【発明の詳細な説明】
発明の名称 ヒトhRASA−I遺伝子の単離とクローニング及びその利用発明の分野
本発明は一般的には分子毒物学、生化学、及び分子生物学に関するものである
。より具体的には、本発明はヒトhRASA−I遺伝子の単離とクローニングに
関するものである。先行技術の説明
環境性重金属塩毒素に関連した哺乳動物の解毒システムに関してはまだほとん
ど知られていない。一部の化学医療薬は重金属に基づいており、そうした薬品に
対する抵抗性の形成は措置中にしばしば起こり、敏感な腫瘍の措置においても重
大な障害となる。この抵抗性は自発的な体細胞変異を通じて発生する薬品抵抗性
細胞に対する選択性とその過剰成長によるものと考えられている。生化学的研究
はこうした抵抗性の根拠を結論的に確認する上で未だ成功を収めていないが、そ
の抵抗性に関与している可能性のあるいくつかのメカニズムを明らかにしている
。白金製剤はmdrl(P−糖蛋白)又はMRP遺伝子のいずれかによって与えられ
る多重薬品抵抗性表現型には関与していないが、ATP−依存グルタチオンGS
−Zポンプはシスプラチンに対する抵抗性を調節することが知られている。
重金属塩の解毒を媒介するいくつかの輸送−蛋白質複合体がバクテリア及びイ
ースト菌で確認されており、進化の過程を通じて構造的にも機能的にも保持され
ているようである。
大腸菌やs.アウレウス菌の亜ヒ酸塩、アンチモン塩、テルル化合物、及びヒ酸
塩などに対する抵抗性はその遺伝子生成物がオキシアニオン類を成型し、これら
非金属化合物摂取の減少をもたらすATP−依存ポンプを形成するプラスミド担
持arsオペロンによって媒介される。
重金属は多くのタイプの生物に対して毒性を示し、ヒトにとっての重要な産業
毒素である。バクテリア内の重金属塩に対する抵抗性は特定のプラスミド担持多
成分ATP依存流出液系(1,2)によって媒介される。大腸菌においては、亜
ヒ酸塩、ヒ酸塩及びアンチモン酸塩に対する抵抗性は二つの調節遺伝子(arsR
及びarsD)及び三つの構造遺伝子(arsA,B及びC)を含む特徴付けが十分に
行われたarsオペロン(3)によって媒介されている。
遺伝子arsAはチャンネル形成膜透過蛋白質と推定されるarsB遺伝子の生成物
と関係するオキシアニオン依存ATPaseをコード表現する。arsA蛋白質のAT
P結合カセット(ABC)はカチオン位置転移トランスポータを含む他のATP
ase内に存在しているものとは違った修飾NTP結合モチーフを有する遺伝子の
上位系列に属している(5,6)。arsA遺伝子は二つのATP結合カッセット
領域を有する583アミノ酸(63kDa)触媒性サブユニットを表現するのに対して、
arsB遺伝子はアニオン・チャンネルとarsA蛋白質(7)に対するアンカーとし
ての両方の機能を発揮すると推定されている12の膜透過領域を有するアミノ酸(
45.5kDa)内部膜蛋
白質をコード表現する(7)。これら二つの蛋白質は亜ヒ酸塩やアンチモン酸塩
を細胞外に運び出す。arsC遺伝子はGSHをヒ酸塩(As+5)から亜ヒ酸塩(
As+3)に還元するコファクターとして用いて、それをars移送システムの基質
にすることができる141アミノ酸(16kDa)還元酵素をコード表現する(8)。
先行技術においてはヒトhARSA−i遺伝子を単離、グローニングする技術
が存在しない。本発明は先行技術における長年のニーズと要望を満たすものであ
る。
発明の要約
亜ヒ酸塩はそれに対するバグテリア内での抵抗性がarsAおよびarsA遺伝子生
成物によって構成される流出液ポンプによって媒介される産業及び環境毒素であ
る。本発明は二つの非常に関連性の高いヒト遺伝子のひとつであるバクテリア性
arsA(hARSA−I)のヒト相同物の単離とクローニングを開示するもので
ある。hARSA−I遺伝子は膜透過領域を持たないATPase上位系列の非常
に広範に表現されているメンバーである。ヒトの腎臓細胞株293内でhARSA
−I遺伝子を過剰に表現させたところオキシアニオン亜ヒ酸塩と陽イオンカドミ
ウム及びニッケルに対する抵抗性がつくりだされ、これは重金属塩のヒト毒性の
決定因子としてのhARSA−Iの役割を示唆している。
本発明のひとつの実施態様において、(a)ヒトARSA−I蛋白質をコード
表現する単離されたDNA;(b)上記
(a)の単離されたDNAにハイブリダイズしてヒトARSA−I蛋白質をコー
ド表現する単離されたDNA;及び遺伝子コードの退化によるコドン配列で上記
(a)及び(b)の単離されたDNAとは異なっており、ヒトARSA−I蛋白
質をコード表現する単離されたDNA、で構成されるグループから選択されるヒ
トARSA−I蛋白質をコード表現するDNAが提供される。
本発明の別の実施態様では、ヒトARSA−I蛋白質と薬学的に受け入れ可能
な基剤あるいはイクシピエント(excipient)で構成される医薬品組成物が提供
される。
本発明のさらに別の実施態様では、本発明によるベクターでヒトARSA−I
蛋白質を表現するベクターを形質導入された宿主細胞が提供される。
本発明のさらに別の実施態様では、(a)ヒトARSA−I蛋白質をコード表
現する単離されたDNA;(b)上記(a)の単離されたDNAにハイブリダイ
ズしてヒトARSA−I蛋白質をコード表現する単離されたDNA;及び遺伝子
コードの縮重によるコドン配列で上記(a)及び(b)の単離されたDNAとは
異なっており、ヒトARSA−I蛋白質をコード表現する単離されたDNA、で
構成されるグループから選択されるDNAによってコード表現される単離され精
製されたヒトARSA−I蛋白質が提供される。
本発明の別の実施態様では、配列ID NO.2で示されている配列を有する
ヒトARSA−I蛋白質をコード表現す
るDNA配列が提供される。
本発明の別の実施態様では、ヒトARSA−I蛋白質を表現し、SEQ ID
NO.1に示される配列を有するDNAが提供される。
本発明の別の実施態様では、ヒトARSA−I蛋白質をコード表現し、操作可
能な結合が、a)複製の発生源;b)プロモータ、及びc)前記蛋白質をコード
