WO1995030740A1

WO1995030740A1 - Verfahren zur gewinnung von peptidamidase enthaltenden mikroorganismen, damit gewonnene mikroorganismen, darin enthaltene peptidamidasen und deren verwendung

Info

Publication number: WO1995030740A1
Application number: PCT/EP1995/001689
Authority: WO
Inventors: Ursula Stelkes-Ritter; Maria-Regina Kula; Klaudia Wyzgol; Andreas Bommarius; Michael Schwarm; Karlheinz Drauz
Original assignee: Degussa Aktiengesellschaft
Priority date: 1994-05-09
Filing date: 1995-04-29
Publication date: 1995-11-16
Also published as: EP0759066B1; EP0759066A1; US5985632A; US6333176B1; JPH09510623A; JP3112090B2; DE19516018A1; DE59509369D1

Abstract

Bekannt ist eine pflanzliche Peptidamidase aus dem Flavedo von Orangen. Diese ist nur in geringen Mengen und saisonabhängig zu gewinnen. Die neuen Enzyme sind mikrobielle Peptidamidasen, die aus Mikroorganismen erhältlich sind, welche in einem 'Doppel-Screening' aus Bodenproben gewonnen und vermehrt werden. Die mikrobiellen Peptidamidasen sind besonders nützlich bei a) Herstellung von Peptiden und N-terminal geschützten Aminosäuren, b) Racematspaltung von N-geschützten Aminosäureamiden, c) Gewinnung nichtproteinogener D-Aminosäuren, d) Gewinnung neuer Nα-geschützter D-Aminosäureamide.

Description

Verfahren zur Gewinnung von Peptidamidase enthaltenden

Mikroorganismen, damit gewonnene Mikroorganismen, darin enthaltene Peptidamidasen und deren Verwendung Beschreibung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von Peptidamidase enthaltenden Mikroorganismen, damit gewonnene Mikroorganismen, darin enthaltene Peptidamidasen und deren Verwendung. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Screening-Verfahren für Peptidamidaseaktivität zeigende Mikroorganismen gemäß Oberbegriff des Anspruchs 1; nach diesem Verfahren

erhaltene und hinterlegte Mikroorganismen gemäß den

Ansprüchen 2 - 4; aus den Mikroorganismen isolierbare

Peptidamidasen gemäß Ansprüchen 5 - 7 sowie deren

Verwendung.

Zum Stand der Technik werden die Druckschriften

(1) DE-OS 36 29 242,

(2) K. Breddam, Carlsberg Res. Commun. 49 (1984) 535 - 554, (3) DE-PS 40 14 564 und

(4) Y. Nishida et al., Enzyme Microb. Technol., 6 (1984),

85 - 90

genannt.

Eine Peptidamidase ist ein Enzym, das die selektive

Hydrolyse einer C-terminalen Amidfunktion in einem

Peptidamid katalysiert, d. h. folgende Umsetzung

beschleunigt:

Hierin bedeuten R' für n = 0 eine Schutzgruppe und für n > 0 eine beliebige Aminosäure, eine Schutzgruppe oder H; n steht für Null oder eine beliebige ganze Zahl, R_x sind die Seitenketten der Aminosäuren für n > 0, während R₁ die Seitenkette der C-terminalen Aminosäure bedeutet.

Die selektive Abspaltung der C-terminalen Aminogruppe von Peptidamiden ist durch eine chemische Umsetzung i. allg. schwer zu erreichen, da die Peptidbindung ebenfalls einem hydrolytischen Angriff unterliegt. Daraus ergeben sich schwer zu trennende Gemische und geringe Ausbeuten.

Aus (1) sind Amidasen für eine enzymatische Abspaltung der Säureamidgruppe bekannt, die jedoch aufgrund ihrer

α-Aminosäureamidaseaktivität nur zur Herstellung von

L-Aminosäuren aus α-ungeschützten D,L-Aminosäureamiden eingesetzt werden können, Peptidamide werden nicht

akzeptiert.

Aus (4) ist die kontinuierliche Herstellung von N-Ac-L-Met aus N-Ac-D,L-methioninamid in einem enzymatischen Verfahren unter Verwendung von Erwinia carotovera bekannt. Erwinia carotovera enthält zwar eine Amidaseaktivität, diese ist jedoch ausschließlich auf Amide des Methionins beschränkt. Damit handelt es sich bei dem Enzym aus Erwinia carotovera nur um einen "Aminosäure-Amidabspalter" und nicht um eine Peptidamidase. Ferner kann das Enzym aus Erwinia carotovera offenbar nur N-acetylierte

Aminosäureamide umsetzen, wobei die Ac-Schutzgruppe nachteilig nur schwer oder nicht wieder abspaltbar ist. Andererseits kennt man Peptidasen, welche die hydrolytische Spaltung der Peptidbindungen katalysieren und von denen lediglich bekannt ist, daß sie eine gewisse Nebenaktivität zur Abspaltung der C-terminalen Amidschutzgruppe besitzen. Ein Beispiel dafür ist die Carboxypeptidase Y, insbesondere in chemisch modifizierter Form (siehe (2)).

Alle diese Verfahren haben also gravierende Nachteile.

Stand der Technik ist gemäß (3) auch eine Peptidamidase, die aus dem Flavedo von Citrusfruchten, insbesondere von Orangen, isoliert werden kann. Die beschriebene

Peptidamidase greift die Peptidbindung nicht an und

katalysiert die Abspaltung der freien Aminogruppe von

Peptidamiden. Die aus (3) bekannte Peptidamidase

kennzeichnet sich durch folgende Parameter: - Abspaltung der C-terminalen Aminogruppe von Peptidamiden und N-terminal geschützten Aminosäureamiden;

- keine Spaltung von Peptidbindungen;

- optimaler pH-Wert bei 7,5 ± 1,5;

- gute Stabilität im pH-Bereich zwischen pH 6,0 und

pH 9,0;

- die optimale Temperatur beträgt 30 °C bei einem pH-Wert von 7,5;

- schwache Inhibierung durch Hemmstoffe von

Serinproteasen, insbesondere

Phenylmethansulfonylfluorid;

- das Molekulargewicht beträgt 23 000 ± 3 000;

- Aggregatbildung wird gelegentlich beobachtet;

- der isoelektrische Punkt liegt bei pH 9,5;

- das Enzym akzeptiert keine D-Aminosäurereste in

C-terminaler Position, wobei die

Hydrolysegeschwindigkeit deutlich geringer ist als bei L-Aminosäureresten . Das isolierte Enzym ist aus Flavedo allerdings nur in geringen Mengen und saisonabhängig zu gewinnen. Auch gelang es in weiterführenden Arbeiten trotz einer ca. 500fachen Anreicherung nicht, das Protein in homogener Form

darzustellen, so daß molekular-genetische Arbeiten zur

Verbesserung der Enzymproduktion aus Mangel an Daten nicht aufgenommen werden konnten.

Hiermit wird jedoch auch der in (3) gegebene Hinweis gegenstandslos, daß sich eine mikrobielle Produktion des Enzyms durch gentechnologische Manipulation in bekannter Weise erreichen ließ. Gerade die Schwierigkeiten bei der Darstellung der homogenen Form lassen gentechnologische Manipulationen nicht zu.

Angesichts der mit dem Stand der Technik verbundenen

Probleme ist es daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Isolierung von Peptidamidase enthaltenden

Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen, das eine schnelle Auswahl geeigneter Stämme ermöglicht. Aufgabe ist auch eine stabile Peptidamidase, die bei gleich hoher Selektivität der hydrolytischen Abspaltung der freien Aminogruppe am C-terminalen Ende von Peptidamiden, besser verfügbar ist als die bekannte Peptidamidase aus Flavedo.

Gelöst werden diese und weitere nicht im einzelnen

aufgeführte Aufgaben durch ein Verfahren mit den Merkmalen des kennzeichnenden Teils des Anspruchs 1.

