WO1995032990A1 - Cyclodepsipeptide - Google Patents

Cyclodepsipeptide Download PDF

Info

Publication number
WO1995032990A1
WO1995032990A1 PCT/JP1995/001003 JP9501003W WO9532990A1 WO 1995032990 A1 WO1995032990 A1 WO 1995032990A1 JP 9501003 W JP9501003 W JP 9501003W WO 9532990 A1 WO9532990 A1 WO 9532990A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cyclic
debpeptide
methanol
compound
acceptable salt
Prior art date
Application number
PCT/JP1995/001003
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shigeru Hiramoto
Yukio Saito
Shigeo Hatanaka
Akiko Shingai
Original Assignee
Nisshin Flour Milling Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nisshin Flour Milling Co., Ltd. filed Critical Nisshin Flour Milling Co., Ltd.
Priority to US08/737,599 priority Critical patent/US5801143A/en
Priority to JP50064696A priority patent/JP3718226B2/ja
Priority to EP95919634A priority patent/EP0761682B1/en
Priority to DE69519669T priority patent/DE69519669T2/de
Priority to KR1019960706672A priority patent/KR970703363A/ko
Publication of WO1995032990A1 publication Critical patent/WO1995032990A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a cyclic depsipeptide having a lipid secretion inhibitory activity and an apolipoprotein B production inhibitory activity which can be used as a therapeutic agent for hyperlipidemia, a method for producing the same, and a use thereof.
  • hyperlipidemia drugs For hyperlipidemia drugs, several compounds have already been put into practical use. In particular, it has been reported that HMG CoA reductase inhibitors such as pravastatin and lovastatin have a remarkable cholesterol lowering effect, and it can be said that the treatment of hypercholesterolemia has progressed dramatically since the emergence of these drugs. . However, these drugs do not lower blood triglycerides.
  • clofibrate drugs and nicotinic acid preparations have been put to practical use as drugs that lower both cholesterol and triglyceride, but nicotinic acid frequently causes side effects such as itching, hot sensation and rash.
  • side effects such as gallstone formation, muscular disorders, hepatic dysfunction, and gastrointestinal disorders have become problems.
  • niacin which is a nicotinic acid preparation
  • clofibrate aluminum is as much as 1.5 g.
  • An object of the present invention is to provide a compound that lowers both plasma cholesterol and triglyceride more effectively than conventional drugs in order to effectively treat and prevent hyperlipidemia.
  • Hep G2 cells which are model cells of hepatocytes, for compounds that inhibit secretion of both cholesterol and triglycerides from microbial metabolites.
  • An active ingredient was found in the culture broth of the bacterium, and was found to be a compound having a cyclic depsipeptide structure.
  • cyclic debpeptides were purified and isolated from the culture broth, clarified to be novel compounds, and further studied.As a result of these studies, these cyclic debpeptides were found to be extremely low-density ribota Suppresses the production of apolipoprotein B, a major constituent protein of Very Low Density Lipoprotein (VLDL), in hepatocytes, etc., and does not hinder the synthesis of albumin and other proteins in hepatocytes. It has been confirmed that lipid secretion is selectively suppressed, and the present invention has been completed.
  • VLDL Very Low Density Lipoprotein
  • n represents an integer of 5 to 15, and a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • a compound in which n is an integer of 6 to 12 is preferable, and a compound in which n is 7, 8, 9, or 10 is particularly preferable.
  • a bacterium which produces the novel cyclic debpeptide belonging to the genus Vanras is further cultured, and the cyclic debpeptide is collected from the culture.
  • the present invention provides a method for producing these cyclic debpeptides.
  • a pharmaceutical composition comprising these cyclic depsipeptides or a pharmaceutically acceptable salt thereof, particularly a therapeutic drug for hyperlipidemia, a lipid secretion inhibitor or an apolipoprotein B production inhibitor is provided.
  • Microorganisms that can be used for the production of the cyclic debpeptide of the present invention may be any microorganisms belonging to the genus Vanras and producing this cyclic debpeptide.
  • Bacillus sp. No. 4691 strain isolated from the soil of Otaru City, Hokkaido is mentioned as an example that can be used.
  • the bacteriological properties of No. 4691 are as follows.
  • Colony morphology Perimeter is irregular (R type) Force Force is circular as a whole
  • Diaminopimelic acid in whole cell hydrolyzate is meso type.
  • this strain was considered to belong to the genus Bacillus. Therefore, this strain was named Bacillus sp. No. 4691.
  • An application for deposit of No. 4691 strain was submitted to the Research Institute of Life Science and Technology, Ministry of Industry and Industry, and the deposit was received on April 20, 1994 under the accession number FERM P-14282.
  • An application for transfer to the international deposit was made at a later date, and on May 15, 1995, it was deposited internationally under accession number FEM BP-5101.
  • the medium used for the culture of the present invention may be any medium that contains any nutrient source that can be used by the bacteria producing the cyclic debpeptide of the present invention.
  • any nutrient source that can be used by the bacteria producing the cyclic debpeptide of the present invention.
  • glycerin, glucose, maltose, sucrose, dextrin, starch, oils and the like can be used as carbon sources.
  • Organic substances such as soy flour, meat extract, peptone, dried yeast, yeast extract, corn steep liquor, etc., and inorganic salts such as ammonium nitrate and chloride can be used as nitrogen sources.
  • inorganic salts such as salt, potassium chloride, calcium carbonate, phosphate, and heavy metal salts can be added.
  • an appropriate antifoaming agent for example, silicone, soybean oil and the like can be appropriately added according to a conventional method.
  • culturing method static culturing, shaking culturing, aeration stirring culturing and the like can be used.
  • the culture temperature is suitably from 20 to 50 ° C, preferably from 25 to 40 ° C.
  • the production amount of the physiologically active substance of the present invention by this method reaches the maximum in both shaking culture and aeration-agitation culture in 2 to 4 days.
  • cyclic depeptide of the present invention is mainly present in the cells, centrifugation of the culture, Alternatively, it is desirable to perform a purification operation from the cells obtained by filtration.
  • a purification method a method usually used for collecting a fat-soluble substance from a cultured microorganism cell is applied. That is, a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, and acetone is added to the cells and stirred to obtain an extract. After distilling off the organic solvent in the extract, extract with a water-immiscible organic solvent such as ethyl acetate.
  • Organic solvents used for the extraction include esters such as ethyl acetate and butyl acetate, halogenated hydrocarbons such as chloroform, methylene chloride, and alcohols such as n-butanol and iso-butanol. No.
  • the extract thus obtained is washed with a saline solution and concentrated.
  • the crude powder obtained is subjected to silica gel column chromatography.
  • a developing solvent for example, a mixed solvent system such as octanol-form-methanol or hexane-monoethyl acetate is used, and by sequentially increasing the ratio of a polar solvent such as methanol or ethyl acetate in the solvent, another solvent is used. It can be eluted separately from contaminants.
  • the fraction containing the cyclic debpeptide of the present invention eluted in this way is further purified by preparative thin-layer chromatography or high performance liquid chromatography (HPLC), and finally, the cyclic debpeptide of the present invention is finally purified.
  • a peptide is obtained.
  • the cyclic depsipeptide of the present invention can be prepared by a method known per se, such as a metal salt such as a sodium salt, a potassium salt, and a calcium salt, a salt with an organic amine such as an ammonium salt, or a trinitiamin salt.
  • a metal salt such as a sodium salt, a potassium salt, and a calcium salt
  • a salt with an organic amine such as an ammonium salt
  • a trinitiamin salt such as sodium salt, a potassium salt, and a calcium salt
  • a salt with an organic amine such as an ammonium salt
  • a trinitiamin salt such as sodium salt, sodium potassium salt, and a calcium salt
  • a salt with an organic amine such as an ammonium salt
  • a trinitiamin salt such as sodium salt, sodium salt, a potassium salt, and a calcium salt
  • a salt with an organic amine such as an ammonium salt