表現するDNA配列で構成された宿主内で複製できるベクターが提供される。
本発明の別の実施態様では、遺伝子組換えDNA分子で形質変換され、その遺
伝子組換えDNA分子がSEQ ID NO.1の配列を有するDNA配列を含
いでいる宿主が提供される。
本発明のさらに別の側面、特徴、及び利点は開示の目的で提供される本発明の
現時点での好ましい実施態様についての以下の説明から明らかになるであろう。
簡単な図面の説明
上に述べた、及びこれから明らかになるであろう本発明の特徴、利点及び目的
を達成し、詳細に理解できるように、上に要約的に述べた発明について、添付図
面に示すいくつかの実施態様を参照してより詳細に説明する。これらの図面は明
細書の一部を形成する。しかしながら、添付された図面は本発明の好ましい実施
態様を示すものであって、発明の範囲を限定するものではない。図1はhARS
A−I遺伝子の構造とそのクローニングのために用いられる戦略を示している。
図1AはArsA蛋白質のATP結合カセット領域内の高度に保存されたアミノ酸
の配列を示している。ラベルされた矢印はPCRプライマーを発生させるために
用いられるモチーフの位置を示している(20)。保存されたアミノ酸モチーフに
対応した縮重プライマーが望まれていた。SH60は縮重1024mer(5'−GGNA
ARGGNGGNGTNGG(G,C)AAAAC−3')であり、SH61は
縮重512mer(5'−GTRTGNCCNGTNGG(A,T)GTATC−3')
である。ヒト子宮癌腫2008細胞から得られたランダム・ヘグサマー・プライム化
cDNAライブラリをTaq DNAポリメラーゼ(Boehringer Mannhein)を
用い、94℃で30秒間、50℃で30秒間、そして72℃で60秒間の温度プロフィールで
全部で40サイクルを行って増幅された。ENGフラグメントのヌクレオチド配列
に対応するプライマー116と123による:116,5'−CCACCTGCAGCTG
CSGCCTGG−3';123,5'−CCACCACCGAGAAGTTCAT
GCCC−3'増幅はそのG+C含有量が高いので63℃のアリーリング温度で行
われた。ars上位系列のメンバーが共有しており、114アミノ酸(点線)で分離さ
れたボックスA及びBとしてKooninnら(5)によって識別された保存されてい
る明確なモチーフが示されている。
図1BはhARSA−I(H)のヌクレオチド及び予想される配列とC.eleg
ans仮想arsA遺伝子生成物(C)との位置的関係を示している。ポテンシャル・
ポリ(A)信号に下
線を付してある。同じアミノ酸と保存性変化はそれぞれ(:)と(.)で示して
ある。
図2はENAフラグメントを用いたノーザン及びサザン・ブロット分析を示す
。図2Aはレーン(21)上に示されたヒト組織から得られたポリ(A)+RNA
のノーザン分析を示している。ノーザン分析は市販されているブロット(Clonte
ch,Palo Alto,CA)を用いて行われた。各レーンは2mgのポリ(A)+RNAを
含んでいた。サザン・ブロット分析はヒト子宮癌腫2008細胞から得た制限酵素で
消化したヒト・ゲノム性DNA100mgを用いて実行された。
図2BはEcoRI及びHindIIIで消化されたヒト子宮癌腫から得られたヒト・ゲ
ノムDNAのサザン分析を示している。プローブとして全長cDNAを用いたノ
ーザン及びサザン分析でハイブリダイゼーションの同じパターンが得られた。
図3は293及び293/hARSA−Iヒト胎児腎臓細胞のウェスターン・ブロッ
ト分析を示している。293細胞(レーン2)及び293/hARSA−I細胞(レー
ン1)からの細胞溶解物(50mg)を10%ナトリウム・ドデシル・スルフェート−
ポリアクリルアミド・ゲル電子泳動(SDS−PAGE)を用いて単離し、PV
PD膜に移し、ウサギhARSA−Iポリクローナル抗体(14)を用いて培養し
、ペロキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギ抗体を用いて検出され、強化化学蛍光(22)
を用いて作成した(22)。
図22はスルフォルソアミンDアッセイで測定した、重金属
存在下での293・hARSA−I及び293比較対照細胞の成長抑制を示している。
白丸:293/hARSA−I細胞;黒丸:293比較対照細胞;R:特定濃度の重金
属の存在下での相対成長(C.P.Higgins,Cell82,693−696(1995))。(図
4A)砒素化ナトリウム(Na2AsO3)、(図4B)塩化カドミウム(CdC
l2)、(図4C)塩化ニッケル(NiCl2)、及び(図4D)塩化亜鉛(Zn
Cl2)。計算されたIC50値はそれぞれ三回づつ行われた6つの独立したアッ
セイの結果を示すグラフの下に示してある。P値は両側非対t−テストで判定し
た。
発明の詳細な説明
哺乳動物細胞(6,9,10)内で3つの重金属トランスポータ遺伝子を確認
し、そのうちの2つは致死的なX結合メンケス病(11)及び常染色体が退行する
ウィルソン病(9)を含む銅代謝の病気に関与していると思われるPタイプAT
Paseであり、三番目のものは亜鉛イオン・トランスポータ(10)である。新し
い薬品抵抗性遺伝子を確認し、その特徴付けを行うために、本発明はヒトarsA
相同体をクローンした。C,elegansゲノム性配列決定プロジェクト(12)はバ
クテリアのarsA遺伝子に対する相同性を有する二つの配列を確認した。これら
のもののひとつであるC.elegans arsA相同体と思われるものは単一のATP
結合カセット領域(5)を有する342アミノ酸蛋白質をコード表現し、他方は前
者と80%配列相同性を有する短い配列である。事前に大腸
菌arsAをC.elegans arsA(5)と位置的に合わせておくと、この上位系列の
他のメンバーも保有している両方の蛋白質のATP結合カセット領域内部にA,
A'、及びBボックスと命名された3つの保存されたアミノ酸モチーフの存在が
明らかにされた。
本発明は新しいヒト遺伝子(hARSA−I)、亜ヒ酸塩に対する抵抗性を媒
介する大腸菌arsA遺伝子の相同体を確認し、クローンした。さらに、本発明は
