T ) をプライマーにして 4 6 4 n gの c D N Aを合成した

( c D N A合成システム · プラス： Amersham社製）。

この c D N Aの 3 7 n gより、市販キット（ c D N A クローニングシステム ^ g t 1 0 · アダプタ一法：

Amersham社製及び Gigapack 11 Gold： Stratagene 社製）により、 2 0 5 0 0 0 p f uのえ g t l O c D N Aライブラリーを作成した。

このライブラリーの 1 1 0 0 0 0 クローンで、大腸菌 N M 5 1 4 を宿主としてプ^ークを作り、ハイボンド N + フィルター ( Amersham社製）に固定した。これを 5 X S S C ( S S C ： 150m NaCl-15mM クェン酸ナトリウム (pH7.0) ) 、 1 0 X デン /ヽノレ卜（ Denhardt' s) 溶液 (デンハルト溶液： 0.02% 牛血清アルブミン - 0.02% フイコーノレ一 0.02% ポリビニルピロリドン）、 0. 1 % S D S及び 1 O O g Z m l サケ精子 D N Aの溶液中で 6 5 °C下に約 2 0 時間のプレハイブリダィゼーションを行なつた

更に、 5 x S S C、 1 O-^ 'デンハルト溶液、 0. 1 % S D S、 1 0 0 〃 g Z m 】サケ精子 D N A及びプローブの溶液中で、 6 5て下に約 2 0時間のハイブリダィゼ一シヨンを行なつた。

尚、プローブとしては、 4 0 n gの N a 8 8 0 D N A フラグメントをマルチ · プライマーラベルキット

( Amershara社製）で標識したものを用いた。

ノヽイブリダィゼーシヨン後、フイノレターを 2 X S S C 及び 0. 1 96 S D Sの溶液中、室温下に 1 5分間（ 2回） 0. l x S S C及び 0. 1^%,S D Sの溶液中で 6 5 。C下に 3 0分間（ 2 回）、それぞれ洗浄した。風乾後、 X線フィルム（XAR-5 ： Kodak社製）に露光した。フィルム上のポジティブシグナルの位置に相当するプラーク領域をかき取り、 S M溶液に懸濁し、ファージ溶液とした。このファージ溶液を用いて、再度上記の条件によりプラークハイブリダィゼーションを行ない、

3 8個のポジティブクローンを単雜した。

この 3 8個のファージ溶液の一部を煮沸水浴中で 2分間インキュベートし、ス 8 1 1 0 プラィマー及び乙八ー P C Rキット（宝酒造社製）により P C Rを行なった。

尚、 P C Rは、 9 4 °C— 3 0秒、 5 5 °C— 3 0秒、

7 2 °C— 3 0秒（ extension timeは各サイクルにつき 4 秒）の条件で 3 0サイクル行なった。

P C R產物を、クロ口ホルム抽出後、 1 %ァガロースゲル電気泳動にかけ、 c D N Aが最も長いクローンを選び、その挿入 c D N Aを p U C 1 1 8 の E c o R I 部位にサブクローニングし、挿入 c D N Aについてシークェナーゼ D N Aシークェンスキット（ Sequenase DNA sequence Kit ： USB社製）を用いて塩基配列の一部を決定した。

かくして得られた N a 8 8 0 に相当する全長クローン「 n b 1 — 8」の 5 ' 側と 3 ' 側の配列の確認により、配列番号： 3 に示す推定塩基配列が决定された。 ( 2 ) D N Aフラグメンテーション（断片化）の分析組織を溶解緩衝液（50mM Tris-HCl(pH8.0), 10mM EDTA, 0.5¾ SDS)中でホモジナイズ後、 2 0 0 / £ノ 111 1 のプロティネース K (Proteinase K) 存在下に 5 0。Cでー晚インキュベートした。 D N Aは、フエノーノレ ' クロロホノレムにより抽出し、エタノール沈殿後、 R N a s e Aにより R N Aを分解し、 D N Aフラグメンテーションの解析に用いた。

D N A l O /z gを 4 0 m M トリスアセテート（ Tris- acetate) (pH7.8) 及び I m M E D T Aからなる 1 % ァガロース · ゲルで電気泳動を行ない、泳動終了後のゲルの写真のネガをデンシトメ一ターで測定することにより、 D N Aフラグメンテーションの定量化を行なった。

( 3 ) ノーザンプロット分析

全 R N Aは、酸性グァニジゥム ' チオシァネート ' フェノール ' クロ口ホルム抽出による 1段階抽出法（Anal. Biochem. , 162. 156- 159(1 87)) に従って調整した。

即ち、組織を 4 Μグァニジゥム ' イソチオシァネート一 2 5 mMクェン酸ナトリウム一 0. 2 M酢酸ナトリウム（pH4.0) でホモジナイズ後、 1容量のフエノール及び 1/5容量のクロ口ホルム一イソアミノレァノレコーノレ（ 4 9 ： 1 ) を加え振 ¾6し、遠心して得られた水層にイソプロパノール（ 1 容量）を加え、遠心により R N Aペレツトを得た。

これを再度、 4 Μグァニジゥ厶 ' イソチオシァネート — 2 5 m Mクェン酸ナトリウム一 0. 2 M酢酸ナトリウム（ρΗ4· 0) に溶解し、 1 容量のイソプロパノールを加え、遠心により R N Aペレツ卜を得、 8 0 %エタノールで洗浄後、乾燥し、水に溶解した。

全 R N Aのァガロース電気泳動は、 2 0 m M 3 — ( N 一モルフォリノ）プロパンスルホン酸（3- (N-Morpholino) -propane sulfonic acid) ( pH7.0 ) ― 5 m M 酸ナ卜 U ゥムー I m M E D T A - . 2 Mホルムアルデヒドを含む 1. 2 %ァガロース ' ゲルで 2 0 g の R N Aを用いて行なった。電気泳動終了後、ニトロセルロース ' フィルターへ R N Aを移した。

ノヽイブリダィゼーシヨンは、 5 0 %ホノレムアミドー

2 5 m M K H 2 P 0 4 (pH7.4) 一 5 x S S C — 5 x デンハルト溶液及び 2 0 0 g / m 1 サケ精子 D N Aの溶液中で、 ³² P —標識 D N Aプローブ（約 2 x l 0 ⁶ cpm/ml) を用いて 4 2 °Cでー晚行なった。

尚、 ³² P —標識 D N Aプ^ 3'—ブは、ランダム ' プライマー法にて [ α — ³² P ] デォキシアデノシン三リン酸を用いて調製した。用いた D N Aプローブは、次の通りである。

n b 1 プロ一： N a 8 8 0の 0. 9 k bの P s I 断片

m y c プロ一： 9 k bの十 m y c染色体 D N Aクローン ( Oncor Inc.社）由来の 1. 3 k bの C 1 a I — E c o R I 断片ハイブリダィゼーシヨン後、フイノレターを 1 X S S C 一 0. 1 % S D S、続いて 0. l x S S C - 0. 1 % S D S溶液中で 6 5て下に 3 0分間それぞれ洗浄した。洗浄後、増感スクリーンを用いて一 7 0 °Cでオートラジォグラフィーを行なった。ハイブリダィゼーシヨンのシグナルの相対的強度は、レーザー · デンシトメ一夕一により定量化し、またホスホ、イメージヤー分析機も使用した

( 4 ) マウス組織におけるアポトーシスと n b 1 遣伝子の発現

マウスの種々の正常組織と腫瘍組織について、アポト一シスの程度を前記 D N Aフラグメンテーションの分析に従い調べた。

正常組織として、 4週令のマウス（Balb/c、ォス）より摘出した小脳、胸腺、肺及び肝臓組織を採用した。腫瘍組織としては、変異を有するヒト c 一 H— r a s CT/ P95/02090