  • the cyclic debpeptide of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof can be formulated into various dosage forms. That is, the formulation can be administered orally in the form of tablets, dragees, hard capsules, soft capsules, granules, powders and solutions, such as solutions, emulsions or suspensions. it can. In addition, in the case of non-microbial administration, it is administered in the form of injection solution or suppository
  • additives for formulation such as excipients, stabilizers, preservatives, solubilizers, wetting agents, emulsifiers, lubricants, sweeteners and coloring agents are used. It can be formulated by adding a flavoring agent, a tonicity adjusting agent, a buffer, an antioxidant and the like.
  • Additives include, for example, starch, sucrose, fructose, lactose, glucose, mannitol, sorbitol precipitated calcium carbonate, crystalline cellulose, carboxymethylcellulose, dextrin, gelatin, gum arabic, magnesium stearate, talc, Hydroxypropyl methyl cellulose and the like.
  • the active ingredient can be dissolved or suspended in a conventional diluent.
  • Diluents include physiological saline, Ringer's solution, aqueous glucose solution, alcohols, fatty acid esters, glycols, glycerin fatty acid glycerides, oil sources of plant and animal origin, paraffins and the like.
  • the usual clinical dosage is 0.5 to 5000 mg per adult per day orally. More preferably, it is used in the range of 5 to 500 mg.
  • FIG. 1 shows an ultraviolet absorption spectrum of the cyclic depeptide (Compound 1) of the present invention.
  • the vertical axis indicates absorbance, and the horizontal axis indicates wavelength ( ⁇ ).
  • FIG. 2 shows an infrared absorption spectrum of the cyclic depeptide (Compound 1) of the present invention.
  • the vertical axis shows transmittance (%) and the horizontal axis shows wave number (cnr 1 ).
  • FIG. 3 shows the nuclear magnetic resonance spectrum of the cyclic depsipeptide of the present invention (Compound 1).
  • the horizontal square indicates the chemical shift (ppm; ⁇ ).
  • a liquid medium containing 1.0% soluble starch, 1.0% molasses, 1.0% polypeptone, and 1.0% meat extract was dispensed in 100ml aliquots in a 5.00ml Erlenmeyer flask, sterilized in a usual manner at 120 ° C for 20 minutes.
  • Bacillus were cultured in agar slant medium, a sp ⁇ Nanba4691 strain was inoculated, 28 e C for 48 hours rotary shake culture (220 revolutions per minute) and was seed culture solution.
  • the aqueous solution was extracted three times with one liter of ethyl acetate, washed twice with 500 ral of saturated saline, dried over anhydrous sodium sulfate, and dried.
  • the ethyl acetate extract was concentrated under reduced pressure to dryness, dissolved in a small amount of chloroform, and mounted on a column (200 ml) filled with silica gel suspended in chloroform.
  • the column was washed in the order of 300 ml of black-mouthed form, 300 ml of black-mouthed formanol (98: 2), and 300 ml of black-mouthed form-methanol (95: 5) to remove impurities.
  • the column was eluted with 300 ml of a solvent system of black form-methanol (80:20).
  • Fractions 21 to 23 were similarly concentrated to dryness and subjected to high performance liquid chromatography (under the same conditions as above) to collect a peak with a retention time of 25.02 minutes. This was concentrated to dryness to obtain a compound 4 white powder.
  • the physicochemical properties of the thus-obtained cyclic depeptide of the present invention are as follows.
  • Test Example 1 Cholesterol secretion inhibitory activity of cyclic debpeptide of the present invention
  • Hep G2 cells 1 X 10 5 24-well tissue culture of Zarl (l ()% fetal bovine serum-containing Dulbecco's modified method single medium (manufactured by Nissui Pharmaceuticals; hereinafter referred to as D-MEM medium)
  • the culture medium was removed at 37 ° C, 5% CO2 and 95% air, and the medium was removed. Sigma) was added, and a methanol solution of this cyclic depsipeptide was added in 101. After 18 hours, the medium was replaced again (D-MEM containing 10% lipoprotein-deficient serum).
  • the medium was extracted with black-mouthed form methanol (2: 1). Then, the extract was subjected to a saponification reaction in a 15% aqueous hydration medium at 85 ° C. for 45 minutes to convert ester-type cholesterol into free cholesterol.
  • Cholesterol was extracted with petroleum ether, applied to a thin layer gel chromatography, and developed with hexane getyl ethernoacetic acid (80:20 ⁇ 1). Scraped spot of cholesterol, by liquid scintillation counter and the radioactivity was measured, which was used as a [1 4 C] cholesterol amount.
  • Table 2 shows the effect of each concentration of the cyclic debpeptide of the present invention on cholesterol secretion.
  • Test Example 2 Activity of cyclic debpeptide of the present invention for inhibiting triglyceride secretion
  • the medium was extracted with hexane / ⁇ isopropanol (3: 2), subjected to silica gel thin-layer chromatography, and developed with hexanediethyl ether acetic acid (90: 10: 1). Scraped scan pots of triglyceride, by liquid scintillation one Chillon counter, the radiation activity was measured, which was used as a [3 H] triglyceride amount.
  • Table 3 shows the effect of the cyclic depsipeptide of the present invention on triglyceride secretion at various concentrations.
  • Test Example 3 Effect of cyclic debpeptide of the present invention on apolipopin tin B and albumin production in HepG2 cells
  • Hep G2 cells 1 x 10 5 Zml (containing 10% fetal bovine serum!-MEM medium) was injected into a 24-well tissue culture plate in a volume of 1 ml each, and at 37 ° C 5% CO2 and 95% air was cultured under a mixed gas atmosphere. After 4, the medium was removed, 1 ml of D-MEM medium containing 10% lipoprotein-deficient serum (manufactured by Sigma) was added, and 10/1 methanolic solution of cyclic depsipeptide was further added.
  • the medium was replaced again (including 10% lipoprotein-deficient serum!-MEM medium, and a 10% methanol solution of cyclic depeptide was added, followed by further culturing at 37 ° C for 18 hours.
  • Abolipoprotein B and albumin produced in the medium were quantified by the Enzymim Noassy method. The method for quantifying each protein is described below.
  • Table 4 shows the composition of the buffer used in this method. Note that PBS indicates a phosphate buffer, and PBS-T indicates a phosphate buffer to which Tween20 has been added. Table 4
  • Buffer solution is prepared by adding distilled water to make a total volume of 1000 ml.
  • a 0.05M sodium bicarbonate (pH 9.5) is added to the fraction of Higgie Anti-Hiapolipoprotein B IgG (manufactured by Binding Site). And dissolved to lO ⁇ gZml.
  • the 501 was dispensed into Nunc Immunobrate and allowed to stand at 4 ° C for 16 hours.
  • sample solution 50 1 (3.3 times diluted Hep G2 medium with 10% milk protein-derived immunizing block (Block Ace; manufactured by Dainippon Pharma Co., Ltd.)) In addition, it was left at room temperature for 2 hours.
  • PBS-T3001 add a 0.5% solution (10% Block Ace) of a beige anti-human polypoprotein B peroxidase label (Binding Site) 501, and leave at room temperature for 2 hours. did.
  • Test Example 3 Apori a calibration curve in the case of, except that methanol was used in Ri I Do methanol cyclic depsipeptides measures carried out in the same manner, was used as a control (low-density lipoprotein (Sigma) and standard The absolute amount of poplin B was determined, and the relative amount of apolipoprotein B in each sample was expressed as the ratio of this to the control X 100%.
  • the relative albumin amount of the sample was determined as a ratio (%) when the absolute amount of albumin in the control was taken as 100.
  • Table 5 shows the effect of the cyclic debpeptide of the present invention on the production of apolipoprotein B and albumin at various concentrations.
  • the cyclic depsipeptide of the present invention can selectively inhibit the production of apolipoprotein B in HepG2 cells without affecting the production of albumin. Indicated.
  • the cyclic debpeptide of the present invention strongly inhibits the secretion of cholesterol and triglyceride from Hep G2 cells at a low concentration, and further suppresses the production of apolipoprotein B.
  • Other proteins Since it does not suppress the secretion of lipoproteins, it is expected to be used as a highly selective new type of therapeutic agent for hyperlipidemia.
  • Compound 1 magnesium silicate and lactose are mixed, and the mixture is kneaded with an alcohol solution in which hydroquinone propylcellulose is dissolved, and then granulated to an appropriate particle size, dried, sized, and further mixed with magnesium stearate and vegetable hardener. Add the mixed oil to make uniform granules. Then, tablets having a diameter of 7.0 mm, a weight of 150 mg and a hardness of 6 kg were prepared by a rotary tableting machine.
  • the cyclic depsipeptide (I) provided by the present invention is useful as a therapeutic agent for hyperlipidemia, particularly as a lipid secretion inhibitor and an apolipoprotein B production inhibitor.
  • the compound of the present invention is produced by culturing a bacterium producing the present compound belonging to the genus Bacillus.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

