WO1995024201A1 - Preparation de liposomes - Google Patents

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Yoshiyuki Mori
Kazuyoshi Sagara
Hiroaki Mizuta
Akihiro Fujii
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Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd.
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Description

明 細 書
リボソーム製剤
技術分野
本発明は、 抗悪性腫瘍作用を示す水溶性 2 ' -デォキシシチジン化合物の骨髄 移行性を抑制し、 かつ腫瘍組織への移行性を高めたリボソーム製剤に関する。
背景技術
悪性腫瘍に対する治療法の中で、 化学療法は外科療法や放射線療法とともに有 効な療法の一つである。 しカヽし、 現在に至るまで腫瘍組織に対して選択的に殺細 胞効果を示す抗悪性腫瘍剤は開発されておらず、 骨髄毒性等の副作用の軽減がそ の使用上の課題となっている。 この課題に対し、 抗悪性腫瘍剤を製剤学的手法に より腫瘍組織を標的部位とする標的指向化製剤に修飾することにより副作用の軽 減と抗腫瘍効果の増強を図ろうとする試みがなされている。 すでに、 肝臓の悪性 腫瘍等の治療のためにネオカルチノス夕チンとスチレン無水マレイン酸共重合体 の結合物を油性造影剤に懸濁させた抗悪性腫瘍剤を悪性腫瘍組織部位に局所投与 することにより、 該製剤が悪性腫瘍組織に集積し、 すぐれた抗悪性腫瘍効果を示 すことが臨床試験により確認されている 〔キャンサー リサーチ （Cancer Research) 、 第 4 4巻、 2 1 1 5〜 2 1 2 1頁 （ 1 9 8 4年） 〕 。 しかし、 この 手法は特殊な投与技術が必要であることや適応可能な悪性腫瘍が限られているな どの問題点を有している。 現在では全身投与での副作用の軽減と抗悪性腫瘍効果 の増強を可能にする手段が模索されている。
そのような研究の中で、 腫瘍組織が正常組織と比較してリン脂質、 糖脂質を水 溶液に分散した際に形成される脂質二分子膜構造からなる微小な閉鎖型小胞体で あるリポソームなどの微小粒子を取り込みやすい性質を有していることに着目し て、 抗悪性腫瘍剤をリボソームに封入させることが知られている。 抗悪性腫瘍剤 をリボソーム化することによって、 正常細胞への悪影響を抑制し、 ひいては高薬 用量で連続投与が可能になることから、 高い抗悪性腫瘍効果が観察されていた。 しかし、 単にリボソーム化するだけでは、 抗悪性腫瘍剤の骨髄組織移行性は抑制 されず、 また悪性腫瘍組織への集積も充分に図ることができなかった。 そこで、 リポソームに種々の修飾を行うことによって血中滞留性を向上させ、 結果的に腫 瘍組織への抗悪性腫瘍剤の集積を図ろうとする試みがなされてきた。 そのような 試みとして知られているものには、 （ 1 ) リボソームの粒子径を小さくする 〔キ ヤンサ一 リサーチ（Cancer Research) 、 第 36巻、 2949〜2957頁 （1976年） 〕 、 ( 2 ) 長鎖飽和脂肪酸を有するホスファチジルコリン等のリポソーム膜構造強化 因子を用いる 〔バイオキミ力 エト バイオフイジ力 ァクタ（Biochimica et Biophysica Acta), 第 8 3 9巻、 1〜 8頁 （ 1 9 8 5年） 〕 、 （ 3 ) ポリエチレ ングリコール等の水溶性高分子や天然多糖、 糖類に脂肪酸やコレステロ一ル等を 結合した合成脂質を添加する 〔バイオキミ力 エト バイオフイジ力 ァクタ (Biochimica et Biophysica Acta )、 第 1 1 1 3巻、 1 7 1〜 1 9 9頁 （1992年） および応用細胞生物学研究、 第 9巻 （ 3 - 4 ) 、 5 3〜 6 1頁 （ 1 9 9 2年） 〕 等があり、 特に第 3の手法は実際に悪性腫瘍組織への集積化が図られている。 し かしながら、 これらの手法によつて抗悪性腫瘍剤の副作用発現部位である骨髄組 織への抗悪性腫瘍剤の移行を抑制したという報告はなされておらず、 依然として 骨髄毒性の発現という課題の解決には至っていない。
ところで、 リポソ一ムの膜表面に負電荷を付与することにより骨髄組織への移 行性が高まるという報告がなされている 〔バイオキミ力 エト バイオフイジ力 ァクタ（Biochimica et Biophysica Acta ), 第 401 巻、 3 3 6〜 3 4 8頁 (1975 年） 〕 。 しかし、 当該文献はエチレンジァミン四酢酸の骨髄組織への取り込みを 報告しているのみである。 