WO1995001371A1 - Nouveau peptdie et agent anti-agregation plaquettaire le renfermant - Google Patents

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WO1995001371A1
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peptide
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PCT/JP1994/000999
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Inventor
Yoshimi Sato
Yoshio Hayashi
Jun Katada
Yoshimi Takiguchi
Original Assignee
Nippon Steel Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/75—Fibrinogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel peptide and a platelet aggregation inhibitor using the same.
  • the present invention relates to a novel peptide having a platelet aggregation inhibitory action, and a platelet aggregation inhibitor containing the peptide as an active ingredient.
  • platelets play a major role in preventing bleeding by adsorbing to the surface of damaged blood vessels.
  • platelets are activated by binding to connective tissue proteins such as collagen present in subendothelial tissues exposed due to vascular damage and the like, and to platelet membrane receptors such as thrombin present in plasma. It is also activated by autocrine binding to membrane receptors through the release of adenosine diphosphate (ADP), adrenaline, serotonin, thromboxane (TX) A2, etc. present in platelets .
  • ADP adenosine diphosphate
  • adrenaline adrenaline
  • TX thromboxane
  • the two types of glycoprotein units that constitute the fibrinogen receptor are displayed on the cell surface, associate with each other, and form a receptor complex (gpllbllla). Aggregation via cross-linking is induced.
  • the monoclonal antibody has the potential as a therapeutic agent to suppress platelet aggregation, but it is a high molecular weight protein. There is concern about the production of antibodies that act on itself. Therefore, the development of a platelet aggregation inhibitor, which is a low molecular weight compound having no properties as an antagonist to the gpllbllla complex and having no immunogenicity, is expected.o
  • RGD arginine-glycine-aspartic acid
  • the tetrabeptide derivative having an RGD peptide is described in JP-A-1-90699, JP-A-2-62892, EP0422937AI, and US Pat. No. 4,952,562. Derivatives composed of peptides are further described in JP-A-63-215696. In addition, derivatives of the cyclic structure of the RGD peptide are described in JP-A-3-118331, JP-A-2-62892 or WO09 / 01331.
  • the present invention has a structure that is excellent in platelet aggregation inhibitory ability and has a structure as close as possible to a natural peptide and a structure that is easily absorbed in the body. It is an object of the present invention to provide a peptide having excellent safety properties, which has a drug duration and is rapidly metabolized and then eliminated, and a platelet aggregation inhibitor containing the peptide as an active ingredient.
  • the present invention introduces a structure having a guanidino group or an amidino group to the amino group of the N-terminal amino acid of the peptide having the RGD sequence, thereby allowing natural peptides to be introduced. It has been found that the platelet aggregation inhibitory activity is significantly increased while maintaining the structure as close as possible. It was also found that introduction of the carboxylic acid having the basic group into the amino group of the N-terminal amino acid increases the resistance of the present peptide to aminopeptidase and leads to an improvement in stability in vivo.
  • an alkyl chain, an aromatic ring, or a hydrophobic group corresponding thereto is introduced between the basic group and the N-terminal amino acid to increase the hydrophobicity of the peptide, thereby increasing the body of the compound in the intestinal tract and the like.
  • the inventors have found that the absorption is promoted, and completed the present invention.
  • the present invention has the following matters as its gist.
  • A is an aliphatic carboxylic acid having a guanidino group or an amidino group, an aromatic carboxylic acid, or an acyl group derived from a carboxylic acid containing both an aliphatic group and an aromatic group
  • B is an amino acid residue
  • C represents an amino acid residue having a hydrophobic group
  • D represents —OH or —NH 2
  • m represents an integer of 0 to 3, and represents the number of amino acid residues in B].
  • the amino acid of B is represented by Trp-Z (wherein, Z represents a serine residue, a glycine residue, a valine residue, or an S-alanine residue).
  • Z represents a serine residue, a glycine residue, a valine residue, or an S-alanine residue.
  • Y is - (CH 2) P C0- or - (CH 2) q C 6 H 4 C0 - ( wherein, p and q, it - respectively an integer from 0 to 8), and D is - shows the NH 2] - 0H or.
  • A is an aliphatic carboxylic acid having a guanidino group or an amidino group, an aromatic carboxylic acid, or an acyl group derived from a carboxylic acid containing both an aliphatic group and an aromatic group; the presence of the guanidino group or the amidino group; Has greatly improved the platelet aggregation inhibitory activity of the compound of the present invention. This is because the presence of the basic group makes it easier for the molecule itself to form a three-dimensional structure essential for the expression of activity, or the portion interacts with a new acidic pocket in the receptor molecule to form the receptor. It is presumed to enhance the ability to bind with the body.
  • the carboxylic acid containing an aliphatic carboxylic acid, an aromatic carboxylic acid, or both an aliphatic group and an aromatic group having a guanidino group or an amidino group constituting the acyl group represented by A is as follows. ⁇
  • Examples of the aliphatic carboxylic acid include a carboxylic acid having an alkyl group and a cycloalkyl group. Therefore, A represents guanidinoalkylcarboxylic acid, amidinoalkylcarboxylic acid, Nocycloalkylcarboxylic acids, specifically, 6-guanidinocaproic acid, 6-amidinocabronic acid, 5-guanidinovaleric acid, 5-amidinovaleric acid, 7-guanidinoheptanoic acid, 7-amidinoheptanoic acid; Guanidinocyclohexylcarboxylic acid, amidinocyclohexylcarboxylic acid, guanidinomethylcyclohexylcarboxylic acid, amidinomethylcyclohexylcarboxylic acid, guanidinocyclohexylacetic acid, amidinocyclohexylacetic acid, etc. be able to.
  • aromatic carboxylic acid examples include carboxylic acids having an aromatic ring such as benzoic acid, and carboxylic acids having a hetero ring such as thiazoline carboxylic acid. That is, A having a guanidino group or an amidino group bonded to these rings is acceptable.
  • Examples of the carboxylic acid containing both an aliphatic group and an aromatic group include phenylacetic acid, phenylpropionic acid, keichic acid, alkylbenzoic acid, and alkylphenylacetic acid. Therefore, A is acceptable as long as a guanidino group or an amidino group is bonded to these structures.
  • guanidinophenyl acetic acid amidino phenyl acetic acid, guanidino phenyl propionic acid, amidino phenyl propionic acid, guanidino keichic acid, amidino keichic acid, guanidino methyl benzoic acid, amidino methyl benzoic acid, guanidino methyl
  • phenylacetic acid and amidinomethylphenylacetic acid include phenylacetic acid and amidinomethylphenylacetic acid.
