明細睿
ECDN蛋白質およびそれをコ一 ドする D N A 発明の背景
発明の分野
本発明は、 新規なス テロイ ドホルモ ン レセプ夕一様蛋白質である ECDN蛋白質、 それをコー ドする D N Aならびに本蛋白質の製造および使用する方法に関する も のである。
関連技術の記述
これまでに、 ス テロイ ドホルモ ン レセブター様蛋白質と して、 ァミ ノ酸配列上 相同性を持つ蛋白質群が発見同定されている。 これらの蛋白黄は、 ス テ ロ イ ドホ ルモ ン類のみならず、 甲状腺ホルモ ンや、 ビタ ミ ン D代謝物及びその天然並びに 合成誘導体、 レチノ イ ン酸及びその天然並びに合成誘導体、 ビタ ミ ン A代謝物な どの脂溶性ビタ ミ ンの誘導体に対しても、 応答性を有する。 これらリ ガン ド依存 性の転写調節蛋白質群は、 スーパーファ ミ リーを構成しており、 ホルモ ンや リ ガ ン ド刺激に対して特異的な D N Aの応答ヱ レメ ン ト に直接結合することにより、 特定の遗伝子の発現を翻節することができる。 これらのレセプター蛋白質は、 ホ ルモ ン類ゃビタ ミ ン類をリ ガン ドとして用いて特定の ¾伝子の発現を調節する転 写調節因子として、 発生や分化、 生体の恒常性の維持に極めて重要な機能を果た していることが明らかとされている [Evans. R. M. , Science, 240. 889 (1988)] 。 これらレセプター蛋白質に結合でき、 リ ガン ドと して機能しうる天然並びに合成 誘導体は、 医学、 薬学、 農学の分野で広く研究され、 応用されてきている。
ス テ ロ イ ドホルモ ン レセブター蛋白質のスー パーフ ァ ミ リ ーに厲する と考えら れる蛋白質群の中には、 スー パーフ ァ ミ リーに共通な D N A結合 ドメ イ ンの相同 性に注目し、 緊縛を緩和させた条件下でのハイブリダイゼーショ ンによつて行わ れた分子ク ローニ ングで作られた蛋白質群が、 数多く含有されている。 これらの 蛋白質群の中には、 それに特異的なリ ガン ドがこれまでに未同定である、 ォー フ ァ ンレセプターと呼ばれる一群の蛋白質が存在する [Laudet. V. , et. al.,
EMBO J.. 11, 1003 (1992)] 。 これらのォ一フ ァ ン レセプターに特異的な リ ガン ドの同定や、 これらのォーフ ァ ン レセプターの転写調節因子と しての機能に関す る研究は、 医薬や農学に適用できる医学及び生物学上の新たな知見を提供する可 能性があるので、 極めて重要であると考えられている。 例えば、 従来ォーフ ァ ン レセブターの一つと位置づけられていたレチノ ィ ド X受容体 (RXR) のリ ガン ド は、 9 一シス ー レチノ イ ン酸であること、 及び、 R X Rは、 転写調節に重要な 機能を担う受容体であることが明らかにされた [Levin. に et. al. , NATURE. 355, 359 (1992) ] 。 ヒ ト の リ ガン ド依存性転写調節機構に関わる蛋白質におい ては、 多く の受容体が未だ未同定のままであると考えられる。 それ故、 これらの 受容体をを単離、 同定することは、 医学、 薬学へのそれらの応用という観点にお いても、 重要な意義がある。 発明の開示
発明の概要
本発明の目的は、 ス テロイ ド サイ ロイ ドホ ルモ ン レセブタ一 スー パー フ ァ ミ リ ーに属し、 ヒ 卜 に由来する新規なレセプター蛋白質、 その蛋白質をコ 一 ドする ¾伝子、 その蛋白質を用いたレセブター機能の解析法及びその蛋白質を用 いたやリ ガ ン ドの探索法を提供し、 その応用分野を広げることである。
ス テロイ ドホルモ ン受容体様蛋白質のスー パ一フ ァ ミ リ一を構成する蛋白質群 の構造上の比較、 及び逡伝子改変を通じて構築された変異レセプターを用いた機 能解析結果と して、 これら蛋白質群が機能的な ドメイ ンより構成されていること が、 明らかとされてた。 66ないし 68ア ミ ノ酸よりなり、 2個の亜 フィ ンガーを 持つ ドメ ィ ンは、 スー パーフ ァ ミ リ一に属する蛋白質群間で、 最も高い相同性を 示し、 かつ、 D N Aに結合することが明らかとされ、 一方、 C末端側約 250 個の ア ミ ノ酸よりなる ドメ イ ンは、 リ ガン ドに結合可能な ド メ イ ンと して、 リ ガン ド 依存性に関与することが明らかとされた [Wahli. W. , et. al. , FASEB, J. , 5, 2243 (1991) ] 。 これらのス テロイ ドホルモ ン レセプタ一様蛋白質は、 哺乳類の みならず昆虫においても発見、 同定されている。 その代表例として、 昆虫の変態 を司るス テロイ ドホ ルモ ンであるェク ジソ ンに対する受容体が、 上記スー パ一
フ ァ ミ リーの一員と して知られている [ Koe l l e. M. R . . e t . a l . . Ce l l , 61. 5 9 ( 19 9 1 ) ] 。
本発明者らは、 ヒ ト胎児肺 cDNAライブラ リーよりク ロー ンをラ ンダムに選び、 各ク ロ一 ンの 5 ·末端側のヌ ク レオチ ド E列を決定した。 次いで、 それより演繹さ れたア ミ ノ酸 K列を、 検索に供した。 その結果、 昆虫の脂肪体より単離、 同定さ れたェク ジソン受容体のァ ミ ノ酸配列に対する相同性が高いァ ミ ノ酸配列を有す るク ロー ンを見出した。 このクロー ンは全長 cDNAを含んでいなかつたので、 こ の クローンをプローブと して用いて、 cDNAライブラ リ一を再度スク リーエングした c このように して、 ヒ ト乳腺ラィブラ リーより、 全長 cDNAを含むク ロー ンを得るこ とに成功した。 この cDNAがコー ドする蛋白質のア ミ ノ酸配列は、 ェク ジソ ン受容 体、 及びヒ トやマウ スの レチ ノィ ン酸受容体並びに甲状腺ホルモン受容体のァ ミ ノ酸配列に対して、 相同性が高かった。 特に、 D N A結合 ドメ イ ンに相当すると 思われる部位には、 2個の亜鉛フ ィ ンガーを含む領域が、 高い相同性を持って保 持されていた。 リ ガン ド結合領域に相当する領域は、 上述のェク ジソ ン受容体や レチ ノ ィ ン酸受容体のリ ガン ド結合領域と、 高い相同性を示し、 ステロ イ ドホル モ ン受容体様蛋白質群のリガン ド結合領域に特徴的な ドメ イ ン構造を持っている ことも確認された。 このようにして、 この蛋白質が、 これまで報告のない、 ス テ ロイ ドホルモ ン受容体様蛋白質群の新規な一員であることが証明された。 本発明 者らは、 こ の蛋白質を、 " E CDN蛋白質" と命名した。
本受容体蛋白質をコー ドする cDNAを、 宿主 (大腸菌、 酵母、 昆虫細胞、 哺乳類 細胞など) に導入し、 形質転換体を作製することによって、 本発明の受容体蛋白 質を単離、 精製でき、 従って、 それに結台している リ ガン ドの構造を決定できる 更に、 精製蛋白質を用いた結合試験によって、 本受容体に結合できる新たな合成 リ ガン ドゃ応答ェレメ ン トをスク リーニングできる。 本受容体蛋白質をコー ドす る cDNAを、 応答ヱレメ ン ト と レボーター遺伝子を含むブラス ミ ドと共に共形質変 換に供すると、 本受容体の転写活性に及ぼす作用について、 詳細に検討すること が可能となる。
本発明は、 上記蛋白質に結合する D N A応答エ レメ ン トゃ他の転写調節因子と この蛋白質との相互作用を調べ、 かつ、 この蛋白質に特異的なリ ガン ドを検索す
るこ とによ つて、 私達が上記蛋白質の転写調節因子と しての機能を解析するのを 可能と し、 かつ、 私達が、 新たな医薬品、 診断薬、 予防薬の開発を目指した研究 の範囲を広げるのを可能とし、 従って、 この分野の知見を飛躍的に進歩させるの で、 本発明は、 極めて重要である。
本発明者らは、 抗 ECDN蛋白質モノ ク ロ—ナル抗体を作製し、 各種細胞における 本蛋白質の発現を解析した。 その結果、 驚くべきこ とに、 癌細胞においては、 約 50kDa の ECDN蛋白質に加え、 約 40kDaの小分子の蛋白質が特異的に発現している ことが確認された。 次いで、 この小分子蛋白質の構造を確認したところ、 ECDN蛋 白質をコー ドする D N Aから 291 個の塩基が欠失し、 その結果、 ECM蛋白質から 97個のア ミ ノ酸が欠失した蛋白質であることが確認された。 そこで、 本発明者ら は、 この蛋白質を" ECDN小分子蛋白質" と命名した。 この事実から、 本発明に係 る ECDN小分子蛋白質は、 癌の診断、 治療などに広く利用し得るュニ—クな蛋白質 であることが判る。