28 遺伝子でトランスフォームしたマウス N I H 3 T 3細胞由来のフイブロザルコーマ（ Fibrosarcoma) 株 1 一 6並びに 1 一 5及びリンパ腫の細胞株 A K R— 2を用いた。

フイブロザルコーマ 1 一 6及び 1 一 5 は、ォスのヌ一ドマウスの皮下に植えられた。一方、 A K R— 2 は、

A K Rマウスの腹腔に植えられた。

D N Aフラグメンテーションを調べた結果、正常組織では認められず、フイブロザルコーマ 1 一 6では、腫瘍の増殖後期及び 1 一 6を複数ケ所に植えた場合に初期の増殖期に認められた。また 1 一 5では程度は弱いが、はつきりと D N Aフラグメンテーションが認められた。

A K R— 2においても D N Aフラグメンテ一ションが認めりれた。

—方、上記の各種組織における n b l 遺伝子の発現を前記（ 3 ) に従うノーザン ' ブロット法で解析した結果、正常組織（小脳、肝臓、胸 H腺'、肺）ではその発現が低いことが認められた。これに対して、アポトーシスが誘導されている、フイブロザルコ一マ 1 一 5及び A K R— 2 並びに 1 - 6の腫瘍小塊（small nodule) においては、いずれも n b 1 m R N Aの発現が高いこと力、'、また増殖の 1 一 6 においても上昇していることが認められた ₍ 以上のことから、 n b l 遺伝子の発現と D N Aフラグメンテーシヨンの関係は、必ずしも比例的ではない力、アポトーシスの過程において、この遺伝子の発現が関与していると考えられた。

( 5 ) グルココルチコイド誘導アポトーシスと n b 1 遺伝子の発現

① 2 5 0 gのデキサメサゾンを P B Sに溶解し、 4 週令のォスの B a 1 b Z c マウスの腹腔に投与した。投与前（ 0時間）、投与 3、 6、 9、 1 2、 1 8、 2 4及び 4 8時間後に胸腺を摘出 _、前記に従い D N Aフラグメンテーシヨンの解析を行なった。

また、前記に従い n b l 及び m y cの m R N A発現をノーザン · ブロット法で分析した。

その結果のまとめを第 1 図に示す。第 1 図において、黒丸は D N Aフラグメンテーションの結果（％ ) を、白丸は n b l m R N Aの発現レベルを、黒三角は m y c m R N Aのレベルをそれぞれ示す。

D N Aフラグメンテーションは、デキサメサゾン投与 9時間後にピークに達し、その後減少し、 2 4時間後にはわずかに認められる程度となった。 n b l m R N Aの発現は、デキサメサゾン投与後著しく増大し、 6時間後にピークに達し、その後の 3時間で急激に減少し、そして 2 4時間後には未処理のマウス胸腺に見られるレベルに回復した。 m y c m R N Aの発現は、デキサメサゾン投与後に減少し、その後 D N Aフラグメンテーション力く減少（ 9時間以降）するにつれて上昇した。

② ァクチノマイシン Dは、インビボ（ in vivo) では特定の臓器、例えば腎臓にすぐに取り込まれ尿として排泄される。従って、血中でのァクチノマイシン Dの効果濃度も、投与後すぐに減少する。このことは、ァクチノマイシン Dを in vivoで一過的な転写阻害剤として使用できることを示している。

n b l m R N Aの前記一過的な発現力、'、デキサメサゾン誘導胸腺アポトーシスに関係するかどうかをァクチノマイシン Dを用いて調べた '

即ち、ァクチノマイシン Dを水に溶解し、体重 l g当たり 1. 5 gを腹腔に、デキサメサゾン投与の 1 5分前、 3時間後、 5. 7 5時間後又は 8時間後に、それぞれ投与した。デキサメサゾン投与 9時間後に胸腺を摘出し、 D N Aフラグメンテーションの分析を行なった。

その結果、デキサメサゾン投与の 5. 7 5時間後にァクチノマイシン Dを投与すると、 D N Aフラグメンテ一シヨンが強く阻害された。

一方、ァクチノマイシン、、 P,をデキサメサゾン投与時及び 5. 5時間後に投与し、デキサメサゾン投与 6時間後に胸腺を摘出し、前記に従い n b 1 m R N A発現を分析しナ。

その結果、ァクチノマイシン Dをデキサメサゾン投与の 5 . 5時間後に投与すると、 n b 1 m R N Aの発現が抑制された。従って、グル^ f コルチコイド誘導胸腺の i n v i voァポトーシスには、 n b 1 遺伝子の一過的な発現が関与していると考えられた。

③ 以上の結果より以下のことが分かる。

即ち、マウスにステロイド剤であるデキサメサゾンを投与することにより生じる胸腺のアポトーシスでは、 n b 1 遣伝子の一過的な発現（一時的に急激な増大とその後の減少）後に、アポトーシスの特徴である D N Aフラグメンテーシヨンが認められる。この結果によれば、アポト一シスに至る過程において n b 1 遗伝子（遺伝子産物）の一時的な関与が必要であると考えられる。

また、正常組織では、 n b 1 ¾伝子の発現が低いのに対し、腫瘍組織 · 細胞では同遗伝子の発現が高い場合が認められる。このことは、 n b 1 ¾伝子の発現が高い腫瘍組織 · 細胞では、上記胸腺のアポトーシスに至る過程での n b 1 遺伝子の一過的な発現時のピーク時に相当し、該遣伝子の発現が維持されている為に、アポトーシスが誘導されないものと考えられる。従って、腫癢組織 · 紬胞では、この場合 n b I 遣伝子の発現を抑制すれば、胸腺の場合と同様に、腫瘍組織 · 細胞にアポトーシスを誘導できるものと考えられる。 ( 6 ) 各種細胞系におけるアポトーシスの誘導と恒常的 n b l 発現のレベルとの関係

① ヒト組織細胞培養前骨髄性白血病株 H L — 6 0 [ Collins, S. I. , et al. , Nature, 271. 347-349( 1 W) 、組織球性白血病株

U 9 3 7 [ Sundstrom, C. , et al. , Int. J. Cancer, Π, 565-577( 1976) 及び形質細胞腫 H S - S υ 1 t a n

C Harris, N. S. , Nature, 250. 507-509( 19749〕を、それぞれ 1 0 % F C S (ゥシ胎児血清、 C S L社製、メルボルン、オーストラリア）、 2 m Mグルタミン、 1 m M ピルビン酸ナトリウム、 1 0 0 Uノ m 】ペニシリン、 l O O /z g Zm l ストレプトマイシンを含む R P M I — 1 6 4 0培地（ギブコ B R L社製、ゲイザスバーグ、

M D、米国）で 3 7 °Cで培」養した。

'

また、 3 7てにて T細胞白血病株 J u r k a t

C Gillis, S. and Watson, J. , J. Exp. Med. , 152, 1709 - 1719( 1980)〕は、 0. 0 5 m M 3 — メルカプトエタノールを上記培地に含めた培地にて培養した。

膀胱癌細胞株 5 6 3 7 [ Welto, K. et al. , Proc. Natl, Acad. Sci. , USA. , 一 82, 1 1530(1985)〕と肝癌細胞株

H e p G 2 [ Aden, D. P. , et al. , ature, 282. 615- 616 ( 1979)〕は、 2 0 % C S、 2 m Mグルタミン、 l O O UZm l ペニシリン、 1 0 0 g Zm 】ストレプトマイシン、モディファイド · ァミノ · ァシッド