  • the hydrophobicity of A can be adjusted by changing the number of carbon atoms in consideration of absorption into the living body.
  • the hydrophobic group of the sulfonic acid moiety Y other than the basic group is preferably such that p or q is an integer of 0 to 8, In particular, in the case of an alkylcarbonyl group, is preferably 5. In the case of an alkylbenzoyl group, the alkyl group is preferably as low as possible.
  • B plays a role as a spacer located between A, which exhibits effects such as enhancement of activity and improvement of stability, and arginine residue which is a receptor recognition site essential for expression of activity.
  • It is an amino acid residue that plays a role, and the number m of the residues is preferably an integer of 0 to 3 as a distance where A effectively acts. More preferably, m is an integer of 2, and a structure in which two kinds of amino residues are Trp-Z is more preferable.
  • Z is Amino acid residues that do not cause strong steric hindrance to arginine are preferred, and specific examples include serine residues, glycine residues, palin residues, and -alanine residues. Among these amino acid residues, serine residues are particularly preferable in consideration of the obtained platelet aggregation inhibitory activity of the peptide of the present invention.
  • C is a hydrophobic domain that is thought to interact with a hydrophobic pocket in the receptor Ilbllla. That is, C must be an amino acid residue having a hydrophobic group. Specific examples include a tributophan residue, a phenylalanine residue, and a tyrosine residue. Of these, tryptophan residues are particularly preferred.
  • D is, - 0H or - but is either Saku 2, in the case of -0H - platelet aggregation inhibiting activity than that of NH 2 tends to be high.
  • Specific peptides of the present invention include, for example, the following.
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2) C0-Pro-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2) 2 CO- Pro-Ser- Arg- Gly -Asp- Trp- OH
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2 ) 3 C0- Pro- Ser- Arg- Gly- As P-Trp-OH, H 2 NCONH) NH (CH 2 ) 4 C0- Pro -Ser- Arg- Gly- Asp-Trp- OH
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2 ) 5 C0- Pro- Ser-Arg- Gly- Asp- Trp- 0H
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2 ) 6 C0- Pro- Ser-A rg-Gly-Asp-Trp-OH
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2 ) 8 C0- Pro- Ser- Arg- Gly- As
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2) C0-Gly-Arg-Gly-Asp-Trp-0H
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2) 2 C0-G ly-Arg-Gly-Asp- Trp-OH
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2 ) 3 C0-Gly-Arg-Gly-Asp-Trp-0H
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2 ) 4 C0- Gly- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2 ) 5 C0-Gly- Arg-Gly-Asp-Trp-OH
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2 ) 6 C0- Gly- Arg-Gly-Asp- Trp- 0H
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2) 7 C0- Gly- Arg- Gly- Asp_Trp- 0H
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2 ) C0- ⁇ Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-OH
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2 ) 2 CO- ⁇ Ala-Arg-Gly-Asp -Trp-OH
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2 ) 3 C0- ySAla- Arg- Gly- Asp-Trp-OH
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2 ) 4 C0- ⁇ Ala- Arg- Gly_Asp- Trp- OH
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2 ) 5 C0- ySAla- Arg- Gly-Asp- Trp- OH
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2 ) 6 C0- / SAla- Arg-Gl y-Asp -Trp-OH, H 2 NCONH) NH (CH 2) 7 C0- Ala- Arg- G
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2) 2 C0-Arg-G ly-Asp-Trp-OH
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2 ) 3 C0- Arg- Gly- Asp- Trp- OH
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2 ) 4 C0-Arg-Gly-Asp-Trp-0H
  • H 2 NC ( NH) NH (CH 2 ) 5 C0- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H
  • the peptide of the present invention can be easily synthesized by a simple operation using a commercially available amino acid. That is, the peptide of the present invention can be prepared by a method usually used in peptide chemistry, for example, “The Peptides”, Vol. 1, [Schroder and Luhke, Academic Press, New York, USA (1966)], “Peptides” Basic method and experiment of synthesis ”[Nobuo Izumiya et al., Maruzen Co., Ltd. (1985)], etc., and it can be produced by either liquid phase method or solid phase method. Can also be manufactured. Further, any of a column method and a batch method can be used.
  • Condensation methods for forming peptide bonds include the azide method, acid chloride method, acid anhydride method, carposimid method, carposimidative method, active ester method, carbonilimidazole method, redox method, and enzymatic method. And a method using Woodward's reagent K.
  • the acid anhydride method, the carpoimide method, and the active ester method are mentioned as main methods.
  • the C-terminal amino acid of the peptide chain is bound to a support such as a resin which is insoluble in the organic solvent used.
  • a resin in which a functional group is introduced for the purpose of bonding an amino acid to the resin a spacer in which a spacer is inserted between the resin and the functional group, and a resin that can be cut at various points depending on the conditions.
  • Resins having introduced chains referred to as hands (handles) may be used according to the purpose.
  • a resin examples include a halomethyl resin such as a chloromethyl resin, an oxymethyl resin, a 4- (oxymethyl) -phenylacetamide methyl resin, a 4- (oxymethyl) -fuunoxymethyl resin, and a C-terminal amide. And the like.
  • carboxyl-protecting group examples include generally known protecting groups such as various methyl esters, ethyl esters, benzyl esters, p-nitrobenzyl esters, t-butyl esters, and hexyl esters. .
  • Examples of the protecting group for an amino group include a benzyloxycarbonyl group, a t-butoxycarbonyl group, an isobornyloxycarbonyl group, and a 9-fluorenylmethoxycarbonyl group.
  • Examples of the protecting group for the guanidino group in the arginine residue include nitro, tosyl, mesitylenesulfonyl, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, 2,2,5,7 , 8-pentamethylcguchiman-6-sulfonyl group and the like.
  • Examples of the protecting group for a hydroxyl group in an amino acid residue containing a hydroxyl group such as a serine residue include a t-butyl group, a benzyl group, a trimethylsilyl group, a tetrahydrovinylyl group and the like.
  • activated carboxyl groups include, for example, an acid anhydride corresponding to the carboxyl group; azide; pentafluorophenol, 2,4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, p-ditrophenol, N Active esters with -hydroxysuccinic acid imid, N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, N-hydroxyphthalimido, 1-'hydroxybenzotriazole and the like.
  • the activated amino group include a phosphoric acid amide corresponding to the amino group.
  • chloroform form for example, chloroform form, dichloromethane, ethyl acetate, ⁇ , ⁇ -dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, pyridine, dioxane, tetrahydrofuran, ⁇ -methylpyrrolidone, water, methanol and the like, or a mixture thereof. it can.
