CN107868784B - 一种能降低氟致细胞凋亡的shRNA及其应用 - Google Patents

一种能降低氟致细胞凋亡的shRNA及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能降低氟致细胞凋亡的shRNA及其应用，该shRNA包括正义链核苷酸和反义链核苷酸，所述正义链核苷酸的序列如SEQ NO.1所示，所述反义链核苷酸的序列如SEQ NO.2所示。本发明通过shRNA技术，在PRKAR1A shRNA干扰的UMR‑106和MC3T3‑E1细胞模型中染氟48h，采用Western Blot检测Cleaved Caspase‑3、Caspase‑8、Bim和PARP的蛋白表达，并通过流式细胞术、TUNREL法检测细胞凋亡，证明了PRKAR1A shRNA在氟诱导的成骨细胞凋亡过程中有着一定作用，该shRNA片段可降低氟致细胞凋亡。

Description

一种能降低氟致细胞凋亡的shRNA及其应用
技术领域
本发明属于生物工程基因重组技术领域，尤其涉及一种能降低氟致细胞凋亡的shRNA及其应用。
背景技术
氟作为机体所必需的一种化学性质活泼的非金属微量元素被广泛的应用于生产、生活中。适量的氟对于龋齿的预防及骨质疏松的治疗有着重要的意义，而长期过量的摄入会引起以氟骨症(skeletal fluorosis)和氟斑牙(dental fluorosis)为主要特征的一种慢性全身性疾病，即地方性氟中毒(endemic fluorosis)。骨作为氟作用的主要靶器官之一，是由成骨细胞和破骨细胞构成。成骨细胞作为骨的重要组成部分，其引起的骨形成与破骨细胞引起的骨吸收两者的平衡是维持骨完整性的关键，当它们之间的关系失去平衡时可导致骨转换加速、骨硬化、骨软化、骨质疏松等病变。氟骨症发生过程中成骨细胞的激活、骨转换的加速、细胞凋亡的激活调控等是目前氟骨症发病机制研究的热点问题，这些表型变化都涉及很多信号分子调控。
Gs/Gi-AC-cAMP-PKA细胞信号通路是目前最完善的细胞信号传递模型，是由G蛋白介导的在细胞内普遍存在的信号转导通路。由激动型G蛋白(stimulating adenylatecyclase G protein，Gs)和抑制性G蛋白(inhibitory adenylate cyclase g protein，Gi)介导激活腺苷酸环化酶(Adenylate Cyclase，AC)，AC将三磷酸腺苷(AdenosineTriphosphate，ATP)去磷酸化为细胞环磷酸腺苷(3’，5’-Cyclic AdenosineMonophosphate，cAMP)，蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)作为cAMP的主要效应物，cAMP通过与PKA的调节亚基PRKAR1A结合，释放催化亚基，从而激活PKA。PKA作为cAMP的主要效应物，影响着细胞增殖、分化、凋亡、坏死和合成分泌物质等功能。无活性的PKA是由两个催化(C)和两个调节(R)亚单位组成的四聚体结构，包括3种催化亚基(Cα，Cβ，Cγ)。其中每种调节亚基又分为两种亚型分别为(R1A、R1B、R2A、R2B)。当G蛋白活化时，将细胞中的ATP转化为cAMP，细胞中cAMP浓度增高时，两个cAMP分子与R调节亚基结合导致催化亚基的解离和活化。通过磷酸化特定的丝氨酸或苏氨酸，完成对细胞生长发育，糖及脂类代谢，细胞周期，凋亡等重要生命活动的调节作用。PRKAR1A作为PKA重要的调节亚基，是四个已知调节亚基中分布最为丰富和普遍的。研究发现PRKAR1A对cAMP具有更高的亲和力，细胞内PKA活性主要由它调节而活化。PRKAR1A发生突变时将会通过影响PKA活性或其它信号通路导致各种病理生理改变。
研究发现在PRKAR1A失活突变的淋巴细胞中，通过活化丝裂原蛋白激酶(MAPK)信号通路，细胞增殖和存活率上升，细胞凋亡率下降。PRKAR1A在17q23-24功能获得突变时，PKA活性下降，患者出现一种罕见形式的骨骼发育不良、身材矮小。而在基因敲除小鼠中也发现有骨病变，进一步研究发现病变多为分化不完全的成骨细胞，提示PRKAR1A参与氟骨症中发病机制的调控。但是目前还没有有效的干扰手段。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能降低氟致细胞凋亡的shRNA及其应用，为降低氟致细胞凋亡并将RNA干扰开发用于治疗″氟中毒″的试剂提供一种新的途径。
一种能降低氟致细胞凋亡的shRNA，包括正义链核苷酸和反义链核苷酸，其中，所述正义链核苷酸的序列如SEQ NO.1所示，所述反义链核苷酸的序列如SEQ NO.2所示。
所述的shRNA在制备降低氟致细胞凋亡试剂盒中的应用。
所述的应用，使用步骤包括：
步骤A、将所述正义链核苷酸和反义链核苷酸退火，得到退火引物；
步骤B、将所述退火引物连接到线性化质粒载体pDC315-U6-CMV-EGFP中，得到包含退火引物的腺病毒载体；
步骤C、将所述腺病毒载体和辅助质粒pBHGloxdelE13cre转染到HEK293细胞中，并进行培养和测试。
所述的应用，其中，所述步骤A中，所述退火的反应体系及反应条件如下：
反应体系：
Figure BDA0001462319610000031
反应条件：
Figure BDA0001462319610000032