即ち本発明は、 ( 1 ) 配列番号 1 に記載のヌ ク レオチ ド配列によってコ ー ドさ れたァ ミ ノ酸配列の全部又は一部からなるァ ミ ノ酸配列を有する ECDN蛋白質、 及 び、 ( 2 ) 配列番号 2に記載のヌク レオチ ド配列によつてコ — ドされたァ ミ ノ酸 配列の全部又は一部からなるァ ミ ノ酸配列を有する ECDN小分子蛋白質を提供する 本発明は、 配列番号 1 に記載のァミ ノ酸配列を有する ECDN蛋白質と実質的に同 等で、 その蛋白質への 1又はそれ以上のア ミ ノ酸残基の付加又は挿入、 あるいは その蛋白質の 1又はそれ以上の連統するァ ミ ノ酸残基の欠失又は置換によつて得 られる ECM蛋白質をも包含する。 ECDN蛋白質の研究及び診断において、 同様の効 果を発揮する限り、 そのような等価物は、 本発明に包含される。 また、 本発明は、 配列番号 2 に記載のァ ミ ノ酸配列を有する ECDN小分子蛋白質と実質的に同等で、 その蛋白質への 1又はそれ以上のァ ミ ノ酸残基の付加又は挿入、 あるいはその蛋 白質の 1又はそれ以上の連統するァ ミ ノ酸残基の欠失又は置換によつて得られる ECDN小分子蛋白質をも包含する。 ECDN小分子蛋白質の研究及び診断において、 同 様の効果を発揮する限り、 そのような等価物は、 本発明に包含される。
本発明は、 また、 ( 3 ) 配列番号 1 に記載のヌク レオチ ド配列の全部又は一部 からなる ヌク レオチ ド配列を有する、 E CDN蛋白質をコ一 ドする D N A、 及び、
( 4 ) 配列番号 2 に記載のヌ ク レオチ ド配列の全部又は一部からなるヌ ク レオチ ド配列を有する、 ECDN小分子蛋白質をコー ドする D N Aを提供する。
上記 ECDN蛋白質におけると同様に、 配列番号 1 に記載のァ ミ ノ酸配列を有する ECDN蛋白質をコ一ドする D N Aと実質的に同等で、 その D N Aへの 1又はそれ以 上のヌ ク レオチ ドの付加又は挿入、 あるいはその D N Aの 1又はそれ以上の連続 するヌ ク レオチ ドの欠失又は置換によって得られる D N A、 即ち等価物、 も、 本 発明に包含される。 また、 上 KECDN小分子蛋白質におけると同様に、 配列番号 2 に記載のァ ミ ノ酸配列を有する ECDN小分子蛋白質をコー ドする D N Aと実質的に 同等で、 その D N Aへの 1又はそれ以上のヌ ク レオチ ドの付加又は挿入、 あるい はその D N Aの 1又はそれ以上の連続するヌク レオチ ドの欠失又は置換によつて 得られる D N A、 即ち等価物、 も、 本発明に包含される。
更に、 本発明は、 ( 5 ) 上記 D N Aを含有するベクター、 ( 6 ) 該ベクターを 保持する形質転換体、 及び、 ( 7 ) 移入された、 該ベクターを保持する形質転換 体を培養し、 その発現産物を回収することからなる、 ECDN蛋白質又は ECDN小分子 蛋白質の製造方法を提供する。
加えて、 本発明は、 ( 8 ) 移入された、 ECDN夕ンパク質をコ一 ドする D N Aを 含有するベクターと、 そのベクターに応答する D N Aを含むレポーターベクター とを保持する共形質転換体、 ( 9 ) 移入された、 ECDN蛋白質の D N A結合 ド メ ィ ンを ECDN蛋白質以外の公知のステロ イ ドホルモ ン受容体様蛋白質の D N A結合 ドメ イ ンで置換して得たキ メ ラ ECDN蛋白質をコ ー ドする D N Aを含有する べ ク ター と、 そのベクターに応答する D N Aを含むレポ一ターベクターとを保持する 共形質転換体、 ( 1 0 ) 上記共形質転換体を用いることからなる、 当該共形質転 換体に作用できる化合物のスク リ一ニ ング方法、 及び、 ( 1 1 ) 上記 ECDN蛋白質 を用いることからなる、 ECDN蛋白質と結合し得る化合物のス ク リ — ニ ング方法を 提供する。
本発明は、 ( 1 2 ) 配列番号 1 又は 2 に記載のヌ ク レオチ ド配列の全部又は一 部からなる ヌ ク レオチ ド配列を有する D N Aプローブ、 ( 1 3 ) 配列番号 1 又は 2に記載のヌ ク レオチ ド配列の一部からなるヌ ク レオチ ド配列を有する D N Aプ ライマー、 ( 1 4 ) 当該 D N Aプローブ又は当該 D N Aブライマーを被検 D N A
とハイプリ ダイ ズさせることからなる、 ECDN蛋白質又は ECDN小分子蛋白質の遗伝 子の解析方法、 ( 1 5 ) 当該 D N Aプローブ又は当該 D N Aプライマーを用い、 被検組織又は被検細胞中の ECDN蛋白質又は ECDN小分子蛋白質の m R N Aを測定 するこ とからなる钿胞検査方法、 ( 1 6 ) 当該 D N Aプローブを被検 D N A と ハイ プリダイズさせ、 ECDN蛋白質又は ECDN小分子蛋白質の遺伝子を測定するこ と からなる細胞検査方法、 ( 1 7 ) 当該 D N Aプライマーを用いて被検 m R N Aを R T - P C R法にて增幅させ、 ECDN蛋白質又は ECM小分子蛋白質の遗伝子の発現 を測定することからなる钿胞検査方法、 及び、 ( 1 8 ) 配列番号 6に記載の D N Aプライマーと E列番号 7に記載の D N Aブラ イ マ—を用いて、 被検 m R N Aを R T - P C R法にて增幅させ、 ECDN蛋白質又は ECDN小分子蛋白質の遗伝子の発現 を測定するこ とからなる細胞検査方法を提供する。
また、 本発明は、 ( 1 9 ) ECDN蛋白質又は ECDN小分子蛋白質と結合できる、 ポ リ ク ロ ーナル抗体又はモノク ロ—ナル抗体、 ( 2 0 ) 当該ポリ ク ロ—ナル抗体又 はモノ ク 口ーナル抗体を用いるこ とからなる、 ECDN蛋白質又は ECDN小分子蛋白質 の免疫化学的測定方法、 ( 2 1 ) 当該ポリ ク口ー ナル抗体又はモノ ク ローナル抗 体を用いて、 被検組織又は被検紬胞の免疫化学的組織染色を行い、 ECDN蛋白質又 は ECDN小分子蛋白質の細胞内分布を測定する こ とからなる細胞検査方法、 及び ( 2 2 ) 当該ポ リ ク ロ — ナル抗体又はモノ ク ロ — ナル抗体を用い、 被検組織又は 被検細胞の ECDN蛋白質又は ECDN小分子蛋白質の発現簠を剮定することからなる細 胞検査方法を提供する。
さ らに、 本発明は、 ( 2 3 ) ECDN蛋白質の有するァ ミ ノ酸配列中の、 連続して なる少なく とも 8個のア ミ ノ酸からなるペプチ ド、 及び、 ( 2 4 ) ECM小分子蛋 白質の有するァ ミ ノ酸配列中の、 連統してなる少なく とも 8個のア ミ ノ酸からな るべプチ ドを提供する。
加えて、 本発明は、 ( 2 5 ) ECDN小分子蛋白質の m R N Aに特異的にハイプリ ダィ ズする、 ア ンチセ ンス D N A又はア ンチセ ンス R N A、 ( 2 6 ) ECDN小分子 蛋白質の m R N Aを特異的に切断する リ ボザィ ム、 及び、 ( 2 7 ) 当該ア ンチセ ンス D N A、 当該ア ンチセ ン ス R N A、 あるいは、 当該リ ボザィ ムを発現する遗 伝子構築物を有効成分とする ¾伝子治療用薬剤を提供する。
本発明は、 ( 1 ) 配列番号 1 で表される蛋白質の、 全部又は一部を含むものか らなる蛋白質、 ( 2 ) 配列番号 1 で表される D N Aの、 全部又は一部を含むもの からなる D N A、 ( 3 ) E列番号 1記載の D N Aの、 全部又は一部を含むブラ ス ミ ド、 及びそれを保持する形質転換体、 ( 4 ) 配列番号 1 で表される蛋白質の製 造方法、 ( 5 ) 配列番号 1で表される蛋白質に結合する抗体、 ( 6 ) 配列番号 1 で表される D N A配列の一部を含むブライマ一又はプローブ、 及びそれを使用す ることを特徴とする遺伝子解析方法、 ( 7 ) 配列番号 1 で表される蛋白質の全部 又は一部を用いた、 結合リガン ドもしく は応答 D N Aの解析法、 及び、 ( 8 ) 列番号 1 で表される D N A E列の全部又は一部による発現べクタ一、 及び配列番 号 1 に記載の蛋白質に応答してレポーター ¾伝子の発現の亢進も しく は抑制が観 察できるように構築されたレポータープラ ス ミ ドの両者による共形質転換体を用 いた、 転写調節作用の解析法を包含する。 なお、 この場合にも、 上記蛋白質や D N Aには、 それらと実質的に同等であるものも包含される。
本発明の D N A及びその D N Aに相補的な D N Aは、 その一部をブライマ一又 はプローブとして用いることにより、 ECDN蛋白質又は ECDN小分子蛋白質の遺伝子 解析ゃ遗伝子の発現の解析に利用することができる。 ここで用いる用語 「 D N A の一部」 とは、 本発明の D N Aのヌ ク レオチ ド配列に対応する (即ち、 含まれる 又は相補的な) 、 連続する少なく とも 8個のヌ ク レオチ ド、 好ま しく は少なく と も 1 0個のヌ ク レオチ ド、 さらに好ま しく は少なく とも約 1 5〜2 5個のヌ ク レ ォチ ドの配列を意味する。 オ リ ゴヌク レオチ ド又はポ リ ヌ ク レオチ ドである本発 明のブラィマー又はプローブは、 ECDN蛋白質又は ECDN小分子蛋白質をコー ドする D N Aのヌク レオチ ド配列に対応しない少なく とも 1 個のヌク レオチ ドをも含ん でいてもよい。
本発明の蛋白貧は、 その全部又は一部をェビ トーブと して用い、 抗体の作製や、 そのような抗体を含む研究用、 診断用試薬において、 利用するこ とができる。 用 「ヱ ピ トーブ」 は、 ポ リぺブチ ドの抗原決定基を意味する。 ェ ビトーブは、 一 般に、 少なく とも 6個のァミ ノ酸残基で構成され、 6個のァ ミ ノ酸残基で構成さ れるポ リペプチ ドが抗体と結合することは、 よく知られている [ 1984年 9月 13日 発行の P C T特許出願の国際公開第 8403564号参照 (出願人: COMMONWEALTH