( modified amino acid) 、モアィフアイ · ビタミン ( modof ied v amines ： ICN社製、シドニ一、オース卜ラリア）で補われた M E M培地（ギブコ B R L社製、ゲィザスバーグ、 M D、米国）中、 3 7 °Cで培養した。

W I S H羊膜細胞 [ Hayf lick, L. , Exp. Cell Res. , 23, 14(1961)3 と C h a n g肝細胞！： Chang, R. S. Proc. So Exp. Biol. Med. , ϋ, 440( 1954)〕は、 1 0 % F C S、 2 mMグルタミン、 l O O U Zm l ペニシリン、 1 0 0 g m 1 ストレプトマイシンで補われた M E M培地中、 3 7 °Cで培養した。

実験使用に先立って、浮遊細胞は、 5 < 1 0 ⁵細胞 m 1 で新鲜培地に再浮遊させた。一方、付着細胞については、 7 0〜 8 0 %の細胞密度に対して新鲜培地を加え ο

ァクチノマイシン D J¾"^f A c t Dという、シグマ社製、セントルイス、 M O、米国）は、 2 0 0 g / m l になるように、水に溶解し、後記実施例に示す濃度で培地に添加した。 A c t D添加、非添加で培養後、浮遊細胞は遠心分雜により集め、付着細胞はトリプシン処理した付着細胞と培養培地の両者より集めた。

細胞生存能力は、トリパ^ブルー染色によって排除する能力によって評価した。細胞形態もまたトリパンブル一染色で処理した細胞培養液とギムザ染色した通常の塗抹標本或いはサイトスピンによって作成した塗抹標本の顕微鏡検査によって、それぞれ評価した。

また、ヒト胎盤組織は、ウォードン · バレー病院

( Woden Valley Hospital，キャンベラ、オース卜ラリア）より得た。

② c D N Aプローブ

実施例 1 の（ 3 ) に記載の n b 1、 m y c の各プロ一ブと共に、以下の各プローブを用いた。

1 8 S リボソーム D N Aプローブ：プラスミド p X l r

1 4 F (Maden, B. E. H. , Nature, 288, 293-296( 1980 )) 由来の 0. 9 7 k b P s t I 断片

ュビキチンプローブ：ヒト U b B遣伝子〔 Baker, R. T.

and Board, p. G.， Nuclic Acids Res. , 15, 443( 1987)] の 1. 0 4 k bの D r a l — B a m H I 断片更に、 1. 0 k bのヒト ' グリセローノレ ' ァノレデヒド ■ 3 — リン酸デヒドロゲナーゼ c D N Aは、クローンテック社（パロ · アルト、 C A、米国）より購入した。

ヒト /9ーァクチン · プローブは、プラスミド p H F 3 A - 3 ' U T - H T ( Ponte, P. , et al. , Mol. Cell.

Biol. , 3, 1783- 1791 ( 1983)) に由来する 0. 4 k の E c o R I 断片を用いた。

③ R N Aと D N Aの単離と分析

R N Aの単離とノーザン · プロット分析は、前記（ 3 ) の方法に準じて行なった CNaora.H.， et al. , J.

Immunol. , 152, 5691-5702(1994)〕。

ホスホ · イメージヤー（Phosphoimager)分析（モレキュラー . ダイナミツックス社製、サニーヴアレー、 C A、米国）は、ノーザン ' プロット上のハイブリダィゼーシヨン，シグナルの相対的な強度を定 S化するために用いた。，

更に染色体の D N Aの単雜及びァガロースゲル電気泳動ゲル上の D N A断片の定量は、前記（ 2 ) に記載の方法に準じて行なった C Naora, H. , et al. , Immunology, 85, 63-68(1995)〕。

④ A c t Dによる H L — 6 0細胞中のアポトーシスの誘導遺伝子発現を抑制することによって誘導されるアポ卜一シスを調査するためのモデル系として H L — 6 0細胞株を用いた。該モデルは、アポトーシスを転写抑制剤 A c t D ( MArtin, S. J. , et al. , J. Immunol. , Η5₍ 1859 - 1867 ( 1990 ) ： Naota, H. , B. B. R. ， 211. 491 -496( 1995)) によって強力に誘導する。予備試験によって、アポトーシス誘導の最適条件をトリパンブルー染色した培養^ a胞の顕微鏡試験により調べた。 A c t D l g Z m l 処理 6 時間後、 H L — 6 0細胞群のおよそ半分が外観上それらの細胞表面に突起物を持って縮んでいたり、光をよく屈折させていた。該細胞は、アポトーシスの過程において、比較的遅くまで細胞膜を維持するために、アポブティック細胞として知られている能力の通り、トリパンブルー染色を排除した

C Wyllie, A. H. , et al. , Int. ev. Cytol. , 68, 251 -306 (1980)〕。更に、今までに報告されているような細胞表面上に典：- ,

型的なアポプティック体であるとみられる突起物が表われた ( Tanaka, Y. , et al. , Exp. Cell Res. , 213, 242- 252(1994)) o ァポプティック形態の評価手順は上記のようにいくつかの系の証拠によって支持された。マツパ'ラらの報告

( Matsubara, K. , et al. , Exp. Cell Res.， 213. 412- 417( 1994)) にあるように核膜の周囲に対して、又は細胞内の集塊內に対してのどちらかにおいてクロマチン凝縮がギムザ染色細胞標本において観察された。ァポプティック形態の外観上の時間的推移は、ヌクレオゾーム間の D N A断片化の形成の動きと強く相関していた。ヌクレォソーム間の D N A断片化は、 3、 6、 9、 1 2、 1 8 時間インキュベートした場合、 A c t D l /z g Zm l 処理 6時間後に最大に誘導された。 6時間を越える処理時間の延長は、「 D N Aラダー」ノターンの低下と細胞の生存能力の低下を導いた。 ^. 5〜： L 0 ^ g Zm 1 の範囲の A c t D濃度の 6時間インキュベーションが 6時間後に見られるァポプティック形態を持つ細胞量と

「 D N Aラダー」形成の程度が程良く比例的に上昇した。これらのことは、第 2図に示す通りである。

該図は、上記に従い、 A c t D処理による H L - 6 0 細胞におけるアポトーシスの誘導を調べたグラフであり、図中、白丸は未処理の H L— 6 0細胞を、黒丸は A c t D ( l / g Z m l ) 存在下にインキュベートした同 H L 一 6 0細胞を、また黒三は , A c t D ( δ g / m 1 ) 存在下にインキュベートした同細胞をそれぞれ示し、グラフは 2 4時間までの時間推移（横軸）におけるァポプティック細胞量及び生存率（％ ) (縱軸）を示している ₍ また、細胞の生存能力（生存率）は、トリパンブル一染料の排除能力によって評価したものであり、ァポプティック細胞の比率は、アポプイツク細胞の形態的特徴である細胞表面上の突起物、細胞の萎縮及び光をよく屈折させる細胞とそれらの形態を示さない細胞の比率によつて評価した。

また、同第 2図より明らかな通り、 l 〜 5 g Z m l の A c t D濃度の上昇は、アポブティック形態の誘導の動きに大きな変化は与えなかった。そして、「 D N Aラダー」形成についても変化がなかった。

従って、測定条件としては、 1 g Z m l の A c t D 濃度で 6時間処理する方法が用いられた。特に特定しない限り、上記手順に沿って続く実験を行なった。