退火后可立即使用或者-20℃长期保存。
所述的应用，其中，所述步骤B中，所述退火引物连接到线性化质粒载体中连接的反应体系及反应条件如下：
反应体系：
Figure BDA0001462319610000033
Figure BDA0001462319610000041
反应条件：于4℃混匀连接10小时以上。
有益效果：本发明提供了一种如上所述的能降低氟致细胞凋亡的shRNA，通过shRNA技术，在PRKAR1A shRNA干扰的UMR-106和MC3T3-E1细胞模型中染氟48h，采用WesternBlot检测Cleaved Caspase-3、Caspase-8、Bim和PARP的蛋白表达，并通过流式细胞术、TUNREL法检测细胞凋亡，证明了PRKAR1A shRNA在氟诱导的成骨细胞凋亡过程中可降低氟致细胞凋亡。
附图说明
图1为PRKAR1A干扰对染氟UMR-106细胞凋亡蛋白表达的影响。
图2为PRKAR1A干扰对染氟UMR-106细胞凋亡蛋白表达灰度值的影响。
图3为PRKAR1A干扰对染氟MC3T3-E1细胞凋亡蛋白表达的影响。
图4为PRKAR1A干扰对染氟MC3T3-E1细胞凋亡蛋白表达灰度值的影响。
图5为DAPI、TUNEL和Merge三种检测方法检测UMR-106细胞的凋亡图。
图6为DAPI、TUNEL和Merge三种检测方法检测MC3T3-E1细胞的凋亡图。
具体实施方式
本发明提供了一种能降低氟致细胞凋亡的shRNA及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种能降低氟致细胞凋亡的shRNA，具体实施方式如下：
(1)PRKAR1A基因siRNA的设计及筛选
1)PRKAR1A基因siRNA的设计
根据NCBI里大鼠(NM.013181.1)及小鼠(NM.021880.2)的PRKAR1A全基因mRNA的比对结果，二者具有较高同源性，故设计大鼠小鼠通用的siRNA序列。序列采用BLAST(NCBI)进行非同源性查询，siRNA靶点无其它同源序列，设计siRNA针对靶基因ORF区域(开放阅读框区域)，通过比对相同的序列设计21个碱基正义链和与其互补的碱基反义链，共构成3条模板链，如表1所示。
表1 siRNA序列
Figure BDA0001462319610000051
2)PRKAR1A基因siRNA的筛选
将合成的3对siRNA瞬时转染细胞，通过qPCR确定敲除效率选择一对(PRKAR1A(2))用于腺病毒载体构建及包装。
合成以下shRNA正义链及反义链，合成时靶序列及反义靶序列之间插入茎环结构，两端分别加入MluI和Xba I内切酶的酶切位点，以poly T为终止序列。shRNA序列如下(下划线部分为酶切位点)。
SEQ NO.1：
F：5′-ACGCGTGGGATAACTTCTATGTGATTGTTCAAGAGACAATCACATAGAAGTTATCCCTTTTTTG-3′。
SEQ NO.2：
R：5′-TCTAGACAAAAAAGGGATAACTTCTATGTGATTGTCTCTTGAACAATCACATAGAAGTTATCCCG-3′。
(3)shRNA引物退火
1)将合成的引物(oligo)溶解于退火缓冲液(Buffer)，浓度为100μM，反应体系如下：
Figure BDA0001462319610000052
Figure BDA0001462319610000061
2)PCR反应条件：
Figure BDA0001462319610000062
退火后可立即使用或者-20℃长期保存。
(4)重组穿梭质粒pDC315/shRNA的构建
连接pDC315-U6-CMV-EGFP线性化质粒载体和PRKAR1A退火引物，将干扰片段接入线性载体中。
连接反应体系如下：
Figure BDA0001462319610000063
4℃充分混匀连接过夜(10小时以上)。
(5)重组pDC315/shRNA/PRKAR1A的包装与纯化
按照lip3000脂质体转染方法将腺病毒载体和辅助质粒pBHGloxdelE13cre转染到HEK293细胞中，放置于含5％CO2，37℃的细胞培养箱中培养。24h后荧光显微镜下观察荧光表达，7天后收集细胞与上清，置于干冰中或者-20℃反复冻融2次，1500rpm低温离心1min以去除上清中的细胞残渣。
在100mm培养皿或75cm2培养瓶中加入10ml 5％FBS DMEM(胎牛血清培养基)培养5×106个以上的HEK293细胞。取500ul-1ml首次扩增的病毒保存液，加入5％FBS DMEM至1ml，混匀，这样稀释得到的MOI值约为5。移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3次，37℃ CO2孵箱中培养90min。加入9ml 5％FBS DMEM。再培养72h，这时在10ml溶液中大约有5×109-5×1010个病毒颗粒，进行MOI测定以估计病毒颗粒。
使用100KD浓缩柱，对所收扩增的20ml的病毒进行离心浓缩；离心力4000g，10min/次，直到将所有病毒液浓缩为1-2ml；加入3-4ml的PBS，离心力3000g，10min/次，洗涤3次；将浓缩的病毒进行病毒滴定检测。
实验结果分析