ヒト子宮癌腫のrARSA−I遺伝子の過剰表現と形質変換されたヒト胎児腎臓
細胞が亜ヒ酸塩、カドミウム、及びネッケルに対する抵抗性を媒介することを示
した。
重金属塩に対する抵抗性を媒介する新しい遺伝子の識別とクローニングは薬品
措置に対して腫瘍が反応を示さないという問題をいろいろな方法で解決するのに
役立つであろう。hARSA−I遺伝子は臨床状況での薬品抵抗性の理解と管理
において重要な役割を演じる、これまで十分な説明が行われていない遺伝子であ
る。抵抗性発現におけるhARSA−1遺伝子の生物学的な役割を理解すること
は、いくつかの方法で医療に影響を及ぼすであろう。例えば、本発明の教示は腫
瘍の感作性を増強してそれによって抵抗性の発現を抑制する複数のファクターを
同時に投与する形でのより有効な腫瘍措置法の開発を可能にしてくれるであろう
。第二に、本発明の教示は腫瘍措置の有効性に関する診断あるいは予測手段を提
供してくれ、それによって癌措置におけるヒトの負担と経済
的負担の両方を減らしてくれる。この診断ないし予測的手段は臨床例でのhAR
SA−I媒介薬品抵抗の根底にある分子メカニズムを分析した後、この分野の当
業者であれば誰でも実行可能である。
本発明は全長hARSA−I cDNAに関する配列を提供し、さらに、この
遺伝子の過剰表現は実際にこの細胞の表現型における変化を引き起こし、この場
合、亜ヒ酸塩、カドミウム及びニッケルに対する抵抗性を引き起こす。ヒトAR
SA−I遺伝子は他の種々の重金属に対する抵抗性を媒介する可能性がある。
本発明による新規遺伝子のこの配列に関する知識は癌患者の措置と重金属によ
る環境汚染の幅広い分野に関連した診断及び治療戦略の基礎として用いることが
できるであろう。重金属は産業で用いられる重要な毒素である、hARSA−I
遺伝子の蛋白質生成物これらの金属のヒト毒性において一定の役割を演じる可能
性がある。適用例には以下のようなものがある:(a)その細胞への摂取が機能
性hARSA−I蛋白質の存在によって影響を受け、効率的な細胞内伝達をもた
らすことが分かっており、その伝達がhARSA−I蛋白質の存在によって増強
されたり、あるいは逆に影響を受けなかったりする類似あるいは新規薬品の確認
において医薬業界に寄与することが分かっている重金属を含む癌治療薬(例えば
シスプラチン、カルボプラチン)の有効性についての予測;(b)細胞内のhA
RSA−Iの表現のレベルが措置に対す
る反応に相関性があることが分かった場合に、重金属を含んだ癌治療薬(シスプ
ラチン、カルボプラチンなど)に対する任意の患者の腫瘍の応答性の予測;(c
)体組織内のhARSA−Iレベルの個体間の差が分かっている場合(個体は重
金属に対する露出に対する許容性に差がある)に、重金属あるいは重金属含有毒
素に対する作業場所の露出の結果としての、医療問題発現の可能性が高い作業員
の確認;(d)細胞が重金属毒素を取り込んで、濃縮し、従って環境から取り除
いてしまうような方法でhARSA−Iを過剰生産する生物(例えばイースト菌
)のエンジニアリング。
hARSA−I遺伝子はその生成物がいくつかの環境化学毒素を含むいくつか
の重金属と、潜在的には関連治療薬に対する抵抗性を媒介する新しいヒト遺伝子
である。哺乳動物の細胞では特定の重金属のトランスポータとして3つだけが知
られており、それは1)ラットの肝臓における亜鉛トランスポータ;2)致死的
なX結合ヒト・メンケス病に関与するヒトP−タイプATPase銅トランスポー
タ;そして3)常染色体退行性ウィルソン病に関与する第二のヒト銅トランスポ
ータである。一方、mdr−1(P−糖蛋白)及びMRPなどの公知の多重薬品抵
抗性遺伝子は重金属化学治療薬に対する抵抗性には関与していない。
hARSA−I cDNAは1216塩基対の長さを有しており、332アミノ酸蛋
白質と215塩基対3'未翻訳領域をコード表現する993塩基対のコード表現配列に
よって構成されてい
る。hARSA−Iは単−ATP結合カセットを含んでいるが膜透過領域は含ん
でいない。hARSA−I遺伝子が利用できるようになると、種々の応用可能性
をもたらすことができる多数の研究への道が開かれる。例えば、hARSA−I
遺伝子が特定のヒトの遺伝性疾病の根底で作用しているのであれば、cDNAは
診断予測テストの根拠となるであろう。hARSA−I遺伝子表現が重金属によ
って規制されるのであれば、それは環境重金属汚染のインジケータ・テストのた
めの基礎として用いることが可能であろう。hARSA−I遺伝子が重金属に基
づく化学治療薬に対する腫瘍抵抗性に関与しているのであれば、それは治療に対
する応答可能性に関する予測テスト、及び薬品抵抗性腫瘍に対する診断的テスト
として役立つであろう。
本発明によって、先行技術の範囲内でのこれまでの分子生物学、微生物学、そ
して遺伝子組換えDNA技術を用いることが可能であろう。そうした技術は文献
に十分の説明されている。例えば、Maniatis、Fritsch & Sambrook,“分子クロ
ーニング:実験マニュアル(1982);“DNAクローニング:実際的方法”I巻
、II巻(D.N.Glover編.1985);“オリゴヌグレオチド合成”(M.J.Gait編
。1984);“核酸ハイブリダイゼーション”[B.D.HameS & S.J.Higgins編
,(1995)];“転写及び翻訳”[B.D.Hames & S.J.Higgins編.(1984)
];“動物細胞培養”[R.I.Freshney編.(1986)];“不動態化細胞及び酵
素”[IRLPress,
(1986)];B.Perbal,“分子クローニングに対する実際的ガイド”(1984)
参照。
従って、以下の用語が使われた場合、それらは以下のように定義されている。
ここで述べられているアミノ酸は“L”異性体であることが好ましい。しかし
ながら、ポリペプチドによって免疫グロブリン結合の望ましい機能的特性が保持
されている限り“D”異性体での残基はL−アミノ酸残基と置換することができ
る。NH2はポリペプチドのアミノ末端に存在している遊離アミノ基を示してい