⑤ 他の細胞系における A c t Dによるアポトーシスの誘導

銃いて、他のヒト細胞株においてアポトーシスを誘導する A c t Dの能力を調べた。即ち、 A c t D ( I μ g / m 1 ) 存在下（ + ) 及び非存在下（一）での 6時間培養と 2 4時間ィンキュベーションの間の培養液中の細胞の生存能力（結果を第 3 図に示す）並びに A c t D O l 又は 1 0 z gノ m l 存在及び非存在下での 0、 6、 2 4 時間ィンキュベートした細胞株から単離した D N Aと

R N Aのそれぞれを分析した。

ヒト細胞株として H L — 6 0、 H S — S u l t a n、 J u r k a " U 9 3 7、 5 6 3 7、 C h a n g、

W I S H及び H e p G 2を用いた細胞の存在能力の結果を第 3図に示す。図中、左欄は 6時間インキュベーションによる培養液中の細胞の ¾存能力を示し、右欄は 2 4 時間インキュベ - ションによる同生存能力を示す。また. 黒棒は、 A c t D存在下を、ドット棒は A c t D非存在下をそれぞれ示す。

T細胞白血病株 J u r k a t及び組織球性白血病株

U 9 3 7に対して、 A c t Dでの 6時間処理によってこれらの細胞内において、かなりのヌクレオソーム間の D N A断片化が誘導された。しかしながら、それらは

H L - 6 0細胞におけるそれよりも少ないものであった , 更に、細胞の生存能力に有"^な影響を与えることもなか

1乙

同一条件で、 H S - s u 】 t a nにおいても僮かの「D N Aラダー」形成が誘導された。これらの細胞株における「D N Aラダー」形成は、細胞の萎縮や光の屈折. トリパンブルー排除の表現と相関していた。 2 4時間延長処理は、これらの細胞の存能力を低下させた。

A c t Dによるアポトーシス誘導に対する細胞の影響は、造血系起源の細胞や浮遊細胞に限定されなかった。ヒト付着細胞株を使用する実験において、トリプシン処理された単層細胞と培養液の両者からプールした細胞からの D N Aが分析された。

アポトーシスの形態は、浮遊細胞のそれとは異なる基準によって、調べられた。

他の研究によると細胞の型が緩やかな丸みをおびてくると同時に、互いの細胞が離れる現象が見られるが、フ

'

ラスコの表面からは離れないアポトーシスの初期相と、 2 3 一 5 0 k bの大きな D N A切断の出現を報告している [ es j ardins, L. M. and Mac anus, J. P. , Exp. Cell Res.， 216, 380-387(1984)〕。

アポトーシスが進展するにつれて、細胞は縮んできて. フラスコから雜れ、「 D N Aラダー」を含んでいる

[ es jardins, L. M. and MacManus, J. P. , Exp. Cell Res. 216, 380 - 387( 1984) ： Kanter, P. , et al. , B. B. R. C. , 118, 392-399(1984)〕。

膀胱癌細胞株 5 6 3 7 は ^ 'A c t D処理 6時間のインキュベート後にかなりのヌクレオソーム間の D N A断片化を呈した。これは縮んだ、浮遊している細胞の出現と相関している。フラスコ表面上に付着して残っている 5 6 3 7細胞は、「丸くなつた」形態を呈し、互いに離れている。

C h a n g肝細胞はよりさな程度の「 D N Aラダー形成を含んでいる。

これに反して、たとえ 1 0倍の高澳度の A c t Dで 6 時間処理しても、 W I S H羊膜細胞と肝癌 H e p G 2紬胞では、両者ともヌクレオソーム間 D N A断片化が観察されなかった。両細胞株とも未処理コントロールとは、形態において殆ど変化は観察されなかつた。

2 4時間 A c t D処理の後、 W I S H細胞の生存能力は実質的に低下し（第 3図参照）、 5 6 3 7細胞と

C h a n g細胞培養に見らると同様に殆ど全ての細胞が浮遊していた。

しかしながら、 W I S H細胞は「 D N Aラダー」ではない「スメアー」 D N Aノ、。ターンを呈した。これは

W I S H細胞が 5 6 3 7細胞と C h a n g細胞及び他のいくつかの付着細胞系に見られた細胞死の過程と異なつた細胞死の過程を受けているかもしれないことを示唆している [ Des jardins, L. M. and MacManus, J. P. , Exp.

Cell Res. , 216, 380-387(1995) ： Kanter, P. , et al. , Biochem. Biophys. Res. Comm. , 118, 392-399(1984) 〕 ₀ 同様に、 H e p G 2細胞の大多数は A c t D処理 2 4 時間後、自由に浮遊していて、「 D N Aラダー」ではなく「スメアー」 D N Aパターンを呈した。しかしながら、浮遊している H e p G 2細胞の形態は、より「丸くなつて」、それらの生存能力は W I S H細胞より高かった (第 3図参照）。

⑥ 恒常的 n b l 発現レベルとアポトーシスの誘導

種々のヒト細胞株における恒常的 n b 1 発現レベルを、ホスホイメージャー分析によって測定した。

実施例 1 の（ 4 ) に示されたように、正常マウス組織、例えば小脳、肝、肺では低いレベルの n b 1 m R N Aを保有していた。

この実験においては、正常ヒ卜胎盤の n b l m R N A のレベルを、種々の細胞株における相対的な n b l m R N Aのレベルと比較するための標準物として用いた。

結果を第 4図に示す。図 ¾'D N A断片化の増加率（ 96 ) を横軸に、また恒常的 n b l m R N A発現レベルを縦軸にとり、各細胞におけるこれらの関係をプロットしたグフノあ o

尚、各細胞内の n b l m R N Aレベルは、ヒト胎盤内 n b 1 m R N Aレベルに比べて発現した量を示しており、この値は R N A積載量に関して訂正された。例えば任意の細胞株（ C とする）内の恒常的 n b l m R N A レベルは、（ N c Z N p ) X ( R p / R c ) によって計算される。 N c と Ν ρ は、供試細胞 C と胎盤中の n b l ハイブリダィゼーシヨン，シグナルの強度であり、 R c と R p は、供試細胞 C と胎盤中の 1 8 s r R N Aハイブリダィゼーション · シグナルの強度である。

D N Aの断片化の程度は、 A c t D ( l g « m l ) で 6時間処理後に誘導されたもので、方法に記載のように定量し、未処理細胞内に^出された D N A断片化の低い基礎レベル以上の増加量として表現させた。

また、恒常的 n b l m R N Aレベルは、 3〜 4回の繰り返し実験の結果の平均土 S Dとして表わし、 D N Aの断片化の増加に対してプロッ卜した。

n b 1 がドットラインによって示された閾値以上に恒常的に発現した時に、 A c t Dによってアポトーシスが誘導されるように思われる。

該図より次のことが判る。

A c t D未処理 H L — 6 0細胞と H S — S u 1 t a n 細胞の n b 1 m R N Aは、非常に高いレベルで、胎盤において検出されたレベルの 2 6倍と 5 7倍であった。

n b l m R N Aの恒常的レベルは、また C h a n g細胞、 U 9 3 7細胞、 5 6 3 7細胞、 J u r k a t 細胞において相対的に高く、胎盤のレベルのおよそ 8 ~ 1 4 倍のレべノレであった。

n b l m R N A レベルは、 W I S H細胞において極めて低く、 H e p G 2細胞におけるレベルは、胎盤のレべルより低かつた。

一般により高いレベルの恒常的 n b 1 発現を保有している細胞は、 A c t Dに対する反応においてより大きな程度の典型的なァポプティック形態とヌクレオソーム間の D N A断片化を呈する傾向が見られた。

また第 4 図より、 W I S H細胞や H e p G 2細胞のような相対的に低い n b 1 発現を有する細胞は、殆ど典型的なアポブティック形態や"^ D N Aラダー」形成は呈さず、長時間の A c t D処理後にのみ「スメアー」 D N A ノターンを呈したことが判る。

恒常的 n b 1 発現のレベルとアポトーシスの誘導との相関は、厳格に釣り合つているわけではなく、 A c t D 処理によるアポトーシスの誘導に対する細胞の感受性は. まず、ある閾値以上の高恒常的 n b l 発現が係わっている。その閾値は、例えば、ヒト胎盤における n b 1 m R N A レベルのおよそ 5 〜 6倍位の m R N A レベルであることが示唆される。 .