  • reaction temperature of the condensation reaction can be in the range of 30 ° C. to 50 ° C. as in the usual case.
  • the above-described peptide bond is formed as it is or in a state where these basic groups are protected by an appropriate protecting group. It can be introduced by using a condensation method.
  • the guanidino group or amidino group-protecting group include the above-mentioned amino group and the guanidino group for arginine.
  • the guanidino group can be introduced by introducing the guanidino group in advance and then converting the amino group to a guanidino group using a guanidino reagent.
  • guanidinating reagent examples include 3,5-dimethylvirazole-1-carboxamidine nitrate and S-methylisothiourea. Further, after introduction as a halogen, the halogen can be guanidinated with guanidine.
  • the type of the reaction for removing the protective group in the production process of the peptide of the present invention is selected according to the type of the protective group to be used, as long as the protective group can be released without affecting the peptide bond. can do.
  • a cationic scavenger such as anisol, phenol, cresol, thioanisole, and ethanedithiol. No. Thereby, the deprotection group reaction is efficiently performed.
  • the elimination of the peptide of the present invention synthesized by the solid phase method from the solid phase is also usually performed by a known method.
  • the above-mentioned treatment with an acid or a silylating agent and the like are mentioned as the desorption method.
  • the thus-produced peptide of the present invention can be obtained, after the completion of the above series of reactions, by making use of separation and purification means which are generally known.
  • the peptide of the present invention can be obtained in a purer form by extraction, distribution, reprecipitation, recrystallization, column chromatography and the like.
  • the peptide of the present invention can be obtained in the form of a salt depending on the reaction conditions in the production process.
  • the salt include inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, and phosphoric acid; organic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid, glycolic acid, succinic acid, malic acid, tartaric acid, cunic acid, and trifluoroacetic acid; Alkali metal salts such as sodium and potassium; alkaline earth metal salts such as calcium salts; and organic amines such as ammonium, ethanolamine, triethylamine, dicyclohexylamine and the like.
  • the peptide of the present invention obtained above is used as a platelet aggregation inhibitor
  • the peptide of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof is used as an active ingredient together with a solid or liquid pharmaceutical carrier or diluent. That is, it is preferable to prepare a formulation together with excipients and stabilizers.
  • the ratio of the active ingredient to the carrier component is
  • the dosage form and administration form of the preparation can be used in the form of granules, fine granules, powders, tablets, capsules, pills or liquids. Further, it can be administered orally as it is, and can be administered as an injection by intravenous administration, intramuscular administration, or subcutaneous administration. When used as an injection, the peptide of the present invention can also be prepared as a powder for injection at the time of use.
  • any organic or inorganic, solid or liquid pharmaceutical carrier or diluent suitable for oral, enteral or parenteral administration can be used to prepare the platelet aggregation inhibitor of the present invention.
  • Water, gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, talc, animal and vegetable oils, benzyl alcohol, gum, polyalkylene glycos W 5/71, petroleum resin, coconut oil, lanolin and other carriers used in pharmaceuticals can all be used as carriers or diluents for the platelet aggregation inhibitor of the present invention.
  • Water, gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, talc, animal and vegetable oils, benzyl alcohol, gum, polyalkylene glycos W 5/71, petroleum resin, coconut oil, lanolin and other carriers used in pharmaceuticals can all be used as carriers or diluents for the platelet aggregation inhibitor of the present invention.
  • a stabilizer, a wetting agent, or an emulsifier can be added, and a salt can be appropriately used as an auxiliary agent as an osmotic pressure regulator or a pH regulator.
  • the platelet aggregation inhibitor of the present invention may be used in the treatment of various diseases, in addition to the above-mentioned active ingredient, if necessary, other pharmaceutically active ingredients, for example, other types of platelet aggregation inhibitory components, or blood.
  • a coagulation inhibitor can be contained.
  • the active ingredient in an amount of 5 to 80% by weight.
  • the effective component is contained at a ratio of 1 to 30% by weight.
  • parenteral administration preparations when used as an injection, it is preferable to contain the active ingredient in a proportion of 1 to 10% by weight.
  • the dosage can be adjusted as appropriate depending on the age, symptoms, etc. of the patient.
  • the above-mentioned platelet aggregation inhibitor of the present invention can be administered once a day, but can also be administered at appropriate intervals in 2 to 3 divided doses.
  • the administration can be performed once or continuously by means such as infusion.
  • the compound of the present invention when used as a blood coagulation inhibitor for extracorporeal circulation, it can be used in the form of the above-mentioned injections or drops.
  • the place of administration and dosage vary depending on the extracorporeal circulation system and the duration of the system.For example, 1 to 100 mg / kg per hour should be continuously injected from the entrance to the extracorporeal circulation system. Can be.
  • the dosage, whether administered alone or in combination with other drugs, is small and effective in the extracorporeal circulation system compared to the body in which high amounts of degrading enzymes are present.
  • heparin which has been conventionally used as a blood coagulation inhibitor for extracorporeal circulation
  • two important pathways related to blood coagulation such as platelet aggregation and coagulation
  • blood coagulation can be more completely suppressed available.
  • a synergistic effect of the two can be expected, the use of heparin, which has the above-mentioned side effects, can be reduced.
  • a thrombolytic agent such as a citrate proteinase inhibitor (eg, fuzan) or a tissue plasminogen activator is also effective.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of a stability test of the peptide of the present invention in plasma.
  • a peptide of the formula (IX) was synthesized in the same manner as in Example 1.
  • the peptide of the formula (VII) was synthesized in the same manner as in Example 1.
  • a peptide of the formula (VIII) was synthesized in the same manner as in Example 1.
  • the blood was further centrifuged at room temperature for 15 minutes (3500 rpm, 1500 g), and the supernatant was taken after stopping without applying a brake to obtain platelet-poor plasma (PPP). After the preparation of PPP, the platelet count was measured, and only those with a platelet count of 2 ⁇ 10 8 ml or more were subjected to the experiment described below.
  • PPP platelet-poor plasma
  • Platelet aggregation was measured from changes in the light transmittance of PRP using an 8-channel platelet aggregometer (Hematracer, Nikoh Bioscience, Tokyo, Japan).
  • 200 l of PPP and PRP were placed in a glass cuvette, incubated at 37 ° C, and the transmittance was measured.
  • the transmittance of PPP was set to 100%, and the transmittance of PRP was set to 0%.
  • physiological saline or physiological saline containing a sample is added to PRP at 10 z1 and incubated at 37 ° C for 1 minute, and then a 100 ⁇ g Zml collagen solution is added at 10 ⁇ ⁇ 1 (final concentration 5 ⁇ l).