る。COOHはポリペプチドのカルボキシル末端に存在している遊離カルボキシ
ル基を指している。標準的なポリペプチド命名法、J.Biol.Chem.,243:3552
−59(1969)に従って、アミノ酸残基の略語を以下の対応表に示す。 すべてのアミノ酸残基配列はここではその左右の向きがカルボキシル末端に対
するアミノ末端の通常の方向であるような式で示されている。さらに、アミノ酸
残基配列の先頭や末端に記されたダッシュはひとつ又は複数のアミノ酸残基の別
の配列に対するペプチド結合を示す。上の表はここで交互に現れる3文字及び1
文字略号の関連性を示すものである。
『レプリコン』はイン・ビボでのDNA複製の独立単位として機能する、つま
りそれ自体の制御下で複製が可能ないすべての遺伝子要素(例えば、プラスミド
、クロモゾーム、ウイルス)である。
『ベクター』は別のDNAセグメントが取り付いてその取り付いたセグメント
の複製が引き起こされるような、プラスミド、ファージ又はコスミドなどのレプ
リコンである。
『DNA分子』は一本鎖形態又は二本鎖らせん形状のデオキシリボヌクレオチ
ド類(アデニン、グアニン、チミン、あるいはシスチン)の多重体形状を意味し
ている。この用語は分子の一次及び二次構造を意味するだけで、特定の三次形状
への限定は意味しない。従って、この用語は特にDNA分子(例えば制限フラグ
メント)、ウイルス、プラスミド、及びクロモゾームで見いだされる二本鎖DN
Aを含んでいる。ここでの構造に関する検討においてはDNAの非転写鎖に添っ
た5'−3'末端方向の配列だけを示すという通常の方法に従っている(つまり、
mRNAに対する相同の配列を有する鎖)。
『複製の源』とはDNA合成に関与するDNA配列を示している。
『配列をコードする』DNAとは適切な規制配列の制御下に置かれた場合にイ
ン・ビボでポリペプチド内に転写され翻訳される二本鎖DNA配列である。コー
ドする配列間の境界は5'(アミノ)末端の開始コドンと3'(カルボキシル)末
端の停止コドンによって判定される。コードする配列は原核配列、真核mRNA
からのcDNA、真核性(例えば哺乳動物の)DNAからのゲノム性DNA配列
、そして合成DNA配列さえも含むことができる。ポリアデニル化信号及び転写
中止配列は通常そのコード表現配列に対して3'に位置付けられる。
転写及び翻訳制御配列はプロモータ、エンハンサー、ポリアデニル化信号、タ
ーミネータなど宿主細胞内のコード配列の発現をもたらすDNA規制配列である
。
『プロモータ配列』は細胞内のRNAポリメラーゼに結合して、下流(3'方
向)コード配列の転写を開始することができるDNA規制領域である。本発明を
定義する目的で、プロモータ配列は転写開始サイトによってその3'末端によっ
て結合され、上流に延び、背景レベル以上の検出可能なレベルで転写を開始する
のに必要な最低数の塩基あるいは原子を取り込む。プロモータ配列内に転写開始
サイト(ヌクレアーゼS1によるマッピングで簡単に識別することができる)、
及びRNAポリメラーゼの結合に関与する蛋白質結合領域が
見い出されるであろう。真核性プロモータは、常にではないが、しばしば、“T
ATA”ボックス及び“CAT”ボックスを含んでいる場合がある。原核性プロ
モータは−10及び−35コンセンサス配列に加えてShine−Dalgarno配列を含んで
いる。
『発現制御配列』は別のDNA配列の転写と翻訳を制御、規制するDNA配列
である。コード表現配列は、RNAポリメラーゼがコード表現配列をmRNAに
転写し、それがそのコード配列によってコード表現された蛋白質内に翻訳される
場合、細胞内の転写及び翻訳制御配列の『制御下』にある。
『信号配列』はコード表現配列の前に含まれている場合がある。この配列は宿
主細胞と反応してポリペプチドをその細胞表面に向かわせるか、そのポリペプチ
ドを培養液内に分泌するように指令する信号ぺプチド、ポリペプチドへのN−末
端をコード表現し、この信号ペプチドは蛋白質がその細胞を離れる前に宿主細胞
によってクリップ・オフされる。信号配列は原核細胞や真核細胞に本来存在する
種々の蛋白質と結びついた形態で見つかる場合もある。
『オリゴヌグレオチド』という用語は、本発明によるプローブに関連して用い
られる場合、2つ以上、好ましくは4つ以上のリボヌクレオチドで構成された分
子と定義される。その正確なサイズは、オリゴヌクレオチドの最終的な機能とそ
の使用に依存する多くのファクターに依存している。
ここで使われている『プライマー』という用語は、精製さ
れた制限消化酵素内で自然に発生したか人為的に合成されたかを問わず、核酸ス
トランドに対して相補的なプライマー延長生成物の合成が誘発される条件下に置
かれた場合、つまり、核酸とDNAポリメラーゼなどの誘発剤が存在しており、
適切な温度とpH条件が満たされれれば、合成を開始する点として機能することが
できるオリゴヌクレオチドを指している。このプライマーは一本鎖でも二本鎖で
もよいが、誘発剤の存在下で望ましい延長生成物の合成を行わせるのに十分な長
さを有していなければならない。プライマーの正確な長さは温度、プライマーの
供給源、及びその使用法に依存する。例えば、診断的な応用のためには、標的配
列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチド・プライマーは通常15−25、あるいは
それ以上のヌクレイチドを含んでいるが、それより少ない場合もある。
プライマーはここでは特定の標的DNA配列の種々のストランドに対して『ほ
ぼ』相補的であるように選択される。これはプライマーがそれぞれ対応するスト
ランドとハイブリダイズするのに十分な程度に相補的でなければならないことを
意味している。従って、プライマー配列はテンプレートの正確な配列を反映する
必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド・フラグメントをそのプライマー
の残りの部分がそのストランドに対して相補的なプライマーの5'末端に取り付
けるようにしてもよい。又、そのプライマー配列がその配列との十分な相補性を