0) アポトーシスの誘導と n b l 発現の抑制この実験は、 A c t D ( 1 g Z m 1 ) 添加後 6時間で細胞内に存在する残存 n b l m R N A レベルを、ホスホイメージャー分析によって定量化し、その値をヒト胎盤中の n b 】 m R N A レベルに対して表わしたものであり、結果を第 5図に示す。 ,

尚、上記残存値は、図 4 と同様に R N A積載量で補正し、 A c t D添加後 6時間後に誘導された D N Aの断片化の増加に対してプロッ卜した。残存 n b l m R N Aレベルは、 3 〜 4回の繰り返し実験の結果の平均士 S Dとして表わした。図中、ドットラインは、統計的に計算された減衰曲線を示し、 △は全ての D N Aがアポトーシス細胞内で断片化された時の n b 1 m R N Aが減衰したレベルを示しており、外挿法によって得られた値

( 0. 1 2 ) を表わす。

上記第 5図より次のことが判る。即ち、 n b 1 転写物は、 A c t D処理 6時間後、 H L — 6 0細胞内では殆ど検出できなかった。 H L— 6 0細胞程ではないが、

A c t Dに対する反応において、 H S — S u i t a n細胞、 C h a n g細胞、 U 9 3 7細胞、 J u r k a t細胞のそれぞれにおいてもまた n b 1 発現の低下が観察された。また、 W I S H細胞における n b 1 m R N A レベルの変化は、非常に小さいものであった。一方、高濃度の A c t D処理によっても H e p G 2細胞においては有意な n b 】発現の低下は観察されなかつた。また、 W I S H細胞と H e p G 2細胞においては、 2 4時間の長時間 A c t D処理後のみにおいて、 n b l 発現レベルの低下を示すことが観察されたが、それはーァクチン（Naora. H. , B. B. R. ， 2Π, 491 -496( 1995)) ゃグリセローノレァノレデヒドー 3 - リン酸デヒドロゲナーゼ m R N Aのようなよく知れた安定な m R N Aのレべルの減少が観察された時間であった。

一般に、恒常的 n b 1 発現が高いレベルを有する細胞は、より程度の強い典型的なアポブティック形態と「 D N Aラダー」形成のみならず、 A c t Dに対する反応において n b 1 発現をより強く抑制する傾向があった。

しかしながら、この関係の注目すべき例外として、

H S - S u 1 t a n細胞は、非常に高いレベルの恒常的 n b 1 発現を有していた：^、 A c t Dの添加に続いて n b l m R N A レベルの相^的に大きな減少を呈していた。しかしながら、恒常的な n b 1 発現レベルを呈し、 H S - S u 1 t a n細胞において観察されたそれより低い n b l 抑制の比率を呈する J u r k a t 細胞や

U 9 3 7細胞のような細胞に観察された「 D N Aラダ一」形成の量と比較したとき、 H S — S u 1 t a n細胞内の A c t Dによって誘導されヌクレオソーム間の D N A 断片化の程度は、相対的に高くなかった。

H L - 6 0細胞、 J u r k a t 細胞や U 9 3 7細胞のようなかなりの「 D N Aラダー」形成を呈する細胞の n b l m R N A残存レベルと比較したとき、 A c t D処理 6時間後の H S — S u 1 t a n細胞中に検出された残存 n b 1 m R N Aレベルはまだ実質的に高かった（第 5 図参照）。当初の高い恒常的な n b 1 発現レベルが、 A c t D処理によって誘導されて起こる n b 1 発現レベルの減少は、ヌクレオソーム間の D N A断片化の形成に重要な因子であると考えられる。

以上の結果は、高い恒常的 n b 】発現の減少と A c t D処理によるアポトーシスの誘導との間の関係を示している。種々の細胞株における A c t Dの異なる影響は、異なる細胞型では効果的に侵入したり、転写を抑制したりする A c t Dの能力に違いがあり得るためであるとは考えられない。

第 1 に、アポトーシスと n b I 発現の変化は、浮遊細胞だけでなく、付着細胞型においても異なる程度で誘導された。

第 2に、 A c t D処理後に見られた m y c m R N Aレベルの减少は、 n b l 発現の変化と D N A断片化の程度の変化における実質的な違いを示した細胞株間では、有意な違いは示さなかった。

第 6図は、 H L - 6 0、 C h a n g及び W I S H細胞における n b 1 と m y c と各 m R N Aの半減期を 0, 1 , 2 , 3 , 4， 5及び 6時間の間、 A c t D ( 5 g /m l ) でインキュベートした細胞から単雜した R N A のノーザン · ブロット上の n b 1 と m y c m R N Aハイブリダィゼーシヨン · シグナルのホスホイメージャ分析を用いて計算した減衰曲線から見積もった結果を示すグラフである。

これらの細胞株における m y c m R N Aの測定された半減期は、他の細胞型について報告された値に一致していた ( Rabbits, P. H. , et a ， EltBO J. , 4, 3727-3733 (1985)) 。

A c t D処理によるアポトーシス誘導が最も弱い

H e p G 2細胞においては、 m y c m R N A レベルが非常に低いために、 A c t D処理による m y c m R N A レベルの低下を測定することは困難である。そのため、 m y c以外の他の ¾伝子の発現が、この細胞株において A c t Dによって抑制されるかどうかを試験した。

A c t D処理によるュビキチン転写物のレベルの低下は、 H L — 6 0細胞においてみられるものと同程度の低下が、 H e p G 2細胞において見られるので、 A c t D が H e p G 2細胞においても効果的であることを示している。

⑧ n b 1 アンチセンス · ォリゴヌクレオチドによるァポトーシス誘導に関する特異的な影響

高い n b I 発現の抑制とアポトーシスの誘導との間に特別な因果関係が存在するどう力、、或いは n b 1 抑制がアポトーシスの誘導に単に一致している力、、或いはァポトーシスの誘導の結果であるかどうかを検討するために、 n b 1 アンチセンス ' オリゴマーを、他の研究において一般に用いられる濃 i度の範囲と時間で、 H L - 6 0 細胞に加えてインキュベートした（ Shi, Y. , et al. , Science, 257, 212-214(1992) ： Kimura, S. , et al. , Cancer Res. , 55, 1379-1384(1995)) ₀

即ち、ホスホロチォエート · オリゴヌクレオチドは、 Biomolecular Resource Fa lity (オース卜ラリア国立大学、キャンベラ）にて合成され、逆相 H P L Cによつて精製した。

n b 】アンチセンス · オリゴマーの配列は、 n b l m R N Aの A T G開始コドンと次の 4つのコドンに対して相補的になっており、その配列は、配列番号： 4 に示す通りである。コント口一ノレとして、 n b l アンチセンス · オリゴマート同じ塩基組成のランダム配列から構成された、配列番号： 5 に示す配列を有するオリゴマーを使用した。