Mikroorganismen sind praktisch zu jeder Jahreszeit in beliebiger Menge zu produzieren. Daher werden in einem limitierten Screening Sammlungsstamme und isolierte Stämme, die Amidstickstoff als Stickstoffguelle mobilisieren können, auf Peptidamidaseaktivität untersucht. Als

Testsubstrat wurde Z-Gly-Tyr-NH₂ eingesetzt und das

erwartete Hydrolyseprodukt Z-Gly-Tyr-OH mittels HPLC bestimmt. Dadurch, daß man in einem "Doppel-Screening"

Mikroorganismen enthaltende Proben zuerst in einem

Nährmedium, das Amidstickstoff als Stickstoffquelle

aufweist, bebrütet und anschließend entstandene Kolonien auf ein Nährmedium überimpft, das N-Acetyl-D,L- Methioninamid enthält, bebrütet und die Mikroorganismen auswählt, die in beiden Nährmedien wachsen, gelingt es in einer ungewöhnlich guten Erfolgsquote Stämme aufzufinden, die sowohl relativ stabil als auch selektiv und aktiv sind. Für das Screening nach Mikroorganismen, die Amidstickstoff verwerten können, wurden Bodenproben in isotonischer

Kochsalzlösung 4 - 6 Stunden aufgeschlämmt, wobei die

Bodenproben willkürlichen Ursprungs waren, u. a. aus

Gartenerde, Waldboden, Lehm- oder Sandboden stammten. Die Feststoffe wurden bei 2000 Upm durch Zentrifugation

abgetrennt. Der Überstand wurde auf Agarplatten

ausgestrichen bzw. zum Animpfen von Flüssigmedien in

Erlenmeyerkolben genutzt. Die Platten wurden für 3 - 7 Tage bei 30 °C inkubiert, die Erlenmeyerkolben bei der gleichen Temperatur bei 120 Upm geschüttelt. Anschließend wurden von den Platten Einzelkulturen isoliert und durch mehrmaliges Ausstreichen in Reinkultur gebracht. Aus den bebrüteten Erlenmeyerkolben wurden nach dieser Zeit Aliquots entnommen und damit frisches Medium angeimpft. Dieser Vorgang wurde bis zu fünfmal wiederholt, bevor Proben der

Kulturflüssigkeit nach geeigneter Verdünnung auf Platten ausgestrichen wurden. Das Nährmedium sowohl für das feste als auch für das flüssige Medium hatte folgende

Zusammensetzung: K₂HPO₄ 2.50 g/l

KH₂PO₄ 1.95 g/l

NaCl 1.00 g/l

CaCl₂*2H₂O 0.05 g/l

MgSO₄*7H₂O 0.30 g/l

Hefeextrakt 0.50 g/l DL-Carnitinamid 5.00 g/l

Spurensalzlösung 0.80 ml/l

Vitaminlösung 2.5 ml/l

(Agar für Festmedien 18.0 g/l)

pH 7.2

CaCl₂*2H₂O, MgSO₄*7H₂O sowie DL-Carnitinamid und die Vitaminlösung (s. u.) wurden sterilfiltriert dem

autoklavierten, abgekühlten Medium zugesetzt. Die

Spurensalzlösung setzte sich wie folgt zusammen: H3BO3 75.0 mg

MnCl₂*4H₂O 50.0 mg

ZnCl₂ 187.0 mg

CuSO₄*5H₂O 50.0 mg

FeCl₃*6H₂O 625.0 mg

(NH₄)₈Mo7O₂4*4H₂O 25.0 mg

CoSO₄*7H₂O 37.5 mg

H₂O demin. ad. 0.2 l

Auf diesem Medium gewachsene und vereinzelte

Mikroorganismen wurden für das Screening nach Organismen mit Peptidamidaseaktivität eingesetzt.

Für das Screening nach Mikroorganismen mit

Peptidamidaseaktivität wurde ein Teil der oben gewonnenen Organismen auf Agarnährboden ausgestrichen und für 2 Tage bei 30 °C inkubiert. Zur Gewinnung höherer Zellmassen wurden die Kulturen in 100 ml Erlenmeyerkolben mit 20 ml Medium angereichert. Die Inkubation erfolgte bei 30 °C für 2 Tage bei 120 Upm. Das hierfür benutzte Nährmedium hatte folgende Zusammensetzung:

KH₂PO₄ 0.50 g/l

K₂HPO₄ 2.00 g/l

NaCl 1.00 g/l

CaCl₂*2 H₂O 0.05 g/l

MgSO₄*7H₂O 0.10 g/l Glucose 5.00 g/l

DL-Carnitinamid 1.00 g/l

N-Ac-DL-Met-NH₂ 2.00 g/l

Hefeextrakt 0.50 g/l

Vitaminlösung 2.50 ml/l

Spurensalzlösung 0.80 ml/l

(Agar für Festmedien 18.00 g/l

pH 7.3

Dabei wurde N-Ac-D, L-Met-NH₂ als Induktor eingesetzt.

Glucose als Kohlenstoffquelle sollte vermeiden, daß der Induktor vom N-Terminus her angegriffen wird. Amide,

Glucose, CaCl₂ *2H₂O, MgSO₄*7H₂O und die Vitaminlösung wurden sterilfiltriert dem autoklavierten, abgekühlten Nährmedium zugesetzt (Zusammensetzung der Spurensalzlösung und der Vitaminlösung siehe unten).

Die Zellen wurden zentrifugiert, mit 50 mM Tris/HCl, pH 7.5 gewaschen und in eben diesem Puffer aufgenommen

(20 - 40 %ige Zellsuspension). Der Zellaufschluß erfolgte durch Naßvermahlung mit Glasperlen von 0.3 mm im

Durchmesser.

Die hieraus gewonnenen Rohextrakte wurden auf ihre

Fähigkeit zur Hydrolyse von Z-Gly-Tyr-NH₂ hin untersucht.

Von 45 auf Desamidierung hin untersuchten Stämmen zeigten 6 die Fähigkeit zur Umsetzung von Z-Gly-Tyr-NH₂ zu Z-Gly-Tyr-OH . In Tabelle 1 werden ausgewählte Daten aus dem Screening für Peptidamidasen dargestellt.

Die isolierten Stämme 4, 11, 18, 21, 22, 42 wurden bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen DSM auf den Namen der Anmelderin hinterlegt.

Von den hinterlegten Stämmen wurde Stamm 11 für weitere Untersuchungen ausgewählt. Von der DSM wurde Stamm 11 als Stenotrophomonas maltophilia (Xanthomonas maltophilia) bestimmt. Die Stämme 4, 18, 21, 22 und 42 wurden ebenfalls taxiert, mit dem Ergebnis, daß die Stämme 4, 18, 21 und 22 ebenfalls als Stenotrophomonas maltophilia (Xanthomonas maltophilia), der Stamm 42 als Ochrobactrum anthropi identifiziert wurden.

Gegenstand der Erfindung sind auch aus den gescreenten Mikroorganismen erhältliche Peptidamidasen. Die Peptidamidase wird intrazellulär gebildet und kann nach dem Fachmann geläufigen Verfahren aus den Zellen isoliert und gereinigt werden.

Die mikrobielle Peptidamidase kennzeichnet sich durch folgende Parameter - Abspaltung der C-terminalen Aminogruppe von

Peptidamiden und N-terminal geschützten

Aminosäureamiden;

- keine Spaltung von Peptidbindungen;

- optimaler pH-Wert bei 6,0 ± 0,5;

- gute Stabilität im pH-Bereich zwischen pH 7 und pH 8; - die optimale Temperatur beträgt 35 - 40 °C bei einem pH-Wert von 7,5;

- Inhibierung von Serinresten durch Hemmstoffe, wie

Phenylmethansulfonylfluorid, sowie insbesondere 4-(2- Aminoethylbenzylsulfonylfluorid) (Pefabloc);

- das Molekulargewicht beträgt etwa 38.000 Dalton

(bestimmt durch Gelfiltration);

- der isoelektrische Punkt liegt bei pH 5,8. Die Erfindung umfaßt ebenfalls die isozymen Formen der erfindungsgemäßen mikrobiellen Peptidamidase. Unter isozymen Formen werden dabei die Enzyme in anderen

Mikroorganismen verstanden, die dieselbe Reaktion

katalysieren wie die Peptidamidase aus Xanthomonas

maltophilia.

In Tabelle 2 werden einige Daten zur Aufreinigung der Peptidamidase aus Xanthomonas maltophilia angegeben.