またリポソ一ムの膜表面に正の電荷を与えることも知 られているが、 血清カルシウム濃度の上昇を目的とするリボソーム製剤 （特表昭 6 3 - 5 0 0 3 7 8号公報） 、 外傷性脳障害患者へのマグネシウム供給を目的と するリボソーム製剤 （W0 8 8 / 0 7 8 5 2号公報） 、 有効成分であるプロス夕 グランジンの遊離抑制を目的とするリボソーム製剤 （特開平 3— 9 5 1 1 8号公 報） 、 正または負に荷電したリボソームの凍結乾燥製剤等に該リボソームとは逆 に荷電した薬物の水溶液を加えて得られる薬物保持率の高いリボソーム製剤 （特 開平 4一 1 0 3 5 2 7号公報） ， 特定の成分を含有する外部脂質層を有し、 粘膜 組織に対する結合力を増大させるために設計された眼科疾患の治療に有用なリボ ソ一厶組成物 （特表平 2— 5 0 0 3 6 0号公報） 、 それぞれ特定の構造を有する 2種の双極脂質分子で構成することによって、 表面領域が正電荷を帯びるように した温血動物のムチン膜への親和性を有するムチン指向リボソーム製剤 （特表平 3 - 5 0 3 4 0 8号公報） 、 正の過剰電荷を有する特定の化合物を含有する肝臓 特異性の挙動を示し、 肝臓疾患治療のための薬物担体として好適なリポソーム製 剤 （特表平 5— 5 0 6 6 6 1号公報） 、 経口投与を目的としたインシュリ ンリポ ソーム製剤 〔エンドクリノロジィ ジャパン（Endocrinol, Jpn. )、 第 26巻、 337 〜3 4 4頁 （ 1 9 7 9年） 〕 、 シクロスポリン A含有リボソーム製剤 〔ジャーナ ル ォブ マイクロェンカプシユレーシヨン （Journal of Microencapsulat ion^ 第 6巻、 1 1 7〜 1 8 2頁 （ 1 9 8 9年） 〕 が報告されているのみである。
一方、 米国特許第 5 1 8 3 8 8 2号明細書によると、 2 ' —デォキシ— 2 ' 一 メチリデンシチジン 2水和物と糖類とを含有する保存安定性のよい注射用組成物 が開示されている。
発明の開示
本発明は、 抗悪性腫瘍作用を示す水溶性 2 ' —デォキシシチジン化合物の骨髄 移行性を抑制し、 かっ血中滞留性を向上し、 その結果悪性腫瘍組織への移行性を 高めた製剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、 2 ' -デォキ シシチジン化合物をリポソ一ムに内包させ、 かつリポソーム製剤の膜表面を正に 荷電することによって、 有効成分の骨髄移行性が抑制され、 同時に血中滞留性を 向上させ、 ひいては悪性腫瘍組織への移行性を高めたリポソーム製剤が調製され ることを見出し、 本発明を完成させるに至った。 すなわち、 本発明は、 水溶性の 2 ' —デォキシシチジン化合物を内包し、 脂質膜の表面を正に荷電する化合物を 含有することを特徴とするリポソ一ム製剤に関する。
図面の簡単な説明
図 1は、 実験例 1の結果を示す図である。
図 2は、 実験例 2の結果を示す図である。
図 3は、 実験例 3の結果を示す図である。 図 4は、 実験例 4の結果を示す図である。
図 5は、 実験例 5の結果を示す図である。
発明の詳細な説明
本発明のリボソーム製剤に用いられるリボソームとは、 前記したように細胞膜 を構成しているリン脂質 （レシチン） を水中に分散させて形成される脂質二分子 膜により囲まれた内水相部分を有する閉鎖小胞であり、 そのサイズゃ脂質二分子 の数によって多重層リボソーム （Multilamellar Vesicle ； MLV)、 大きな一枚膜 リボソーム（Large Unilamellar Vesicle ； LUV) および小さな一枚膜リボソーム (Small Unilamellar Vesicle ； SUV)の 3種類に分類される。 本発明では、 いず れの種類のリボソームも使用可能である。 本発明のリボソーム製剤は、 生体内で 安定なリボソーム構造を形成しなければならない。 すなわち、 リボソームを構成 する脂質二分子膜の動きが温度によって激しくなると相転移温度を境として膜容 積、 膜厚、 流動性、 膜透過性は大きく変化するため、 内包されている薬物が溶出 するおそれがある。 これを防ぐためにゲル一液晶相転移温度が 3 7 °C以上である リン脂質から構成される必要があり、 このようなリン脂質としては、 ゲル—液晶 相転移温度が好ましくは 4 0〜6 5°Cのもの、 たとえば水素添加精製卵黄ホスフ ァチジルコリン （相転移温度 5 0〜6 0°C、 以下、 HEPCと称する） 、 水素添 加精製大豆ホスファチジルコリン （相転移温度 5 5°C、 以下、 HSPCと称する） ジパルミ トイルホスファチジルコリン （相転移温度 4 2°C、 以下、 DP PCと称 する） およびジステアロイルホスファチジルコリン （相転移温度 55°C、 以下、 DS PCと称する） から選ばれ、 より好ましくは HSPCまたは DP PCがあげ られる。 これらは 1種または 2種以上混合して用いることができる。 本発明に用 い得るリボソームは、 これらリン脂質に加えて、 好ましくは生体内でのリポソ一 厶の安定性を改善することが報告されているコレステロール （Biochem. J., 186,_ 591-598,(1980)) 、 コレス夕ノール等のステロール類、 またはスフインゴミエリ ンなどの安定化剤と混合して使用される。