  • Samples 2.2X10- 2 was dissolved in physiological saline so that the M, was used to the prepare the 2-fold dilution series based on experiments.
  • the sample insoluble in physiological saline was dissolved in physiological saline containing 10% of DSO (dimethyl sulfoxide).
  • Blood was collected from healthy men who had not taken any medication for at least two weeks. Blood was collected from the vein of the inferior patch on an empty stomach using a plastic syringe previously containing 10 volumes of 3.8% sodium citrate solution. Immediately after blood collection, the syringe was stirred to mix both solutions. For stability in whole blood, an experiment was performed using this blood as it was. On the other hand, for the stability in plasma, the blood was centrifuged for 10 minutes (800 g :), and the rotation was stopped without applying a brake, and the supernatant was used as the blood fraction to conduct an experiment.
  • the samples were analyzed by reverse phase HPLC.
  • the peak area of each synthetic peptide was calculated, and the stability in blood or plasma was evaluated using the change in the peak area as an index.
  • FIG. 1 shows the results of examining the stability in plasma by comparing the compounds of Example 1 and Example 4 with the compound of Comparative Example 1.
  • the compound of Comparative Example 1 the compound was very rapidly decomposed in plasma, and its half-life was 3.1 minutes.
  • both the compounds of Example 1 and the compound of Example 4 showed much higher stability in plasma than the compound of Comparative Example 1, and even after 120 minutes, more than 70% did not undergo degradation. It remained.
  • an aliphatic carboxylic acid having an guanidino group or an amidino group represented by A in the general formula, an aromatic carboxylic acid, or a carboxylic acid containing both an aliphatic group and an aromatic group is defined in the present invention.
  • the stability in blood has also been dramatically improved. This indicates that when the compound is administered by oral, infusion, intravenous administration, etc., platelet aggregation is more effectively suppressed in the body. This supports the usefulness of the invention.
  • mice Male, 6 weeks old that had been fasted for 16 hours were used.
  • the mice were grouped into groups of five, and were administered with the peptide administration group of the present invention shown in Example 1, the peptide administration group of Comparative Example 1, or the aspirin administration group 2 orally used as a platelet aggregation inhibitor. It was divided into a total of 5 groups, a group and a control group. Each drug was used by suspending it in a 5% gum arabic solution, and a 5% gum arabic solution was used as a control.
  • platelet aggregation inducer (collagen and epinephrine mixed solution; dose is 400 / gZKg Collagen, 50 gZKg epinephrine) was administered via the tail vein. From the number of surviving mice 15 minutes after administration of the platelet aggregation inducer, the thrombotic lethal avoidance rate (the number of surviving mice Z1 group mice x 100) was determined.
  • Comparative Example 1 was a peptide consisting of four amino acids, and was rapidly hydrolyzed to amino acids by a protease in the gastrointestinal tract by oral administration, losing its platelet aggregation inhibitory action.
  • the compound of Example 1 was introduced orally administered by introducing a guanidino group-containing fatty acid, thereby suppressing degradation in the gastrointestinal tract and further improving intestinal absorption due to an increase in the hydrophobicity of the carboxylic acid portion. It is probable that it worked effectively in.
  • the platelet aggregation inhibitor introduced with a basic group such as a guanidino group as in Example 1 is an effective substance even when the administration route is oral, and is useful as an oral platelet aggregation inhibitor .
  • Example 1 100 mg of the peptide of the present invention obtained in Example 1 was dissolved in 100 ml of physiological saline, and the obtained solution was aseptically filled in a 2.5 ml ampoule, sealed, and used as an injection for extracorporeal circulation. It was a formulation. Industrial applicability
  • the present invention has a platelet aggregation inhibitory effect, has a structure as close as possible to a natural peptide and a structure that is easily absorbed in the body, shows an appropriate drug effect time when administered in vivo, and is rapidly metabolized thereafter.