Die gereinigte Peptidamidase aus Xanthomonas maltophilia hat insbesondere folgende charakteristische Eigenschaften: - Aufreinigung von > 500 bei einer Ausbeute von > 60 %

- Molekulargewicht von 38000 Da (Gelfiltration)

- isoelektrischer Punkt liegt bei pH 5.8

- Temperaturoptimum zwischen 37 - 45 °C

- pH Optimun zwischen 5 - 6.5

- bei 20, 30 und 37 °C über 3 Tage temperaturstabil

- bei pH 7 - 8 ist das Enzym bei 30 °C über 7 Tage stabil

- bei Zusatz von 20 % DMF zeigt die Peptidamidase nach 24 h eine Restaktivität von 32 % bei einem pH-Wert von 7.5

- Serinrest entscheidend für Enzymaktivität.

Die N-terminale Anfangssequenz der Peptidamidase aus

Xanthomonas maltophilia ist:

AS 1 X

AS 2 Arg

AS 3 Asn

AS 4 Val

AS 5 Pro AS 6 Phe

AS 7 Pro

AS 8 Tyr

AS 9 Ala

AS 10 Glu

AS 11 Thr

AS 12 Asp

AS 13 Val

AS 14 Ala

AS 15 Asp

AS 16 Leu

AS 17 Gin

Die erste Aminosäure konnte nicht bestimmt werden. In dem Programm Genepro 5.0 der Datenbank PIR Version 30 konnte keine vergleichbare Sequenz ermittelt werden.

In der folgenden Tabelle 3 sind die Eigenschaften der bekannten pflanzlichen Peptidamidase aus Flavedo von Orangen (PAF) und der erfindungsgemäßen mikrobiellen Peptidamidase aus Xanthomonas (PAX) verglichen. Die erfindungsgemäße Peptidamidase zeigt danach weder Peptidaseaktivität noch Aminosäureamidaseaktivität.

Die zur Erfindung gehörigen mikrobiellen Peptidamidasen eignen sich sehr vorteilhaft zur Katalyse einer ganzen Reihe von Reaktionen. So lassen sich die erfindungsgemäßen mikrobiellen

Peptidamidasen erfolgreich zur Herstellung von Peptiden und N-terminal geschützten Aminosäuren der allgemeinen

Formel II

in der R' eine Schutzgruppe oder ein beliebiger peptidisch oder isopeptidisch gebundener Aminosäure- oder Peptidrest ist und R₁ Wasserstoff oder eine beliebige Seitenkette bedeutet, unter enzymatischer Abspaltung einer C-terminalen Aminogruppe von einem Peptidamid oder einem N-terminal geschützten Aminosäureamid einsetzen.

In bevorzugter Verfahrensvariante wird diese enzymatische Reaktion kontinuierlich durchführt.

Weiterhin ist es bevorzugt, daß man die Desamidierung als Verfahrensschritt einer gekoppelten Umsetzung mit einem Enzymsystem durchführt, das Proteasen, Peptidasen,

Esterasen und/oder Lipasen umfaßt. Hierbei ist besonders die Selektivität der erfindungsgemäßen Peptidamidasen von Vorteil.

Die mikrobiellen Peptidamidasen lassen sich erfindungsgemäß auch in Verfahren zur Herstellung von Peptiden der oben erwähnten Art durch enzymatische Umsetzung von ggf. N-geschützten Aminosäurealkylestern bzw. ggf. N-geschützten Peptidalkylestern mit Aminosäureamiden in wäßriger Phase oder wäßrig-organischem Milieu verwenden. Hierbei verläuft die Reaktion in Gegenwart eines die peptidische Verknüpfung herbeiführenden Enzyms und unter enzymatischer Abspaltung der Amidschutzgruppe, wobei man die Synthese kontinuierlich ablaufen läßt und das Peptidamid mittels der Peptidamidase enzymatisch zum Peptid hydrolysiert und schließlich das Peptid aufgrund seiner Ladung vom Reaktionsgemisch abtrennt und das Aminosäureamid zurückführt .

Weiterhin kann die mikrobielle Peptidamidase der Erfindung auch zur Racematspaltung von N-geschützten Aminosäureamiden verwendet werden, wobei ein racemisches Gemisch von

N-geschützten Aminosäureamiden mit der Peptidamidase inkubiert wird und bis zum vollständigen Umsatz des

N-geschützten L-Aminosäureamids reagiert wird und

nachfolgend die N-geschützte L-Aminosäure vom N-geschützten D-Aminosäureamid aufgrund der Ladungsunterschiede getrennt wird. Ferner lassen sich erfindungsgemäß auch D-Aminosäuren herstellen. So kann beispielsweise im Rahmen der Erfindung durch Verwendung der erfindungsgemäßen mikrobiellen

Peptidamidase selektiv das N^-geschützte L-Aminosäureamid enzymatisch hydrolysiert werden, das N_α-geschützte

D-Aminosäureamid abgetrennt und mittels Säurehydrolyse in die freie D-Aminosäure überführt werden. Zu den für die

Erfindung nützlichen Aminosäureamidracematen gehören u. a. N_α-Formyl-DL-methioninamid, N_α-Methylaminocarbonyl-DL-methioninamid, N_α-Methoxycarbonyl-DL-methioninamid,

N_α-Ethoxycarbonyl-DL-methioninamid, N_α-Benzyloxycarbonyl-DL-methioninamid, N_α-Acetyl-DL-neopentylglycinamid,

N_α-Benzyloxycarbonyl-DL-neopentylglycinamid.

Schließlich lassen sich die erfindungsgemäßen mikrobiellen Peptidamidasen mit großem Vorteil auch zur Gewinnung nichtproteinogener D-Aminosäuren einsetzen, wobei man bevorzugt sterisch anspruchsvolle, N-geschützte racemische Aminosäureamide wie N-Acetyl-Neopentylglycinamid, N-Acetyl- Naphthylalaninamid, N-Acetylphenylglycinamid oder ähnliche Derivate einsetzt. Die N-Acetyl-L-Aminosäureamide werden enzymatisch hydrolysiert, die N-Acetyl-D-Aminosäureamide durch Chromatographie aus dem Reaktionsgemisch abtrennt und schließlich mittels Säurehydrolyse in die freien

D-Aminosäuren überführt.

Zu den durch Verwendung der erfindungsgemäßen mikrobiellen Peptidamidase aus den bevorzugten racemischen

N_α-geschützten Aminosäureamiden erhältlichen

N_α-geschützten D-Aminosäureamiden gehören z. B.:

N_α-Formyl-D-methioninamid, N_α-Methylaminocarbonyl-D-methioninamid, N_α-Methoxycarbonyl-D-methioninamid,

N_α-Ethoxycarbonyl-D-methioninamid, N_α-Benzyloxycarbonyl-D-methioninamid, N_α-Acetyl-D-neopentylglycinamid,

N_α-Benzyloxycarbonyl-D-neopentylglycinamid.

Nachfolgend wird die Erfindung eingehender anhand von

Beispielen erläutert. Weitere Ausführungsformen und

Besonderheiten ergeben sich insbesondere auch aus den beigefügten Figuren, auf die in der Beschreibung Bezug genommen wird.

In den Figuren zeigen:

Fig. 1: Die Abhängigkeit der Umsatzrate [%] vom pH-Wert für aus Xanthomonas maltophilia gewonnene Peptidamidase

Fig. 2: Eine Auftragung der relativen Aktivität gegen die

Zeit für Peptidamidase aus Xanthomonas maltophilia in verschiedenen Puffern bei 30 °C

Fig. 3: Auftragung der Umsatzrate in Abhängigkeit von der

Temperatur für Peptidamidase aus Xanthomonas maltophilia

Fig. 4: Temperaturstabilität der Peptidamidase aus

Xanthomonas maltophilia

Fig. 5: Kinetische Bestimmung des Umsatzes von Z-Gly-Tyr- NH₂ mit der Peptidamidase aus Xanthomonas maltophilia Fig. 6: Racematspaltung von Z-D, L-Ala-NH₂ mit der

Peptidamidase aus Xanthomonas maltophilia

Fig. 7: Enantioselektive Desamidierung von N-Ac-D,L-Met-NH₂ mit der Peptidamidase aus Xanthomonas maltophilia Fig. 8: Lösungsmitteleinfluß auf die Enzymaktivität der

Peptidamidase aus Xanthomonas maltophilia

Fig. 9: Lösungsmittelstabilität der Peptidamidase aus

Xanthomonas maltophilia Beispiel 1

Produktion und Aufarbeitung der Peptidamidase aus

Xanthomonas maltophilia

1.1 Wachstum

In dem partiell optimierten Medium der folgenden

Zusammensetzung wurden 40 g Biofeuchtmasse/1 und eine Aktivität von 4 U/l erhalten. Die Medienoptimierung erfolgte mit Hilfe des Genetischen Algorithmus. Das

Nährmedium wurde autoklaviert, Glucose, N-Ac-DL-Met-NH₂, CaCl₂*2H₂O, MgSO₄*7H₂O und die Vitaminlösung wurden steril hinzugefügt.