本発明で用いられる有効成分化合物である 2' —デォキシシチジン化合物は、 水溶性化合物であることから、 リボソームの内相に封入される。 ここで、 2' — デォキシシチジン化合物とは、 2' —デォキシー 2' —メチリデンシチジン （特 開昭 6 3— 25 8 8 1 8号公報） 、 2' —デォキシー 2' —フルォロメチリデン シチジン 〔ジャーナル ·ォブ 'アメリカン，ケミカル， ソサイエティ一（Journal of American Chemical Society) 、 第 113巻、 74 3 9〜 744 0頁 （1991年） 〕 2' —デォキシ一 2' —メチリデンー 5—フルォロシチジン （特開平 2— 1 38 292号公報） 、 2' -デォキシー 2' , 2' ージフルォロシチジン （特開昭 61 - 1 4 8 1 9 3号公報） 、 2' — C—シァノー 2' —デォキシー —ァラビノフ ラノシルシトシン （特開平 4一 235 1 82号公報） 、 またはそれらの医薬上許 容される塩もしくは水和物から選ばれ、 好ましくは 2' —デォキシー 2' —メチ リデンシチジン、 2' —デォキシー 2' —メチリデンー 5—フルォロシチジンま たはそれらの医薬上許容される塩もしくは水和物が挙げられ、 特に 2' —デォキ シー 2' —メチリデンシチジン 2水和物 （特開平 3— 24 07 9 4号公報参照、 以下 DMDCと称する） が好ましい。
本発明のリポソ一ム製剤は、 脂質膜の表面が正に荷電されたことを特徴とする のであって、 その脂質膜、 すなわち、 リボソームの表面を正に荷電する化合物と しては、 飽和または不飽和脂肪族ァミン （ステアリルァミン、 ォレイルァミンな ど） 、 スフィ ンゴシン、 ホスファチジルエタノールァミ ン、 N— 〔1一 （2, 3 —ジォレイ口キシ） プロピル〕 一 N, N, N—トリメチルアンモニゥムクロライ ド、 コレステリルへミサクシネート、 3 B— CN- (Ν' , N' —ジメチルアミ ノエタン） 力ルバモイル〕 コレステロールおよびコレステリル （4' —トリメチ ルアンモニォ） ブ夕ノエ一トから選ばれ、 ステアリルアミンまたはスフインゴシ ンが好ましい。
本発明のリボソーム製剤としては、 リン脂質 1モルあたり脂質膜の表面を正に 荷電する化合物 0. 00 1〜0. 4モル、 好ましくは 0. 02〜0. 4モル、 安 定化剤 0. 6〜 1モルの範囲のものがあげられる。
本発明のリボソーム製剤は、 それ自体公知の方法により調製される。 すなわち、 一般に行われているハイ ドレ一シヨン法、 逆相蒸発法、 界面活性剤除去法、 溶媒 注入法、 凍結融解法およびデハイ ドレーシヨンリハイ ドレーシヨン法などがあげ られる。 たとえば、 ハイ ドレーシヨン法では、 リン脂質および脂質膜の表面を正 に荷電する化合物を、 それらを変成しない有機溶媒 （クロ口ホルム、 エーテルな ど） に溶解し、 得られた溶液から溶媒を留去して脂質の薄膜を調製する。 得られ た薄膜に水溶性 2 ' —デォキシシチジン化合物を含有する溶液を添加し、 攪拌処 理ぉよび超音波照射処理によつて水溶性 2 ' -デォキシシチジン化合物を取り込 んだリボソーム製剤が調製される。 ここで、 水溶性 2 ' —デォキシシチジン化合 物を含有する溶液の溶媒としては、 ゲル一液晶相転移温度よりも約 1 0 °C高い温 度に設定した、 リボソームを変成または分解せず、 かつ生理的に許容されるもの であればよく、 たとえば水、 生理食塩水または緩衝液があげられる。
逆相蒸発法では、 リン脂質および脂質膜の表面を正に荷電する化合物を、 それ らを変成しない有機溶媒 （クロ口ホルム、 エーテルなど） に溶解し、 この溶液に 水溶性 2 ' —デォキシシチジン化合物を含有する溶液を添加し、 得られた混合液 に攪拌処理、 超音波照射処理および高圧ホモジナイザ一処理を行うことによって 水溶性 2 ' —デォキシシチジン化合物溶液を均一に分散させる。 この分散液から 溶媒を留去することによつて水溶性 2 ' —デォキシシチジン化合物を取り込んだ リボソーム製剤が調製される。 ここで、 水溶性 2 ' —デォキシシチジン化合物を 含有する溶液の溶媒としては、 リボソームを変成または分解せず、 かつ生理的に 許容されるものであればよく、 たとえば水、 生理食塩水または緩衝液があげられ る。
界面活性剤除去法ではリン脂質および脂質膜の表面を正に荷電する化合物を、 界面活性剤 （コール酸、 デォキシコール酸等の陽イオン性界面活性剤およびトリ トン X— 1 0 0、 ォクチルー D—グルコシド等の非イオン性界面活性剤） および 水溶性 2 ' —デォキシシチジン化合物を含有する溶液と混合し、 攪拌処理、 超音 波照射処理および高圧ホモジナイザー処理等を行うことによって均一に分散させ、 この分散液から界面活性剤を除去することにより水溶性 2 ' —デォキシシチジン 化合物を取り込んだリボソーム製剤が調製される。 ここで、 水溶性 2 ' —デォキ シシチジン化合物を含有する溶液の溶媒としては、 リポソ一ムを変成または分解 せず、 かつ生理的に許容されるものであればよく、 たとえば水、 生理食塩水また は緩衝液があげられる。 さらに、 界面活性剤の除去は透析処理、 ゲル濾過処理お よび限外濾過処理を単独または適宜組み合わせて行うことによって行われる。 溶媒注入法ではリン脂質および脂質膜の表面を正に荷電する化合物を、 それら を変成しない有機溶媒 （エーテルゃジクロロフルォロメタンなど） に溶解し、 得 られた溶液を有機溶媒の沸点よりも約 1 0 eC高い温度に設定した水溶性 2 ' —デ ォキシシチジン化合物を含有する溶液に添加し、 有機溶媒を留去することにより 水溶性 2 ' —デォキシシチジン化合物を取り込んだリポゾーム製剤が調製される c ここで、 水溶性 2 ' —デォキシシチジン化合物を含有する溶液の溶媒としては、 リボソーム変成または分解せず、 かつ生理的に許容されるものであればよく、 た とえば水、 生理食塩水または緩衝液があげられる。