更に、 n b l m R N Aの開始コドンとそれに続く 4つのコドンの配列を含む n b 1 センス ' オリゴマーも実験に供した。

2 O Mの各オリゴマーを水に溶解させ、 9 6 ゥエル • プレート中に 1 X 1 0 ⁵細胞/ m 1 で新鲜培地中に再懸濁させた細胞に加え、 2 日^インキュベートした。

その結果を第 7 図に示す。

第 7 図は、 H L — 6 0細胞のアポトーシスと生存能力に関する n b 1 アンチセンス ' オリゴマーの影響を求めたグラフであり、白棒はオリゴマーなしの H L — 6 0細胞を、黒棒は 2 0 M n b l アンチセンス ' オリゴマ一添加の同細胞を、ドット棒は 2 0 // M ランダム * ォリゴマー添加の同細胞を、それぞれ表わす。

ァポプティック細胞の形態的特徵である細胞表面上の突起物、細胞の萎縮及び光の屈折を示す細胞をアポプテイツク細胞として、ァポプ" Vイツク形態を呈する細胞の数（ a ) と、非生存細胞（ b ) をカウントし、評価した。

2回の実験から得られた結果の平均土 S Dで表わした。上記結果より、 n b l アンチセンス ' オリゴマーでィンキュペートした H L — 6 0細胞は、前記したように多くの突起物を示すアポトーシス小体の特徴を有し、外観上、縮んで、光をよく屈折 ¾ Tいた。非生存細胞の数の上昇も相応して観察された。

また、アポブティック細胞と非生存細胞の出現は、 n b 1 アンチセンス · オリゴマーによって時間と澳度に依存して誘導された。

これは、第 8 図に示す通りである。

該図の a ) は、オリゴマーなしの H L - 6 0細胞（△) ， 2 0 μ Μ n b 1 アンチセンス · オリゴマー添加の同細胞（黒丸）及び 2 0 M ランダム ' オリゴマー添加の同細胞（白丸）を、それぞ .1 , 2及び 3 日間インキュペートした時の、第 6図で示されたと同じ条件下でのァポプティック細胞の数に相同して上昇した非生存細胞の数を示し、アポブティック細胞と非生存細胞数を合算した結果を示している。

また、該図の b ) は、図示された各濃度における

n b 1 アンチセンス ' オリゴマー（黒丸）及びランダム，オリゴマー（白丸）の存在下でそれぞれ 2 日間インキュベー卜した時の H L — 6 0細胞中の全ァポプティック細胞と非生存細胞の数を示したものである。

第 8図 a ) 及び b ) より、アポブティック細胞と非生存細胞の出現は、 n b l アンチセンス ' オリゴマーによつて濃度と時間に依存して誘導されることが判る。これに対して、 n b l アンチセンス · オリゴマーと同じ塩基組成のランダム配列からなるホスホロチォエート · オリゴマーでインキュベートされた H L — 6 0細胞は， ■

形態学と生存能力の面から見て、オリゴマー無添加でィンキュベートされた H L ― 6 0細胞と有意な違いを示さなカヽった。 n b 1 m R N Aの A T G開始コドンと次の 4 つのコドンの配列を含んでいる n b 1 センス · オリゴマーでのィンキュペートは、ランダム配列で観察されたそれと類似の結果であった。更に、 n b l アンチセンス · オリゴマーで H L — 6 0 細胞をィンキュベートした時に D N Aの断片化が誘導されるかどうかを検討した。れは、オリゴマー実験に用いられる細胞数が少ないことに鑑みて、キムラらの方法 [ Kimura, S. , et al. , Cancer Res. , 55, 1379 - 1384 ( 1995)〕と同様にして、 D Ν Αの切断を末端デォキシヌクレオチジル転移酵素で遊離の 3 ' — O Hを標識することによって検出した。即ち、標識された D N Aを有する細胞は沈殿させて、冷 1 0 % トリクロ口酢酸を用いてニトロセノレ口一スフィルター上に集めた。 D N Aの断片化の程度は、シンチレーシヨン - カウンティングにより評価した。即ち、 H L 一 6 0細胞をオリゴマーなし、 n b l アンチセンス · オリゴマー及び 2 0 Mランダム · オリゴマーで 2 日間インキュベートした。その後、細胞をゴルチッッァらの方法でホルムアルデヒド中に固定した [ Gorczyca, W. , et al. , Cancer Res.， 51, 1945-1951 (1993)〕。

また、単離した染色体 D N A上の遊離 3 ' — O Hを末端標識 D N A 3 ' -末端標識キット（ベ一リンガー ' マンハイム社製、ドイツ）を用いて標識した。標識した D N Aは 6 %ポリアクリソレアミド 8 Mゥレアゲル上に電気泳動させて、断片化の程度を乾燥ゲル上の放射線標識した D N Aパターンをホスホ · イメージヤー分析によつて評価した。その結果、オリゴマーを添加しないでインキュベートした H L — 6 0細胞内で検出された D N Aの切断の量と.

'

ランダマー配列を加えてィンキュベートした同細胞内の D N Aの切断の量は、殆ど差がなかった。対照的に、 n b l アンチセンス ' オリゴマーでのインキュベーションの場合は、 2 日間のインキュベーション後での H L — 6 0細胞内 D N Aの断片化の程度は、 4倍上昇した。 D N Aの断片化は、単離した染色体 D N A中の断片を標識することによって測定した時と固定した細胞中の in situ標識によつて測定した時では、類似の結果が得られた。それ故に、 n b 1 アンチセンス ' オリゴマーは、特異的にアポトーシス形態と D N Aの断片化の出現を誘導し、 H L — 6 0細胞の生存能力の低下を導いた。

このことは、第 9 図から明白である。

第 9 図は、 n b l アンチセンス ' オリゴマーにより誘導された D N Aの断片化を示したグラフである。即ち、第 9 図は、 H L — 6 0細胞を、オリゴマーなし（白棒）、 2 0 μ M n b l アンチセ · オリゴマー存在下（黒棒）及び 2 0 / Mランダム · オリゴマー存在下（ドット棒）で、それぞれ 2 日間インキュベートし、ァポプティック細胞と非生存細胞の全細胞数合計（第 9図の a ) 及びターミナル · デォキシヌクレオチジル · 卜ランスフエラーゼによって放射性標識される、単雜された染色体

D N A中の断片化（第 9図 b ) を、それぞれ示したグラフである。各結果は、 2 回の実験の平均土 S Dで表わされる。

産業上の用の可能性

本発明アポトーシス関与遣伝子は、その発現を適当に調節することによって、アポトーシスの誘導乃至誘導阻止を行ない得、かくして癌治療等に有効に利用できる

配列表配列番号： 1

配列の長さ： 264 配列の型：アミノ酸トポロジー：直線状

配列の種類：蛋白配列：

Met Ala Val Gly Lys Asn Lys Arg Leu Thr Lys Gly Gly Lys Lys Gly 1 5 10 15 Ala Lys Lys Lys Val Val Asp Pro Phe Ser Lys Lys Asp Trp Tyr Asp 20 25 30