N-Ac-D,L-Met- -NH₂ 4.3 g/l

Hefeextrakt 4.5 g/l

Pepton aus Casein 19.7 g/l

Glukose 18.4 g/l

KH₂PO₄ 0.5 g/l

K₂HPO₄ 2.0 g/l

NaCl 1.0 g/l

CaCl₂*2 H₂O 0.05 g/l

MgSO₄*7 H₂O 0.1 g/l

Vitaminlösung nach Schlegel* 2.5 ml/l Spurensalzlösung 0.8 ml/l

(Agar bei Festmedien 18.0 g/l)

Schlegel, H. G. (1985) : Allgemeine Mikrobiologie, Thieme Verlag, Stuttgart Spurensalzlösung H3BO3 75.00 mg

MnCl₂*4H₂O 50.00 mg

ZnCl₂ 187.50 mg

CuSO₄*5H₂O 50.00 mg

FeCl3*6H₂O 625.00 mg (NH4)₆Mo₇O₂4*4H₂O 25.00 mg

CoCl₂*6H₂O 37.50 mg

NiCl₂*6H₂O 50.00 mg H₂O ad 0.2 l 1.2 Zellaufschluß

Der Zellaufschluß erfolgte durch Naßvermahlung einer

20 - 40 %igen Zellsuspension in 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7.5 mit Glasperlen 0 0.3 mm. Die Glasperlen sowie die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation abgetrennt.

Anschließend wurden die Glasperlen in 50 mM Tris/HCl, pH 7.5 resuspendiert und erneut durch Zentrifugation abgetrennt. Die Überstände wurden vereinigt und stellten den Rohextrakt für die im folgenden beschriebene

Aufarbeitung dar. Der Zellaufschluß wurde durch Bestimmung der freigesetzten Proteinmenge nach Bradford (Bradford, M. M. (1976), Anal. Biochem., 72_., 248 - 254) und

mikroskopische Beobachtung beurteilt.

1.3 Reinigung 1.3.1 Ionenaustauschchromatographie

Als erster Schritt der Aufreinigung der Peptidamidase aus Xanthomonas maltophilia wurde eine

Anionenaustauschchromatographie an Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia, Uppsala) durchgeführt. Für den

Anionenaustauscher galten folgende Bedingungen:

Säule 10 cm * π * 1.3 1.3 cm ² = 53 ml

Q Sepharose FF (Pharmacia, Uppsala) Laufgeschwindigkeit 10 ml/min

Äquilibrierung 50 mM Tris, 20 mM KCl, pH 8.0

Probeaufgabe 77.2 ml Rohextrakt à 6.8 mg BSAeq/ml Waschen 50 mM Tris/HCl, 20 mM KCl, pH 8.0 Elution Linearer Gradient mit steigendem

Salzgehalt

200 ml 50 mM Tris, 20 mM KCl, pH 8.0

200 ml 50 mM Tris, 200 mM KCl, pH 8.0

Die Detektion erfolgte bei 280 nm, die Fraktionen wurden zu je 10 ml aufgefangen. Die Peptidamidase konnte bei einem Salzgehalt von 80 - 120 mM KCl von dem Anionenaustauscher eluiert werden. Die aktiven Fraktionen wurden gepoolt und mit Hilfe einer Amicon Ultrafiltrationszelle mit einer YM 10 Membran auf 2 ml für die anschließende Gelfiltration aufkonzentriert.

1.3.2 Gelfiltration

Die aktiven Fraktionen der Anionenaustauschchromatographie wurden wie beschrieben aufkonzentriert und einer

Gelfiltration an Superdex G 75 Material (Pharmacia,

Uppsala) unterzogen. Für die Gelfiltration galten folgende Bedingungen :

Säule 60 cm * π * 0.8 0.8 cm ² = 120.6 ml

Superdex G 75 (Pharmacia, Uppsala)

Laufgeschwindigkeit 1 ml/min

Äquilibrierung 50 mM Tris, 150 mM KCl, pH 7.5

Probe 2 ml à 4.55 mg BSAeq/ml der

aufkonzentrierten aktiven

Fraktionen der

Anionenaustauschchromatographie Elution 50 mM Tris, 150 mM KCl, pH 7.5

Fraktionsgröße 1 ml

Detektion 280 nm Die aktiven Fraktionen der Gelfiltration wurden gepoolt und über eine YM 10 Membran in einer Amicon

Ultrafiltrationszelle auf 1 ml aufkonzentriert (1.47 mg BSAeq/ml) und standen so für die anschließende

isoelektrische Fokussierung zur Verfügung. 1.3.3 Isoelektrische Fokussierung

Die aktiven und wie unter 1.3.2 beschrieben auf 1 ml eingeengten Fraktionen der Gelfiltration wurden mit Hilfe der isoelektrischen Fokussierung weiter aufgereinigt. Die Bedingungen hierfür sind im folgenden wiedergegeben. Säule 5.1 cm * 0.25 * 0.25 cm² π = 1 ml

Mono P (Pharmacia, Uppsala)

Laufgeschwindigkeit 1 ml/min

Äquilibrierung 25 mM Triethanolamin, pH 8.0

Probe 1 ml der aufkonzentrierten aktiven

Fraktionen der Gelfiltration

(umgepuffert mit 25 mM Triethanolamin, pH 8.0, 1.47 mg BSAeq/ml)

Waschen 25 mM Triethanolamin, pH 8.0

Elution 10 mM linearer pH-Gradient von A

nach B

Eluent A: 25 mM Triethanolamin, pH 8.0 Eluent B: Polypuffer 74 (1:10

verdünnt, Pharmacia), pH 5.0

Fraktionen 0.5 ml

Detektion 280 nm

In den ersten beiden Schritten der Aufreinigung

(Anionenaustauschchromatographie und Gelfiltration) wurden störende Protease/Peptidase-Aktivitäten vollständig

entfernt. Nach der isoelektrischen Fokussierung wurde ein 533fach angereichertes Präparat erhalten. Im nativen Gel wird eine Hauptbande beobachtet, die enzymatisch aktiv ist. Die N-terminale Sequenz wurde nach Elution der Bande aus dem nativen Gel mittels eines Flüssigphasensequenators (Applied Biosystems 470 mit on-line HPLC-Kopplung)

bestimmt. Beispiel 2

Charakterisierung des Enzyms pH-Optimum und -Stabilität

In Figur 1 wird die Abhängigkeit der Umsatzrate in % vom pH-Wert dargestellt. In dem pH-Bereich von 3.0 - 7.25 wurde 50 mM Mc-Ilvain-Puffer eingesetzt, zwischen pH 7.0 - 9.0 50 mM Tris/HCl-Puffer und für den basichen pH-Bereich von 9.5 - 10.5 50 mM Na₂CO₃-Puffer. Der Testansatz von 1 ml setzte sich wie folgt zusammen:

100 μl 100 mM Z-Gly-Tyr-NH₂ (gelöst in

H₂O/Dimethylformamid im Verhältnis 1:1)

200 μl Enzymlösung à 63 μgBSAeq/ml der

Reinigungsstufe nach der Gelfiltration 700 μl Puffer Es erfolgte eine Vorinkubation ohne Zugabe von Substrat für 5 min bei 30 °C. Anschließend wurde durch Zugabe von 100 μl Substrat die Reaktion gestartet und 4 Stunden bei 30 °C inkubiert. Zum Abstoppen der Reaktion wurden 100 μl des Reaktionsansatzes entnommen und mit 100 μl Eisessig sowie 1.4 ml HPLC-Laufmittel versetzt (siehe 1.4 Standard Assay der Peptidamidase). In Fig. 1 sind die Ergebnisse zur Untersuchung des pH-Optimums wiedergegeben. Das pH-Optimum der Peptidamidase aus Xanthomonas maltophilia ergibt zu 6.0 ± 0.5.