凍結融解法ではリン脂質および脂質膜の表面を正に荷電する化合物を用い、 そ れ自体公知の方法、 たとえばハイ ドレ一シヨン法、 逆相蒸発法、 界面活性剤除去 法、 凍結融解法およびデハイ ドレーシヨンリハイ ドレ一シヨン法で調製したリポ ソ一ムを超音波照射処理および高圧ホモジナイザ一処理を行うことによつて調製 される小さな一枚膜リボソーム （S U V) と水溶性 2 ' —デォキシシチジン化合 物を含有する溶液を液体窒素等の冷媒により凍結し、 次にゲル一液晶相転移温度 よりも約 1 0 °C高い温度で融解させることにより水溶性 2 ' —デォキシシチジン 化合物を取り込んだリボソーム製剤が調製される。 ここで、 水溶性 2 ' —デォキ シシチジン化合物を含有する溶液の溶媒としては、 リポソームを変成または分解 せず、 かつ生理的に許容されるものであればよく、 たとえば水、 生理食塩水また は緩衝液があげられる。
デハイ ドレーシヨンリハイドレ一シヨン法ではリン脂質および脂質膜の表面を 正に荷電する化合物を、 それらを変成させることなく、 かつ水に混和する溶媒 （ エタノール等） に溶解させ、 得られた溶液を攪拌している水層中に加え、 好まし くは高圧ホモジナイザー処理および超音波照射処理を行い、 小さな一枚膜リポソ ーム （S U V) を調製する。 ここで、 水層は糖や多価アルコール類 （ブドウ糖、 乳糖等の単糖、 二糖類およびグリセロール、 プロピレングリコール等） 等の等張 化剤を添加し、 リン脂質のゲル一液晶相転移温度より約 1 0 C高い温度に設定す る。 なお、 S U Vは、 それ自体公知の方法、 たとえばハイ ドレ一シヨン法、 逆相 蒸発法、 界面活性剤除去法、 凍結融解法およびデハイドレーシヨンリハイ ドレー シヨン法で調製したリポソームを超音波照射処理および高圧ホモジナイザー処理 を行うことによつても調製される。 この S U V懸濁液に水溶性 2 ' —デォキシシ チジン化合物を含有する溶液を添加し、 凍結させた後、 減圧下 （約 0. 1 から 0. 2 mm H g前後） で乾燥させ凍結乾燥品を得る。 ここで、 水溶性 2 ' -デォキシン チジン化合物を含有する溶液の溶媒としては、 リポソームを変成または分解せず、 かつ生理的に許容されるものであればよく、 たとえば水、 生理食塩水または緩衝 液があげられる。 この凍結乾燥状態のリボソームに分散溶媒を添加し、 ボルテツ クスミキサー等を使用し、 激しく攪拌することによって水溶性 2 ' —デォキシシ チジン化合物を取り込んだリボソーム製剤が調製される。 この分散溶媒はゲル— 液晶相転移温度よりも約 1 0 °C高い温度に設定した上記の水溶性 2 ' -デォキシ シチジン化合物を含有する溶液と同様のものであればよい。
本発明においては、 薬物内包リポソームの粒子径をより均一にするためにサイ ジング処理を行うのが好ましく、 たとえば、 脂質のゲル一液晶相転移温度よりも 約 1 0 °C高い温度に設定した装置 （ェクストルーダ、 リペツクスパイオメンブラ ン社製など） を使用し、 同じ孔径のメンブランフィルターを数回強制的に通過さ せながら、 同様の操作を孔径の大きなメンブランフィルターから孔径の小さなメ ンブランフィルタ一^ ^順次行うことにより、 平均粒子径として約 5 0から約 2 0 0 n m、 好ましくは 1 0 0〜 1 8 0 n m、 更に好ましくは 1 2 0〜1 6 0 n m、 特に好ましくは 1 5 0〜 1 6 0 n mになるように調整するとよい。
以上の操作によって、 本発明のリボソーム製剤が調製され、 必要に応じ、 超遠 心処理、 分子ふるい処理、 ゲル濾過処理、 限外濾過処理および透析処理を単独ま たは適宜組み合わせて行うことによって、 リポソ一ムに内包されなかった水溶性 2 ' —デォキシシチジン化合物を除去するとよい。
本発明のリボソーム製剤は、 安定化剤 （ァスコルビン酸、 一トコフヱロール、 3 , 5—ジ第 3級プチルー 4ーヒドロキシトルエン （B H T) など） および等張 化剤 （グリセリン、 ブドウ糖、 白糖など） とともに水溶性懸濁液とする力、、 また は凍結乾燥を行ない凍結乾燥製剤とすることができ、 好ましくは凍結乾燥製剤と して使用時に生理的に許容される水溶液によつて懸濁または希釈して注射剤 （静 脈内、 筋肉内、 皮下投与用製剤） として使用される。 これら最終製剤は、 悪性腫 瘍 〔ヒト等の哺乳動物の肺癌、 消化器系癌 （食道癌、 胃癌、 大腸癌、 直腸癌、 結 腸癌等） 、 乳癌、 頭頸部癌、 婦人科癌 （子宮癌、 子宮頸癌、 卵巣癌等） 、 泌尿器 科癌 （腎癌、 膀胱癌等） 、 白血病、 メラノーマ、 リンパ好性転移腫瘍等〕 の治療 のための有効量が投与されるように製剤設計されていればよく、 たとえば、 静脈 注射用リボソーム製剤として水溶性 2' —デォキシシチジン化合物 1〜5 0 Om gが含有されていればよく、 1日 1回ないし適宜増減して投与される。