SERUM LABS AND GEYSEN, H. M. ) ] 。 こ こで用いる用語 「蛋白質の一部」 とは、 本発明の蛋白質のァミ ノ酸 E列に基づいて、 少なく と も 6個の連続したァ ミ ノ酸 残基、 好ま しく は少なく とも 8個の連続したァ ミ ノ酸残基、 さらに好ま しく は少 なく とも約 1 0個の連続したァミ ノ酸残基、 特に好ま しく は少なく とも約 1 5〜 2 5個の連続したァ ミ ノ酸残基からなるポリぺプチ ドを意味する。 上記ポリぺプ チ ドは、 ECDN蛋白質又は ECDN小分子蛋白質のア ミ ノ酸配列に対応しない少なく と も 1個のア ミ ノ酸残基をも含んでいてもよい。
以下に本発明を詳細に説明する。
発明の詳細な説明
( 1 ) c D N A ク ロー ンの単離
常法により、 ヒ ト胎児肺 mBNAをもとに cDNAを合成し、 一定方向にクローニ ン グ された cDNA挿入体を有する cDNAライブラ リ一を作製する。 このライブラ リーより ラ ンダムにク ロー ンを選び、 5·末端側より、 各クロー ンの ヌ ク レオチ ド配列を部 分的に決定する。 このようにして、 蚊の脂肪体組織よりク ローユ ングされたェク ジソ ン受容体のヌ ク レオチ ド配列と相同性を有するヌ ク レオチ ド配列を有する一 つのクローンを遇択する。 このように選択されたクローンが全長 cDNAを含んでい ない場合は、 当該ク ローンの cDNAをブローブと して種々の cDNAラィブラ リ一を ス ク リーユ ングし、 目的とする全長 cDNAを含むク ロー ンを得る。
( 2 ) 遺伝子の全構造の確認
上記の方法により得られた cDNAは、 配列番号 1 に記載の新規な D N A配列であ ることが確認された。 本発明者らは、 それによつてコ 一 ドされたァ ミ ノ酸配列を 有する新規な蛋白質を、 ECDN蛋白質と命名した。
同様に、 本発明者らは、 配列番号 2に記載の新規な D N A配列を有する cDNAを 得、 それによつてコー ドされたア ミ ノ酸配列を有する新規な蛋白質を、 ECDN小分 子蛋白質と命名した。
( 3 ) 組換え発現ベク ターとその形質転換体
こ こでは、 ECDN蛋白質について述べるが、 同様のことが、 ECDN小分子蛋白質に も当てはまる。
上記記載の方法により得られたヒ ト E CDN蛋白質をコー ドする D N Aあるいはそ
の断片を、 適切なベクターに組み込む。 次いで、 該ベクターを適切な宿主細胞に 移入する。 このよ うにして、 形質転換体を得ることができる。 この形質転換体を 常法により培養し、 培養物より ヒ ト ECDN蛋白質を大量に生産することができる。 さらに具体的には、 ヒ ト ECDJJ蛋白質をコー ドする D N Aまたはその断片を、 その 発現に適したべクターのプロモーター下流に、 制限酵素と D N A リガーゼを用い る公知の方法により再結合する。 このようにして、 組換え発現べクタ一を接築す ることができる。 使用できるベクターの例と しては、 大腸菌由来のプラス ミ ド PBR322及び pUC18、 枯草菌由来のブラス ミ ド pUB110、 酵母菌由来のブラス ミ ド pRB15、 バクテリ オフ ァージベクター λ gtlO及び λ gtlK 及びべクタ一 SV40が挙 げられる。 宿主内で複製、 增幅可能である限り、 ベク ターは特に限定されない。 プロモーターおよびター ミ ネータ一も、 それらがヒ ト ECDN蛋白質をコー ドする D N A配列の発現に用いられた宿主に適切である限り、 特に限定されない。 宿主 に応じて、 適切なものを組み合わせて使用できる。 用いる D N Aは、 それがヒ ト ECDN蛋白質をコ一ドする限り、 配列番号 1記載の D N A配列を有するものに限定 されない。 意図的であるか否かにかかわらず、 配列番号 1 の D N A配列の一部に おいて、 匮換、 欠損、 挿入及び Z又は付加が個々にあるいは組み合わさ って起こ つた結果得られた塩 D N AE列を有する D N Aを使用することが出来る。 また、 化学合成されたものを使用するこ とができる。
このよ うにして得られた組換え発現ベクターを、 例えばコ ン ビテ ン ト紬胞法
[ J. ol. Biol. , ϋ, 154 (1970)] 、 プロ トプラス ト法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7_5, 1929 ( 1978)] 、 リ ン酸カルシウム法 [ Sc i en ce. 22J., 551 (1983)] 、 イ ンビ ト ロ パッ ケージング法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 581 (1975)] 又はウィ ルスベクター法 [Cell. 37. 1053 (1984)] により、 宿主 に導入し、 形質転換体が得られる。 宿主と して、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細 胞、 動物細胞などのいずれも使用するこ とができる。 このよ うに して得られた形 質転換体は、 その宿主に応じて適切に選択された培地中で培養される。 培養は、 必要に応じた通気及び/'又は攪拌下に、 通常、 20〜45て、 pH5〜8の範囲内で行 われる。 行われる形質転換は、 本発明に係る ECDN蛋白質の組換え発現ベクターの みを用いて行うものに限定されない。 即ち、 ECDN蛋白質に結合しうる DNA 応答ェ
レメ ン トを含むレポ一タープラ ス ミ ドを、 ECDN蛋白質と共に用いるこ とにより、 共形質転換体を作製することができる。
( 4 ) 組換え蛋白質の分離 · 精製
培養物からの ECDN蛋白質又は ECDN小分子蛋白質の分離 · 精製は公知の分離 · 精 製法を適宜組み合わせて実施すれば良い。 これらの公知の方法と しては塩析、 溶 媒沈殿法、 透析ゲルろ過法、 電気泳動法、 ィ ォ ン交換ク 口マ ト グラ フ ィ ー、 ァフ ィ ニティ ク ロマ ト グラフ ィー、 逆相高速液体ク 口マ ト グラ フ ィ一などが挙げられ な
( 5 ) 抗体の調製
抗体は、 ECDN蛋白質の全部あるいは一部分を抗原と して用い、 通常の方法で調 製することができる。 例えば、 ポ リ ク ローナル抗体は、 マウ ス、 モルモ ッ ト、 ゥ サギ等の勦物に、 抗原の皮下、 筋肉内、 腹腔内又は静脈接種を複数回行い、 その 動物を十分に免疫し、 斯かる動物から採血し、 血清分離して作製するこ とができ る。 この処置において、 市販のアジュバン トを使用できる。
モノ ク ローナル抗体は、 例えば、 ECDN蛋白質で免疫したマウ スの脾細胞と市販 のマウ ス ミ エローマ細胞との細胞融合を行い、 それによつてハイ プリ ドーマを調 製し、 そのハイプリ ドーマを培養し、 その培養上清から抗体を分離するか、 又は、 そのハイ プリ ドーマをマウスに投与し、 そのマウ スの腹水から抗体を分離する こ とによつて調製するこ とができる。
. 抗原と して使用される ECDN蛋白質は、 必ずしも全ァ ミ ノ酸構造を有する必要は ない。 即ち、 その蛋白質の部分構造を有するぺプチ ド、 その蛋白質の変異体又は 誘導体、 あるいは他のぺプチ ドとの融合で得られた融合ぺプチ ドを使用するこ と ができる。 これらを調製する方法は重要ではなく、 生物学的又は化学合成手法で あってよい。
上記と同様の方法により、 ECDN小分子蛋白質に対する抗体も調製することがで きる。 なお、 ECDN蛋白質および ECDN小分子蛋白質を個々に分析するならば、 ECDN 小分子蛋白質には欠けている部分、 ECDN小分子蛋白質で新しく生じた部分などか ら、 適宜ェ ビ トープと して使用する部分を選択するとよい。
得られた抗体は、 ヒ ト生体試料中の ECDN蛋白質及び/又は ECDN小分子蛋白質の
同定や定量を可能と し、 例えば種々の試薬において使用され得る。 本発明の抗体 は、 必要に応じ、 F (ab' ) a、 Fab'、 Fab などのフラグメ ン トおよびそれらの誘導 体の形で使用することも可能である。 さらに、 本発明の抗体は、 キメ ラ抗体、 ヒ ト化抗体、 ヒ ト抗体と しての応用も可能である。 これらのフラグメ ン ト及び抗体 は、 全て本発明の抗体の概念に包含される。
ECDN蛋白質又は ECDN小分子蛋白質の免疫学的測定は、 公知の方法に従って行え ばよく、 例えば、 蛍光抗体法、 受身凝集反応法及び酵素抗体法のうちのいずれか によつて実施され得る。
( 6 ) ¾伝子およびその発現の解析
本発明に係る ECDN蛋白質又は ECDN小分子蛋白質をコー ドする遗伝子の変異は、 その蛋白質をコ一 ドする D N Aの制限酵素断片からなるプローブを使用して、 あ るいは、 その蛋白質をコー ドする D N Aから、 適切な位置のヌク レオチ ド配列を 適宜選択し、 それを用いて合成することによって得られたオ リゴヌク レオチ ドを ブライマーとして用いることにより、 解析され得る。