Für die pH-Stabilität der Peptidamidase aus Xanthomonas maltophilia wurde die relative Aktivität [%] in

Abhängigkeit von der Zeit [h] bestimmt. Für den pH-Bereich von 5.0 - 7.0 wurde 50 mM Kp_i-Puffer und zwischen 7.0 - 9.0 50 mM Tris/HCl-Puffer eingesetzt. Für die Untersuchungen zur pH-Stabilität wurden 100 μl Enzymlösung ä

0.73 mgBSAeq/ml (Reinigungsstufe nach der Gelfiltration) mit 900 μl Puffer unterschiedlichen pH-Wertes bei 30 °C inkubiert. Es wurden zu verschiedenen Zeiten Proben gezogen und die Aktivität mit Z-Gly-Tyr-NH₂ als Substrat bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt. Es ergibt sich eine gute Stabilität im Bereich pH 7 - pH 8.

Beispiel 3

Temperaturoptimum und -Stabilität

Es wurde das Temperaturoptimum der Peptidamidase aus

Xanthomonas maltophilia bestimmt. Dazu wurden 200 μl

Enzymlösung ä 63 μgBSAeq/ml der Reinigungsstufe nach der Gelfiltration mit 700 μl des auf die jeweilige Temperatur vortemperierten 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7.5 versetzt und die Reaktion mit 100 μl Z-Gly-Tyr-NH₂ (10 mM im Testansatz) gestartet. Aliquots von 100 μl wurden nach 2 h mit 100 μl Eisessig gestoppt und die Aktivität entsprechend 1.4 bestimmt. Das Ergebnis ist in Fig. 3 wiedergegeben. Das Temperaturoptimum lag bei 35 - 40 °C bei einem pH von 7.5.

Für die Temperaturstabilität der Peptidamidase aus

Xanthomonas maltophilia wurde die relative Aktivität [%] in Abhängigkeit von der Zeit [h] bestimmt. Dazu wurden 100 μl Enzymlösung ä 0.73 mgBSAeq/ml mit 900 μl vortemperierten 50 mM Tris/HCl-Puf fer, pH 7 ..5 versetzt und bei 20 , 30 , 37 und 56 °C inkubiert. Zu unterschiedlichen Zeiten wurden Proben gezogen und die Aktivität mit Z-Gly-Tyr-NH₂ als Substrat bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 4

dargestellt. Während das Enzym bei 56 °C bereits nach wenigen Minuten inaktiviert wird, erweist es sich bei 20, 30 und 37 °C als äußerst stabil.

Beispiel 4

Enzymkinetik der Peptidamidase Die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit der

Peptidamidase aus Xanthomonas maltophilia von der

Substralkonzentration (Z-Gly-Tyr-NH₂) wurde bestimmt und aus den Daten die kinetischen Parameter nach Marquardt bestimmt. Dazu wurden 50 μl Enzymlösung ä 27 μgBSAeq/ml mit 400 μl 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7.5 versetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Z-Gly-Tyr-NH₂ als Substrat

gestartet. In den Reaktionsansätzen lag das Substrat in einem Konzentrationsbereich von 0.4 bis 20 mM vor. Die Inkubation erfolgte für 2 Stunden bei 30 °C. Anschließend wurde die Enzymaktivität wie unter 1.4 beschrieben

bestimmt. Der K_m-Wert wurde mit 0.82 mM und v_max mit

0.53 U/mg BSAeq bestimmt.

In Figur 5 ist die Reaktionsgeschwindigkeit der

Desamidierung von Z-Gly-Tyr-NH₂ als Funktion der

Substralkonzentration dargestellt.

1.4 Standard Assay der Peptidamidase

Die Reaktionsbedingungen wurden im Hinblick auf die pH- Stabilität der Peptidamidase aus Xanthomonas maltophilia ausgewählt. Standardassay der Peptidamidase

50 mM Tris/HCl, pH 7.5 350 - 700 μl

Enzymlösung 100 - 200 μl

100 mM Z-Gly-Tyr-NH₂, gelöst

in Puffer/DMF 1:1 (im Test 10 mM) 50 - 100 μl

Testansatz 500 - 1000 μl

Temperatur 30 °C

Inkubationszeit variabel Zum Abstoppen der Reaktion wurden 100 μl der

Reaktionslösung entnommen, mit 100 μl Eisessig versetzt und mit 1.4 ml HPLC-Laufmittel aufgefüllt. Ein Aliquot von 20 μl wurde mittels HPLC analysiert. Die Bedingungen für die HPLC-Analytik von Z-Gly-Tyr-NH₂ und Z-Gly-Tyr-OH sind nachfolgend aufgeführt.

Laufmittel: 65 % 10 mM TBA

(Tetrabutylammoniumsulfat)

35 % Acetonitril

Laufgeschwindigkeit 1 ml/min

Laufzeit 10 min

Detektion 280 nm

Elution isokratisch

Säule RP-18, ODS Hypersil (5 μm)

Retentionszeiten Z-Gly-Tyr-NH₂ 4.5 min

Z-Gly-Tyr-OH 5.9 min

Beispiel 5

Substratspektrum

Für das Substratspektrum der Peptidamidase aus Xanthomonas maltophilia wurden 18 mU der Peptidamidase (Reinigungsstufe nach der Gelfiltration) pro ml Testansatz eingesetzt. Die Konzentration der getesteten Substrate betrug 10 mM im Reaktionsansatz. Soweit nicht anders angegeben, wurden L-Aminosäurederivate eingesetzt. Die Inkubation erfolgte in 50 mM Tris/HCl, pH 7.5 bei 30 °C für 3 Stunden. Die

Reaktion wurde durch fünfminütiges Erhitzen bei 95 °C abgestoppt. Die Aktivitätsbestimmung erfolgte mittels enzymatischer Bestimmung des freigesetzten Ammoniaks

(Bergmeyer, U. (1985); Methods of enzymatic analysis,

S. 459, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim). Tabelle 4a gibt die Umsetzung von Dipeptidamiden wieder, Tabelle 4b die Umsetzung von N-Acetylaminosäureamiden und Tabelle 4c den Einfluß der N-terminalen Schutzgruppen bzw. der zum

C-Terminus benachbarten Aminosäure.

Für die Analytik der in Tabelle 4d aufgeführten Substrate und Produkte wurde die folgende

dünnschichtchromatographische Methode verwendet. Dazu wurden 1 μl des abgestoppten Reaktionsansatzes aufgetragen.

Stationäre Phase DC-Alufolie Kieselgel 60 F₂54

(20 * 10 cm²)

Mobile Phase Pyridin/Butanol/Eisessig/Wasser

(12:15:3:5)

Detektion Ninhydrin (0.3 % in Propan-1-ol)

Die Farbentwicklung erfolgte für ca. 3 min bei 100 °C Für die Analytik der in Tabelle 4e wiedergegebenen

Umsetzung längerkettiger Peptide galten folgende HPLC

Trennbedingungen:

10 mM Tetrabutylammoniumsulfat/Acetonitril

Zusätzlich wurde mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie auf mögliche Protease- bzw. Peptidaseaktivität hin untersucht. Es konnte bei keinem der Peptide eine

Freisetzung von Aminosäuren detektiert werden.

Die Ergebnisse zeigen, daß mit Ausnahme von L-Pro alle proteinogenen geschützten Ammosäureamide bzw. Peptidamide desamidiert werden. Auch einige geschützte

nichtproteinogene Aminosäureamide werden hydrolysiert

(Phenylglycin, Naphthylalanin, Neopentylglycin).

D-Aminosäuren in der C-terminalen Position werden nicht umgesetzt. Die Amidfunktion in den Seitenketten von

Asparagin und Glutamin werden nicht angegriffen. Die

Peptidbindungen längerkettiger Oligopeptide werden nicht gespalten, ungeschützte Aminosäureamide werden nicht umgesetzt.