以下に実施例および実験例をあげて、 本発明をさらに具体的に説明する。
実施例 1
DPPC 220. 2mg、 コレステロール 6 9. 0 m gおよびステアリルアミ ン 32. 4mg (DPPC : コレステロール：ステアリルアミン = 50 ： 30 ： 20モル を約 6 0°Cに加温した 1 0m lのエタノールに溶解後、 約 55でに 加温しながら攪拌している 5重量％のブドウ糖水溶液 200 m lにこのエタノー ル溶液を注入し、 粒子径が約 6 0 nmの小さなリボソーム懸濁液を調製した。 こ のリボソーム懸濁液に限外濾過処理を施し、 エタノールを除去、 約 1 Om lにな るまで濃縮を行う。 このリボソーム懸濁液に 1. 5重量％DMDC水溶液 1 Om 1を加え、 凍結乾燥を行った。 このリボソーム凍結乾燥品に約 55°Cに加温した 精製水 1 Om lを加え、 再水和後、 攪拌処理によりリボソーム懸濁液とする。 こ の懸濁液中のリボソーム粒子径を均一にするために孔径 0. 6から 0. 2 zmの ヌクレオポアメンブラン（Nucleopore membrane 野村マイクロサイエンス （株） 製） を装着したェクストルーダ （リペツクスパイオメンブラン社製） を用いてサ イジング処理を行い、 平均粒子径約 1 6 0 nmの均一なリボソームを得た。 その 後、 限外濾過により内包されなかった DMDCを除去し、 DMDCリボソームを 調製した。
実施例 2
HSPC 235. 5 mg、 コレステロール 6 9. 6 m gおよびステアリルアミ ン 32. 4mg (HSPC : コレステロール：ステアリルァミン = 5 0 ： 30 ： 20モル を約 6 0°Cに加温した 1 0m lの温エタノールに溶解後、 約 70 °C に加温しながら攪拌している 5重量％のブドウ糖水溶液 200 m lにこのェ夕ノ ール溶液を注入し粒子径が約 60 nmの小さなリボソーム懸濁液を調製した。 こ のリボソーム懸濁液に限外濾過処理を施し、 エタノールを除去後、 約 1 0m lに なるまで濃縮した。 このリボソーム懸濁液に 1. 5重量％の0^00水溶液 1 0 m lを加え、 常法によって凍結乾燥を行った。 このリボソーム凍結乾燥品に約 7 0°Cに加温した精製水 1 0m lを加え、 再水和後、 攪拌処理によりリボソーム懸 濁液とした。 この懸濁液中のリボソーム粒子径を均一にするために孔径 0. 6か ら 0. 2〃mのヌクレオポアメンブラン（Nucleopore membrane、 野村マイクロサ ィエンス （株） 製） を装着したェクストルーダ （リペツクスパイオメンブラン社 製） を用いてサイジング処理を行い、 平均粒子径約 1 6 O nmの均一なリポソ一 厶を得た。 その後、 限外濾過により内包されなかった DMDCを除去し、 DMD Cリボソームを調製した。
実施例 3
HSPC 3 92. 5 mg、 コレステロール 1 74. Omgおよびステアリルァ ミン 1 3. 5 mg (HSPC ： コレステロール：ステアリルアミン = 5 0 ： 4 5 5モル ） を約 6 0°Cに加温した 20m 1の温エタノールに溶解後、 約 70°Cに 加温しながら攪拌している注射用蒸留水 4 0 0 m lにこのエタノール溶液を注入 し粒子径が約 6 0 nmの小さなリボソーム懸濁液を調製した。 このリボソーム懸 濁液に限外濾過処理を施し、 エタノールを除去後、 約 30m lになるまで濃縮し た。 このリボソーム懸濁液に DMDC 1 50mgを加え、 常法によって凍結乾燥 を行った。 このリボソーム凍結乾燥品に約 70°Cに加温した 5重量％のブドウ糖 水溶液 1 0m lを加え、 再水和後、 攪拌処理によりリボソーム懸濁液とした。 こ の懸濁液中のリボソーム粒子径を均一にするために孔径 0. 6から 0. 2 mの ヌクレオポアメンブラン（Nucleopore membrane. 野村マイクロサイエンス （株） 製） を装着したェクストル一ダ （リペツクスパイオメンブラン社製） を用いてサ イジング処理を行い、 平均粒子径約 1 6 0 nmの均一なリボソームを得た。 その 後、 限外濾過により内包されなかった DMDCを除去し、 DMDCリボソームを 調製した。
実施例 4
HS P C 3 92. 5 mg、 コレステロール 1 74. Omgおよびスフインゴシ ン 1 5. Omg (HS P C ： コレステロール：スフインゴシン = 5 0 ： 4 5 ： 5 モル％) を約 6 0°Cに加温した 2 Om 1の温エタノールに溶解後、 約 70°Cに加 温しながら攪拌している注射用蒸留水 4 00 m lにこのエタノール溶液を注入し 粒子径が約 6 0 nmの小さなリボソーム懸濁液を調製した。 このリボソーム懸濁 液に限外濾過処理を施し、 エタノールを除去後、 約 3 Om 1になるまで濃縮した。 このリボソーム懸濁液に DMDC 1 5 Omgを加え、 常法によって凍結乾燥を行 つた。 このリボソーム凍結乾燥品に約 70°Cに加温した 5重量％のブドウ糖水溶 液 1 Om lを加え、 再水和後、 攪拌処理によりリボソーム懸濁液とした。 この懸 濁液中のリボソーム粒子径を均一にするために孔径 0. 6から 0. 2 mのヌク レオポアメンブラン（Nucleopore membrane^ 野村マイクロサイエンス （株） 製） を装着したェクストルーダ （リペツクスパイオメンブラン社製） を用いてサイジ ング処理を行い、 平均粒子径約 1 6 0 nmの均一なリボソームを得た。 その後、 限外濾過により内包されなかった DMDCを除去し、 DMDCリポソームを調製 した。