  • a peptide having excellent safety properties and a platelet aggregation inhibitor containing the peptide as an active ingredient and having an excellent ability to inhibit platelet aggregation.
  • the platelet aggregation inhibitor of the present invention can be used not only as a normal form for in vivo administration but also as a platelet aggregation inhibitor for extracorporeal circulation.

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Description

明 糸田 β 新規べプチド及びそれを用いた血小板凝集抑制剤 発明の技術分野
本発明は、 血小板凝集抑制作用を有する新規ペプチド、 及び当該ペプチドを有 効成分とする血小板凝集抑制剤に関する。 発明の技術背景
血液中において、 血小板は、 損傷した血管の表面に吸着して、 出血を防止する という大きな役割を演じている。
しかしながら、 病的な環境下においては、 血小板の凝集は血液凝固の引き金と なり、 これにより生じた血栓が原因で血管が閉塞することが知られている。 そし て、 この閉塞により、 組織若しくは臓器への、 酸素や栄養分の十分な供給が妨げ られ、 これが心筋梗塞や脳卒中に代表される循環器の虚血性疾患の重大な原因と なっている。 今日において、 かかる虚血性疾患は癌に次ぐ死亡率を示し、 大きな 社会問題になっている。 外科手術時においても、 血管や組織の損傷により血栓が 形成され脳梗塞等の原因となることがある。 また、 人工心臓や透析のように、 体 外への血液の循環を伴う医学的処置においては、 血液が体外で循環する際にも血 栓が形成されることがあり、 上記と同様の問題が生じ得る。
したがって、 これらの血栓の形成を防止することは、 上記虚血性疾患の発生を 防止するためには非常に重要なことである。
ところで、 血小板は、 血管損傷等により露出される内皮下組織に存在するコラ —ゲン等の結合組織蛋白質や血漿中に存在するトロンビン等の血小板膜受容体へ の結合によって活性化される。 また、 血小板内に存在するアデノシンジフォスフ エイ ト （ADP)、 ア ドレナリ ン、 セロ トニン、 トロンボキサン （TX)A2 等の放出に よる自己分泌的な膜受容体への結合によっても活性化される。 そして、 フイブリ ノーゲン受容体を構成する 2種の糖蛋白質ュニッ トが細胞表面に提示され、 会合 し、 受容体複合体 （g p l l b l l l a ) を形成することによって、 フイブリノーゲ ン架橋を介する凝集が惹起される。
かかる g p lib及び g p III aを先天的に欠如した血小板無力症 （thrombasthe nia) においては、 血小板凝集能が認められない。 よって、 gp lib III a複合体 のフイブリノ一ゲンとの結合が血小板凝集において必須であることは明らかであ る (Ruoslahti et al.， Science, 238, 491(1987))。
上記の g p 11 b I II a複合体の性質に着目して、 血小板の凝集を抑制して血栓 の生成を妨げようとする試みがなされている。
例えば、 コラー （Coller) らは、 g p lib III a複合体に対するモノクローナ ル抗体の F(ab')2 フラグメントに強力な血小板凝集抑制作用があることを報告し ており (Blood, 68， 783， (1988)) 、 かかる作用を利用して、 血小板凝集抑制剤 の開発が可能であることを明らかにしている。
し力、しな力 ら、 当該モノクローナル抗体は、 血小板凝集を抑制する治療薬とし ての潜在性は認められるが、 それ自体が高分子蛋白であるため、 繰り返し投与す る場合は、 当該モノクローナル抗体自体に作用する抗体の産生が懸念される。 従って、 gpllbllla複合体に対するアンタゴニス卜としての性質を有し、 かつ免疫原性のない低分子化合物である血小板凝集抑制剤の開発が期待されてい o
また、 g p 11 b Π I a複合体とフイブリノ一ゲンの結合に関する研究も精力的 に行われている。 すなわち、 Ruoslahtiらによる一連の研究により導かれた、 細 胞接着分子に共通のァミノ酸配列である、 アルギニン—グリシンーァスパラギン 酸 （以下、 RGDと略す) の発見 (Ruoslahti et al.， Nature, 309， 30-33(198 4)) に始まって、 RGD配列を認識するレセプターの研究により、 今日では gp 11 b 111 a複合体は、 R G D配列を認識するインテグリンファミ リーに属する受 容体であり (Philllips et al.， Blood, 71, 831-843(1988)) 、 当該複合体とフ ィプリノーゲンとの結合においては、 特にフイブリノ一ゲン分子中に存在する二 つの RGDF配列を認識して結合することが明らかにされている （Andrieux et al.， J. Biol. Chem. , 264, 9258-9265(1989))。
さらに、 フイブリノ一ゲンと同様に RGD配列を有する、 フォンビルプラント 因子、 フイブロネクチン、 ビトロネクチンやトロンボスボンジンも gp II bill P T a複合体と結合することが知られている (Pytela et al. , Science., 231, 1559 (1998)あるいは、 Cell, 42, 439, (1985))。
かかる知見から、 RGD配列を含む合成べプチドが g p lib ΙΠ a複合体とフ ィプリノーゲンの結合を抑制して血小板の凝集を抑制することが予想され、 現実 に、 400 /M の合成ペプチド GRGDS Pが、 A D Pで活性化された血小板の凝 集を完全に抑制したことが報告されている（Plow et al., Proc. Natl. Acad. Sc i. USA., 82， 8057-8061(1985)) 。 また、 RGD Sでは、 46— 50 ;zMの濃度で濃 度依存的に 80— 90%の血小板の凝集を抑制することが判明しており、 さらにぺプ チド RGDFは、 RGDSの 4一 5倍強い血小板凝集抑制活性を示すことが判明 している (Plow et al., Blood, 70, 110-115(1987) あるいは、 Harfinest et a l.， 71, 132-136(1988))。
RGDぺプチドを有するテトラべプチド誘導体に関しては、 特開平 1-190699号 公報、 特開平 2- 62892 号公報、 EP0 422937 AI 号、 及び米国特許 4952562号に記 載されている。 ペプチドからなる誘導体に関してはさらに、 特開昭 63- 215696 号 公報に記載されている。 また、 RGDペプチドの環状構造の誘導体については、 特開平 3- 118331号公報、 及び特開平 2- 62892 号公報あるいは W0 91 /01331 号公 報に記載されている。
近年、 高活性で安定性の優れた薬剤を開発するため、 RGDペプチドを構成す るァミノ酸を、 天然には存在しない構造へ誘導した残基などで構成されるべプチ ドの合成研究が、 盛んに行われている (Hartman et al., J.Med. Chem. , 35, 4640-4 642(1992) ： Callahan et al.， ibid, 35， 3970- 3972(1992))。 このような化合物は 蛋白分解酵素による影響を受けやすい経口投与型の血小板凝集抑制剤としては有 用であるが、 同時に非天然型への誘導に伴う毒性の発現や、 体内において薬剤が 消失されずに蓄積されてしまうなどの副作用が予想され、 安全性についての問題 が強く懸念されている。 実際に体外循環時において血栓形成を抑えるために使用 されている生体由来の医薬品であるへパリンにおいても、 その作用が適度な作用 時間を超えてしまい、 出血し易くなるといった重篤な副作用が報告されている（ 秋沢忠男ら、 日本臨床、 43巻、 377-391 頁（1985)) 。 発明の開示
本発明は、 上記従来技術を受けて、 さらに血小板凝集抑制能力に優れ、 かつ天 然ぺプチドに可能な限り近い構造と、 体内において吸収され易い構造を併せ持ち 、 生体内に投与した場合、 適度な薬効時間を示し、 その後は速やかに代謝され消 失するという、 安全性に優れた特性を持つペプチド、 及び当該ペプチドを有効成 分とする血小板凝集抑制剤の提供を課題とする。
本発明は、 上記課題解決のため鋭意研究を重ねた結果、 RGD配列を有するぺ プチドの N末端ァミノ酸のァミノ基にグァニジノ基若しくはァミジノ基を有する 構造を導入することで、 天然のぺプチドに可能な限り近い構造を保ったままで、 その血小板凝集抑制活性が著しく上昇することを見出した。 また、 当該塩基性基 を有するカルボン酸を N末端ァミノ酸のァミノ基に導入することは、 本べプチド のアミノぺプチダーゼに対する耐性を上げ、 生体内の安定性の向上につながるこ とも見出した。 さらに、 当該塩基性基と N末端アミノ酸との間に、 アルキル鎖や 芳香環、 又はそれに相当する疎水的な基を導入し、 当該ペプチドの疎水性を上げ ることで腸管等における本化合物の体内吸収を促進させることを見出し、 本発明 を完成した。
すなわち、 本発明は以下の事項をその要旨とするものである。
(1) 式（I) に示されるアミノ酸配列を有するペプチド又はその塩
A- (B) ra - Ar g-G l y-As p-C-D (I)
〔式中、 Aはグァニジノ基又はアミジノ基を有する脂肪族カルボン酸、 芳香族 カルボン酸、 若しくは脂肪族基及び芳香族基の両者を含むカルボン酸由来のァシ ル基； Bはアミノ酸残基； Cは疎水性基を有するアミノ酸残基；及び Dは- 0H又 は- NH2を示す、 また、 mは 0〜3の整数を示し、 Bにおけるアミノ酸残基の個 数を示す〕 。