Beispiel 6

Racematspaltung von N-geschützten Aminosäureamiden Die Untersuchungen zur Racematspaltung erfolgten in 50 mM Triethylammoniumcarbonat-Puffer, pH 7.5. Die Testansätze ä 50 ml mit jeweils 20 U Peptidamidase wurden bei 30 °C inkubiert. Als Substrate standen Z-D,L-Ala-NH₂, Ac-D,L-Met-NH₂ und Ac-D,L-Neopentylglycinamid (Ac-D,L-Npg-NH₂) zur Verfügung. Die Konzentration der Substrate im

Reaktionsansatz betrug 10 mM. Es wurden zu

unterschiedlichen Zeiten Proben entnommen, die Reaktion durch fünfminütiges Erhitzen bei 95 °C abgestoppt und die Enantiomerenreinheit mittels HPLC untersucht. Die

Ergebnisse sind nachfolgend wiedergegeben:

Z-D-Ala-OH 0.4 %

Z-L-Ala-OH 99.6 %

Ac-D-Met-OH 0.2 - 0.3 %

Ac-L-Met-OH 99.7 - 99.8 %

Ac-D-Npg-OH 0.2 %

Ac-L-Npg-OH 99.8 % Die Ergebnisse werden auch durch Fig. 6, die sich auf die Racematspaltung von Z-D,L-Ala-NH₂ bezieht, und durch die Fig. 7, die die enantioselektive Desamidierung von N-Ac-D,L-Met-NH₂ darstellt, erläutert.

Beispiel 7

Einfluß von Enzymeffektoren auf die Peptidamidaseaktivität

Die Untersuchungen erfolgten in 50 mM Tris/HCl, pH 7.5. Nach einer Vorinkubation des Enzyms (38 mU pro Ansatz, Reinigungsstufe nach der Gelfiltration) mit dem Effektor (10 mM im Testansatz) für 1 h bei 30 °C wurde die Reaktion durch Zugabe von Substrat (Z-Gly-Tyr-NH₂, 10 mM im

Testansatz) gestartet. Die Reaktionsansätze wurden für 2.5 h bei 30 °C inkubiert. Tabelle 5 gibt die Ergebnisse zum Einfluß von Enzymeffektoren auf die

Peptidamidaseaktivität wieder. Es zeigt sich, daß die

Peptidamidase weder zu den klassischen Serinhydrolasen gehört, die bereits bei einer Konzentration an PMSF von 1 mM bzw. an Pefabloc von 0.2 mM gehemmt werden, noch zu den Metalloenzymen, die von EDTA bzw. 1,10-Phenanthrolin in dem hier angegebenen Konzentrationsbereich gehemmt werden.

Beispiel 8 Einfluß von Lösungsmitteln auf die Peptidamidaseaktivität und Stabilität der Peptidamidase bei Inkubation in

Lösungsmittel

Für die Untersuchungen zum Einfluß von Lösungsmitteln auf die Peptidamidaseaktivität wurden jeweils 200 μl

Enzymlösung (59 μg BSAeq/ml, Reinigungsstufe nach der

Gelfiltration) mit 700 μl eines entsprechenden Gemisches von 50 mM Tris/Lösungsmittel, pH 7.5 versetzt. Als Lösungsmittel wurden Dimethylformamid (DMF), Aceton,

Ethanol und Propan-1-ol getestet, die im Reaktionsansatz bis zu 70 % Volumenanteil vorlagen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Substrat Z-Gly-Tyr-NH₂ gestartet. Die Inkubation erfolgte für 90 Minuten bei 30 °C. Anschließend wurden Aliquots von 100 μl der Reaktionsansätze mit 100 μl Eisessig versehen und die Enzymaktivität wie unter 1.4 beschrieben bestimmt. In Fig. 8 sind die Ergebnisse zum Einfluß von Lösungsmitteln auf die Enzymaktivität

wiedergegeben. Es zeigt sich, daß bei 20 % DMF noch 94 % Restaktivität vorhanden ist und selbst bei 30 % noch 59 %. In der Gegenwart anderer Lösungsmittel wie Propan-2-ol büßt das Enzym deutlich Aktivität ein, aber ist trotzdem bei einem Gehalt von 10 % nicht vollständig inaktiviert

(Restaktivität 30 %).

Zur Bestimmung der Lösungsmittelstabilität der

Peptidamidase aus Xanthomonas maltophilia wurden 600 μl Enzymlösung à 57 μg BSAeq/ml (Reinigungsstufe nach der Gelfiltration) mit 150 μl Lösungsmittel bzw. als Kontrolle 150 μl 50 mM Tris/HCl, pH 7.5 versetzt. Die Inkubation erfolgte bei 30 °C. Zu verschiedenen Zeiten wurden Proben für die Aktivitätsbestimmung gezogen. Als Lösungsmittel wurden Dimethylformamid (DMF), Aceton, Ethanol und Propan-1-ol getestet. In Fig. 9 ist die Lösungsmittelstabilität der Peptidamidase aus Xanthomonas maltophilia dargestellt. Nach 26 Stunden ergibt sich bei einem Lösungsmittelgehalt von 20 % DMF noch eine Restaktivität von 32 %.

Beispiel 9 Bestimmung der Molmasse

Die relative Molmasse der Peptidamidase aus Xanthomonas maltophilia wurde durch Gelfiltration bestimmt

(Laufbedingungen siehe 1.3.2). Folgende Eichproteine wurden eingesetzt.

Die Detektion erfolgte bei 280 nm. Das Elutionsvolumen der Peptidamidase wurde durch Aktivitätsbestimmung ermittelt. Aus dem Elutionsvolumen wurde anhand der Eichkurve die relative Molmasse zu 38000 ± 1000 Dalton bestimmt.

Beispiel 10

Induzierbarkeit der Peptidamidase aus Xanthomonas

maltophilia

Für die Untersuchungen der Induzierbarkeit der

Peptidamidase aus Xanthomonas maltophilia wurden 1 l

Erlenmeyerkolben mit 200 ml des im 2. Teil des Screenings benutzten Nährmediums versehen. Dabei wurde der Anteil des Hefeextraktes auf 0.1 % erhöht und jeweils nur ein

Amidderivat zu 0 . 5 % dem Medium zugesetzt . Zusätzlich wurden Medien ohne Zusatz von Amiden bzw. mit 1.5 %

Hefeextrakt untersucht. Als Amide wurden Ac-DL-Met-NH₂, Leucinamid und Carnitinamid eingesetzt. Die Kolben wurden 0.5 %ig angeimpft und 2 Tage bei 30 °C und 120 Upm

geschüttelt. Die Gewinnung der Rohextrakte erfolgte wie bereits oben beschrieben. In Tabelle 6 sind die Ergebnisse wiedergegeben. Aus den Daten geht hervor, daß das Enzym zwar auch ohne Zugabe von Ac-DL-Met-NH₂ als Induktor in der Zelle gebildet wird, daß aber die spezifische Aktivität durch Zugabe dieses Induktor verdoppelt bis verdreifacht werden kann. Die Zugabe anderer Amide zeigt hingegen keinen Einfluß.

Beispiel 11

Darstellung racemischer N_α-geschützter Aminosäureamide für die enzymatische Trennung mit Peptidamidase

A) N_α-Formyl-DL-methioninamid

30 g (0,20 mol) DL-Methioninamid wurden mit 250 ml

Ameisensäuremethylester zwei Tage bei Raumtemperatur gerührt, wobei sich feine, leicht gelbliche Kristalle bildeten. Diese wurden abfiltriert und aus einem Gemisch von 150 ml Hexan und 160 ml Ethanol umkristallisiert. Nach Abkühlen, Filtrieren, Waschen und Trocknen wurden 23 g (55 %) N_α-Formyl-DL-methioninamid in Form farbloser

Kristalle vom Schmelzpunkt 121 - 122 °C erhalten.