実施例 5
実施例 1における DMDCを 2' —デォキシー 2' —フルォロメチリデンシチ ジン、 2' —デォキシー 2' —メチリデン一 5—フルォロシチジン、 2' —デォ キシー 2' , 2' ージフルォロシチジン、 または 2' — Cーシァノー 2' —デォ キシー —ァラビノフラノシルシトシンに替えて同様にリポソ一ム製剤を得る。 対照例 1
DMDC濃度が 1 5mgZm l となるように 2. 5重量％乳酸水溶液で溶解し た。
比較例 1
HSPC 235. 5 mgおよびコレステロール 1 1 6. Omgを 60°Cに加温 した 1 Om 1の温エタノールに溶解しエタノール溶液を調製した。 以下、 実施例 2と同様にして DMDCリポソームを得た。
実験例 1
対照例 1で得た D M D C溶液を一群 3から 8匹の雄性 SDラッ トに DMDCと して 3 OmgZkgで静脈内投与した。 投与後、 経時的に 0. 25、 0. 5、 1、 2、 4および 6時間目の血漿、 肝臓および骨髄を採取し、 DMDC濃度を測定し た。 また、 臓器移行性は肝臓および骨髄の組織中濃度と血漿中濃度の比である K P値 （組織中濃度/血漿中濃度） を使用して評価した。 定量は HP LC法で行い、 定量限界はそれぞれ、 0. 1 zg/m l (血漿） 、 0. 5 gZg (肝臓） 、 約 0. 25 n g/g (骨髄） であった。 その結果、 図 1に示すように水溶液静注時 のラットにおける骨髄および肝臓中濃度推移は血漿中濃度推移とほぼ同様であつ た。 1< 値は肝臓で約 1. 2、 骨髄で 0. 9であり、 各時間でほぼ一定であった c 実験例 2
実施例 1で得た DMDCリポソ一ム製剤または対照例 1で得た DMDC溶液を —群 3から 8匹の雄性 SDラットに DMDCとして 3 Omg/k gで静脈内投与 した。 投与後、 経時的に 0. 25、 0. 5、 1および 2時間目の血漿ならびに実 験終了時の肝臓および骨髄を採取し、 DMDC濃度を測定した。 また、 臓器組織 移行性は組織中濃度と血漿中濃度の比である Kp値 （組織中濃度/血漿中濃度） を使用して評価した。 その結果、 図 2に示すように対照例投与時に比べ、 血漿中 濃度が著しく持続し、 2時間までの AUC (曲線下面積） 値が約 3. 4倍に上昇 した。 さらに、 第 1表に示すように肝臓および骨髄移行性が約 1ノ 2に低下した c
第 1 表
[fjji f =
Ut水 ( 中 T濃 the IX. 肝臓中濃度 昏！ ¾中濃 [¾=
(J g/m 1 ) in g/g) (fl g/g) 対昭例 1 5. l ± 1. 1 4 . 7 ± 1. 0 4. 0 ± 0. 8
( 1 ) (0 . 9± 0. 1 ) (0. 8 ± 0. 2) 実施例 1 38. 1 ± 5. 3 22 . 5± 3. 2 1 2. 4 ± 1. 2
( 1 ) (0 . 6± 0. 2) (0. 3± 0. 1 ) 括弧内の数値は Kp値 （組織中濃度 Z血漿中濃度） を示す。
実験例 3
実施例 3で得た D M D Cリボソーム製剤または対照例 1で得た D M D C溶液を —群 3から 8匹の雄性 SDラットに DMDCとして 3 OmgZk gで静脈内投与 した。 投与後、 経時的に 0. 25、 0. 5、 1、 2、 4、 6、 1 0および 24時 間目の血漿ならびに実験終了時の肝臓および骨髄を採取し、 D MD C濃度を測定 した。 また、 臓器組織移行性は組織中濃度と血漿中濃度の比である Kp値 （組織 中濃度/血漿中濃度） を使用して評価した。 その結果、 図 3に示すように血漿中 濃度が持続し、 対照例投与時に比べて、 2時間、 1 0時間および 24時間までの AUC値がそれぞれ約 3倍、 約 8倍および約 1 3倍に増大した。 臓器移行性につ いて、 2時間値、 1 0時間値および 24時間値を比較した結果、 第 2表に示すよ うにリポソ一ム製剤化によって、 骨髄移行性が約 1 Z2〜約 1 Z4に低下した。 第 2 表 血漿中濃度 肝臓中濃度 骨髄中濃度
( g/m i； in g/g; v Λ* ¾ / も） 昭例 1 1 + 1 1 1 4 7 + 1 η 4 • 0 v + 0 U . β O
( 2時間値） ( 1 ) (0 . 9 ± 0. 1 ) (0 . 8 ± 0. 2) 実施例 3 3 9 7+ 1 2 . 0 22 0 + 1 8 1 l . 5 ± 3. 7
( 2時間値） ( 1 ) (0 . 7± 0. 1 ) (0 . 4 ± 0. 1 ) 実施例 3 1 5. 0 ± 6. 1 7 . 6 ± 2. 2 3 . 9 ± 1. 1
( 1 0時間値） ( 1 ) (0 . 5 ± 0. 2) (0 . 2± 0. 1 ) 実施例 3 5. 4 ± 2. 3 6 . 0 ±2. 6 1 . 3 ± 0. 4
( 24時間値） ( 1 ) ( 1 . 4 ± 1. 0) (0 . 3± 0. 1 ) 括弧内の数値は Kp値 （組織中濃度/血漿中濃度） を示す。