試料遗伝子中の挿入、 欠失などの異常も、 上記解析により検知され得る。
この ECM蛋白質をコー ドする D N Aを含むブラス ミ ドを保有する Escher i ch i a col i DH5 a /pFATSR は、 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、 寄託 番号 FERM BP-4769と して、 1994年 8月 4 日に寄託された。
( 7 ) ECDN蛋白質への結合物質および応答 DNA の解析
ここでは、 ECDN蛋白質について述べるが、 同様のことが、 ECDN小分子蛋白質に も当てはまる。
上記 ( 3 ) で調製された ECDN蛋白質を発現できる形質転換体を、 一定期間培養 する。 その後、 その形質転換細胞から発現された ECDN蛋白質を、 分離 · 回収する c 培養条件下で ECDN蛋白質を含有する画分に結合している リ ガン ドの構造は、 抽出 法、 HPLC、 マススぺク トロメ ト リー、 核磁気共鳴法などの公知の方法を組合わせ ることにより、 決定できる。 リ ガン ドの構造を明らかとした後、 形質転換体から 得られた粗抽出物もしく は単離 · 精製された ECDN蛋白質を、 標識リガン ドと共に 用い、 レセブター結合試験を行う。 このようにして、 ECDN蛋白質に結合しうる天 然もしく は合成誘導体をスク リーユングすることができる。
ECDN蛋白質が結合する応答 DNA は、 形質 換体から得られた粗抽出物もしく は 単離 ·精製された ECDN蛋白質を、 同位体もしく はピオチ ンなどの非同位体で標識 されたォ リ ゴヌ ク レオチ ドと共に用い、 ゲル · シフ ト法などの公知の ΜΑ 結合試 験によって解析され得る。
( 8 ) レポーターブラ ス ミ ドとの共形質転換体を用いた転写調節作用の解析
こ こでは、 ECDN蛋白質について述べるが、 同様のこと力 ECDN小分子蛋白質に も当てはま る。
ECDN蛋白質も し く は公知のステ ロ イ ドホルモ ン受容体様蛋白質類縁体の結合す る DNA 配列を、 SV40やサイ ト メガロウイルス由来のプロモータ一、 酵母の発現プ 口モータ一等の上流に組み込み、 一方、 プロモーター下流には、 例えばク ロ ラ ム フ エ ニ コ一ノレ ' ァセチル ト ラ ンス フ ェ ラ ーゼ、 胎盤型アルカ リ フ ォ ス フ ァ タ一ゼ、 ルシ フユ ラ一ゼ又は LacZのレポータ一遗伝子を挿入し、 レポータープラ ス ミ ドを 構築する。 ECM蛋白質発現ベクター、 又は ECDN蛋白質の D N A結台 ドメ イ ンが公 知のステロイ ドホルモン受容体様蛋白質の D N A結台 ドメ イ ンで置換されてなる キメ ラ ECDN蛋白質の発現べク タ一を、 レポーターブラ ス ミ ドあるいは他のステロ ィ ドホルモ ン受容体様蛋白質発現べク タ―と共に、 酵母、 昆虫細胞も し く は動物 細胞に導入し、 共形質転換体を得る。 このような形質転換体内で発現した ECDN蛋 白質の場合、 ECDN蛋白質そのものあるいはその複合体力;、 同時に発現された他の 受容体蛋白質もし く は細胞内の蛋白質と相互作用し、 このように してレポーター ブラ ス ミ ドに結合し、 その結果、 レポーター遗伝子の転写に影響を及ぼす。 レ ポータ一遺伝子の転写を介したレポーター遗伝子産物の発現は、 レポータ一遗伝 子産物に特異的な反応によって検出可能である。 こ う した転写調節能を解析する 方法を用いて、 例えば ECDN蛋白質を介した転写調節作用を有する物質をス ク リ ー ユングする こ とが可能となる。
( 9 ) 瘙細胞における ECDN小分子蛋白質の発現
実施例 9以下に示される如く、 坑 ECDN抗体を用いるウ ェ ス タ ン ' ブロ ッ テイ ン グ法及び RT-PCR法による、 各種癌細胞株および癌組織の解析の結果、 本発明者ら は、 各種癌細胞株および癌組織において、 約 40 kDaの ECDN小分子蛋白質が癌特異 的に発現していることを見い出した。 この ECDN小分子蛋白質をコ一ドする D N A
のヌ ク レオチ ド配列を確認した結果、 配列番号 1記載の配列中、 塩基番号 387 〜 677 部分が欠失したものであることが判明した。 さらに、 この ECDN小分子蛋白質 が、 細胞の核小体に蓄積していることが、 免疫組織染色により確認された。
このことは、 癌の進展と ECDN小分子蛋白質の生成に、 非常に高い相関性がある こ とを示唆するものである。 従って、 被検細胞ゃ被検組織での ECDN蛋白質及び ECDN小分子蛋白質の ¾伝子解析や細胞内分布を検査するこ とによ り、 正常細胞と 癌細胞との識別が可能となる。
遗伝子解析は、 ECDN蛋白質又は ECDN小分子蛋白質をコー ドする D N Aのヌ ク レ ォチ ド配列の一部からなる D N A配列を有するプロ—ブ又はブライマ ーを用いて、 被検組織の D N A又は m R N Aを測定することによって行う。 プローブ又はブラ イマ一の D N AE列は、 ECDN蛋白質をコ— ドする D N Aの ヌク レオチ ド配列にお ける、 ECM小分子蛋白質では欠失している部位を考慮して 目的に応じて適宜選 択するこ とができる。 被検組織の D N A又は m R N Aの刺定は、 公知の方法に準 じて実施するこ とができる。
ECDN蛋白質及び ECDN小分子蛋白質の则定に、 抗体を使用することも可能である。 抗体調製用の抗原 (ェ ビトープ) は、 両蛋白質の共通部分、 ECDN小分子蛋白質に おける欠失部位、 欠失後の ECDN小分子蛋白質の結合部位 (配列番号 2に記載のァ ミ ノ酸番号 61位付近を含む部分) などの中から逋宜選択するとよい。 このような 部位を抗原と して用いて調製された抗体を、 各々使い分けることも可能である。
( 1 0 ) 医学への応用
ECDN蛋白質を介して転写調節に作用する物質の中には、 前骨髄球性白血病にお ける al卜 trans retinoic acid のように、 ECDN蛋白質の正常の機能を刺激するこ とにより、 ECDN小分子蛋白質を発現する腫瘊細胞の正常細胞への分化を導いたり、 当該腫瘍細胞の異常増殖の抑制をもたらす物質が見いだされることが期待できる。 また、 ECDN小分子蛋白質の mRNAに特異的にハイブリ ダィ ズするア ンチセ ン ス核 酸 ( D N A又は R N A ) やリボザィムを用いて、 腫瘻における ECDN小分子蛋白質 の発現を抑制するこ とによ り、 腫癀細胞の異常増殖を抑制することが期待でき る。 更に、 ECDN小分子蛋白質の mRNAに特異的にハイブリダィ ズするア ンチセ ン ス R N Aゃリ ボザィ ムを発現する ¾伝子構築物を、 腫瘻に導入することによ つて も、
同様の効果が期待できる。 他の物質 (ア ンチセ ンス R N Aやリボザィ ム) がそこ に特異的にハイブリダィ ズする、 ECDN小分子蛋白質の mRNAの部位としては、 ECDN 蛋白質のヌ ク レオチ ド S列から塩基の欠失が生じ、 結合した部位、 即ち、 配列番 号 2 に記載の ECDN小分子蛋白質をコー ドする ヌ ク レオチ ド配列の塩基番号 387 位 付近を含む部分、 が掲げられる。
ECDN小分子蛋白質の mRNA又は ECDN小分子蛋白質の発現を、 適当なプラ イマ-、 プロ―ブ又は抗体を用いて検出するこ と によ り、 正常組蛾では見られない ECDN小 分子蛋白質の発現を抑制する物質を、 スク リ ー ニ ングする ことができる。
ヒ ト ECDU蛋白質又は該蛋白質をコー ドする D N Aの全部又は一部を含む D N A を用いて、 本発明のヒ ト ECDN蛋白質の転写調節作用ゃ該蛋白質をコー ドする遺伝 子そのものを解析し、 この受容体蛋白質に特異的に結合できる天然および合成化 合物を解析するこ と によ り、 新たな治療薬、 診断薬、 予防薬が発明されるこ とが 期待される。 更に、 被検組辙における、 ECDN蛋白質及び ECDN小分子蛋白質の発現 の検出や、 ECDN蛋白質及び ECDN小分子蛋白質の遗伝子の解析の、 癌の診断、 治療 への応用が期待される。
図面の簡単な説明
図 1 は、 大腸癌組織及び乳癌組繳 (T ) 、 及びそれら各々に対応する正常組織 ( N ) における、 抗 ECDN蛋白質モノ クローナル抗体を用いたウ ェ ス タ ン ' プロ ッ テ ィ ングの結果を示す。
図 2 は、 正常組織及び癌細胞株のそれぞれの mRNAについての、 R T - P C Rの 結果を示す。 R T— P C Rの際には、 それぞれ配列番号 6及び 7 に示すヌ ク レオ チ ド配列を有するブラィマーを使用した。
実施例
本発明を詳細に且つ具体的に更に説明するために、 但し、 本発明を限定するた めではなく、 以下の実施例を示す。
(実施例 1 ) ヒ ト cDNAラ イ ブラ リ ーの作製
ヒ ト胎児肺および乳腺 mRNA ( C l on tech社より購入) をもとに、 cDNAを台成し、 Uni -ZAP XRべクターキッ ト ( St ratagene社より購入) を用い、 一定方向にク 口一 ユ ングされた cDNA挿入体をそれぞれ有する cDNAラ イ ブラ リ ーを作製した。