PRKAR1A shRNA对氟致成骨细胞凋亡的影响如图1-图4所示，Western Blot结果显示，NaF单独处理组明显地激活Bim(包括BimL：B淋巴细胞瘤-2家族成员的亲凋亡的蛋白质L型和BimEL：B淋巴细胞瘤-2家族成员的亲凋亡的蛋白质EL型)、Cleaved Caspase-3(活化半胱氨酸特异性蛋白酶3)、full-length Caspase-8(活化半胱氨酸特异性蛋白酶8)、full-length PARP(聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶全长片段)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)和Cleaved PARP(活化的聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶)蛋白的表达，PRKAR1A基因干扰联合NaF处理后Bim、Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP等凋亡蛋白较单独NaF处理组低。
分别采用DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)法、TUNEL(DNA断裂的原位末端标记法)和Merge(合并)法测试，实验结果如表2、图5和图6所示，NaF单独处理组细胞凋亡率明显高于其它各处理组，PRKAR1A干扰联合NaF处理后细胞凋亡率较单独NaF处理组低。
表2 TUNEL检测PRKAR1A基因干扰对氟致UMR-106和MC3T3-E1细胞凋亡百分率(
Figure BDA0001462319610000081
n＝3)
Figure BDA0001462319610000082
注：a：与对照组比较，P＜0.05；b：与pDC315组比较，P＜0.05；c：与pDC315/shRNA/PRKAR1A组比较，P＜0.05。d：与NaF组比较，P＜0.05。
根据上述研究结果，可制备一种包含如上所述shRNA的试剂盒，根据该shRNA具有降低氟致细胞凋亡的原理，制备一种解决″氟中毒″问题的试剂盒。
综上所述，本发明提供了一种如上所述的能降低氟致细胞凋亡的shRNA，本发明以UMR-106大鼠骨肉瘤细胞和MC3T3-E1小鼠成骨细胞为研究对象，通过shRNA技术，在PRKAR1AshRNA干扰的UMR-106和MC3T3-E1细胞模型中染氟48h，采用Western Blot检测CleavedCaspase-3、Caspase-8、Bim和PARP的蛋白表达，并通过流式细胞术、TUNREL法检测细胞凋亡，证明了PRKAR1A shRNA在氟诱导的成骨细胞凋亡过程中可降低氟致细胞凋亡。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 贵州医科大学
<120> 一种能降低氟致细胞凋亡的shRNA及其应用
<160> 2
<210> 1
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 1
acgcgtggga taacttctat gtgattgttc aagagacaat cacatagaag ttatcccttt 60
tttg 64
<210> 2
<211>
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 2
tctagacaaa aaagggataa cttctatgtg attgtctctt gaacaatcac atagaagtta 60
tcccg 64

Claims (5)

1.一种能降低氟致细胞凋亡的shRNA，包括正义链核苷酸和反义链核苷酸，其特征在于，所述正义链核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反义链核苷酸的序列如SEQ IDNO.2所示。
2.权利要求1所述的shRNA在制备降低氟致细胞凋亡试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，使用步骤包括：
步骤A、将所述正义链核苷酸和反义链核苷酸退火，得到退火引物；
步骤B、将所述退火引物连接到线性化质粒载体pDC315-U6-CMV-EGFP中，得到包含退火引物的腺病毒载体；
步骤C、将所述腺病毒载体和辅助质粒pBHGloxdelE13cre转染到HEK293细胞中，并进行培养和测试。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤A中，所述退火的反应体系及反应条件如下：
反应体系：
Figure FDA0003028717880000011
反应条件:
Figure FDA0003028717880000012
Figure FDA0003028717880000021
退火后可立即使用或者-20℃长期保存。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤B中，所述退火引物连接到线性化质粒载体中连接的反应体系及反应条件如下：
反应体系：
Figure FDA0003028717880000022
反应条件：于4℃混匀连接10小时以上。
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