B) N_α-Methylaminocarbonyl-DL-methioninamid

Zu einer Lösung von 30 g (0,2 mol) DL-Methioninamid in 350 ml Wasser wurden bei 5 - 10 °C 18 ml (0,3 mol) Methylisocyanat getropft, wobei sich ein farbloser,

kristalliner Niederschlag bildete. Nach 30 min Nachrühren bei 5 - 10 °C und 30 min bei Raumtemperatur wurden die Kristalle abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei 25 g Produkt erhalten wurden. Aufkonzentrieren der Mutterlauge lieferte weitere 10 g. Durch Umkristallisation aus Methanol/Essigester wurden 29 g (70 %)

N_α-Methylaminocarbonyl-DL-methioninamid in Form leichter, flockiger Kristalle vom Schmelzpunkt 156 - 157 °C erhalten.

C) N_α-Methoxycarbonyl-DL-methioninamid

Zu einer Lösung von 150 g (1,02 mol) DL-Methioninamid in 200 ml Wasser wurden bei 5 - 10 °C 85 ml (1,11 mol)

Methylchlorformiat getropft, wobei der pH-Wert durch Zugabe von Natronlauge bei 8 - 10 gehalten wurde. Nach 30 min Nachreaktion wurden 60 ml Wasser zugesetzt, worauf sich Kristalle bildeten, die abfiltriert, mit Wasser gewaschen und in 250 ml Wasser gelöst wurden. Diese Lösung wurde zweimal und die Kristallisationsmutterlauge einmal mit je 500 ml Methylenchlorid extrahiert. Nach Einrotieren

verblieben 162 g gelblich-kristalliner Rückstand. Dieser wurde in 200 ml heißem Ethanol gelöst. Dann wurden 400 ml und nach Erscheinen der ersten farblosen Kristalle nochmals

200 ml MTBE zugesetzt. Nach Kühlung im Eisbad,

Abfiltrieren, Waschen mit 200 ml MTBE und Trocknung wurden 127 g (60 %) N_α-Methoxycarbonyl-DL-methioninamid vom

Schmelzpunkt 93 - 94 °C erhalten.

D) N_α-Ethoxycarbonyl-DL-methioninamid

Zu einer Lösung von 150 g ( 1 , 02 mol ) DL-Methioninamid in 200 ml Wasser wurden bei 5 - 10 °C 106 ml (1,10 mol)

Ethylchlorformiat getropft, wobei der pH-Wert durch Zugabe von Natronlauge bei 7 - 9 gehalten wurde. Es bildete sich schnell ein dicker, feinkristalliner Niederschlag. Durch Zusatz von 800 ml Wasser wurde eine gerade noch rührbare Suspension erhalten, die noch 3 h bei Raumtemperatur gerührt wurde. Anschließend wurden die farblosen Kristalle abfiltriert, mit Wasser gewaschen und aus 900 ml Wasser umkristalliert. Nach Kühlung auf 0 - 5 °C, Abfiltrieren,

Waschen mit Wasser und Trocknen wurden 129 g (57 %)

N_α-Ethoxycarbonyl-DL-methioninamid vom Schmelzpunkt

110 - 112 °C erhalten.

E) N_α-Benzyloxycarbonyl-DL-methioninamid

Zu einer Lösung von 50 g (0,34 mol) DL-Methioninamid in 200 ml Wasser wurden bei 5 - 20 °C 51 ml

Benzyloxycarbonylchlorid getropft, wobei der pH-Wert mit Natronlauge bei 7 - 9 gehalten wurde. Es bildete sich sofort ein schleimiger Niederschlag, der auf Zusatz von 200 ml MTBE feinkristallin wurde. Nach beendeter Zugabe wurde noch 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Die

ausgefallenen farblosen Kristalle wurden anschließend abfiltriert, mit wenig MTBE gewaschen und aus 700 ml Toluol umkristallisiert . Nach Abfiltrieren, Waschen mit Toluol und Trocknen wurden 67 g (69 %) N_α-Benzyloxycarbonyl-DL-methioninamid vom Schmelzpunkt 120 - 122 °C erhalten.

F) N_α-Acetyl-DL-neopentylglycinamid

Zu einer Lösung von 17 g (0,12 mol) DL-Neopentylglycin in 200 ml Wasser wurden unter Eiskühlung in ca. 30 min 12 ml (0,13 mol) Acetanhydrid getropft, wobei der pH-Wert mit Natronlauge bei etwa 8 gehalten wurde. Nach 1 h Rühren bei Raumtemperatur wurde dreimal mit 100 ml Methylenchlorid extrahiert und die organische Phase nach Trocknen über Natriumsulfat einrotiert. Es verblieben 20 g (89 %)

N-Acetyl-DL-neopentylglycin als farbloser Feststoff.

Zu 19 g (0,1 mol) N-Acetyl-DL-neopentylglycin in 150 ml THF wurden dann bei -10 °C in 15 min 14 ml (0,1 mol)

Triethylamin getropft. Nach 10 min wurde eine Lösung von 10 ml (0,1 mol) Ethylchlorformiat in 10 ml THF so

zugetropft, daß die Temperatur -5 °C nicht überschritt.

Dann wurden 70 ml 25 %ige Ammoniaklösung auf einmal

zugegeben, anschließend 50 ml THF, und dann 2 h bei -5 °C und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde der Ansatz zur Trockne eingedampft, mit 100 ml Wasser ausgerührt, der Feststoff abfiltriert und aus 70 ml

Methanol umkristallisiert. Es wurden insgesamt 15 g (78 %) N_α-Acetyl-DL-neopentylglycinamid in Form farbloser

Kristalle mit einem Schmelzpunkt >205 °C erhalten.

G) N_α-Benzyloxycarbonyl-DL-neopentylglycinamid

Zu einer Lösung von 15 g (0,10 ml) DL-Neopentylglycin in 150 ml Wasser wurden unter Eiskühlung in ca. 30 min 15 ml (0,11 mol) Benzyloxycarbonylchlorid getropft, wobei der pH-Wert mit Natronlauge bei etwa 9 gehalten wurde. Nach 1 h Rühren bei Raumtemperatur wurde dreimal mit 75 ml

Methylenchlorid extrahiert und die organische Phase nach Trocknen über Natriumsulfat einrotiert. Es verblieben 25 g (90 %) N-Benzyloxycarbonyl-DL-neopentylglycin als farbloses Öl, das beim Stehen kristallisierte.

Zu 24 g (0,09 mol) N-Benzyloxycarbonyl-DL-neopentylglycin in 150 ml THF wurden dann bei -10 °C in 15 min 12 ml

(0,09 mol) Triethylamin getropft. Nach 10 min wurde eine Lösung von 8 ml (0,09 mol) Ethylchlorformiat in 10 ml THF in ca. 30 min so zugetropft, daß die Temperatur -5 °C nicht überschritt. Nach 30 min Rühren bei -5 °C wurden 60 ml 25 %ige Ammoniaklösung auf einmal zugegeben und dann 2 h bei -5 °C und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.

Anschließend wurde der Ansatz zur Trockne eingedampft, mit 50 ml Wasser aufgenommen und mit 150 ml Methylenchlorid extrahiert. Nach Trocknen der organischen Phase über

Natriumsulfat und Einrotieren verblieben 26 g Rückstand, die in 50 ml Methanol gelöst und dann innerhalb von ca. 2 h unter Eiskühlung mit 70 ml Wasser versetzt wurden. Nach Filtration, Waschen mit Methanol/Wasser und Trocknen wurden 13 g (54 %) N_α-Benzyloxycarbonyl-DL-neopentylglycinamid als farbloser Feststoff mit einem Schmelzbereich von

132 - 137 °C erhalten.

Beispiel 12

Darstellung von D-Neopentylglycin aus N-Acetyl-D,L-Neopentylglycinamid

10 mM N-Acetyl-D,L-Neopentylglycinamid wurden in einem 50 ml Erlenmeyerkolben in 50 mM TriethylammoniumcarbonatPuffer bei pH 7.5 und 30 °C mit 20 U Peptidamidase

inkubiert. Per HPLC wurde der Umsatz kontrolliert. Nach 24 Stunden betrug der Umsatz 50 % und änderte sich über die Zeit nicht mehr. Das Enzym wurde nun durch fünfminütiges Erhitzen bei 95 °C desaktiviert und die

Enantiomerenreinheit untersucht. Die Reinheit von N-Acetyl-L-Neopentylglycin (bestimmt durch

Ligandenaustauschchromatographie) betrug 99.8 %, die

Reinheit des N-Acetyl-D-Neopentylglycinamids (bestimmt durch Inklusionschromatographie) betrug 99.7 %. Durch

Anionenaustauschchromatographie an Amberlite M 500 wurden die beiden Produkte getrennt und das N-Acetyl-D-Neopentylglycinamid durch mehrstündige Hydrolyse in

6-normaler siedender Salzsäure in die freie D-Aminosäure überführt, wobei der Nachweis des vollständigen Umsatzes per HPLC oder DC erfolgt. Der Drehwert des

D-Neopentylglycins [α_D ²⁵] (c = 0.5, 6N HCl) betrug -16.2°.