(実施例 2 ) ク ローンの選択
上記実施例 1 で作製された ヒ ト胎児肺 cDNAライ ブラ リーより、 ク ロー ンをラ ン ダムに選び、 各ク ローンのヌ ク レオチ ド配列を、 5·末端側より部分的に決定した c これらのヌク レオチ ド £列を、 FASTA アルゴリ ズ厶を用いてデータ · ベース中の 既知の配列と比較したところ、 昆虫のヱク ジソ ン受容体の配列と相同性を有する ヌ ク レオチ ド配列を有する一つのクロー ン L1-1793 を見出した。
(実施例 3 ) 全長 cDNAのクローニング
ク ローン L1-1793 は、 全長ク ローンではなかったので、 ク ローン L1- 1793 の cDNA挿入体を、 " Pを用い、 ラ ンダム · ブライ ム ' ラベリ ング法 [Feinberg. et al. , Anal. Biochem.. 132., 6 (1983)] により標識し、 ハイブリ ダィゼー シヨ ン 法による種々の cMAラィ ブラ リーのスク リーニングにおいて、 プローブと して用 いた。 その結果、 ヒ ト乳腺 cDNAラ イ ブラ リーよ り、 全長 cDNAを含むク ローンが得 られた。 このク ローンの構造解析の結果、 このク ロー ンは、 205 bpの 5'非翻訳領 域、 1386bpのコーディ ング領域及び 388bpの 3·非翻訳領域を含む 1979bpよりなる 新規な D N Aヌク レオチ ド配列を有することを確認した (配列番号 1参照) 。 こ の c D N Aの配列に含まれるオープン ' リーディ ング · フ レームは、 461 ァ ミ ノ 酸よりなる新規な蛋白質 (ECDN蛋白質、 配列番号 1参照) をコー ドしていた。
(実施例 4 ) ECDN蛋白質をコー ドする遗伝子の各種ヒ ト組織での発現
上記実施例 3で得た c D N Aク ロー ン (配列番号 1参照) の D N A挿入体を、 で標識し、 各種ヒ ト組織 nRNAのノーザン ' プロッ ト解析にて、 プロ—ブと し て用いた (ノーザン ' ブロッ ト解析用のキッ トは、 Clontech社より購入した) 。 その結果、 検討した全ての組織、 即ち、 脳、 心臓、 S朦、 肝職、 肺、 睇臓、 胎盤、 骨格筋、 大腸、 末梢血白血球、 卵巣、 前立腺、 小腸、 脾臓、 睾丸及び胸腺、 にお いて、 約 2 Kbの大きさを有する nRNAバン ドの形で、 発現が認められた。
(実施例 5 ) ECDN蛋白質の構造上の特徴
列番号 1 に記載されたヌ ク レオチ ド配列の、 塩基 20S 番から塩基 1591番まで の配列に対応するオープン · リーディ ング ' フ レームから演繹された、 列番号 1 に記載のア ミ ノ酸配列を有する ECM蛋白質は、 461 ア ミ ノ酸よりなる新規な蛋 白質である。 残基 87番から残基 152 番の範囲 (即ち、 66残基) のァ ミ ノ酸配列は、
ス テ ロ イ ドホルモ ン レセブター様蛋白質群に特徴的な二つの亜鉛フ ィ ンガ一を保 持しており、 かつ、 ヱ ク ジソ ン受容体、 レチ ノ イ ン酸受容体、 甲状腺ホルモ ン受 容体等の受容体蛋白質の DNA 結合ドメィ ンの配列との相同性が高い。 ァ ミ ノ酸配 列中の 243 番のア ミ ノ酸より C末端の 461 番のア ミ ノ酸までの 219 残基は、 ェク ジソ ン受容体並びにレチノィ ン酸受容体の C末端側に存在する リ ガン ド結合 ドメ ィ ンの配列との相同性が高く、 本蛋白質のリガン ド桔台部位に相当している。 (実施例 6 ) 組換え ECDN蛋白質発現ベク ターの構築
配列番号 1 に記載された ECDN蛋白質をコ― ドするヌ ク レオチ ド配列を含む cDNA を鋅型として用いて、 PCR 法により、 その蛋白質コ一ディ ング領域を含む部分配 列を増幅した。 次の配列を、 プライマー用に選択した。
プラ イマー 1 : 5' -GACGGATCCATGTCCTCTCCTACCACGAGTT-3' ( コーデ ィ ング鎖、 配列番号 1 の塩基番号 206 から塩基番号 227 の範囲の K列に相当、 配列番号 3 に 記載) 。
プラ イマー 2 : 5" -CTAGAATTCGGAGGGTGGTCAGGCAAGGC-3" (ア ンチセ ン ス鎖、 E列番号 1 において、 逆向きに塩基番号 1634から塩基番号 1615の範囲のア ンチセ ンス鎮に相当、 配列番号 4に記載) 。
プラ イマー 1 は、 5'末端に、 付加された BamHI 切断部位を、 一方、 ブラ イ マ一 2は、 5'末端に、 付加された EcoRl 切断部位を有する。 PCR 産物を、 BamHl 及び EcoRl で切断した。 得られた断片を、 予め BaraHI と EcoRI で切断しておいた発現 ベクター PGEX-2T (Pharmacia社より購入) に挿入し、 それによつて、 発現プラ ス ミ ド pGST-FATSRを構築した。 ブラス ミ ド pGST-FATSRを用いて、 E.coli DH5aを形 質転換させ、 得られた形質転換体を、 ア ン ビシ リ ン耐性を基に選択するこ と によ り、 グルタ チオ ン— S—ト ラ ンス フ ユ ラ 一ゼと ECDN蛋白質との融台蛋白質を発現 できる形質転換体を得た。
(実施例 7 ) 組換え ECDN蛋白質の発現と精製
実施例 6で得られた形質転換体を培養し、 得られた培養物より、 組換え ECDN融 合蛋白質を抽出 · 精製した。
即ち、 形質転換体を、 100 mlの LB培地 (IX peptone^ 0.5¾ yeast extract及び 1% NaCl ) 中で、 37てにて一晚振とうするこ と によ り、 培養した。 得られた培養
液を、 予め 37°Cに加温してある LB培地で 10倍に希釈し、 得られた希釈物を、 37°C にて 30〜90分間、 更に培養し、 対数増殖期の培養物を得た。 培養物 1 に、 その 終 度力 1 mMと るよ.うに、 Isopropyl y9— D-thiogalactopyranosideを添加し、 その後 3〜4時間培養した。 培養物を遠心分離し、 菌体細胞を分離した。 発現 ベク タ一 pGST-FATSRによ つて形質転換された菌体細胞に、 10 mlのカ ラ ム . バッ フ ァ ー (150mM NaCK 16mM Na,HP0«及び 4mM NaH,P04、 pH7.3) を加え、 その後超 音波処理を行った。 細胞破砕によって得られた上清可溶画分を、 グルタ チオ ン - セフ ァ ロ一 ス 4B力 ラ ム (Pharmacia 社よ り購入) にかけた。 カ ラ ムをカ ラ ムノ'ッ フ ァーで洗浄し、 その後、 5 πιΜの還元型グルタ チオ ンを含む溶出液を用いて、 溶 出を行った。 SDS ポリ アク リルァ ミ ド電気泳動法で、 溶出画分を解析、 分画した。 その結果、 プラ ス ミ ド pGST-FATSRを用いて構築した形質転換体から、 所望の約 75 kDa の GST 融合蛋白質が主要バン ドと して検出される画分が得られた。
(実施例 8 ) モ ノ ク ロ —ナル抗体及びポリ ク 口—ナル抗体の調製
実施例 7 で得られた組換え GST 融合蛋白質を、 免疫抗原、 抗体精製 . ス ク リ ー ニ ング用抗原、 測定用標準抗原と して用いた。
抗 ECDN蛋白質特異的モノク ローナル抗体は、 GST融合蛋白質でマウ スを免疫し て調製した。 即ち、 GST融合蛋白質の P B S溶液 (濃度: 500-1000 g/ml) を、 完全ァジュ バン ト と、 1 : 1 の割合で混合した。 得られた混合物を、 マ ウ スの腹 腔内に、 100 gノ匹にて 2週間隔で 3回投与し、 マウ スを免疫した。 免疫終了後、 P3U1細胞と当該マウ スの B細胞とのハイプリ ドーマを PEG-15.000を用いて作製し た。 当該ハイ プリ ドーマを培養し、 その培養上淸中の抗体価をモニ タ ー し、 抗 ECDN蛋白質特異的抗体を産生するハイブリ ドーマの選択を行った。
抗体価の測定は、 次のようにして行った。 即ち、 先ず、 実施例 7で得た GST融 合蛋白質 ( 1 g/ffll) を、 ポ リ ス チ レン製カ ブに固相化した。 そのカ ツプに、 培養上清 100 1を加え、 第一反応を行わせた。 カ ップを洗浄し、 次いで、 カ ッ プ に抗マ ウ ス IgG-HRP (Horse-raddish peroxidase ) を加え、 第二反応を行わせた。 カ ッ プを洗浄し、 次いで、 そのカ ップに、 酵素基質溶液 [過酸化水素水と ABTS ( 2 , 2 ' 一 ア ジノ ー ビス ( 3 — ェチルベンゾチアゾ リ ンー 6 — スルホ ン酸) の 混合液] を添加し、 発色反応 (第三反応) を行わせ、 それをモニ ター した。