(2) Aの塩基性基が、 式（II)に示す構造であることを特徴とする、 前記（1) に 記載されたべプチド又はその塩。
NH II
H2N-C-NH— (Y) 〔式中、 Yは- (CH2) PC0-若しくは-（CH2) qC6H4 C0- (式中、 p 及び qは、 そ れぞれ 0〜 8の整数であることを示す） 〕 。
(3) Bのアミノ酸が、 T r p— Z (式中、 Zはセリン残基、 グリシン残基、 バ リ ン残基、 又は S—ァラニン残基であることを示す。 ） で示される、 前記（1) 又 は（2) に記載されたペプチド若しくはその塩。
(4) 疎水性基を有するアミノ酸残基 Cが、 T r p若しくは P h eであることを 特徴とする、 前記（1) 〜（3) のいずれかに記載されたペプチド又はその塩。
(5) 式（I I I) に示されるアミノ酸配列を有するペプチド又はその塩
NH
II
h2N- C -NH-(Y)- Trp- Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-D (III)
〔式中、 Yは- (CH2) PC0-若しくは-（CH2) qC6H4 C0 - (式中、 p 及び qは、 それ- ぞれ 0〜 8の整数である） 、 及び Dは- 0H又は- NH2を示す〕 。
(6) 前記（1) 〜（5)のいずれかの請求項に記載された、 ペプチド若しくはその 塩を有効成分としてなる血小板凝集抑制剤。
以下、 本発明について詳細に説明する。
Aは、 グァニジノ基又はアミジノ基を有する脂肪族カルボン酸、 芳香族カルボ ン酸若しくは脂肪族基及び芳香族基の両者を含むカルボン酸由来のァシル基であ り、 このグァニジソ基又はアミジノ基の存在は本発明化合物の血小板凝集抑制活 性を大きく向上させている。 これは、 当該塩基性基の存在によって分子自体が活 性発現に必須な立体構造を形成しやすくなる、 あるいは当該部分が受容体分子中 の新たな酸性ポケッ 卜と相互作用をすることにより、 受容体との結合能力を高め るためと推測される。
また、 Aで示されるァシル基を構成するグァニジノ基又はァミジノ基を有する 脂肪族カルボン酸、 芳香族カルボン酸若しくは脂肪族基及び芳香族基の両者を含 むカルボン酸は次のとおりである。·
脂肪族カルボン酸としては、 アルキル基、 サイクロアルキル基を有するカルボ ン酸を挙げることができる。 従って、 Aはグァニジノアルキルカルボン酸、 アミ ジノアルキルカルボン酸を、 グァニジノサイク口アルキルカルボン酸又はァミジ ノサイクロアルキルカルボン酸で、 具体的には、 6-グァニジノカプロン酸、 6-ァ ミジノカブロン酸、 5-グァニジノ吉草酸、 5-アミジノ吉草酸、 7-グァニジノヘプ タン酸、 7-アミジノヘプタン酸； グァニジノサイクロへキシルカルボン酸、 アミ ジノサイクロへキシルカルボン酸、 グァニジノメチルサイクロへキシルカルボン 酸、 アミジノメチルサイクロへキシルカルボン酸、 グァニジノサイクロへキシル 酢酸、 アミジノサイクロへキシル酢酸等を挙げることができる。
芳香族カルボン酸としては、 安息香酸等の芳香環を有するカルボン酸、 チアゾ リンカルボン酸等のへテロ環を有するカルボン酸等を挙げることができる。 すな わち、 これらの環にグァニジノ基又はァミジノ基が結合したものであれば Aとし て許容される。
また、 脂肪族基と芳香族基の両者を含むカルボン酸としては、 フエニル酢酸、 フエニルプロピオン酸、 ケィヒ酸、 アルキル安息香酸、 アルキルフヱニル酢酸等 を挙げることができる。 従って、 Aはこれらの構造にグァニジノ基又はアミジノ 基が結合したものであれば許容される。 具体的には、 グァニジノフエニル酢酸、 . アミジノフヱニル酢酸、 グァニジノフヱニルプロピオン酸、 アミジノフヱニルプ ロピオン酸、 グァニジノケィヒ酸、 アミジノケィヒ酸、 グァニジノメチル安息香 酸、 アミジノメチル安息香酸、 グァニジノメチルフヱニル酢酸、 又はアミジノメ チルフヱニル酢酸等を挙げることができる。
なお Aは、 生体内への吸収を考慮して、 含有する炭素数を変化させることで、 その疎水性を調節することができる。
なお、 Aが式 （I I) で示される前記（3) の化合物では、 その塩基性基以外の力 ルボン酸部分 Yの疎水性基は、 p 又は qが 0〜 8の整数のものが好ましく、 特に アルキルカルボニル基の場合は が 5であるのが好ましく、 アルキルベンゾィル基 の場合はアルキル基が可能な限り低級のものがより好ましい。
Bは、 活性の増強や安定性の向上等の効果を発現する前記 Aと、 活性発現に必 須な受容体認識部位であるアルギニン残基の間に位置するスぺーサ一としての役 割を果たすァミノ酸残基であるが、 その残基数 mは Aが有効に作用する距離とし て、 0〜3の整数が好ましい。 さらに好ましくは mが 2の整数のものであり、 2 種のアミノ残基が T r p— Zからなる構造がより好ましい。 ここで Zは、 隣接す るアルギニンに対し、 強い立体障害を与えるおそれのないァミノ酸残基が好まし く、 具体的には、 セリン残基、 グリシン残基、 パリン残基、 又は ーァラニン残 基等を挙げることができる。 これらのアミノ酸残基の中でも、 得られる本発明べ プチドの血小板凝集抑制活性を考慮すれば、 特にセリン残基が好ましい。
Cは、 受容体 Ilbllla 内の疎水性ポケッ 卜と相互作用すると考えられる疎水的 なドメインである。 すなわち、 当該 Cは疎水性基を有するアミノ酸残基である必 要がある。 具体的には、 例えばトリブトファン残基、 フヱニルァラニン残基、 又 はチロシン残基を挙げることができる。 これらの中でもトリプトファン残基が特 に好ましい。
Dは、 - 0H又は-冊2のいずれかであるが、 -0Hの場合は- NH2の場合に比べ血小板 凝集抑制活性が高い傾向がある。
本発明の具体的なぺプチドとしては、 例えば次のものが挙げられる。
H2NC(=NH)NH(CH2)C0-Trp-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H, H2NC(=NH)NH(CH2)2 CO- Trp-Ser- Arg- Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)3C0-Trp-Ser-Arg-Gly-As p-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)7C0- Trp-Ser- Arg- Gly- Asp- Trp- OH, H2NC(=NH)N H(CH2)8C0- Trp- Ser-Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2)C6H4C0-Trp-S er-Arg-Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)2C6H4C0- Trp-Ser-Arg-Gly- Asp - T rp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)3C6H4C0- Trp- Ser- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH )NH(CH2)4C6H4C0- Trp- Ser- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2)5C6H4 CO- Trp- Ser- Arg- Gly-Asp- Trp- 0H，
H2NCONH)NH(CH2)C0-Trp- Gly- Arg- Gly- Asp- Trp- OH, H2NC(=NH)NH(CH2)2 CO- Trp- Gly- Arg- Gly-Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2)3C0-Trp-Gly-Arg-Gly-As P-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)4C0- Trp- Gly- Arg- Gly-Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)N H(CH 2 ) 5 CO-Trp-G 1 y-Arg-G 1 y-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)6C0-Trp-Gly-A rg-Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)7C0- Trp- Gly- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2 NC(=NH)NH(CH2)8C0- Trp- Gly- Arg-Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2)C6H4 CO - Trp- Gly-Arg- Gly- Asp-Trp- OH, H2NC(=NH)NH(CH2)2C6H4C0- Trp- Gly- Arg- Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)3C6H4C0-Trp-Gly- Arg- Gly- Asp- Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)4C6H4C0-Trp- Gly- Arg- Gly- Asp-Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH 2 ) 5 C6H4 CO-Trp-G 1 y-Arg-Gl y-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NHC6H4C0- Trp- Gly-Arg- Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)C6H4C0- Trp- Gly- Arg- Gly- Asp- Trp- OH,