持っているか、あるいはそれとハイブリ
ダイズして、それによって延長生成物の合成のためのテンプレートを形成するの
であれば、そのプライマー内に非相補的な塩基あるいはより長い配列が分散存在
していても良い。
ここで用いられている『制限エンドヌクレアーゼ』及び『制限酵素』という用
語は、それぞれ特定のヌクレオチド配列で、あるいはその近くで二本鎖DNAを
切断するバクテリア性酵素を意味する。
細胞はその細胞内に各DNAが導入された場合に外来性又は異種DNAによっ
て『形質変換』されたことになる。形質変換するDNAはその細胞のゲノム内に
統合される(共有結合される)場合と、そうでない場合とがある。原核生物、例
えばイースト菌と哺乳動物細胞において、形質変換するDNAはプラスミドなど
のようなエピゾーム性要素上に維持される場合がある。真核細胞に関しては、安
定的に形質変換された細胞は、その内部で形質変換するDNAがクロモソーム内
に一体化されて、クロモソーム複製を通じて娘細胞によって遺伝されるようにな
るものである。この安定性はその真核細胞がその形質変換DNAを含む娘細胞の
群で構成された細胞系あるいはクローンを確立する能力によって示される。『ク
ローン』は単一の細胞あるいはその祖先によって有糸分裂によって導かれた細胞
の群である。『細胞系』とは多くの世代にわたってイン・ビトロで安定した成長
を行うことができる一次細胞クローンである。
2つのDNA配列は、ヌクレオチドの少なくとも約75パー
セント(好ましくは少なくとも80%程度、最も好ましくは少なくとも約90又は95
%)がDNA配列の定義された長さ以上で対応している場合、『基本的に相同』
である。基本的に相同な配列は配列データ・バンクで利用できる標準的なソフト
ウエアを用いて、あるいはその特定のシステムのために定義されている厳格な条
件の下でのササン・ハイブリダイゼーション実験でそれらの配列を比較すること
で確認できる。適切なハイブリダイゼーション条件の決定は先行技術の範囲内で
ある。例えば、Maniatisら、;DNAクローニング、巻I及びII、;核酸ハイブ
リダイゼーションなどを参照。
DNA構成の『異種』領域とはより大型のDNA分子内にあって、自然にあっ
てはその大型の分子との組み合わせでは見られないDNAの未確認セグメントを
意味している。従って、その異種領域が哺乳動物の細胞をコード表現する場合、
その遺伝子は通常その供給源のゲノムの哺乳動物ゲノム性DNAの側鎖とはなら
ないDNAによって側鎖される。別の例では、コード配列がそのコード配列が自
然に見られないような構成物となっている(例えば、そのゲノム性コード表現配
列がイントロン、あるいは自然の遺伝子とは違ったコドンを有する合成配列)。
対立遺伝子の違いや自然発生的変移性イベントはここで定義されているような異
種領域は発生させない。
これらの研究に最も一般的に用いられるラベルは放射性元素、酵素、それに紫
外線などに露出された場合に蛍光を発す
る化学物質である。多数の蛍光物質が知られており、ラベルとして使用できる。
これらには、例えば、フルオレスセイン、ローダミン、オーラミン、テキサス・
レッド、AMCAブルー及びルシフェール・イェロウなどである。特定の検出用
物質はヤギ内でつくられイソチオシアネートを介してフルオレスセインと接合さ
れた抗ウサギ抗体である。
蛋白質も放射性元素や酵素でラベルすることができる。放射性ラベルは現在利
用できるいずれのカウント手順ででも検出することができる。好ましいアイソト
ープは3H,14C,32P,35S,36Cl,51Cr,57Co,58Co,59Fe,90
Y,125I,131I及び186Reである。
酵素ラベルも同様に有効で、現在利用できる比色、分光、蛍光分光、電流測定
、又は気体測定技術のいずれかによって検出することができる。酵素はカルボジ
イミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどの架橋分子との反応によっ
て選択された分子に接合される。こうした手順で用いることができる酵素の多く
が知られており、利用することができる。好ましいものはペロキシダーゼ、β−
グルクロニダーゼ、β−D−グルコシダーゼ、β−D−ガラクトシダーゼ、ウレ
アーゼ、グルコース・オキシダーゼ+ペロキシダーゼ及びアルカリ性ホスホター
ゼである。米国特許No.3,654,090、3,850,752、及び4,016,043は代替ラベリング
物質及び方法を開示しているので好ましい。
先行技術で開発、利用された特定のアッセイ・システムは
レセプタ・アッセイとして知られている。レセプタ・アッセイにおいては、アッ
セイの対象となる物質は適切にラベルされ、その後、一定の細胞テスト・コロニ
ーを両方のラベルの一定量で接種し、その後、ラベルされた物質がその細胞レセ
プタに結合する程度を判定するために結合調査を行う。このようにして、物質間
の親和性の差を確認することができる。
先行技術において有効な“cis/trans”アッセイとして知られている。簡単に
言うと、このアッセイは二つのゲノム性向性物を用い、そのうちのひとつは通常
適切な細胞株内に形質導入された場合に問題の特定レセプタを継続的に表現する
プラスミドであり、第二のものはレセプタ/リガンド錯体の制御下でルシフェラ
ーゼなどのレポータを表現するプラスミドである。従って、例えば、ある化合物
を特定のレセプタに対するリガンドとして評価することが望ましい場合、それら
のプラスミドのひとつは選ばれた細胞株内でレセプタの表現をもたらす構成物で
あり、第二のプラスミドはその内部にその特定のレセプタに対する反応元素が挿
入されているルシフェラーゼ遺伝子に結合されたプロモータを保有しているであ
ろう。テスト下の化合物がそのレセプタに対する拮抗物質である場合、そのリガ
ンドはそのレセプタと錯体を形成し、その結果形成される錯体はその反応元素と
結合して、ルシフェラーゼ遺伝子の転写を開始する。その結果得られる化学蛍光
物質を光度的に測定して、用量応答曲線を得て、知られているリガンドのものと
比較する。上に述べた手順は米国特許No.