選択されたハイ プリ ドーマを、 9 6 ウェルマルチプレー トにて培養し、 その後 H A T通択に供した。 培養開始から約 2週間後に、 培養上清中の抗体価を測定し、 抗原と特異的に反応する抗体を産生するクローンを選択した。 更にク ローニング 操作を行い、 1 ク ローン (F1D5) を抗体産生ハイ ブリ ドーマと して樹立した。 得られたハイプリ ドーマ細胞 300万個の各々を、 その接種の約 1週間前にプリ スタ ン 0. 5mlを腹腔内に投与しておいた BALB/c マウ スの腹腔内に接種し、 接 種の 8〜 1 0 日後に、 腹水を採取した。 プロティ ン G カ ラ ムを用いたァフ ィ 二 ティーク ロマ ト グラフ ィーで、 各腹水より抗体を精製した。
ポ リ ク ローナル抗体の作製は、 次のよ うにして行つた。 配列番号 1 に記載の ECDN蛋白質のァ ミ ノ酸配列から、 ァ ミ ノ酸番号 245 からア ミ ノ酸番号 260 の範囲 の配列を選択した。 このように避択された配列を有するぺプチ ドを化学合成し、 抗原と した (配列番号 5 ) 。 この抗原と Key Halle Limpetとの複合体を調製した 後、 当該複合体を、 完全アジュバン トと共に、 ゥサギのフ ッ トパッ ドに約 2週間 おきに 4回接種し、 動物を免疫し、 このよう に して抗体を作製した。 免疫の各 段階において、 採血された血清の抗体力価は、 ELI SA 法にて剮定した。 即ち、 抗原べプチ ドでコ — トされたマイ ク ロブレー ト にゥサギの血清を添加し、 それを 抗原べプチ ドと室温で 2時間反応させた。 マイ クロプレー ト洗浄後、 ヮサ ビペル ォキシダ—ゼ摞識したャギ抗ゥサギ G 抗体をそれに添加した。 室温で 1 時間 反応させ、 かつ、 洗浄した後、 酵素基質液を加え、 発色させた。 その後、 吸光度 (A . o) を測定した。 その結果、 血清の 10, 000倍希釈液を使用して、 各々 0.097〜0.398の吸光度を示す抗血清 5 口 ッ トを得た。
(実施例 9 ) ウェスタ ン ' ブロ ッテイ ング
実施例 8で作製したモノ ク ローナル抗体を用いて、 各種組織における ECDN蛋白 質の存在形態を、 常法に従い、 ウェスタ ン ' プロ ッテ ィ ング法にて解析した。 その結果、 正常組織では、 約 50kDaUon (kDa) の正常の ECDN蛋白質が認められ たのに対し、 大腸癌細胞株、 食道癌細胞株及び Hela細胞株では、 約 40kDaの ECDN 小分子蛋白質のォー バ — · ェク スプレツ ショ ンが認められた。 次いで、 乳癌組織、 大腸癌組織及びそれらの癌患者の正常組織を用い、 同様に ECDN蛋白質及び ECDN小 分子蛋白質の発現を検討した。 その結果、 大腸癌の 7例中 3例、 乳癌の 9例中 6
例において、 約 40 kDaの ECDN小分子蛋白質が癌組織特異的に発現しており、 かつ、 それらの癌組織では、 正常の ECDN蛋白質の発現が减少しているのが認められた (図 1参照) 。
これらの結果は、 分子量の小さい ECDN小分子蛋白質が、 癌の進展に従って生成 されることを示唆するものであり、 従って、 抗体によるこの異常蛋白質 (ECDN小 分子蛋白質) の検出が、 癌細胞の検査に応用できることをも示すものである。 (実施例 1 0 ) R T— P C Rの実験
このよ うな ECDN小分子蛋白質が生成するメ力二ズムを調べるために、 5種類の 大腸癌細胞株、 6種類の食道瘙細胞株及び正常組織から mRNAを分離して、 RT-P CR 実験を行った。
常法に従って、 mRNAから一本鎮 cDNAを合成した。 3組のブライマ—セ ッ ト (そ れぞれ配列番号 6 と 7 に記載の配列、 E列番号 8 と 9に記載の配列、 配列番号 1 0 と 1 1 に記載の S列、 E列番号 1 に記載の塩基番号によれば、 配列番号 6は塩 基番号 206から塩基番号 227のセ ンス D N A、 配列番号 7 は塩基番号 733から塩 基番号 753のア ンチセ ンス D N A、 配列番号 8は塩基番号 700から塩基番号 7 25 のセ ンス D N A、 配列番号 9は塩基番号 1 2 2 6から塩基番号 1 2 4 4のァンチセ ンス D N A、 配列番号 1 0 は塩基番号 1205から塩基番号 1226のセ ンス D N A、 配列番 号 1 1 は塩基番号 161 5から塩基番号 1 634のア ンチセ ンス D N Aに相当する。 ) を 用いて、 コーディ ング領域の互いに重なり合う 3つのセグメ ン トを、 P C R法で 增幅した。 その結果、 5'末端側のセグメ ン ト及び 3 '末端側のセグメ ン トは、 いず れの癌細胞株に由来する増幅産物も、 正常組織に由来する増幅産物と比較して、 サイ ズの違いは認められなかった。 しかしながら、 中央部のセグメ ン トを增幅し た時には、 正常サイ ズの増幅産物に加え、 正常組織由来の増幅産物では認められ ないより短い増幅産物が、 癌細胞株に由来する増幅産物と して、 1 1種全てにお いて認められた (図 2参照) 。
こ の短く なつた增幅産物の D N A 列を決定したところ、 ECM蛋白質をコ一ド する D N Aにおける、 第 7ヱク ソ ンの 29 1 個の塩基 (E列番号 1 の塩基番号 387 から塩基番号 677に相当する部分) が欠損して短くなっていることが判明した。 この結果より、 癌細胞特異的なバリア ン ト mRNAは、 D N A結合ドメ イ ンの 97ア ミ
ノ酸を失った約 40kDaの蛋白質をコー ドしているものと推察された。 このことか ら、 R T - P C R法、 ハイ ブリ ダィ ゼ— シ ョ ン法などの手法を用い、 上記バリア ン ト mRNAを検出することにより、 癌細胞を検出できることが期待される。
(実施例 1 1 ) 免疫組織化学分析
RT-PCR実験の結果とウェスタ ン ' プロ ッティ ングの結果の比較から、 D N A結 合ドメイ ンを欠く ECDN小分子蛋白質が、 ¾細胞株には蓄積しているものと予想さ れた。 この異常蛋白質が細胞質に存在するか、 又は核に存在するかを検討するた め、 モノ ク ローナル抗体を用いて各種細胞株の免疫染色を行った。
その結果、 正常組織では細胞全体にわずかな染色が認められたのに対し、 癌細 胞株では、 核小体 (nuc l eol i ) における大量の抗 ECM抗体と結合する蛋白質の蓄 積を示唆する結果が得られた。 実施例 9 のウェスタ ン ' ブロ ッテ イ ングの結果か ら、 癌細胞株には、 大量の約 40 kDa の ECDN小分子蛋白質が発現されていることが 明らかであるから、 この核小体蓄積蛋白質は、 ECDN小分子蛋白質と予測された。 以上のことから、 抗体を用いて異常蛋白質 (ECDN小分子蛋白質) の核小体への蓄 積の有無を検査するこ とによって、 正常細胞であるか癌細胞であるかの同定を行 い得ることが期待される。
配列表 配列番号 : 1
配列の長さ : 1 9 7 9
列の型 : 核酸
鎮の数 : ニ本繽
ト ポ ロ ジー : 直鎮状
配列の種類 : cDNA to nRNA
源
生物名 : ホモサ ピエ ンス
直接の起源
ラ イ ブラ リ一名 : ヒ ト乳腺 c DNAラ イ ブラ リ一
特徴
特徴を表す記号 : C D S
存在位置 : 2 0 6. . 1 5 9 1
特徴の決定: 実験
配列の記述
TTTTGAGGGT ATTTGAGTAG CGGCGGTGTG TCAGGGGCTA AAGAGGAGGA CGAAGAAAAG 60 CAGAGCAAGG GAACCCAGGG CAACAGGAGT AGTTCACTCC GCGAGAGGCC GTCCACGAGA 120 CCCCCGCGCG CAGCCATGAG CCCCGCCCCC CGCTGTTGCT TGGAGAGGGG CGGGACCTGG 180 AGAGAGGCTG CTCCGTGACC CCACC ATG TCC TCT CCT ACC ACG AGT TCC CTG 232
Met Ser Ser Pro Thr Thr Ser Ser Leu
1 5
GAT ACC CCC CTG CCT GGA AAT GGC CCC CCT CAG CCT GGC GCC CCT TCT 280 Asp Thr Pro Leu Pro Gly Asn Gly Pro Pro Gin Pro Gly Ala Pro Ser 10 15 20 25
TCT TCA CCC ACT GTA AAG GAG GAG GGT CCG GAG CCG TGG CCC GGG GGT 328 Ser Ser Pro Thr Val Lys Glu Glu Gly Pro Glu Pro Trp Pro Gly Gly
30 35 40
CCG GAC CCT GAT GTC CCA GGC ACT GAT GAG GCC AGC TCA GCC TGC AGC 376
Pro Asp Pro Asp Val Pro Gly Thr Asp Glu Ala Ser Ser Ala Cys Ser
45 50 55
ACA GAC TGG GTC ATC CCA GAT CCC GAA GAG GAA CCA GAG CGC AAG CGA 424
Thr Asp Trp Val He Pro Asp Pro Glu Glu Glu Pro Glu Arg Lys Arg
60 65 70