Val Lys Ala Pro Ala Met Phe Asn lie Arg Asn lie Gly Lys Thr Leu

35 40 45

Val Thr Arg Thr Gin Gly Thr Lys lie Ala Ser Asp Gly Leu Lys Gly 50 55 60

Arg Val Phe Glu Val Ser Leu Ala Asp Leu Gin Asn Asp Glu Val Ala

,

65 70 75 80

Phe Arg Lys Phe Lys Leu lie Thr Glu Asp Val Gin Gly Lys Asn Cys

85 90 95

Leu Thr Asn Phe His Gly Met Asp Leu Thr Arg Asp Lys Met Cys Ser 100 105 110

Met Val Lys Lys Trp Gin Thr Met lie Glu Ala His Val Asp Val Lys 115 120 125

Thr Thr Asp Gly Tyr Leu Leu Arg Leu Phe Cys Val Gly Phe Thr Lys

130 135 140

Lys Arg Asn Asn Gin l ie Arg Lys Thr Ser Tyr Ala Gin His Gin Gin 145 150 155 160

Val Arg Gin He Arg Lys Lys Met Met Glu lie Met Thr Arg Glu Val

165 170 175

Gin Thr Asn Asp Leu Lys Glu Val Val Asn Lys Leu l ie Pro Asp Ser

180 185 190

，

lie Gly Lys Gly lie Glu Lys Ala Cys Gin Ser lie Tyr Pro Leu His 195 200 205

Asp Val Phe Val Arg Lys Val Lys Met Leu Lys Lys Pro Lys Phe Glu

210 215 220

Leu Gly Lys Leu Met Glu Leu His Gly Glu Gly Ser Ser Ser Gly Lys 225 230 235 240

Ala Thr Gly Asp Glu Thr Gly Ala Lys Val Glu Arg Ala Asp Gly Tyr

245 250 255

Glu Pro Pro Val Gin Glu Ser Val 260

配列番号： 2

配列の長さ： 792 配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直線状

配列の種類： C D S

配列：

ATGGCGGTTG GCAAGAACAA GCGCCTTACG AAAGGCGGCA AAAAGGGAGC CAAGAAGAAA

60

GTGGTTGATC CATTTTCTAA GAAAGATTGG TATGATGTGA AAGCACCTGC TATGTTCAAT

120

ATAAGAAATA TTGGAAAGAC GCTCGTCACC AGGACCCAAG GAACCAAAAT TGCATCTGAT

180

GGTCTCAAGG GTCGTGTGTT TGAAGTGAGT ^TTGCTGATT TGCAGAATGA TGAAGTTGCA 240

TTTAGAAAAT TCAAGCTGAT TACTGAAGAT GTTCAGGGTA AAAACTGCCT GACTAACTTC

300

CATGGCATGG ATCTTACCCG TGACAAAATG TGTTCCATGG TCAAAAAATG GCAGACAATG

360

ATTGAAGCTC ACGTTGATGT CAAGACTACC GATGGTTACT TGCTTCGTCT GTTCTGTGTT

420

GGTTTTACTA AAAAACGCAA CAATCAGATA CGGAAGACCT CTTATGCTCA GCACCAACAG

4B0

GTCCGCCAAA TCCGGAAGAA GATGATGGAA "¾ CATGACCC GAGAGGTGCA GACAAATGAC 540

TTGAAAGAAG TGGTCAATAA ATTGATTCCA GACAGCATTG GAAAAGGCAT AGAAAAGGCT

600

TGCCAATCTA TTTATCCTCT CCATGATGTC TTCGTTAGAA AAGTAAAAAT GCTGAAGAAG ⁶⁶⁰

CCCAAGTTTG AATTGGGAAA GCTCATGGAG CTTCATGGTG AAGGCAGTAG TTCTGGAAAA

720

GCCACTGGGG ACGAGACAGG TGCTAAAGTT GAACGAGCTG ATGGATATGA ACCACCAGTC

780

CAAGAATCTG TT

792 配列番号： 3

配列の長さ： 8 98

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー直線状

配列の種類 cD NA

直接の起源

ライブラリー：ヒト c D N A

クローン： n b

配列の特徵：名称： C D S

位置： 34 . . 8 25

配列：

TTTTTTTTTT TTTTTGGCTC TCTGACCAGC ACC ATG GCG GTT GGC AAG AAC AAG 5 4

Met Ala Val Gly Lys Asn Lys 1 5

CGC CTT ACG AAA GGC GGC AAA AAG Gi^. GCC AAG AAG AAA GTG GTT GAT 10 2

Arg Leu Thr Lys Gly Gly Lys Lys Gly Ala Lys Lys Lys Val Val Asp

10 15 20

CCA TTT TCT AAG AAA GAT TGG TAT GAT GTG AAA GCA CCT GCT ATG TTC 15 0

Pro Phe Ser Lys Lys Asp Trp Tyr Asp Val Lys Ala Pro Ala Met Phe

25 30 35

AAT ATA AGA AAT ATT GGA AAG ACG CTC GTC ACC AGG ACC CAA GGA ACC 19 8

Asn lie Arg Asn lie Gly Lys Thr L u" Val Thr Arg Thr Gin Gly Thr 40 45 50 55

AAA ATT GCA TCT GAT GGT CTC AAG GGT CGT GTG TTT GAA GTG AGT CTT 24

Lys l ie Ala Ser Asp Gly Leu Lys Gly Arg Val Phe Glu Val Ser Leu 60 65 70

GCT GAT TTG CAG AAT GAT GAA GTT GCA TTT AGA AAA TTC AAG CTG ATT 29 4

Ala Asp Leu Gin Asn Asp Glu Val Ala Phe Arg Lys Phe Lys Leu He 5 75 80 85

ACT GAA GAT GTT CAG GGT AAA AAC TGC CTG ACT AAC TTC CAT GGC ATG 34 2

Thr Glu Asp Val Gin Gly Lys Asn Cys Leu Thr Asn Phe His Gly Met 90 95 100

〗 _o GAT CTT ACC CGT GAC AAA ATG TGT TCC ATG GTC AAA AAA TGG CAG ACA 39 0

Asp Leu Thr Arg Asp Lys Met Cys Ser Met Val Lys Lys Trp Gin Thr

105 110 115

ATG ATT GAA GCT CAC GTT GAT GTC AAG ACT ACC GAT GGT TAC TTG CTT 43 8

1 5

Met l ie Glu Ala His Val Asp Val Lys Thr Thr Asp Gly Tyr Leu Leu 120 125 130 135

CGT CTG TTC TGT GTT GGT TTT ACT AAA AAA CGC AAC AAT CAG ATA CGG 48 6

Arg Leu Phe Cys Val Gly Phe Thr Lys Lys Arg Asn Asn Gin lie Arg ^{2 0} 140 145 150

AAG ACC TCT TAT GCT CAG CAC CAA CAG GTC CGC CAA ATC CGG AAG AAG 53 4

Lys Thr Ser Tyr Ala Gin His Gin Gin Val Arg Gin He Arg Lys Lys

155 160 165

ATG ATG GAA ATC ATG ACC CGA GAG GT^. CAG ACA AAT GAC TTG AAA GAA 58

5 ²

Met Met Glu l ie Met Thr Arg Glu Val Gin Thr Asn Asp Leu Lys Glu

170 175 180

GTG GTC AAT AAA TTG ATT CCA GAC AGC ATT GGA AAA GGC ATA GAA AAG 63 0 _{l Q} Val Val Asn Lys Leu l ie Pro Asp Ser He Gly Lys Gly l ie Glu Lys 185 190 195

GCT TGC CAA TCT ATT TAT CCT CTC CAT GAT GTC TTC GTT AGA AAA GTA 67 8

Ala Cys Gin Ser l ie Tyr Pro Leu H § Asp Val Phe Val Arg Lys Val 200 205 210 215

1 5

AAA ATG CTG AAG AAG CCC AAG TTT GAA TTG GGA AAG CTC ATG GAG CTT 72 6

Lys Met Leu Lys Lys Proし ys Phe Glu Leu Gly Lys Leu Met Glu Leu

220 225 230

CAT GGT GAA GGC AGT AGT TCT GGA AAA GCC ACT GGG GAC GAG ACA GGT 77 ^{2 0} 4

His Gly Glu Gly Ser Ser Ser Gly Lys Ala Thr Gly Asp Glu Thr Gly 235 240 245

GCT AAA GTT GAA CGA GCT GAT GGA TAT GAA CCA CCA GTC CAA GAA TCT 82 2

Ala Lys Val Glu Arg Ala Asp Gly Tyr Glu Pro Pro Val Gin Glu Ser

250 255 260

GTT TAAAGTTCAG ACTTCAAATA GTGGCAAATA AAAAGTGCTA TTTGTGAAAA 87 5

Val

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 89 ⁸ 配列番号： 4

配列の長さ： 15

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直線状

配列の種類： C D S

配列：

CTTGCCAACC GCCAT 15 配列番号： 5

配列の長さ： 15 配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直線状

配列の種類： C D S

配列：

TCCAAGCCTT ACGCC 15

Claims

請求の範囲

1. 配列番号： 1 で表わされるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むこと特徵とするアポトーシス関与遣伝子。