明 細 書
環 状 デ ブ シ ぺ プ チ ド
技術分野
本発明は、 高脂血症治療薬として利用可能な脂質分泌抑制活性、 アポ リポプロテイン B産生抑制活性を有する環状デプシペプチ ド、 その製造 法及び用途に関する。
背景技術
高脂血症治療薬に関しては、 すでにいくつかの化合物が実用化されて いる。 特に、 プラバスタチン、 ロバスタチンなどの HMG CoA還元酵素阻 害剤は顕著なコレステロール低下作用を有することが報告されており、 これらの薬剤の出現以後、 高コレステロール血症の治療が飛躍的に進歩 したと言える。 しかしながら、 これらの薬剤は血中トリグリセリ ドは低 下させない。
—方、 コレステロールと 卜リグリセリ ドの両方を低下させる薬剤とし てはクロフイブレート系薬剤とニコチン酸製剤が実用化されているが、 ニコチン酸では痒み、 熱感、 発疹などの副作用が高頻度に出現し、 クロ フイブレー ト系薬剤では胆石の易形成、 筋障害、 肝機能障害、 胃腸障害 などの副作用が問題となっている。 また、 投与量についてはニコチン酸 製剤であるナイァシンは 2〜3 gであり、 クロフイブラー トアルミニゥ ムは 1. 5 gとかなり多いこともまた問題となっている。
発明の開示
本発明の課題は、 高脂血症の治療、 予防を効果的に行うために血漿コ レステロールと トリグリセリ ドの両方を、 従来の薬剤よりも強力に低下 させる化合物の提供である。
血漿中のコレステロールと トリグリセリ ドの大部分は肝臓で合成、 分 泌されることから、 肝細胞でのコレステロールと トリグリセリ ドの両方 の分泌を抑制する物質は、 血漿コレステロールと トリグリセリ ドの両方 を低下させる高脂血症治療薬になることが期待される。 本発明者らは、 肝実質細胞のモデル細胞である Hep G2細胞を用い、 この細胞からコレス テロールと トリグリセリ ドの両方の分泌を抑制する化合物を微生物代謝 産物に求めて探索した結果、 ある種の細菌の培養液に活性成分を見い出 し、 このものが環状デブシペプチド構造を有する化合物であることを見 いだした。 そして培養液よりこれら環状デブシぺプチドを精製単離し、 新規化合物であることを明らかにし、 さらに研究を重ねた結果、 これら 環状デブシぺプチドが、 動脈硬化症の原因とされている超低密度リボタ ンパク質 （Very Low Dencity Lipoprotein； VLDL) の主要な構成タンパ ク質であるアポリポプロテイン Bの肝細胞等での産生を抑制し、 また肝 細胞でのアルブミ ン等他の蛋白質の合成を妨げずに選択的に脂質分泌を 抑制すること等を確認し、 本発明を完成するに至った。
本発明によれば、 次の構造式 （ I )
Figure imgf000004_0001
(式中 nは 5 ~ 15の整数を示す） で表される環状デプシペプチド、 およ びその薬理学的に許容されうる塩が提供される。 上記式中、 nが 6〜12 の整数である化合物が好ましく、 特に nが 7、 8、 9または 10である化 合物が好ましい。
本発明によればさらにバンラス属に属する上記新規な環状デブシぺプ チドを生産する菌を培養し、 その培養物から環状デブシぺプチドを採取 することを特徴とするこれら環状デブシぺプチ ドの製造法が提供され る。
さらに本発明によれば、 これら環状デプシペプチド、 またはその薬理 学的に許容しうる塩を含有してなる医薬組成物、 特に高脂血症治療薬、 脂質分泌抑制薬またはアポリポプロティン B産生抑制薬が提供される。 本発明の環状デブシぺプチドの製造に用いることができる微生物とし てはバンラス属に属しこの環状デブシぺプチドを生産する菌であればい ずれでもよい。 例えば北海道小樽市の土壌より分離されたバシラス ·ェ スピー · No. 4691株は使用しうる例として挙げられる。 No. 4691株の菌学 的性状は下記の通りである。
1 . 形態学的性質
グラム染色 陽性
大きさ 0. 7〜1. 2 x 1. 5~ 2. 5 m
形態
運動 なし
胞子及び芽胞 あり 楕円形または円柱状 中央 2 . 培養的性質
1 ) 代用肉汁寒天平板培地上での生育
コロニーの形態 周縁は不規則形 （R型） である力 全体としては円形である
色 乳白色から薄い茶褐色
光沢 鈍光で艷がない
拡散性色素 なし
2) 代用肉汁液体培地
菌体の沈殿 なし
中間部 濁りなし
表 E 菌膜ぁり 3) その他
30分間の煮沸 耐性
D H L寒天培地 発育せず
デソキシコレート寒天培地 発育せず
4) ゼラチン穿刺培養
ゼラチンの液化 なし
5) リ トマス · ミルクでの反応
凝固、 ペプトン化 あり pHはややアルカリ性. 生理学的性質
表 1に示す。 陽性を +、 陰性を一とする。
表 1 グラム染色性 4 〇一Fテスト ガス グルコース
碓酸塩の還元 対照 脱窒反 ft、 糖から酸及びガスの生成 ガス
Lーァラビノース
MRテスト D—キシロース
D—グルコース +
V Pテスト + D—マンノース +
D—フラク トース + ィンドールの生成 D—ガラク トース +
マルト一ス + 硫化水素の生成 シユークロース +
ラク トース
デンプンの加水分解 + トレ /、口一ス + —
D—ソルビトール
クェン酸の利用 + D—マンニトール + 一 イノシトール
無機窒素源 グリセリン + — 硝酸塩 デンプン + - アンモニゥム塩 + 対照
酸 + 色素の生成 塩化ナトリウムの耐性 (！〜 12% ウレァ一ゼ 溶血性 ォキシダーゼ + アルギニンの分解 + カタラーゼ + リジンの脱炭酸反応 生育の範两 オル二チンの脱炭酸反応
温度 最高，最低 I5~55°C
pll 最適 6. 0〜8. 0 マロン酸の利用 + 最高 ·最低 5. 0〜10. 0
エスクリンの分解 + 酸素に対する態度 好気性
- 0 - 4 . 化学分類学的性質
1) D N Aの塩基組成 （G C含量）
50〜51 %
2) 全菌体加水分解物中のジァミノ ピメ リン酸は meso型である。
以上述べた特徴、 特に形態観察及び化学分析の結果から、 本菌株はバ シラス属に属すると考えられた。 よって本菌株をバシラス ·エスピー . No. 4691 ( Bacillus sp. No. 4691) 株と命名した。 なお、 No. 4691株を通 産省工業技術院生命工業技術研究所に寄託申請し、 平成 6年 4月 20曰、 受託番号 FERM P— 14282号として受託された。 また、 後日国際寄託へ移 管申請し、 平成 7年 5月 15日、 受託番号 FEM BP— 5101号として国際寄 託された。
本発明の培養に用いられる培地は、 本発明の環状デブシぺプチドの生 産菌が利用できる任意の栄養源を含有するものであればよい。 例えば炭 素源として、 グリセリン、 グルコース、 マルトース、 シュクロース、 デ キストリン、 でんぷん、 油脂類などが使用できる。 窒素源として大豆粉、 肉エキス、 ペプトン、 乾燥酵母、 酵母エキス、 コーンスティープリカ一 などの有機物、 ならびに硝酸アンモニゥム、 塩化アンモニゥムなどの無 機塩が使用できる。 また、 必要に応じて食塩、 塩化カリウム、 炭酸カル シゥム、 リ ン酸塩、 重金属塩などの無機塩類も添加することができる。 発酵中の発泡を抑制するために、 常法に従って適当な消泡剤、 例えばシ リコーン、 大豆油などを適宜添加することもできる。 培養法としては静 置培養、 振とう培養あるいは通気撹拌培養などを用いることができる。 培養温度は 20~ 50°Cが適当であるが、 25~ 40°Cが好ましい。 この方法で の本発明の生理活性物質の生産量は振とう培養、 通気撹拌培養共に 2〜 4日間で最高に達する。