4,981,784に詳細に述べられている。
ここで用いられている『宿主』という用語は原核生物だけでなくイースト菌、
植物及び動物細胞などの真核生物も含む意味で使われている。当業者に一般的に
知られているいずれかの技術を用いて宿主を形質変換するために、本発明による
ヒトARSA−I蛋白質をコード表現する遺伝子組換えDNA分子又は遺伝子を
用いることができる。特に好ましいのは原核生物形質変換の目的で本発明による
ヒトARSA−I蛋白質をコード表現する遺伝子のコード表現配列を含んだベク
ターの利用である。
原核性宿主としては大腸菌、S.tymphimurium,セラチア・マルセッセンス及
びバシラス・サチリスなどである。真核性宿主はピキア・パストリスなどのイー
スト菌、哺乳動物細胞及び昆虫細胞などである。
一般的に、挿入されたDNAフラグメントの効率的な転写を促進するプロモー
タ配列を含む表現ベクターが宿主との関連で用いられる。この表現ベクターは一
般的には複製の発生源、プロモータ、ターミネータ、及び形質変換された細胞内
で表現型選択を行わせることができる特殊な遺伝子を含んでいる。形質変換され
た宿主は先行技術で知られている手段によって発酵、培養して最適の細胞成長を
達成する。
本発明はヒトARSA−I蛋白質をコード表現するDNA配列で構成されたベ
クターを含んでおり、そのベクターは、操作可能な結合で:a)複製の発生源;
b)プロモータ、及
びc)前記蛋白質をコードするDNA配列、を含む宿主内で複製を行うことがで
きる。好ましくは、本発明のベクターはSEQ ID No.1に示されている
DNA配列を含んでいる。
本発明はまた、遺伝子組換えDNA分子で形質変換された宿主を含んでおり、
前記遺伝子組換えDNA分子はSEQID No.1の配列を有するDNA配列
を含んでいる。ここに開示されている教示を用いて形質変換可能な宿主の代表的
な例は大腸菌である。本発明による遺伝子組換えDNAを含むpKhARSA−
Iと命名されているプラスミドで形質導入された大腸菌はアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションに1996年6月20日にアクセッション番号ATCC9762
0として預託されたものである。
以下の実施例は本発明の種々の実施の態様を示す目的で開示されるもので、い
かなる意味でも本発明の限定は意味していない。
実施例1 オリゴヌクレオチド・プライマーの合成
縮重オリゴヌクレオチド・プライマーを二つの保存プライマー・アミノ酸モチ
ーフ(図AのSHSO及びSH61)に応じて合成し、ヒト卵巣癌腫2008細胞株か
らのランダム・ヘグサマー・プライマーで発生したヒトcDNAライブラリから
の400塩基対PCR生成物を増幅した。このフラグメントの配列はそれがC.エ
レガンスArsA ATP−結合カセット
領域と思われるものと49%の相同性を有する予想アミノ酸プライマー一次配列を
有するArsA上位系列のメンバーであるヒトの遺伝子の一部であることが確認
された。
ネストされたブライマー(図116と123)を用いて(ENAフラグメントと呼
ばれている)ヒト固有フラグメントを増幅した。cDNA及びヒト・ゲノムDN
Aの両方が同じ生成物を増幅したが、これはATP−結合カセットが単一エクソ
ン内に存在していることを示唆している。RNAメッセージのサイズはENAフ
ラグメントをプローブとして用い、いくつかのヒト体組織からのポリ(A)+R
NAのノーザン・ブロット分析によって推定した。すべての検査された体組織は
1.2−kb転写を表現し(図2A);mRNAレベルは心臓及び骨格筋で最も高か
った。
実施例2 hARSA−I cDNAのクローニング
hARSA−I cDNA、その5'末端、及びその全長cDNAの構成物の
クローニングの実行が成功を収めた。Uni−ZapTMヒト肝臓cDNAライブラリ
(Stratagene,LaJolla,CA)をENAフラグメントをプローブとして用いてス
クリーニングし、1207−bp ENAハイブリダイジングDNAを得た。配列決定
を行ったところ、このcDNAが3'未翻訳領域とそのコーディング配列のほと
んどを含んでいるが、5'末端に開始コドンは含んでいないことが示された。
hARUSA−I cDNAの5'末端は二つの連続する
ステップを用いて修飾生成物として得られた。第一のステップの間に、ベクター
固有プライマー:
(B1,5'−GGAAACAGCTATGACCATGATTACG−3')
及びcDNA−固有プライマ:
(B12,5'−CACATCTGTCAGATGAAAGGG−3')は予想され
た汚点をつくりだした。
プライマーB1及びB23(B23:5'−GAACACTATCACGCCCC
T−3')はKOZAK配列の可能性が高い配列の後に続く翻訳開始ATGを含
むhARSA−IcDNAの欠失5'を増幅した。
実施例3 全長hARSA−I cDNAの配列決定
全長hARSAI−I cDNAは3'未翻訳領域から得られたATGとB7
の間に広がっている非重複末端、B24(5'−CGACCGAAGATCCTC
CTC−3')から得られたプライマーを用いて、5'末端PCRフラグメント及
び重複部分的hARSA−Iの混合物をPCR増幅することによって再構成した
。すべてのPCR増幅はTaqポリメラーゼ・エクステンダの存在下で、メーカ
ー(Stratagene,La Jolla,CA)の指示に従い、93℃で30秒間、56℃で30秒間、
そして72℃の温度で60秒間の温度プロフィールを全部で32サイグル繰り返すこと
で行われた。配列決定はfmoTM DNA配列決定システム(Promega,Wisconsin
)を通じて実行され
た。
全長cDNAの配列決定の結果は、それがアミノ酸配列においてC.elegans
ArsAと思われるものと52%の相同性を有し、N末端ATP結合カセット領
域と機能未確認のC末端領域の両方を含んでいる単一のATP−結合カセット領
域(図1B)を有する332個のアミノ酸によって構成された蛋白質をコードする
ことを示した。
ENAフラグメントには存在しない酵素で消化したヒト・ゲノムDNAのサザ
ン・ブロット分析は二つのハイブリダイズするゲノム・バンド(図2B)の存在
を明らかにしたが、このことはC.elegansに見られる二つの相同性配列の残り
の部分である二つのhARSA遺伝子の存在を示唆している(12)。二重化イベ
ントから発生したと考えられる2つのATP結合カセット領域を有する蛋白質を