Verwendete Methoden zur Enantiomerentrennung: Die Enantiomeren des verbleibenden N-Acyl-Aminosäureamids wurden durch Inklusionschromatographie voneinander

getrennt, die beiden Enantiomeren des N-Acyl- Aminosäureprodukts durch Ligandenaustauschchromatographie,

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Gewinnung von Peptidamidase enthaltenden Mikroorganismen durch Kultivieren von Mikroorganismen haltigen Proben in Nährmedien, die eine Quelle für Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralsalze aufweisen, dadurch gekennzeichnet,

daß man die Proben zuerst in einem Nährmedium, das Amidstickstoff als Stickstoffquelle aufweist, bebrütet und anschließend entstandene Kolonien auf ein

Nährmedium überimpft, das N-Acetyl-D,L-Methioninamid enthält, bebrütet und die Mikroorganismen auswählt, die in beiden Nährmedien wachsen.

2. Xanthomonas maltophilia, hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen unter der Nr. DSM 9181.

3. Mikrobielle Peptidamidase befähigt zur selektiven

hydrolytischen Abspaltung der freien Aminogruppe am C-terminalen Ende von Peptidamiden,

dadurch gekennzeichnet,

daß sie aus einem gemäß Anspruch 1 gewonnenen

Mikroorganismus erhätlich ist.

4. Mikrobielle Peptidamidase befähigt zur selektiven

hydrolytischen Abspaltung der freien Aminogruppe am C-terminalen Ende von Peptidamiden, gewonnen aus den Mikroorganismen gemäß Anspruch 2.

5. Mikrobielle Peptidamidase nach Anspruch 3 oder 4, nach Aufreinigung

gekennzeichnet durch

folgende Parameter - Abspaltung der C-terminalen Aminogruppe von

Peptidamiden und N-terminal geschützten

Aminosäureamiden;

- keine Spaltung von Peptidbindungen;

- optimaler pH-Wert bei 6,0 ± 0,5;

- gute Stabilität im pH-Bereich zwischen pH 7 und pH 8;

- die optimale Temperatur beträgt 35 - 40 °C bei einem pH-Wert von 7,5;

- Inhibierung von Serinresten durch Hemmstoffe, wie

Phenylmethansulfonylfluorid, sowie insbesondere

4- (2-Aminoethylbenzylsulfonylfluorid) (Pefabloc);- das Molekulargewicht beträgt etwa 38.000 Dalton

(bestimmt durch Gelfiltration);

- der isoelektrische Punkt liegt bei pH 5,8;

- eine N-terminale Anfangssequenz:

AS 1 X

AS 2 Arg

AS 3 Asn

AS 4 Val

AS 5 Pro

AS 6 Phe

AS 7 Pro

AS 8 Tyr

AS 9 Ala

AS 10 Glu

AS 11 Thr

AS 12 Asp

AS 13 Val

AS 14 Ala

AS 15 Asp

AS 16 Leu

AS 17 Gin und ihre isozymen Formen.

6. Verwendung der mikrobiellen Peptidamidase nach einem der Ansprüche 3 bis 5 in einem Verfahren zur

Herstellung von Peptiden und N-terminal geschützten Aminosäuren der allgemeinen Formel

in der R' eine Schutzgruppe oder ein beliebiger

peptidisch oder isopeptidisch gebundener Aminosäure- oder Peptidrest ist und R]_ Wasserstoff oder eine beliebige Seitenkette bedeutet, zur enzymatischen

Abspaltung einer C-terminalen Aminogruppe von einem Peptidamid oder einem N-terminal geschützten

Aminosäureamid.

7. Verwendung nach Anspruch 6,

dadurch gekennzeichnet,

daß man die enzymatische Reaktion kontinuierlich durchführt.

8. Verwendung nach Anspsuch 6 oder 7,

dadurch gekennzeichnet,

daß man die Desamidierung als Verfahrensschritt einer gekoppelten Umsetzung mit einem Enzymsystem durchführt, das Proteasen, Peptidasen, Esterasen und/oder Lipasen umfaßt .

9. Verwendung der mikrobiellen Peptidamidase nach einem der Ansprüche 3 bis 5 in einem Verfahren zur

Herstellung von Peptiden gemäß Anspruch 6 - 8 durch enzymatische Umsetzung von ggf . N-geschützten

Aminosäurealkylestern bzw. ggf. N-geschützten

Peptidalkylestern mit Aminosäureamiden in wäßriger Phase oder wäßrig-organischem Milieu, in Gegenwart eines die peptidische Verknüpfung herbeiführenden

Enzyms und unter enzymatischer Abspaltung der

Amidschutzgruppe, bei welchem Verfahren man die

Synthese kontinuierlich ablaufen läßt und das

Peptidamid mittels der Peptidamidase enzymatisch zum Peptid hydrolysiert und schließlich das Peptid aufgrund seiner Ladung vom Reaktionsgemisch abtrennt und das Aminosäureamid zurückführt.

10. Verwendung der mikrobiellen Peptidamidase nach einem der Ansprüche 3 bis 5 zur Racematspaltung von Ngeschützten Aminosäureamiden, wobei ein racemisches Gemisch von N-geschützten Aminosäureamiden mit der Peptidamidase inkubiert wird und bis zum vollständigen Umsatz des N-geschützten L-Aminosäureamids reagiert wird und nachfolgend die N-geschützte L-Aminosäure vom N-geschützten D-Aminosäureamid aufgrund der

Ladungsunterschiede getrennt wird.

11. Verwendung der mikrobiellen Peptidamidase nach einem der Ansprüche 3 bis 5 zur Gewinnung nichtproteinogener D-Aminosäuren, wobei man N-geschützte racemische

Aminosäureamide wie N-Acetyl-Neopentylglycinamid, N-Acetyl-Naphthylalaninamid, N-Acetylphenylglycinamid oder ähnliche Derivate einsetzt, die N-Acetyl-L- Aminosäureamide enzymatisch hydrolysiert, die N-Acetyl- D-Aminosäureamide durch Chromatographie aus dem

Reaktionsgemisch abtrennt und schließlich mittels

Säurehydrolyse in die freien D-Aminosäuren überführt.

12. Neue racemische N_α-geschützte Aminosäureamide, von

denen durch Verwendung der mikrobiellen Peptidamidase gemäß Anspruch 10 und 11 das N_α-geschützte

L-Aminosäureamid enzymatisch hydrolysiert wird, so daß das N_α-geschützte D-Aminosäureamid gemäß Anspruch 10 oder 11 abgetrennt und mittels Säurehydrolyse in die freie D-Aminosäure gemäß Anspruch 11 überführt wird: N_α-Formyl-DL-methioninamid, N_α-Methylaminocarbonyl-DL- methioninamid, N_α-Methoxycarbonyl-DL-methioninamid, N_α-Ethoxycarbonyl-DL-methioninamid,

N_α-Benzyloxycarbonyl-DL-methioninamid, N_α-Acetyl-DL- neopentylglycinamid, N_α-Benzyloxycarbonyl-DL- neopentylglycinamid.

13. Neue N_α-geschützte D-Aminosäureamide, die durch

Verwendung der mikrobiellen Peptidamidase gemäß

Anspruch 10 oder 11 aus den neuen racemisehen

N_α-geschützten Aminosäureamiden gemäß Anspruch 12 erhalten werden: N_α-Formyl-D-methioninamid,

N_α-Methylaminocarbonyl-D-methioninamid,

N_α-Methoxycarbonyl-D-methioninDamid, N_α-Ethoxycarbonyl- D-methioninamid, N_α-Benzyloxycarbonyl-D-methioninamid,

N_α-Acetyl-D-neopentylglycinamid, N_α-Benzyloxycarbonyl- D-neopentylglycinamid.