AAG AAG GGC CCA GCC CCG AAG ATG CTG GGC CAC GAG CTT TGC CGT GTC 472
Lys Lys Gly Pro Ala Pro Lys Met Leu Gly His Glu Leu Cys Arg Val
75 80 85
TGT GGG GAC AAG GCC TCC GGC TTC CAC TAC AAC GTG CTC AGC TGC GAA 520
Cys Gly Asp Lys Ala Ser Gly Phe His Tyr Asn Val Leu Ser Cys Glu
90 95 100 105
GGC TGC AAG GGC TTC TTC CGG CGC AGT GTG GTC CGT GGT GGG GCC AGG 568
Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Val Val Arg Gly Gly Ala Arg
110 115 120
CGC TAT GCC TGC CGG GGT GGC GGA ACC TGC CAG ATG GAC GCT TTC ATG 616
Arg Tyr Ala Cys Arg Gly Gly Gly Thr C s Gin Met Asp Ala Phe Met
125 130 135
CGG CGC AAG TGC CAG CAG TGC CGG CTG CGC AAG TGC AAG GAG GCA GGG 664
Arg Arg Lys Cys Gin Gin Cys Arg Leu Arg Lys Cys Lys Glu Ala Gly
140 145 150
ATG AGG GAG CAG TGC GTC CTT TCT GAA GAA CAG ATC CGG AAG AAG AAG 712
Met Arg Glu Gin Cys Val Leu Ser Glu Glu Gin I le Arg Lys Lys Lys
155 160 165
ATT CGG AAA CAG CAG CAG CAG GAG TCA CAG TCA CAG TCG CAG TCA CCT 760 lie Arg Lys Gin Gin Gin Gin Glu Ser Gin Ser Gin Ser Gin Ser Pro
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SIZ OTZ SOZ
19 niO 13 nio ID J8S 13 "13 19 ηΐθ -i^S 10 19 01d 9S8 丄 33 OVO 000 VVO OOD 3:)丄 333 OVO OOV 300 VOO OVO 丄:)丄 V33 丄;) ί) 丄 33
ΟΟΖ S6I 061
J9S ειν 13 OJJ Χ{0 J8S ¾I J8S -las J^S J8S 13 "TO OJJ Λΐο ΙΒΛ
908 331 100 000 丄 33 000 丄)丄 330 V01 OOV ODV OOV 300 OVO 033 000 010 6I0/S6df/X3d WC60/96 O/A
TTG AAG GAC TTC ACC TAC AGC AAG GAC GAC TTC CAC CGT GCA GGC CTG 1240
Leu Lys Asp Phe Thr Tyr Ser Lys Asp Asp Phe His Arg Ala Gly Leu
330 335 340 345
CAG GTG GAG TTC ATC AAC CCC ATC TTC GAG TTC TCG CGG GCC ATG CGG 1288
Gin Val Glu Phe He Asn Pro lie Phe Glu Phe Ser Arg Ala Met Arg
350 355 360
CGG CTG GGC CTG GAC GAC GCT GAG TAC GCC CTG CTC ATC GCC ATC AAC 1336
Arg Leu Gly Leu Asp Asp Ala Glu Tyr Ala Leu Leu lie Ala lie Asn
365 370 375
ATC TTC TCG GCC GAC CGG CCC AAC GTG CAG GAG CCG GGC CGC GTG GAG 1384 lie Phe Ser Ala Asp Arg Pro Asn Val Gin Glu Pro Gly Arg Val Glu
380 385 390
GCG TTG CAG CAG CCC TAC GTG GAG GCG CTG CTG TCC TAC ACG CGC ATC 1432
Ala Leu Gin Gin Pro Tyr Val Glu Ala Leu Leu Ser Tyr Thr Arg He
395 400 405
AAG AGG CCG CAG GAC CAG CTG CGC TTC CCG CGC ATG CTC ATG AAG CTG 1480
Lys Arg Pro Gin Asp Gin Leu Arg Phe Pro Arg Met Leu Met Lys Leu
410 415 420 425
GTG AGC CTG CGC ACG CTG AGC TCT GTG CAC TCG GAG CAG GTC TTC GCC 1528
Val Ser Leu Arg Thr Leu Ser Ser Val His Ser Glu Gin Val Phe Ala
430 435 440
TTG CGG CTC CAG GAC AAG AAG CTG CCG CCT CTG CTG TCG GAG ATC TGG 1576
Leu Arg Leu Gin Asp Lys Lys Leu Pro Pro Leu Leu Ser Glu lie Trp
445 450 455
GAC GTC CAC GAG TGAGGGGCTG GCCACCCAGC CCCACAGCCT TGCCTGACCA 1628 Asp Val His Glu
460
CCCTCCAGCA GATAGACGCC GGCACCCCTT CCTCTTCCTA GGGTGGAAGG GGCCCTGGGC 1688
CGAGCCTGTA GACCTATCGG CTCTCATCCC TTGGGATAAG CCCCAGTCCA GGTCCAGGAG 1748
GCTCCCTCCC TGCCCAGCGA GTCTTCCAGA AGGGGTGAAA GGGTTGCAGG TCCCGACCAC 1808 TGACCCTTCC CGGCTGCCCT CCCTCCCCAG CTTACACCTC AAGCCCAGCA CGCAGTGCAC 1868 CTTGAACAGA GGGAGGGGAG GACCCATGGC TCTCCCCCCT AGCCCGGGAG ACCAGGGGCC 1928 TTCCTCTTCC TCTGCTTTTA TTTAATAAAA ACTAAAAACA GAAAAAAAAA A 1979 配列番号: 2
配列の長さ : 1 6 8 8
配列の型: 核酸
鎖の数: 二本鎖
ト ポ ロ ジー : 直鎮状
ΘΞ列の種類 : cDNA to nRNA
起源
生物名 : ホモサ ピエ ンス
E列の記述
TTTTGAGGGT ATTTGAGTAG CGGCGGTGTG TCAGGGGCTA AAGAGGAGGA CGAAGAAAAG 60 CAGAGCAAGG GAACCCAGGG CAACAGGAGT AGTTCACTCC GCGAGAGGCC GTCCACGAGA 120 CCCCCGCGCG CAGCCATGAG CCCCGCCCCC CGCTGTTGCT TGGAGAGGGG CGGGACCTGG 180 AGAGAGGCTG CTCCGTGACC CCACC ATG TCC TCT CCT ACC ACG AGT TCC CTG 232
Met Ser Ser Pro Thr Thr Ser Ser Leu
1 5
GAT ACC CCC CTG CCT GGA AAT GGC CCC CCT CAG CCT GGC GCC CCT TCT 280 Asp Thr Pro Leu Pro Gly Asn Gly Pro Pro Gin Pro Gly Ala Pro Ser 10 15 20 25
TCT TCA CCC ACT GTA AAG GAG GAG GGT CCG GAG CCG TGG CCC GGG GGT 328 Ser Ser Pro Thr Val Lys Glu Glu Gly Pro Glu Pro Trp Pro Gly Gly
30 35 40
CCG GAC CCT GAT GTC CCA GGC ACT GAT GAG GCC AGC TCA GCC TGC AGC 376 Pro Asp Pro Asp Val Pro Gly Thr Asp Glu Ala Ser Ser Ala Cys Ser
45 50 55
ACA GAC TGG GGC GTC CTT TCT GAA GAA CAG ATC CGG AAG AAG AAG ATT 424
Thr Asp Trp Gly Val Leu Ser Glu Glu Gin lie Arg Lys Lys Lys lie
60 65 70
CGG AAA CAG CAG CAG CAG GAG TCA CAG TCA CAG TCG CAG TCA CCT GTG 472