2. 細胞を刺激してアポトーシス関与遺伝子を発現する工程と該工程に続いて上記アポトーシス関与遣伝子の発現を抑制する工程とを含むことを特徵とする、上記細胞にアポトーシスを誘導させるアポトーシス誘導

3. アポトーシス関与遺伝子発現工程におけるアポト一シス関与遣伝子発現レベルを閾値以上に上昇させ、アポトーシス関与遣伝子現抑制工程における抑制を閻値以下とする、請求の範囲 2項に記載の方法。

4. 閾値が正常組織でのアポトーシス関与遺伝子

m R N A発現レベルの約 5倍である請求の範囲 3項に記載の方法。

5. アポトーシス関与遺伝子が n b 1 遗伝子、 M F T 一 1 ¾伝子、 F t e — 1 遺伝子、 R P S 3 a ¾伝子、 T U - 1 1 遺伝子、 K R P - A遺伝子及び c y c 0 7 遣伝子から選ばれることを特徴とする請求の範囲 3項又は 4項に記載の方法。

6. アポトーシス関与遺伝子組込みレトロウイルスを有効成分とするアポトーシス誘導剤。

7. アポトーシス関与遺伝子が n b l 遺伝子、 M F T 一 1 遣伝子、 F t e — 1遺伝子、 R P S 3 a遺伝子、 T U - 1 1遺伝子、 K R P - A遺伝子及び e y e 0 7 遣伝子から選ばれる請求の範囲 6項に記載のアポトーシス誘導剤。 '

8. アポトーシス関与遺伝子が n b 1 遺伝子である請求の範囲 6項に記載のアポトーシス誘導剤。

9. 有効成分がアポトーシス関与遺伝子アンチセンスである、細胞内のアポトーシス関与遣伝子高発現レべルをアポトーシス誘導レベルまで抑制してアポトーシスを誘導させるためのアポトーシス誘導用医薬組成物

1 0. 請求の範囲 6項に記載のアポトーシス誘導剤をヘルぺス · ウィルス感染症の治療に用いるヘルぺス · ウィルス感染症治療剤。

1 1. アポトーシス関与遣伝子の発現を閾値まで上昇させた後、該遗伝子の発現をアポトーシス誘導閾値以下に低下させることによりアポトーシスを誘導することを特徴とする特定遗伝子及び該遗伝子アンチセンスの利用。

1 2. アポトーシス関与 ¾伝子高発現レベルにある細胞を閩値レベル以下にならないように維持することによりアポトーシスの誘導を阻止することを特徴とするァポトーシス阻止法。

1 3. アポトーシス関与遺伝子髙発現レベルにある細胞を閾値レベル以下にならないように維持することによりアポトーシスの誘導を阻止するためのアポトーシス阻止剤。

1 4. アポトーシス関与遺伝子を組み込んだレトロウイルスを有効成分とする、請求の範囲 1 3項に記載のァポトーシス阻止剤。

1 5. アポトーシス関与遺伝子が n b 1 遺伝子、

M F T - 1遣伝子、 F t e - 1遺伝子、 R P S 3 a遺伝子、 T U - 1 1遣伝子、 K R P - A¾伝子及び c y c 0 7遣伝子から選ばれる少なくとも一つである請求の範囲 1 3項に記載の阻止剤。

1 6. 請求の範囲 1 2項に記載の方法を利用して、

H I V感染疾患（無症候期）、神経細胞死による神経疾患の治療を行なう方法。

1 7. 請求の範囲 1 3項 '記載の阻止剤を利用して、 H I V感染疾患（無症候期）、神経細胞死による神経疾患の治療を行なう方法。

1 8. n b 】関与遺伝子を組込んだレトロウイルスを有効成分とする請求の範囲 1 3項に記載のアポトーシス阻止剤。

9. アポトーシス誘導 ¾至抑制のマーカーを用いてアポトーシス関与遣伝子発現レベルを測定する方法。

0. 有効成分が、 n b l 遣伝子、 M F T - 1 遺伝子、 F t e - 1 遺伝子、 R P S 3 a遺伝子、 T U - 1 1 遺伝子、 K R P — A遺伝子及び e y e 0 7遺伝子から選ばれる少なくとも一つの遣伝子の断片、之等遣伝子の発現蛋白に対する抗体及び該抗体の断片から選ばれる少なくとも一つである、アポトーシス誘導乃至抑制マ一力一。

1. アポトーシス関与伝子の発現を阻止するためのアポトーシス関与遺伝子発現阻止剤。

2. n b l 遺伝子、 M F T - 1 遣伝子、 F t e - 1 遺伝子、 R P S 3 a遺伝子、 T U - 1 1 遺伝子、

K R P — A遺伝子及び c y c 0 7遣伝子から選ばれる少なくとも一つの遣伝子の発現を阻止する請求の範囲 1 2 に記載の阻止方法。

3. n b l ¾伝子、 M F T - 1 遺伝子、 F t e - 1 遺伝子、 R P S 3 a遺伝子、 T U — 1 1 遺伝子、

K R P — A遣伝子及び c y c 0 7遺伝子から選ばれる少なくとも一つの遺伝子の m R N Aからの翻訳を阻害する請求の範囲 1 2項に記載の阻止方法。

4. n b l 遺伝子、 M F T - 1 遺伝子、 F t e - 1 遺伝子、 R P S 3 a遣伝子、 T U - 1 1 遣伝子、

K R P — A遣伝子及び c y c 0 7遣伝子から選ばれる少なくとも一つの遺伝子の D N Aから R N Aへの転写を阻害する請求の範囲 1 2項に記載の阻止方法。

5. 細胞内のアポトーシス関与遺伝子高発現レベルをアポトーシス誘導レベルまで抑制してアポトーシスを誘導することによって癌を治療する癌治療方法。

2 6. 請求の範囲 2 5項に記載の方法に利用する制癌剤。

2 7. アポトーシス関与遗伝子アンチセンスを利用する請求の範囲 2 5項に記載の癌治療方法。

2 8. アポトーシス関与遺伝子アンチセンスからなる請求の範囲 2 6項に記載％制癌剤。

2 9. 細胞内アポトーシス関与遺伝子の発現量を閾値以上に上昇させないように抑制及び Ζ又は維持するァポトーシス誘導防止法。

3 0. 細胞内アポトーシス関与遗伝子の発現量を閾値以上に上昇させないように抑制及び/又は維持するためのアポトーシス誘導防止剤。

3 1. 細胞内アポトーシス関与遗伝子の発現盪が閾値以上に上昇している細胞及びノ又はアポトーシス関与遺伝子の発現細胞から遊離されたアポトーシス関与遣伝子産物を、それらに対する抗体を用いて検出する検出法及び之等の遺伝子の m R N Aレベルを之等の遺伝子をプローブとして用いて検出する検出法。

3 2. ヒト癌細胞及び Z又は H I V感染患者リンパ球の検出を行なう請求の範囲 3 1項に記載の検出法。