実験例 4
実施例 3、 比較例 1で得た DMD Cリポソーム製剤および対照例 1で得た DM DC溶液を一群 3から 8匹の雄性 SDラットに DMDCとして 3 OmgZk gで 静脈内投与した。 投与後、 経時的に 0. 2 5 0. 5 1 2 4 6 1 0お よび 24時間目の血漿ならびに実験終了時の肝臓および骨髄を採取し、 DMDC 濃度を測定した。 また、 臓器組織移行性は組織中濃度と血漿中濃度の比である K P値 （組織中濃度/血漿中濃度） を使用して評価した。 その結果、 図 4に示すよ うにステアリルァミンを除いた比較例 1のリポソーム製剤では血漿中滞留性が減 少し AUC値が低下した。 また、. 骨髄組織移行性については、 ステアリルアミン を添加した実施例 3のリポソ一ム製剤が比較例 1のリボソーム製剤よりも約 1.5 倍の抑制効果を示した。 第 3 表 血漿中濃度 肝臓中濃度 骨髄中濃度
Figure imgf000017_0001
対照例 1 1 ± 1. 1 4. 7 ± 1. 0 4. 0 ± 0. 8 ( 2時間値） ( 1) (0. 9 ± 0. 1 ) ( 0. 8 ± 0. 2) 実施例 3 29. 7± 1. 7 22. 0± 1. 8 1 1. 5 ± 3. 7 (2時間値） （ 1 ) (0. 7± 0. 1 ) (0. 4± 0. 1 ) 実施例 3 1 1 ± 2. 6 7. 6±2. 2 3. 9 ± 1. ( 1 0時間値） ( 1 ) ( 0. 5± 0. 2) ( 0. 2 ± 0. 1 ) 実施例 3 5. 4 ±2. 3 6. 0±2. 6 1. 3± 0. 4 ( 24時間値） （ 1 ) ( 1. 4 ± 1. 0) (0. 3± 0. 1 ) 比較例 1 1 4. 3 ± 0. 1 7. 9± 1. 1 8. 0 ± 0. 9
( 2時間値） ( 1 ) ( 0. 6 ± 0. 1 ) (0. 6 ± 0. 1 ) 比較例 1 1 0. 0± 1. 0 9. 2± 1. 6 3. 1 ± 1. 1
( 1 0時間値） ( 1 ) ( 0. 9 ± 0. 3 ) ( 0. 3 ± 0. 1 ) 比較例 1 3. 3± 0. 8 8. 7±2. 9 1. 2± 0. 3
( 24時間値） （ 1 ) (2. 9± 1. 6) (0. 4± 0. 1 ) 括弧内の数値は Kp値 （組織中濃度 Ζ血漿中濃度） を示す。
実験例 5 実施例 3、 比較例 1で得た DMDCリボソーム製剤 （DMDC 1 0 Omg/k g相当） または対照例 1で得た DMDC水溶液 （DMDC 1 00 mg/kg) を一群 5から 6匹の LX— 1ヒト肺癌移植雄性 BALBZc— n uノ n uヌードマウス に 1日 1回、 5日間連続尾静脈内投与した。 投与後、 経時的に腫瘍の長径 （L)、 短径 （W) を計測し、 腫瘍体積 （V) を次式により算出した。
V= 1/2 XLXW2
各マウスについて治療開始日 （0日目） の体積 V。 に対する相対比 VZV。 を 計算し、 計測日 （n日目） における対照群および治療群の Vn/V。 の平均値 C n、 Tnを求め、 次式により TZC (% を算出し、 治療効果の指標とした。
T/C (%) = (Tn/Cn) x 1 00
観察期間は原則として 4週間とした。 C nと T nの有意差の検定はマン—ホイ ッ トニイ （Man n -Wh i t n e y) の U検定を用いた。 この結果を図 5に示 す。
図 5から明らかなように、 実施例 3で得た DMDCリボソーム製剤は LX— 1 ヒト肺癌の増殖を有意に抑制した。 その効果は対照例 1で得た DMDC水溶液投 与時よりも著しく増強され、 さらにステアリルァミンをのぞいた比較例 1のリポ ソーム製剤と比較しても強いものであった。 この実験結果により、 本発明の DM D Cリポソ一ム製剤は、 悪性腫瘍に対して有意の治療効果を示すことが示唆され た。
産業上の利用可能性
本発明のリボソーム製剤は、 抗悪性腫瘍作用を示す水溶性 2' —デォキシシチ ジン化合物の骨髄組織への毒性柽減が期待できるばかりでなく、 血中滞留性の向 上による腫瘍組織への有効成分の集積も期待できることから、 副作用を発現せず に抗腫瘍効果が維持または向上させ得、 悪性腫瘍の治療に有用である。

Claims

請求の範囲
1. 水溶性の 2' —デォキシシチジン化合物を内包し、 脂質膜の表面を正に荷電 する化合物を含有することを特徴とするリポソーム製剤。
2. 水溶性の 2' —デォキシシチジン化合物を内包し、 脂質膜の表面を正に荷電 する化合物と安定化剤を含有することを特徴とするリポソーム製剤。
3. 2' —デォキシシチジン化合物が、 2' —デォキシー 2' —メチリデンシチ ジン、 2' —デォキシー 2' —フルォロメチリデンシチジン、 2' —デォキシー 2， 一メチリデンー 5—フルォロシチジン、 2' —デォキシー 2' , 2' —ジフ ルォロシチジン、 2' — Cーシァノー 2' —デォキシー —ァラビノフラノシル シトシンまたはそれらの医薬上許容される塩もしくは水和物から選ばれることを 特徴とする請求の範囲第 1または 2項記載のリポソーム製剤。