このようにして生産された本発明の環状デブシぺプチ ドは主として菌 体中に存在するので、 当該物質の採取においては、 培養物の遠心分離、 あるいはろ過によって得られた菌体から精製操作をおこなうことが望ま しい。 精製方法は微生物培養菌体から脂溶性物質を採取するのに通常用 いられる方法が適用される。 すなわち、 菌体にメタノール、 エタノール、 アセ トンなどの水混和有機溶媒を加え、 撹拌し抽出液を得る。 抽出液の 有機溶媒を留去してから酢酸ェチルのような水と混和しない有機溶媒で 抽出する。 抽出に用いられる有機溶媒としては、 酢酸ェチル、 酢酸プチ ルのようなエステル類、 クロ口ホルム、 塩化メチレンのようなハロゲン 化炭化水素類、 n—ブタノール、 i so—ブタノールのようなアルコール 類が挙げられる。
このようにして得られた抽出液を、 食塩水で洗い、 濃縮して得られる 粗粉末をシリカゲルのカラムクロマトグラフィ一に付す。 展開溶媒とし ては、 例えばク口口ホルム一メタノール又はへキサン一酢酸ェチルなど の混合溶媒系が用いられ、 順次溶媒中メタノール又は酢酸ェチルなどの 極性溶媒の比率を増していく ことにより、 他の夾雑物と分離して溶出す ることができる。
このようにして溶出された本発明の環状デブシぺプチ ドを含む区分 は、 調製用薄層クロマトグラフィー又は高性能液体クロマトグラフィー ( H P L C ) などによりさらに精製され、 最終的に、 本発明の環状デブ シぺプチドが得られる。
また、 本発明の環状デプシペプチドは、 それ自体公知の方法で、 ナト リウム塩、 カリウム塩、 カルシウム塩等の金属塩、 アンモニゥム塩、 あ るいはトリニチルアミ ン塩等の有機ァミ ンとの塩など、 薬理学的に許容 されうる塩を形成させることができる。
本発明の環状デブシぺプチ ドまたはその薬理学的に許容し得る塩は種 々の投与形態の製剤とする事ができる。 すなわち、 この製剤は経口的に 錠剤、 糖衣錠、 硬質カプセル剤、 軟質カプセル剤、 顆粒剤、 散剤および 溶液、 ェマルジョ ンまたは懸濁液のような液剤の形態で投与することが できる。 また、 非絰ロ投与の場合には注射液、 坐剤の形態で投与され る
これらの製剤の調製にあつたては製剤化のための慣用の添加剤、 例え ば賦形剤、 安定剤、 防腐剤、 溶解剤、 湿潤剤、 乳化剤、 滑沢剤、 甘味剤. 着色剤；》 香味剤、 張度調製剤、 緩衝剤、 酸化防止剤などを添加して製剤 化することができる。
添加剤としては、 例えばデンプン、 白糖、 果糖、 乳糖、 ブドウ糖、 マ ンニトール、 ソルビトール沈降性炭酸カルシウム、 結晶セルロース、 力 ルボキシメチルセルロース、 デキス ト リ ン、 ゼラチン、 アラビアゴム、 ステアリ ン酸マグネシウム、 タルク、 ヒ ドロキシプロピルメチルセル口 ース等が挙げられる。
本発明の化合物を液剤、 注射剤として用いるときは活性成分を慣用の 希釈剤中に溶解または懸濁して用いることができる。 希釈剤としては、 生理食塩水、 リ ンゲル液、 ブドウ糖水溶液、 アルコール類、 脂肪酸エス テル類、 グリコール類、 グリセリ ン脂肪酸グリセリ ド、 植物、 動物由来 の油源、 パラフィ ン類などが含まれる。
また、 これらの製剤は、 通常の方法で製造することができる。
そして通常の臨床投与量として、 成人一人一日当たり経口の場合 0. 5 〜5000 mgの範囲で用いられる。 さらに好ましくは 5〜500mgの範囲で用 いられる。
図面の簡単な説明
図 1 ：本発明の環状デブシぺプチド （化合物 1 ) の紫外吸収スぺク 卜 ルを示す。 縦軸は吸光度を、 横軸は波長 （ηπι) を示す。
図 2 ：本発明の環状デブシぺプチ ド （化合物 1 ) の赤外吸収スぺク ト ルを示す。 縦軸は透過率 （％) を、 横軸は波数（cnr 1 )を示す。
図 3 ： 本発明の環状デブシペプチド （化合物 1 ) の ' Η核磁気共鳴ス ぺク トルを示す。 横铀は化学シフ ト （ppm； δ を示す。 実施例
実施例 1. 本発明の環状デプシペプチドの製造
可溶性デンプン 1.0%、 廃糖蜜 1.0%、 ポリペプトン 1.0%、 肉エキス 1.0%を含む液体培地.を 5.00ml容三角フラスコで 100mlずつ分注し、 常法 により 120°Cで 20分間滅菌し、 これに寒天斜面培地で培養したバシラス， エスピー · No.4691株を接種し、 28eCで 48時間回転振とう培養 （220回転 毎分） して種母培養液とした。 可溶性デンプン 2.5%、 大豆粉 1.5%、 乾 燥酵母 0.2%、 炭酸カルシウム 0.4%を含む液体培地 100mlに、 この種母 培養液 2mlを接種し、 28°Cで毎分 220回転で 3日間振とう培養させた。 この培養液 15リ ッ トルを遠心分離し、 菌体を得た。 菌体にメタノール 5 リッ トルを加え、 よく撹拌した後、 18時間静置した。 抽出液をろ過し、 得られたろ液は減圧下、 メタノールを留去した。 得られた水溶液に 2 N 塩酸を加え、 pHを 5に調整した。 水溶液を酢酸ェチル 1 リ ッ トルで 3回 抽出し、 これを飽和食塩水 500ralで 2回洗浄後、 無水硫酸ナトリウムを 加え、 乾燥させた。 酢酸ェチル抽出液は減圧濃縮乾固してから少量のク ロロホルムに溶解し、 シリ力ゲルをクロロホルムに懸濁して充填した力 ラム （200ml) にマウントした。 クロ口ホルム 300ml、 クロ口ホルム一メ 夕ノール（98 : 2) 、 クロ口ホルム一メタノール （95 : 5) 各 300mlの順 番でカラムを洗浄し、 不純物を除いた。 次に、 カラムをクロ口ホルム一 メタノール（80： 20) の溶媒系 300mlで活性区分を溶出させた。 活性区分 は減圧濃縮乾固してから、 調製用薄層クロマトグラフィー （担体、 シリ 力ゲルガラスプレート 60F254、 0.50mm. 独メルク社製） に付し、 クロ口 ホルム一メタノール （3 : 1) で展開した。 Rf=0.28を示す活性区分を かきとった後、 メタノールで溶出し、 溶出液を減圧濃縮乾固した。 これ を少量のメタノールに溶解し、 セフアデックス LH20(フアルマシア社製） を充填したカラム（1.6cm直径 X 60cm高さ） にマウントし、 メタノールで 溶出をおこない、 2.5mlずつ分取した。 フラクション 18から 20番までは まとめて濃縮乾固して無色結晶を得た。 これを化合物 1 とする。
フラクション 15から 17番までは濃縮乾固後、 高性能液体クロマトグラ フィー [カラム ； Inertsil 0DS (内径 20mm,長さ 250mm、 GLサイエンス社 製）、 移動相 ； メタノール：水：酢酸アンモニゥム =95 ： 5 ： 0.1、 流速 15ml 分、 検知器 UV222nm] にかけ、 保持時間 15.20分のピークと保持 時間 18. 06分のピークを分取した。 それぞれを濃縮乾固し、 保持時間 15.20分の区分より化合物 2の白色粉末を、 保持時間 18.06分の区分より 化合物 3の白色粉末を得た。 フラクション 21から 23番までも同様に濃縮 乾固後、 高性能液体クロマトグラフィー （条件は上と同じ） にかけ、 保 持時間 25.02分のピークを分取した。 これを濃縮乾固し、 化合物 4の白 色粉末を得た。
このようにして得られた本発明の環状デブシぺプチドの物理化学的性 質は、 次に示す通りである。
化合物 1
形状 無色結晶
融点 155〜： L57°C
質量分析 （FABMS) m/ z 1057 (M + Na)
分子式 C 53H 94N 8W 12
紫外吸収スぺク トル （MeOH) ：末端吸収 （図 1参照）