H2NC(=NH)NH(CH2)C0- Trp- Val- Arg-Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2) 2 CO- Trp- Va卜 Arg- Gly- Asp- Trp- OH, H2NC(=NH)NH(CH2) 3C0- Trp- Va卜 Arg- Gly - As p-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2) 4C0- Trp- Va卜 Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)N H(CH2) 5C0-Trp-Va卜 Arg- Gly- Asp-Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2) 6C0-Trp-Val-A rg-Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2) 7C0-Trp-Val- Arg- Gly-Asp- Trp-OH, H2 NC(=NH)NH(CH2) 8CO-Trp-Val-Arg-Gly-Asp-Trp-0H, H2NC(=NH)NH(CH2)C6H4 CO- Trp- Va卜 Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2) 2C6H4C0- Trp- Va卜 Arg - Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2) 3C6H4C0-Trp-Val-Arg-Gly-Asp-Trp-0H, H2NC(=NH)NH(CH2) 4C6H4C0- Trp- Va卜 Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH 2) 5C6H4C0-Trp-Va卜 Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NHC6H4C0- Trp- Va卜 Arg- Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)C6H4C0-Trp-Val-Arg-Gly-Asp-Trp-0H
H2NC(=NH)NH(CH2)C0- Phe-Ser- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2) 2 CO- Phe- Ser- Arg-Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2) 3C0- Phe-Ser- Arg- Gly-As P-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2) 4C0-Phe-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H, H2NC(=NH)N H(CH2) 5C0- Phe-Ser- Arg- Gly- Asp-Trp- OH, H2NC(=NH)NH(CH2) 6C0-Phe-Ser-A rg-Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2) 7C0- Phe- Ser- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2 NCONH)NH(CH2) 8C0- Phe- Ser- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2)C6H4 CO- Phe-Ser- Arg- Gly- Asp- Trp-OH， H2NCONH)NH(CH2) 2C6H4C0- Phe- Ser- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2) 3C6H4C0- Phe-Ser- Arg- Gly-Asp- Trp- 0H， H2NCONH)NH(CH2) 4C6H4C0- Phe- Ser- Arg- Gly-Asp- Trp- OH, H2NC(=NH)NH(CH 2) 5C6H4C0- Phe- Ser- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NHC6H4C0- Phe- Ser- Arg- Gly- Asp-Trp- 0H， H2NC(=NH)C6H4C0- Phe- Ser- Arg- Gly- Asp- Trp-OH
H2NC(=NH)NH(CH2)C0-Pro-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H, H2NC(=NH)NH(CH2) 2 CO- Pro-Ser- Arg- Gly-Asp- Trp- OH, H2NC(=NH)NH(CH2) 3C0- Pro- Ser- Arg- Gly- As P-Trp-OH, H2NCONH)NH(CH2) 4C0- Pro- Ser- Arg- Gly- Asp-Trp- OH, H2NC(=NH)N H(CH2) 5C0- Pro- Ser-Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2) 6C0- Pro- Ser-A rg-Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2) 8C0- Pro- Ser- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2 NC(=NH)NH(CH2)C6H4C0- Pro- Ser- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2) 2C6H4C0- Pro- Ser- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NCONH)NH(CH2) 3C6H4C0- Pro-Ser -Arg-Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)4C6H4C0- Pro- Ser-Arg- Gly- Asp- Trp -OH, H2NC(=NH)NH(CH2)5C6H4C0- Pro- Ser- Arg- Gly- Asp- Trp- OH, H2NC(=NH)N HC6H4C0- Pro- Ser- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)C6H4C0- Pro- Ser- Arg- Gly- A sp-Trp-OH
H2NC(=NH)NH(CH2)C0- Pro- Gly- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2)2 CO- Pro- Gly-Arg- Gly- Asp- Trp- OH, H2NC(=NH)NH(CH2)3C0- Pro- Gly- Arg- Gly - As p-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)4CO- Pro- Gly-Arg-Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)N H(CH2)5C0- Pro- Gly-Arg- Gly-Asp-Trp- OH, H2NC(=NH)NH(CH2)6C0- Pro-Gly - A rg-Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)7C0- Pro- Gly-Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2 NC(=NH)NH(CH2)8C0- Pro- Gly- Arg- Gly-Asp- Trp- OH, H2NC(=NH)NH(CH2)C6H4 CO- Pro- Gly- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2)2C6H4C0-Pro- Gly- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2) 3C6H4C0-Pro-Gly-Arg- Gly- Asp- Trp- OH, H2NC(=NH)NH(CH2)4C6H4C0- Pro- Gly- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH 2)5C6H4CO-Pro- Gly- Arg- Gly- Asp- Trp-OH， H2NC(=NH)NHC6H4C0-Pro-Gly-Arg- Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)C6H4C0- Pro- Gly- Arg- Gly- Asp- Trp- OH