4. 2' —デォキシシチジン化合物が、 2' —デォキン一 2' —メチリデンシチ ジン、 ーデォキシー 2' —メチリデンー 5—フルォロシチジンまたはそれら の医薬上許容される塩もしくは水和物から選ばれることを特徴とする請求の範囲 第 1または 2項記載のリボソーム製剤。
5. 2' —デォキシシチジン化合物が、 2' —デォキシー 2' —メチリデンシチ ジン 2水和物である請求の範囲第 1または 2項記載のリポソーム製剤。
6. 脂質膜の表面を正に荷電する化合物がステアリルァミン、 ォレイルァミン、 スフイ ンゴシン、 ホスファチジルエタノールァミ ン、 N— 〔1一 （2, 3—ジォ レイ口キシ） プロピル〕 一 N, N, N—トリメチルアンモニゥムクロライ ド、 コ レステリルへミサクシネート、 3 B— CN- (Ν' , N' ージメチルアミノエ夕 ン） 力ルバモイル〕 コレステロールおよびコレステリル （4' 一トリメチルアン モニォ） ブ夕ノエ一トから選ばれる化合物であることを特徴とする請求の範囲第 1または 2項記載のリボソーム製剤。
7. 脂質膜の表面を正に荷電する化合物がステアリルアミンおよびスフィンゴシ ンから選ばれる化合物であることを特徵とする請求の範囲第 1または 2項記載の リボソーム製剤。
8 . 脂質膜の表面を正に荷電する化合物がステアリルアミンであることを特徴と する請求の範囲第 1または 2項記載のリポソーム製剤。
9 . 脂質膜の表面を正に荷電する化合物がスフィンゴシンであることを特徴とす る請求の範囲第 1または 2項記載のリポソーム製剤。
1 0 . リボソームが、 そのゲル一液晶相転移温度が 3 7て以上であるリン脂質か ら構成されることを特徴とする請求の範囲第 1 または 2項記載のリボソーム製剤 c
1 1 . リボソームが、 そのゲル一液晶相転移温度が 4 0でから 6 5 °Cであるリン 脂質から構成されることを特徵とする請求の範囲第 1または 2項記載のリポソ一 ム製剤。
1 2 . リボソームが水素添加精製卵黄ホスファチジルコリン、 水素添加精製大豆 ホスファチジルコリン、 ジパルミ トイルホスファチジルコリンおよびジステア口 ィルホスファチジルコリンから選ばれるリン脂質から構成されることを特徴とす る請求の範囲第 1または 2項記載のリポソ一ム製剤。
1 3 . リポソ一ムが水素添加精製大豆ホスファチジルコリンおよびジパルミ トイ ルホスファチジルコリンから選ばれるリン脂質から構成されることを特徴とする 請求の範囲第 1または 2項記載のリボソ一ム製剤。
1 4 . リボソームが水素添加精製大豆ホスファチジルコリンにより構成されるこ とを特徴とする請求の範囲第 1または 2項記載のリポソ一ム製剤。
1 5 . 安定化剤が、 ステロール類およびスフインゴミエリンから選ばれることを 特徴とする請求の範囲第 1または 2項記載のリポソーム製剤。
1 6 . 安定化剤が、 ステロール類から選ばれることを特徴とする請求の範囲第 2 項記載のリボソーム製剤。
1 7 . 安定化剤が、 コレステロールであることを特徴とする請求の範囲第 2項記 載のリボソーム製剤。
1 8 . リボソームの平均粒子径が 5 0〜2 0 0 n mの範囲であることを特徴とす る請求の範囲第 1 または 2項記載のリポソーム製剤。
1 9 . リポソームの平均粒子径が 1 0 0〜 1 8 0 n mの範囲であることを特徴と する請求の範囲第 1または 2項記載のリポソーム製剤。
2 0. リボソームの平均粒子径が 1 2 0〜 1 6 0 nmの範囲であることを特徴と する請求の範囲第 1または 2項記載のリポソーム製剤。
2 1. リポソ一ムの平均粒子径が 1 5 0〜 1 6 0 nmの範囲であることを特徴と する請求の範囲第 1または 2項記載のリポソーム製剤。
22. リン脂質 1モルあたり、 脂質膜の表面を正に荷電する化合物を 0. 0 0 1 〜0. 4モル、 安定化剤を 0. 6〜1モルの範囲で含有することを特徴とする請 求の範囲第 2項記載のリボソーム製剤。
2 3. リン脂質 1モルあたり、 脂質膜の表面を正に荷電する化合物を 0. 0 2〜 0. 4モル、 安定化剤を 0. 6〜 1モルの範囲で含有することを特徴とする請求 の範囲第 2項記載のリポソーム製剤。
24. 2' -デォキシー 2' —メチリデンシチジン 2水和物を内包し、 脂質膜の 表面が正に荷電され、 水素添加精製大豆ホスファチジルコリンおよびジパルミ ト ィルホスファチジルコリンから選ばれるリン脂質 1モルに対し、 ステアリルァミ ンまたはスフインゴシン 0. 0 0 1〜0. 4モル、 およびコレステロール 0. 6 〜 1モルの割合で構成され、 平均粒子径が 5 0〜2 0 0 nmの範囲にあることを 特徴とするリボソーム製剤。
2 5. 2' —デォキシ— 2' —メチリデンシチジン 2水和物を内包し、 脂質膜の 表面が正に荷電され、 水素添加精製大豆ホスファチジルコリンおよびジパルミ ト ィルホスファチジルコリンから選ばれるリン脂質 1モルに対し、 ステアリルァミ ン 0. 0 2〜0. 4モル、 およびコレステロール 0. 6〜1モルの割合で構成さ れ、 平均粒子径が 1 20〜 1 6 0 nmの範囲にあることを特徴とするリポソーム 製剤。
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