赤外吸収スぺク トル （KBr錠法による） ：
3290, 2958, 2928, 2870, 1750, 1658, 1528, 1468, 1387, 1370, 1260, 1199, 1025, 796 (cm"1. 図 2参照）
核磁気共鳴スぺク トル
(400MHz, ρρπ, 多重度， Methyl- d3 alcohol中） ：
0.79 (6H. d), 0.80 (3H, t), 0.81 (3H, d), 0.82 (3H, d). 0.83 (6H, d), 0.86 (6H, d), 0.87 (3H, d)， 0.88 (6H, d)， 1.10 (2H, m), 1.20 (16H, m), 1.45 (1H, m), 1.50 (6H, m), 1.54 (2H, m), I.57 (1H, m), 1.58 (1H， m), 1.63 (1H, m), 1.85 C2H, m), 1.95 (1H， n , 2.12 (1H, m), 2.18 (2H, d-d), 2.35 (1H, d-d), 2.52 (1H, d-d), 2.75 (2H, t), 4.00 (1H, d-d), 4.24 (1H, m), 4.26 (1H, d-d). 4.32 (1H, m), 4.37 (1H， m), 4.42 (1H, m), 4.60 (1H, m), 5.05 (1H， m), 6.76 (1H, bs), 7.50 (1H, bs), 7.75 (1H, d)， 7.95 (1H, d). 8.08 (1H， d), 8.12 (1H, d), 8.14 (1H, d), 8.19 (1H, d), 8.24 (1H, d) (図 3参照)
13C核磁気共鳴スぺク トル
(100MHz, ppm, 多重度， Methyl alcohol- d4中） ：
II.9 (q), 16.1 (q), 18.5 (q), 19.7 (q), 22.2 (q), 22.2 (q),
22.8 (q) 23.1 (q). 23.1 (q) 23.1 (q), 23.4 (q), 23.4 (q) 25.8 (d) 26.0 (d), 26.0 (d) 26.1 (t), 26.4 (t)， 28.5 (t) 29.1 (t) 29.1 (d), 30.3 (t) 30.6 (t), 30.6 (t), 30.7 (t)
30.9 (d) 31.0 (t), 32.7 (t) 35.2 (t), 37.4 (t), 38.4 (d) 40.2 (t) 41.2 (t), 41.5 (t) 41.5 (t), 42.0 (t), 52.0 (d) 52.8 (d) 53.4 (d), 53.8 (d) 54.1 (d). 58.3 (d), 61.2 (d) 73.9 (d) 172.2 (s), 172.5 (s), 173.0 (s), 173.3 (s), 173.7 (s), 173.7 (s)， 174.8 (s), 175.0 (s), 175.4 (bs), 177.8 (s) 比旋光度
Figure imgf000013_0001
薄層クロマ トグラフィー
(担体 ： シリカゲルガラスプレー ト 60F254、 0.25mm, 独メルク社製） 展開溶媒 Rf クロ口ホルム一メ タノール （3 ： 1 ) 0.28 クロ口ホルムーメ タノ一ルー 28%アンモニア水（10 :4:1) 0.52 化合物 2
形状 ： 白色粉末 質量分析 （F A BMS) ： m/ z 1007 (MH)^ 分子式 ： C51H9。N8012
紫外部吸収スぺク トル （MeOH) ：末端吸収
赤外吸収スぺク トル （KBr錠法による） ：
3320, 2958, 2928, 1740, 1658, 1520, 1439， 1391, 1202 (cnr1)
1H核磁気共鳴スぺク トル
(400MHz, ppm, 多重度. Methyl alcohol-d4中） ：
0.79 (6H, d), 0.80 (3H, t), 0.81 (3H, d), 0.82 (3H, d), 0.83 (6H, d), 0.86 (6H, d), 0.87 (3H, d)， 0.88 (6H, d), 1.10 (2H, m), 1.20 (12H, m), 1.45 (1H, m), 1.50 ~1.65C11H, m), 1.85
(2H, m)， 1.95 (1H, m). 2.12 (1H, m), 2.18 (2H， d-d), 2.35 (1H, d-d), 2.55 (1H, d-d), 2.78 (2H, d), 4.00 (1H， d), 4.24 (1H, d-d), 4.26 (1H, d), 4.32 (1H, d-d), 4.37 (1H, d-d), 4.42 (1H， d-d), 4.60 (1H, d-d), 5.08 (1H, m)
薄層クロマトグラフィー
(担体 ： シリカゲルガラスプレート 60F254、 0.25ιππι, 独メルク社製） 展開溶媒 Rf クロ口ホルム一メタノール （ 3 ： 1 ) 0.28 クロ口ホルム一メ タノ一ルー 28%アンモニア水（10:4:1) 0.52 高性能液体クロマトグラフィー
カラム ； Inertsil ODS (GLサイエンス社製）
移動相 ： メタノール ：水：酢酸アンモニゥム （97 ： 3 ： 0.1) 流速 ； 1.0ral/niin、 検知器； UV 222nm、 保持時間 ； 4.38分
化合物 3
形状 ： 白色粉末
質量分析 （F A BMS) ： m/ z 1021 (MH) +
分子式 ： C52H92N8012 紫外部吸収スペク トル （MeOH) ： 末端吸収
赤外吸収スペク トル （KBr錠法による） ：
3330.2958.2928, 1736, 1652, 1520, 1456, 1389, 1203 (cm— 1)
!H核磁気共鳴スぺク トル
(400MHz, pm, 多重度， Methyl alcohol- d4中） ：
0.79 (6H, d), 0.80 (3H, t), 0.81 (3H, d), 0.82 (3H, d)， 0.83 (6H, d), 0.86 (6H, d), 0.87 (3H， d), 0.88 (6H, d), 1.10 (2H, m), 1.20 (14H, m)， 1.45 (1H, m), 1.50 〜1.65(11H. m), 1.85 (2H, m)， 1.95 (1H, in), 2.13 (1H, m), 2.18 (2H, d-d), 2.38 (1H, d-d), 2.52 (1H, d-d), 2.68 (1H, d-d), 2.73 (1H, d-d),
4.05 (1H, d)， 4.25 (1H, d-d), 4.27(1H, d-d), 4.32 (1H, d-d), 4.35(1H， d-d), 4.42 (1H, d-d), 4.60 (1H, d-d), 5.08 (1H, m) 薄層ク口マトグラフィー
(担体： シリカゲルガラスプレート 60F254、 0.25mm, 独メルク社製） 展開溶媒 Ef クロ口ホルム一メ タノール （3 : 1) 0.28 クロ口ホルム一メタノール一 28%アンモニア水（10: 4:1) 0.52 高性能液体クロマトグラフィー
カラム ； Inertsil ODS (GLサイエンス社製）
移動相 ； メ タノール ：水： 酢酸アンモニゥム （97： 3 ： 0.1) 流速 ； 1.0ml/min、 検知器 ； UV222nm、 保持時間； 4.68分 化合物 4
形状 ： 白色粉末
質量分析 （FABMS) ： m/ z 1049 (MH) +
分子式 ： C54H96N8012
紫外部吸収スぺク トル （MeOH) ： 末端吸収