Arg Lys Gin Gin Gin Gin Glu Ser Gin Ser Gin Ser Gin Ser Pro Val
75 80 85
GGG CCG CAG GGC AGC AGC AGC TCA GCC TCT GGG CCT GGG GCT TCC CCT 520
Gly Pro Gin Gly Ser Ser Ser Ser Ala Ser Gly Pro Gly Ala Ser Pro
90 95 100 105
GGT GGA TCT GAG GCA GGC AGC CAG GGC TCC GGG GAA GGC GAG GGT GTC 568
Gly Gly Ser Glu Ala Gly Ser Gin Gly Ser Gly Glu Gly Glu Gly Val
110 115 120
CAG CTA ACA GCG GCT CAA GAA CTA ATG ATC CAG CAG TTG GTG GCG GCC 616
Gin Leu Thr Ala Ala Gin Glu Leu Met lie Gin Gin Leu Val Ala Ala
125 130 135
CAA CTG CAG TGC AAC AAA CGC TCC TTC TCC GAC CAG CCC AAA GTC ACG 664
Gin Leu Gin Cys Asn Lys Arg Ser Phe Ser Asp Gin Pro Lys Val Thr
140 145 150
CCC TGG CCC CTG GGC GCA GAC CCC CAG TCC CGA GAT GCC CGC CAG CAA 712
Pro Trp Pro Leu Gly Ala Asp Pro Gin Ser Arg Asp Ala Arg Gin Gin
155 160 165
CGC TTT GCC CAC TTC ACG GAG CTG GCC ATC ATC TCA GTC CAG GAG ATC 760
Arg Phe Ala His Phe Thr Glu Leu Ala lie He Ser Val Gin Glu lie
170 175 180 185
GTG GAC TTC GCT AAG CAA GTG CCT GGT TTC CTG CAG CTG GGC CGG GAG 808
Val Asp Phe Ala Lys Gin Val Pro Gly Phe Leu Gin Leu Gly Arg Glu
190 195 200
GAC CAG ATC GCC CTC CTG AAG GCA TCC ACT ATC GAG ATC ATG CTG CTA 856
Asp Gin lie Ala Leu Leu Lys Ala Ser Thr lie Glu lie Met Leu Leu
205 210 215
GAG ACA GCC AGG CGC TAC AAC CAC GAG ACA GAG TGT ATC ACC TTC TTG 904
Glu Thr Ala Arg Arg Tyr Asn His Glu Thr Glu Cys lie Thr Phe Leu
220 225 230
AAG GAC TTC ACC TAC AGC AAG GAC GAC TTC CAC CGT GCA GGC CTG CAG 952
Lys Asp Phe Thr Tyr Ser Lys Asp Asp Phe His Arg Ala Gly Leu Gin
235 240 245
GTG GAG TTC ATC AAC CCC ATC TTC GAG TTC TCG CGG GCC ATG CGG CGG 1000
Val Glu Phe lie Asn Pro lie Phe Glu Phe Ser Arg Ala Met Arg Arg
250 255 260 265
CTG GGC CTG GAC GAC GCT GAG TAC GCC CTG CTC ATC GCC ATC AAC ATC 1048
Leu Gly Leu Asp Asp Ala Glu Tyr Ala Leu Leu lie Ala lie Asn lie
270 275 280
TTC TCG GCC GAC CGG CCC AAC GTG CAG GAG CCG GGC CGC GTG GAG GCG 1096
Phe Ser Ala Asp Arg Pro Asn Val Gin Glu Pro Gly Arg Val Glu Ala
285 290 295
TTG CAG CAG CCC TAC GTG GAG GCG CTG CTG TCC TAC ACG CGC ATC AAG 1144
Leu Gin Gin Pro Tyr Val Glu Ala Leu Leu Ser Tyr Thr Arg lie Lys
300 305 310
AGG CCG CAG GAC CAG CTG CGC TTC CCG CGC ATG CTC ATG AAG CTG GTG 1192
Arg Pro Gin Asp Gin Leu Arg Phe Pro Arg Met Leu Met Lys Leu Val
315 320 325
AGC CTG CGC ACG CTG AGC TCT GTG CAC TCG GAG CAG GTC TTC GCC TTG 1240
Ser Leu Arg Thr Leu Ser Ser Val His Ser Glu Gin Val Phe Ala Leu
330 335 340 345
CGG CTC CAG GAC AAG AAG CTG CCG CCT CTG CTG TCG GAG ATC TGG GAC 1288 Arg Leu Gin Asp Lys Lys Leu Pro Pro Leu Leu Ser Gl u lie Trp Asp
350 355 360
GTC CAC GAG TGAGGGGCTG GCCACCCAGC CCCACAGCCT TGCCTGACCA 1337 Val His Glu
364
CCCTCCAGCA GATAGACGCC GGCACCCCTT CCTCTTCCTA GGGTGGAAGG GGCCCTGGGC 1397 CGAGCCTGTA GACCTATCGG CTCTCATCCC TTGGGATAAG CCCCAGTCCA GGTCCAGGAG 1457 GCTCCCTCCC TGCCCAGCGA GTCTTCCAGA AGGGGTGAAA GGGTTGCAGG TCCCGACCAC 1517 TGACCCTTCC CGGCTGCCCT CCCTCCCCAG CTTACACCTC AAGCCCAGCA CGCAGTGCAC 1577 CTTGAACAGA GGGAGGGGAG GACCCATGGC TCTCCCCCCT AGCCCGGGAG ACCAGGGGCC 1637 TTCCTCTTCC TCTGCTTTTA TTTAATAAAA ACTAAAAACA GAAAAAAAAA A 1688
K列番号 : 3
配列の長さ : 3 1
配列の型 : 核酸
猪の数: 一本鎮
ト ポ ロ ジー : 直鎮状
K列の種類 : 他の核酸 (合成 D N A)
配列の記述
GACGGATCCA TGTCCTCTCC TACCACGAGT T 31 配列番号 : 4
配列の長さ : 2 9
E列の型: 核酸
鎖の数 : 一本鎮
ト ポ ロ ジー : 直鎮状
配列の種類 : 他の核酸 (合成 D N A)
配列の記述
CTAGAATTCG GAGGGTGGTC AGGCAAGGC 29 配列番号: 5
配列の長さ : 1 6
配列の型 : ア ミ ノ酸
鎖の数: 一本鎮
ト ポ ロ ジー : 直鎮状
配列の種類 : ペプチ ド
配列の記述
Asp Gin Pro Lys Val Thr Pro Trp Pro Leu Gly Ala Asp Pro Gin Ser 1 5 10 15 配列番号 : 6
配列の長さ 2 2
配列の型 : 核酸
鎮の数: 本鎖
ト ポ ロ ジー 直鎮状
配列の種類 他の核酸 (合成 D N A)
配列の記述
ATGTCCTCTC CTACCACGAG TT 22
K列番号 : 7
配列の長さ : 2 1
配列の型 : 核酸
鎮の数 : 一本鎖
ト ポ ロ ジー : 直鎮状
配列の種類 : 他の核酸 (合成 D N A)
配列の記述
CCTCAGTGTC AGTGTCAGCG 丁 21 配列番号 : 8
配列の長さ : 2 6
配列の型 : 核酸
鎮の数 : 一本鎖
ト ポ ロ ジー : 直鎮状
配列の種類 : 他の核酸 (合成 D N A) 配列の記述
CCGGAAGAAG AAGATTCGGA AACAGC 26 配列番号 : 9
配列の長さ 1 9
列の型 : 核酸
鎖の数 : 本鎮
ト ポ ロ ジー 直鎮状
配列の種類 他の核酸 (合成 D N A) E列の記述
GTGGCACGTC CGGACGTCC 19
E列番号 : 1 0
配列の長さ : 2 2
配列の型 : 核酸
鎖の数 : 一本鎮
ト ポ ロ ジー : 直鎖状
列の種類 : 他の核酸 (合成 D N A) 配列の記述
ACCTACAGCA AGGACGACTT CC 22
配列番号 : 1 1
配列の長さ : 2 0
配列の型 : 核酸
鎖の数 : 一本鎮
トポロジー : 直鎮状
配列の種類 : 他の核酸 (合成 D NA) 配列の記述
CGGAACGGAC TGGTGGGAGG 20