コード表現するバクテリアのarsA遺伝子(3)とは違って、ヒト及びC.elega
ns ArsA蛋白質の両方ともバグテリアArsAのサイズの半分で、単一のA
TP結合カセット領域を含んでいる。真性生物における二重化イベントは単一の
融合蛋白質ではなく、二つの独立した遺伝子をもたらした可能性がある。これら
の知見を考慮に入れて、現在hARSA遺伝子と述べられているものはhARS
A−I.uと命名された。
実施例4 hARSA固有ウサギ抗体
上記二つのハイブリダイジング・バンドが相同的なアイソ
フォームをコード表現するが異なった機能の遺伝子を示すのかどうかを判定する
ために、hARSA固有ウサギ抗体を調製した。グルタチオン−S−トランスフ
ェラーゼ(GST)−hARSA−I溶融蛋白質が大腸菌内につくられ、親和性
精製溶融蛋白質を用いてウサギを免疫化した。フレーム内の全長cDNAをベク
ター、pGEX−3X(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)内のBamHIサイ
トに挿入して、ファクタ−Xa切断サイトで分離されたグルタチオン−Sトラン
スフェラーゼ(GST)/hARSA−I溶融蛋白質をつくりだすことによって
原核性表現ベクターを構成した。挿入されたhARSA−Iの適切なフレームは
pGEX−3X−hARSA−Iを直接配列決定することによって確認した。遺
伝子組換えGST/hARSA−I溶融蛋白質がXL−1ブルー細胞(Stratage
ne,La Jolla,CA)内で過剰生産され、(D.B.Smith,L.M.Corcoran,Curr
Protocols Mol Biol,F.M.Ausubelら編(John Wiley & Sons,Inc.Massachus
etts,1992).vol.2,pp16.7.1−16.7.8)に述べられている方法で精製さ
れた。hARSA−I固有免疫結成を1mgのGST−hARSA−I溶融蛋白質
を接種したウサギ(R.Seargent,Ramona,CA)内で商業的に発生させた。
M.Towbinら、H.Clin Chem Clin Biochem 27,495−501で述べられているよ
うな確立された技術を用いてウェスタン・ブロット分析を行った。蛋白質をPB
DF膜(Immobilon P,Millipore,Bedford MA)上に電子ブロットして、強化化
学
蛍光システム(Amersham,Arlighton,IL)を用いて信号検出を行った。
hARSA−I固有免疫血清を用いてウェスタン・ブロットによってアデノウ
ィルス(AD5)形質変換ヒト胎児腎臓細胞293細胞の細胞溶解物を分析した。3
7及び42kDaの二つのクロス反応蛋白質が確認され(図3、レーン1及び2)、2
つのhARSAアイソフォームの存在がさらに確認された。ヒト卵巣癌腫2008細
胞でも同じ結果が得られた(データ示さず)。サザン・ブロット分析とウェスタ
ン・ブロット分析の両方の結果とも二つのアイソフォームの存在を示し、ひとつ
の転写だけがノーザン分析で確認された。この見かけの違いは二つの転写間のサ
イズ上の違いが小さ過ぎてノーザン・ブロットで用いられる条件下では解像でき
ないという事実に基づく可能性があり、ハイブリダイジング・バンドが重複した
hARSA−I及びARSA−II転写によって構成されているらしい。
hARSA−Iによって媒介された表現型の変化を確認するために、選択可能
なマーカー(15)としてのneoを含む真核性表現ベクターpRc/CMV−hA
RSA−Iを構成することによって、hARSA−Iを過剰表現するように293
細胞を加工した。hARSA−I cDNA全長キナーゼPCRフラグメントを
、表現プラスミドpRc/CMV−hARSA−Iをつくりだすために、ヒト細
胞メガロウィルス(CVM)即時初期遺伝子エンハンサ/プロモータ配列の制
御下で真核性表現ベクターpRc/CMV(Invitrogen,San Diego,CA)内の
埋め込みXba Iサイト内にhARSA−I cDNA全長キナーゼ化PCRフ
ラグメントを挿入することによって、真核性表現ベクターを構成した。このベク
ターはRSV長末端反復(LTR)の制御下でネオマイシン・ホスホトランスフ
ェラーゼ遺伝子も含んでいた。先行技術で知られているようなリポフェクション
によって293細胞の形質導入を行った。例えば、P.Felgnerら、Proc Natl Acad
Sci USA 84:7413−7417(1987)参照、そして、形質導入された細胞を400mg/ml
G418ないでリポフェクションから48時間後に選択した。
pRc/CMV−hARSA−I形質導入された細胞(15)からG4l8抵抗性
細胞(293/hARSA−I)の集団が発生され、この集団でのhARSA−Iの
過剰生産がhARSA−I固有ウサギ・ポリクローナル抗体を用いたウェスタン
分析で確認された。293/hARSA−I細胞内で37kDa蛋白質のレベルの上昇が
認められるが、42kDaクロス反応性蛋白質のレベルでは相違は認められず、この
ことはhARSA−I遺伝子が37kDa hARSA−Iアイソフォームをコード
表現することを示唆している。
実施例5 hARSA−I発現及び亜砒素酸塩に対する抵抗性
亜ヒ酸塩に対する抵抗性を媒介するhARSA−I発現の能力をスルホルホド
アミンBアッセイ(16,17)を用いて
293及び293/hARSA−I細胞に対する亜ヒ酸塩の濃度を増大させながら1時
間露出させた場合の抑制効果を測定することによって調べた。スルホルホドアミ
ンBアッセイは96−ウェル・プレートに24時間、6,000細胞/ウェルの割合では
ん種することによって行った。比較対照プレートはこの時点0(T0)で固定し
、テスト・ウェルの方は適当な重金属塩で1時間で処理してから、その後、50%
(w・v)トリクロロ酢酸内で48時間成長させてから固定させた。スルホルホド
アミンBで細胞蛋白質を染色させて515nmで分光分析して、相対成長度を測定し
た。Tでの吸収度がT0での吸収度より大きい場合、R=(T−T0)/(C−T0
)であり、T<T0であれば、R=(T−T0)/T0であり(A.Monksら、J.N
atl Cancer Inst 83,757−765(1991))で、Tは薬品処理72時間後の吸収度、
Cは比較対照群での72時間目の吸収度、そしてT0は薬品処理直前の吸収度であ