赤外吸収スぺク トル （KBr錠法による） ： 3310, 2958, 2928, 1745, 1658, 1525, 1440, 1391, 1202 (cnr1) 核磁気共鳴スぺク トル
(400MHz, pm, 多重度， Methyl alcohol- d4中）
0.79 (6H, d), 0.80 (3H, t), 0.81 (3H， d)， 0.82 (3H, d), 0.83 (6H, d), 0.86 (6H, d)， 0.87 (3H, d), 0.88 (6H, d). 1.10 (2H, m), 1.20 (18H, m), 1.45 (1H, m), 1.50 ~1.65C11H, m), 1.85 (2H, m), 1.95 (1H, m), 2.12 (1H， m)， 2.18 (2H, d-d), 2.35 (1H， d-d), 2.53 (1H. d-d), 2.75 (2H, d), 4.00 (1H, d)， 4.24 (1H, d-d), 4.26 (1H, d), 4.32 (1H， d-d), 4.37(1H, d-d), 4. 2 (1H, d-d), 4.60 (1H, d-d), 5.04 (1H, m)
薄層クロマ トグラフィー
(担体 ： シリカゲルガラスプレー ト 60F254、 0.25mm, 独メルク社製） 展開溶媒 Rf クロ口ホルム一メ タノール （3 ： 1 ) 0.28 クロ口ホルム一メタノ一ルー 28%アンモニア水（10 :4:1) 0.52 高性能液体クロマ トグラフィー
カラム ； Inertsil ODS (GLサイエンス社製）
移動相 ； メタノール ： 水 ： 酢酸アンモニゥム （97： 3 ： 0.1) 流速 ： 1.0ml/niin、 検知器 ； UV222nm、 保持時間 ； 5.40分
以上の結果よ り、 化合物 1〜4の構造は以下に示されるとおりであ る
Figure imgf000017_0001
n = 7 化合物 2
n = 8 化合物 3
n = 9 化合物 1
n =10 化合物 4
(薬理作用）
試験例 1 ：本発明の環状デブシぺプチ ドのコレステロール分泌抑制活 性
Hep G2細胞 1 X 105個 Zrnl(l()%牛胎児血清を含むダルべッコ変法ィ一 グル培地（日水製薬社製 ；以後、 D- MEM培地と呼ぶ） を 24穴組織培養用プ レー トに l ralずつ注入し、 37°C、 炭酸ガス 5%および空気 95%の混合ガ ス雰囲気下で培養した。 4曰後に、 培地を除去し、 10%リボ蛋白欠損血 清 （シグマ社製） を含む D- MEM培地 l ralを加え、 さらに、 この環状デブ シペプチドのメタノール溶液 10 1を加えた。 18時間後、 培地を再び交 換 （10%リポ蛋白欠損血清を含む D-MEM培地） し、 この環状デブシぺプ チドのメタノール溶液 10 1 と 〔1- 14C〕 酢酸 3 / Ciを加え、 さらに 37 °Cで 18時間培養した。 培地中に生成した 〔14C〕 コ レステロールは 〔「バ ィォキミ力 ェ卜 ノくィオフイ ジ力 ァクタ (Biochimica et Biop ysica Acta) J 1042卷、 36~41頁（1990)〕 の方法に従って定量した。
すなわち、 培地をクロ口ホルム メタノール （2 ： 1 ) で抽出し、 つ いで抽出物を 15%水酸化力リゥム中 85°C、 45分間の条件でケン化反応を 行い、 エステル型コレステロールを遊離型コ レステロールとした。 コ レ ステロールを石油エーテルで抽出し、 これをシリ力ゲル薄層クロマトグ ラフィ一に付し、 へキサン ジェチルエーテルノ酢酸（80 ： 20 ·· 1 )で展 開した。 コレステロールのスポッ トをかきとり、 液体シンチレーション カウンターによって、 放射活性を測定し、 これを〔1 4C〕 コ レステロール 量とした。
また、 試験例 1において環状デブシぺプチドのメタノール溶液のかわ りにメタノールを用いた以外は同様に行い測定し、 コントロールとした ( さらにコン トロールの [ 1 4C] コレステロール量を 100としてコレステロ ール相対量を計算した。
本発明の環状デブシぺプチドの各濃度におけるコレステロール分泌に 及ぼす影響を表 2に示す。
表 2
本発明の環状デブシぺプチドのコレステロール分泌に及ぼす影響 化合物 濃度 （ C/ g/ml) コレステロール相対量 （％)
0. 1 83
1 0. 3 73
1 0. 9 47
1 2. 7 28
1 8. 1 23
2 8. 1 41
3 8. 1 44
4 8. 1 17
試験例 2 ： 本発明の環状デブシぺプチ ドの ト リグリセリ ド分泌抑制活 性
Hep G2細胞 1 X 105個 Zml ( 10%牛胎児血清を含む D-MEM培地） を 24穴 組織培養用プレートに l mlずつ注入し、 37て、 炭酸ガス 5 %および空気 95%の混合ガス雰囲気下で培養した。 4曰後に、 培地を除去し、 10%リ ポ蛋白欠損血清（シグマ社製）を含む D- MEM培地 1 m lを加え、 さらに、 新 規環状デプシペプチドのメタノール溶液 1を加えた。 18時間後、 培 地を再び交換 （10 %リボ蛋白欠損血清を含む D-MEM培地） し、 新規環状 デブシペプチドのメタノール溶液 10 / 1 と 〔2-3H〕 グリセロール 3 Ci を加え、 さらに 37°Cで 18時間培養した。 培地中に生成した 〔3H〕 トリグ リセリ ドは 〔 「バイオキミ力 エト バイオフイジ力 ァク夕（Biochimica et Biophysica Acta) 」 1170巻、 32~37頁 （1993) 〕 の方法により定量 した。
すなわち、 培地をへキサン/ ^イソプロパノール （3 ： 2 ) によって抽 出し、 これをシリカゲル薄層クロマトグラフィーに付し、 へキサン ジ ェチルエーテル 酢酸 （90 : 10 : 1 ) で展開した。 トリグリセリ ドのス ポッ トをかきとり、 液体シンチレ一シヨンカウンターによって、 放射活 性を測定し、 これを 〔3H〕 トリグリセリ ド量とした。
また、 試験例 2の環状デブシぺプチドのメタノール溶液のかわりにメ タノールを用いて同様に行い測定し、 コントロールとした。 さらにコン トロールの [ 3 H] トリグリセリ ド量を 100としてトリグリセリ ド相対量 を求めた。
本発明の環状デプシペプチドの各濃度における トリグリセリ ド分泌に 及ぼす影響を表 3に示す。
表 3
本発明の環状デブシぺプチドの トリグリセリ ド分泌に及ぼす影響 化合物 濃度 Qz /nil) トリグリセリ ド相対量 （％)
1 . 2. 7 84
1 8. 1 51
2 8. 1 77
3 8. 1 86
4 8. 1 75
以上表 2および表 3の結果より本発明の環状デブシぺプチドは濃度依 存的に肝細胞のコレステロールおよびトリグリセリ ドの分泌を抑制する ことが示された。
試験例 3 ：本発明の環状デブシぺプチドの H e p G 2細胞でのァポリ ポプ口ティ ン Bとアルブミ ン産生に与える影響
Hep G2細胞 1 X 105個 Zml ( 10%牛胎児血清を含む!)- MEM培地） を 24穴 組織培養用プレー卜に l mlずつ注入し、 37°Cで炭酸ガス 5 %および空気 95%の混合ガス雰囲気下で培養した。 4曰後に、 培地を除去し、 10%リ ポ蛋白欠損血清 （シグマ社製） を含む D- MEM培地 l mlを加え、 さらに環 状デプシペプチドのメタノール溶液 10 / 1を加えた。 18時間後、 培地を 再び交換 （10 %リポ蛋白欠損血清を含む!) -MEM培地） し、 環状デブシぺ プチドのメタノール溶液 10 1 を加え、 さらに 37°Cで 18時間培養した。 培地中に生成したァボリポプロティン Bとアルブミ ンはェンザィムィム ノァッセィ法によって定量した。 以下に各蛋白質の定量法を記載する。
1 ) アポリボプロテイン Bの定量
本方法で使用した緩衝液の組成を表 4に示す。 なお、 PBSとはリ ン酸 緩衝液を、 PBS-Tは Tween20を添加したリン酸緩衝液を示す。 表 4
緩衝液の組成
PBS(pH7. 2) PBS-T(pH7. 2) プロッキング液（pH7. 2)
KH2P04 0. 2g KH2P04 0. 2g Block Ace 250ml
Na2HP04 - 12H20 2. 9g Na2HP04- 12H20 2. 9g KH2P04 0. 2g NaCl 8. Og NaCl 8. Og Na2HP04 - 12H?,0 2. 9g
KC1 0. 2g KC1 0. 2g NaCl 8. Og
Tween 20 0. 5g KC1 0. 2g
*緩衝液は蒸留水を加えて、 合計 1000mlになるように調製する, ヒッジ抗ヒ トアポリポプロティン B IgG分画 （バインディ ングサイ ト 社製） を 0. 05M炭酸水素ナ ト リウム （pH9. 5) に lO ^ gZmlになるように 溶解した。 この 50 1をヌンクイムノブレートに分注し、 4 °Cで 16時間 静置した。
PBS 300 1で 3回洗浄後、 ブロッキング液 300 1を加え、 37。Cで 2 時間静置した。 再び PBS 300 1 で 3回洗浄し、 サンプル溶液 50 1 (Hep G2培地を 10%の乳タンパク質由来の免疫用プロック剤（Block Ace ; 大日本製薬社製）で 3. 3倍希釈したもの） を加え、 室温で 2時間放置し た。 PBS- T 300 1で 3回洗浄後、 ヒッジ抗ヒ トアポリポプロテイン B ペルォキシダーゼ標識体 （バインディ ングサイ ト社製） の 0. 5%溶液（10 % Block Ace) 50 1を加え、 室温で 2時間放置した。 PBS- T 300 /2 1で 5回洗浄し、 発色液 （0. 1 Mクェン酸カリウム pH4. 5 l ml , 30 %過酸化 水素水 0. 4 1， オルトフェニレンジアミ ン l mg) 100 Z 1を加え、 その まま 2分間放置した。 2 N硫酸 lOO / 1 を加え反応を止め、 490nmの吸光 度と 650nmの吸光度の差を求め、これをアポリポプロティン Bの吸光度と した。 試験例 3において、 環状デプシペプチドのメタノール溶液のかわ りにメタノールを用いた以外は同様に行い測定し、 コントロールとした ( 低密度リポ蛋白 （シグマ社製） を標準品とした場合の検量線よりァポリ ポプロティン Bの絶対量を求め、 各サンプルの相対アポリポプロテイン B量はこれとコン トロールの比率 X 100%で表した。
2 ) アルブミ ンの定量
アポリポプロテイン Bと同じ方法によって定量した。 ただし、 ヒッジ 抗ヒ トァポリボプロテイン B IgG分画 （バインディ ングサイ ト社製） の かわりにヒッジ抗ヒ トアルブミ ン IgG分画 （バインディ ングサイ ト社製） を使用し、 ヒッジ抗ヒ 卜ァポリポプロティン Bペルォキシダーゼ標識体 のかわりにヒッジ抗ヒ トアルブミ ンペルォキシダーゼ標識体を使用し た。 また、 サンプル溶液は Hep G2培地を 10 %Block Aceで 13. 3倍希釈し たものを 50 / 1加えた。 検量線作成時の標準品としては、 ヒ 卜アルブミ ン （シグマ社製） を使用した。 サンプルの相対アルブミ ン量はコント口 ールのアルブミ ンの絶対量を 100とした際の比率 （％) として求めた。 本発明の環状デブシぺプチドの各濃度におけるアポリポプロテイン B とアルブミ ン産生に及ぼす影響を表 5に示す。 表 5
本発明の環状デブシぺプチドのアポリポプロティン B およびアルブミン産生に及ぼす影響
アポリポプロティ
化合物 濃度 （ g/ml) ン B相対量 （％) アルブミン相対量 （％)
1 12. 5 48 99
1 25. 0 24 106 以上表 5の結果より、 本発明の環状デプシペプチドが Hep G2細胞にお いて、 アルブミ ンの産生に影響を及ぼさずに、 アポリポプロテイン Bの 産生を選択的に抑制することが示された。
以上の結果より、 本発明の環状デブシぺプチドは、 Hep G2細胞のコレ ステロールと ト リグリセリ ドの分泌を低濃度で強力に抑制し、 さらには アポリポプロテイン Bの産生も抑制するカ^ アルブミ ン等の他の蛋白質 の分泌を抑制しないことから、 選択性の高い 新しいタイプの高脂血症 治療薬としての利用が期待される。
(製剤例）
製剤例 1 錠剤 （1錠）
化合物 1 2 O mg
けい酸マグネシゥム 2 O mg
乳糖 9 8 . 5 mg
ヒ ドロキシプロピルセルロース 7 . 5 mg
ステアリン酸マグネシゥム 1 mg
植物硬化油 3 mg
計 1 5 0 mg
化合物 1、 けい酸マグネシウム及び乳糖を混合し、 これをヒ ドロキン プロピルセルロースを溶解したアルコール液で練合し、 次いで適当な粒 度に造粒し、 乾燥、 整粒後さらにステアリン酸マグネシウム及び植物硬 化油を添加混合し均一な顆粒とする。 次いでロータリ一式打錠機により 直径 7. 0mm. 重量 150mgおよび硬度 6 kgの錠剤を調製した。
製剤例 2 顆粒剤
化合物 1 1 O mg
酸化マグネシウム 4 O mg
りん酸水素カルシウム 3 8 mg
乳糖 1 0 mg
ヒ ドロキシプロピルセルロース 2 O mg
上記処方例中ヒ ドロキシプロピルセルロースを除いた各原料を均一に 混合し、 これにヒ ドロキシプロピルセルロースを溶解したアルコール溶 液を加えて練合した後押出造粒機により造粒し、 乾燥して顆粒を得た。 この顆粒を整粒して 12メ ッシュの篩を通過し 48メッシュの篩上に残留す るものを顆粒剤とした。 製剤例 3 シロ ップ剤
化合物 1 1.000 g
白糖 30.000 g
D -ソルビトール.70 w/ V % 25.000 g
パラォキシ安息香酸ェチル 0.030 g
パラォキシ安息香酸プロピル 0.015 g
香味料 0.200 g
グリセリ ン 0. 150
9 6 %ェタノール 0.500 g
精製水
全量 00 ml
白糖、 D—ソルビトール、 パラォキシ安息香酸メチル、 パラォキシ安 息香酸プロピル及び化合物 1を精製水 （温水） 60gに溶解する。 冷却後 香味料を溶解したグリセリ ン及びエタノールの溶液を加える。 次にこの 混合物に精製水を加えて ΙΟΟπΙにする。
製剤例 4 注射液
化合物 1ナ ト リウム塩 10.0 mg
塩化ナトリウム 81.0 mg
炭酸水素ナトリウム 8.40 mg 注射用蒸留水
全量 10. Oral
炭酸水素ナトリウム、 塩化ナトリゥム及びこの化合物 1のナトリウム 塩を蒸留水に加えて溶解し、 全量を 10. Omlとする。
製剤例 5 坐剤
化合物 1 2 g
ポリエチレングリ コール 4000 20 g
グリセリ ン 78 g 全量 1 0 0 g
化合物 1にグリセリ ンを加えて溶解する。 そこへ、 ポリエチレングリ コール 4000を加えて加温し溶解後、 坐剤型に注入して冷却固化し 1個あ たり 1. 5 gの坐剤を製造する。
産業上の利用可能性
本発明により提供される環状デプシペプチド （ I ) は、 高脂血症治療 薬、 特に脂質分泌抑制剤およびアポリポプロティン B産性抑制剤として 有用である。 本発明の化合物はバシラス属に属する本化合物の生産菌を 培養することにより製造される。