る。IC50値はR値が0.5の場合の線形外挿で評価した。
293/hARSA−I細胞はIC50濃度との比率で亜ヒ酸塩に対して1.7倍の抵
抗性を示した(図6A)。図4BとCに示すデータは293/hARSA−I細胞も
塩化カドミウムに対して1.5倍の抵抗性を示し、塩化ニッケルに対して1.6倍の抵
抗性があることを示している。塩化亜鉛に対する感作性においては、何の変化も
認められなかった。従って、本発明はhARSA−Iの過剰生産がオキシアニオ
ン(As+3)に加えて二つの異なった陽イオンに対する抵抗性を媒介することを
示している。さらに、本発明は、両方のhARSAアイソフォームがヒトの細胞
に表現されるが、これらの重金属塩に対する抵抗性をつくりだすためには、hA
RSA−Iの過剰表現だけで十分である。
hARSA−I遺伝子は重金属移送システムの成分であることを実証している
。このシステムは第二のアイソフォーム、hARSA−IIと、そして少なくとも
ひとつの未だ未確認のバクテリア性arsBに類似した、亜ヒ酸塩を細胞の外に運
び出したり、その細胞内にそれを封鎖したりする機能を示す膜透過蛋白質で構成
されている可能性がある。陰イオン性及び陽イオン性重金属に対するhARSA
−I媒介調節はヒト亜ヒ酸塩ポンプの低基質特性の反映であるかもかもしれない
。しかしながら、公知のATP結合カセット・トランスポータが単一の基質、あ
るいは非常に密接に関連した基質グループに対して最も高い頻度で特性を示すの
で、そうした可能性はありそうにもない(18)。一方、バグテリアのarsCに類
似したモジュレータ蛋白質はヒトの細胞に存在する可能性があり、hARSA−
Iと相互作用して陽イオン性重金属を取り込む上での亜ヒ酸塩ポンプの特性を増
大させることができるのかも知れない。
最近の知見は、いくつかのATP結合カセット・トランスポータが異種トラン
スポータの活性を調節することを示している(18で検討)。このことは亜ヒ酸塩
、カドミウム及びニッケル間で観察されるクロス抵抗性に対する別の説明を提供
する。第一に、亜ヒ酸塩サブユニットに対する異なった重金属の結合は、重金属
特性を規定する可能性のある相互作用であるhARSA−Iの種々の膜透過チャ
ンネル蛋白質との結合をもたらしている可能性がある。第二に、hARSA−I
の過剰表現はグルコース・トランスポータとバンド3陰イオン.イクスチェンジ
ャ、Na+/K+−ATPase間のアンキリン/スペクトリン媒介相互作用に類似し
た中間蛋白質との相互作用を通じて間接的に独立の異種カドミウム及びニッケル
・チャンネルを活性化している可能性もある(Millsら、Curr Opin Nephrol Hyp
erten 3,529−534(1994))。重金属塩が存在している場合と存在していない
場合にhARSA−Iが相互作用する細胞性蛋白質を確認する研究は、この抵抗
性表現のメカニズムの理解を深めるのに役立つだろう。
本明細書に引用されている引用文献は以下の通りである。
1. Silverら、Environ Health Perspect 102(3),107−113(1994)
2. P.Kaurら、Plasmid 27,29−40(1992)
3. B.P.Rosenら、Biochim Biophys Acta 1018,203−205(1990)
4. S.Broerら、J.Bacteriol 175,3480−3485(1993)
5. E.V.Koovin,J Mol Biol 229,1165−1174(1993)
6. S.Silnerら、Mol Microbiol 8,637−642(1993)
7. B.P.Rosenら、Arch Biochem Biophys 284,381−385(1991)
8. K.L.Odenら、Mol Microbiol 12,301−306(1994)
9. K.Petrukhinら、Hum Mol Genet 3,1647−1656(1994)
10. R.D.Palmiter,S.D.Findley,EMBO J 14,639−649(1995)
11. J.P.Mercerら、Nature Genet 3,20−25(1993)
12. J.Sulstonら、Nature356,37−41(1992)
22. P.Lorimierら、J Histochem Immunohistochem 41,1591−1997(1993
)
本明細書で述べられているすべての特許あるいは出版物は本発明が関連する技
術分野の当業者の理解できる範囲である。
これらの特許及び出版物は、個々の出版物を具体的、個別的に参照しているのと
同様に、全体としても本明細書に組み込まれる。
本発明が上に述べた、及びそれらに本質的に付随した課題を実行し、目的と利
点を達成するのに適していることは、当業者は容易に理解できるであろう。ここ
に示した実施例はその方法、手順、措置、分子、特定の化合物と共に好ましい実
施の形態を示すものであって、本発明の範囲の限定は意図していない。特許請求
の範囲に定義されている本発明の精神の範囲内での変更や他の利用法は、当業者
には容易に想起できるであろう。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
C12N 1/21 G01N 33/53 D
5/10 33/577 B
G01N 33/53 C12N 5/00 B
33/577 A61K 37/02
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(GH,KE,LS,MW,S
D,SZ,UG,ZW),AM,AT,AU,BB,B
G,BR,BY,CA,CH,CN,CZ,DE,DK
,EE,ES,FI,GB,GE,HU,IS,JP,
KE,KG,KP,KR,KZ,LK,LR,LT,L
U,LV,MD,MG,MN,MW,MX,NO,NZ
,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,
SK,TJ,TM,TT,UA,UG,UZ,VN
(72)発明者 ホウエル,ステファン ビィ.
アメリカ合衆国 92014 カリフォルニア,
デル マール,ノガレス ドライブ
13612
(72)発明者 エンス,ロバート
アメリカ合衆国 92075 カリフォルニア,
ソラナ ビーチ,サンタ ロシタ 673
(72)発明者 ナレディ,ピーター
スウェーデン,バルベルグ 43241,オス
トラ ラング 39 ビィ.