Claims

請 求 の
1 . 構造式 （ I )
Figure imgf000026_0001
(式中 nは 5 ~ 15の整数を示す） で表される環状デブシぺプチドおよ びその薬理学的に許容されうる塩。
2 . nが 6〜12の整数である請求項 1記載の環状デブシぺプチドおよび その薬理学的に許容されうる塩。
3 . nが 7、 8、 9または 10である請求項 1記載の環状デプシペプチド およびその薬理学的に許容されうる塩。
4 . バシラス属に属する請求項 1記載の環状デブシぺプチ ドの生産菌を 培養し、 その培養物から生産された環状デブシぺプチドを採取するこ とを特徴とする環状デブシぺプチドの製造法。
5 . 請求項 1乃至請求項 3のいずれかの項に記載の環状デブシぺプチド- またはその薬理学的に許容されうる塩を含有してなる医薬組成物。
6 . 請求項 1乃至請求項 3のいずれかの項に記載の環状デブシぺプチド- またはその薬理学的に許容されうる塩を含有してなる高脂血症治療
7 . 請求項 1乃至請求項 3のいずれかの項に記載の環状デブシぺプチド- またはその薬理学的に許容されうる塩を含有してなる脂質分泌抑制
8. 請求項 1乃至請求項 3のいずれかの項に記載の環状デブシぺプチド またはその薬理学的に許容される塩を含有してなるアポリポプロティ ン B産生抑制薬。
5
10
15
-25·
PCT/JP1995/001003 1994-05-26 1995-05-25 Cyclodepsipeptide WO1995032990A1 (fr)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/737,599 US5801143A (en) 1994-05-26 1995-05-25 Cyclic depsipeptides useful for treatment of hyperlipemia
JP50064696A JP3718226B2 (ja) 1994-05-26 1995-05-25 環状デプシペプチド
EP95919634A EP0761682B1 (en) 1994-05-26 1995-05-25 Cyclodepsipeptides
DE69519669T DE69519669T2 (de) 1994-05-26 1995-05-25 Cyclodepsipeptide
KR1019960706672A KR970703363A (ko) 1994-05-26 1995-05-25 환상 뎁시펩티드(cyclodepsipeptide)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP11302394 1994-05-26
JP6/113023 1994-05-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1995032990A1 true WO1995032990A1 (fr) 1995-12-07

Family

ID=14601511

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1995/001003 WO1995032990A1 (fr) 1994-05-26 1995-05-25 Cyclodepsipeptide

Country Status (5)

Country Link
US (1) US5801143A (ja)
EP (1) EP0761682B1 (ja)
JP (1) JP3718226B2 (ja)
DE (1) DE69519669T2 (ja)
WO (1) WO1995032990A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997049724A1 (fr) * 1996-06-25 1997-12-31 Nisshin Flour Milling Co., Ltd. Depsipeptides cycliques et medicaments contenant ces composes comme ingredient actif
WO1998006744A1 (de) * 1996-08-12 1998-02-19 Dirk Vollenbroich Verfahren zur inaktivierung von lipidumhüllten viren mit lipopeptiden und neue antivirale lipopeptide
EP0960885A1 (en) * 1996-06-25 1999-12-01 Nisshin Flour Milling Co., Ltd. Depsipeptides and drugs containing the same as the active ingredient

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6001815A (en) * 1997-12-25 1999-12-14 Nisshin Flour Milling Co., Ltd. Depsipeptides containing N-substituted glycine residue
US6211145B1 (en) 1997-12-25 2001-04-03 Nisshin Flour Milling Co., Ltd. Bicyclic depsipeptides
EP0931792B1 (en) * 1998-01-27 2004-01-07 Nisshin Seifun Group Inc. Depsipeptides containing non-natural amino acids
KR100309888B1 (ko) * 1999-07-31 2001-11-01 황규언 골다공증 예방 및 치료제 조성물

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6021998B2 (ja) * 1982-11-20 1985-05-30 工業技術院長 アシル基を有するペプチド、微生物によるその製法及びそれからなる環状アデノシン３′，５′−モノリン酸ホスホジエステラ−ゼ阻害剤

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4891220A (en) * 1988-07-14 1990-01-02 Immudyne, Inc. Method and composition for treating hyperlipidemia
WO1993017701A1 (en) * 1992-03-12 1993-09-16 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Endothelin receptor-binding peptides

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6021998B2 (ja) * 1982-11-20 1985-05-30 工業技術院長 アシル基を有するペプチド、微生物によるその製法及びそれからなる環状アデノシン３′，５′−モノリン酸ホスホジエステラ−ゼ阻害剤

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS, Vol. 37, No. 10, (1984), p. 1257-1259; KOKO SUGAWARA et al., "BMY-28160, A New Peptide Antibiotic". *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997049724A1 (fr) * 1996-06-25 1997-12-31 Nisshin Flour Milling Co., Ltd. Depsipeptides cycliques et medicaments contenant ces composes comme ingredient actif
EP0960885A1 (en) * 1996-06-25 1999-12-01 Nisshin Flour Milling Co., Ltd. Depsipeptides and drugs containing the same as the active ingredient
EP0967222A4 (en) * 1996-06-25 2001-08-22 Nisshin Flour Milling Co CYCLIC DEPSIPEPTIDES AND MEDICINES CONTAINING THESE COMPOUNDS AS ACTIVE INGREDIENT
EP0960885A4 (en) * 1996-06-25 2002-08-28 Nisshin Seifun Group Inc DEPSIPEPTIDES AND MEDICATIONS, WHICH CONTAIN THE SAME AS ACTIVE INGREDIENCIES
US6858585B1 (en) 1996-06-25 2005-02-22 Nisshin Seifun Group Inc. Cyclic depsipeptides and drugs containing the same as the active ingredient
WO1998006744A1 (de) * 1996-08-12 1998-02-19 Dirk Vollenbroich Verfahren zur inaktivierung von lipidumhüllten viren mit lipopeptiden und neue antivirale lipopeptide
US6787520B2 (en) 1996-08-12 2004-09-07 Dirk Vollenbroich Inactivating process for lipid envelopped virus, and new antivirus lipopeptides

Also Published As

Publication number Publication date
DE69519669T2 (de) 2001-04-26
EP0761682A1 (en) 1997-03-12
EP0761682A4 (en) 1997-07-30
JP3718226B2 (ja) 2005-11-24
DE69519669D1 (en) 2001-01-25
US5801143A (en) 1998-09-01
EP0761682B1 (en) 2000-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW208703B (ja)
JPS62277321A (ja) Ｆｒ―９００５０６物質の固形医薬製剤用固溶体組成物
CN107531649B (zh) 含二芳基甲烷结构的羧酸类urat1抑制剂、制备方法及其用途
JP5539193B2 (ja) マクロラクトン誘導体
WO1995032990A1 (fr) Cyclodepsipeptide
WO2000042062A1 (fr) Nouveau compose a base de depsipeptide
JP3111240B2 (ja) Ｆａ−７０ｄ物質、その製造法及びその用途
JPH0394692A (ja) 生理活性物質ｂｅ―１８２５７類
US5498627A (en) Octahydro-2-naphthalenecarboxylic acid derivative, its production and use
EP1372640B1 (en) Use of thiolutin dioxide and its derivatives in the manufacture of a medicament for the treatment of cns disorders
JPH0532579A (ja) エストロゲン物質ｂｅ−２５３２７及びその製造法
JPH037274A (ja) 新規ベンゾフラン誘導体、そほ製造法およびそれを含有する医薬組成物
JPH05219973A (ja) 血管拡張剤および化合物ｍｓ−２８２
JPH01131177A (ja) Ｎｆ−１６１６−９０４物質
JP2000072760A (ja) 新規シストチアゾール類縁体
JPS62132878A (ja) 新生理活性物質モナコリンｍ及びその製造法
US5324742A (en) Aldose reductase inhibitor obtained from Crucibulum sp. RF-3817
JPH09221428A (ja) Ｗｂ２６６３ｂ物質を含有する免疫抑制剤
EP2033636A1 (en) Method of purifying pravastatin
JPH0525190A (ja) 新規薬理活性物質クリソスポリン及びその製造法
JPH06239892A (ja) Ａｃａｔ阻害物質ｒｆ−２６９１ａおよびｂならびにその誘導体
JPH1160589A (ja) 新規生理活性物質ｎａ００２２６ｂ及びｃ、その製造法及びその用途
JPH0525150A (ja) 新規デカレストリクチン類および関連化合物、それらの製造方法およびそれらの使用
JPH06172397A (ja) 新規物質ドラスタチンｃ及びその用途
EP1572697A1 (de) Neu spirobenzofuranlactame und ihre derivate, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung derselben

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): JP KR US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): DE FR GB IT

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1995919634

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 08737599

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1995919634

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1995919634

Country of ref document: EP