H2NC(=NH)NH(CH2)C0- Pro- Ala- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH 2)2C0- Pro- ySAla- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NCONH)NH(CH2)3C0- Pro- ySAla - Arg-Gly-Asp-Trp-OH, H2NCONH)NH(CH2)4C0- Pro- ySAla- Arg- Gly- Asp- Trp - OH ， H2NC(=NH)NH(CH2)5C0-Pro- 3Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-0H, H2NC(=NH)NH(CH 2)6C0-Pro-/SAla-Arg-Gly-Asp-Trp-0H, H2NCONH)NH(CH2)7C0- Pro- ^Ala - Arg-Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)8C0- Pro- /SAla- Arg- Gly- Asp- Trp - OH ， H2NC(=NH)NH(CH2)C6H4C0- Pro- ySAla- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH (CH2)2C6H4C0- Pro-SAla- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2)3C6H4C 0- Pro- S Ala- Arg- Gly - Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2)4C6H4C0-Pro- ^Ala-Ar g-Gly-Asp-Trp-OH, H2NCONH)NH(CH2)5C6H4C0- Pro- SAla- Arg- Gly- Asp-Trp- OH, H2NC(=NH)NHC6H4C0-Pro-^Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-0H, H2NC(=NH)C6H4C0 - Pro- /SAla- Arg-Gly- Asp- Trp- OH H2NC NH)NH(CH2)C0- Ser- Arg- Gly-Asp- Trp- OH, H2NC(=NH)NH(CH2) 2CO-S er-Arg-Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)3C0-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H, H2 NC(=NH)NH(CH2)4C0-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H, H2NC(=NH)NH(CH2) 5C0-Ser- Arg-Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)6C0-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H, H2NC (=NH)NH(CH2)7C0-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H, H2NC(=NH)NH(CH2) 8C0- Ser- Arg -Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)C6H4C0- Ser- Arg- Gly- Asp- Trp- OH, H2N C(=NH)NH(CH2)2C6H4C0- Ser-Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2)3C6H4 CO - Ser- Arg- Gly- Asp-Trp- 0H， H2NCONH)NH(CH2)4C6H4C0- Ser-Arg- Gly- Asp - Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)5C6H4C0- Ser- Arg-Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH C6H4C0- Ser-Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)C6H4C0- Ser- Arg- Gly-Asp- Trp- OH
H2NC(=NH)NH(CH2)C0-Gly-Arg-Gly-Asp-Trp-0H, H2NC(=NH)NH(CH2)2C0-G ly-Arg-Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)3C0-Gly-Arg-Gly-Asp-Trp-0H, H2 NC(=NH)NH(CH2)4C0- Gly- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2) 5C0-Gly- Arg-Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)6C0- Gly- Arg-Gly-Asp- Trp- 0H， H2NC (=NH)NH(CH2)7C0- Gly- Arg- Gly- Asp_Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2)8C0-Gly-Arg -Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)C6H4C0- Gly- Arg- Gly-Asp- Trp-OH, H2N C(=NH)NH(CH2)2C6H4C0-Gly- Arg- Gly- Asp- Trp-OH， H2NC(=NH)NH(CH2)3C6H4 CO - Gly- Arg-Gly- Asp- Trp- 0H， H2NCONH)NH(CH2) 4C6H4C0- Gly- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC NH)NH(CH2)5C6H4C0- Gly- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH CsH4CO- Gly- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)C6H4C0- Gly- Arg- Gly- Asp- Trp - OH
H2NC(=NH)NH(CH2)C0- ^ Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2) 2 CO- ^Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)3C0- ySAla- Arg- Gly- Asp - Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)4C0- ^Ala- Arg- Gly_Asp- Trp- OH, H2NC(=NH)NH(C H2)5C0- ySAla- Arg- Gly - Asp- Trp- OH, H2NC(=NH)NH(CH2)6C0- /SAla- Arg-Gl y-Asp-Trp-OH, H2NCONH)NH(CH2)7C0- Ala- Arg- Gly- Asp- Trp- OH, H2NC(=N H)NH(CH2)8C0- 3Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-0H, H2NC(=NH)NH(CH2)C6H4C0-^ Ala- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2)2C6H4C0- SAla-Arg- Gly- Asp- Tr P-OH, H2NC NH)NH(CH2)3C6H4C0- SAla- Arg- Gly- Asp- Trp-OH, H2NC(=NH)NH (CH2) 4C6H4C0- 3Ala-Arg- Gly- Asp-Trp- OH, H2NC(=NH)NH(CH2) 5C6H4C0- β
l o Ala- Arg- Gly-Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NHC6H4C0- /SAla- Arg-Gly- Asp-Trp- 0H， H2 NC(=NH)C6H4C0- ;SAla- Arg-Gly- Asp-Trp-OH
H2NCONH)NH(CH2)C0- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2) 2C0-Arg-G ly-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2)3C0- Arg- Gly- Asp- Trp- OH, H2NC(=NH)NH(C H2) 4C0-Arg-Gly-Asp-Trp-0H, H2NC(=NH)NH(CH2)5C0- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H，
H2NC(=NH)NH(CH2)6C0- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2) 7C0-Arg-Gl y-Asp-Trp-OH, H2NC(=NH)NH(CH2) 8C0-Arg-Gly- Asp- Trp- OH, H2NC(=NH)NH(CH 2)C6H4C0-Arg- Gly- Asp-Trp- 0H， H2NCONH)NH(CH2)2C6H4C0-Arg-Gly- Asp- Trp-OH, H2NC NH)NH(CH2)3C6H4C0- Arg-Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH 2)4C6H4C0- Arg- Gly- Asp- Trp- 0H， H2NC(=NH)NH(CH2) 5C6H4C0-Arg- Gly-Asp- Trp-OH, H2NC(=NH)NHC6H4C0-Arg- Gly- Asp-Trp- 0H， H2NC(=NH)C6H4C0-Arg-Gl y- Asp- Trp- OH
本発明のペプチドは、 市販のアミノ酸を利用して、 簡単な操作で容易に合成す ることができる。 すなわち本発明ペプチドは、 ペプチド化学において通常用いら れる方法、 例えば、 「ザ ペプチド （The Peptides) 」 第 1巻 [Schroder and L uhke著， Academic Press, New York, U. S. A. (1966年） 〕 、 「ペプチド合成の基 礎と実験」 〔泉屋信夫ら著， 丸善 （株）（1985年） 〕 等に記載されている方法によ つて製造することが可能であり、 液相法及び固相法のいずれによっても製造でき る。 さらに、 カラム、 バッチ法のいずれの方法も用いることができる。
ペプチド結合を形成するための縮合方法として、 アジド法、 酸クロライ ド法、 酸無水物法、 カルポジイミ ド法、 カルポジイミ ドーアディティブ法、 活性エステ ル法、 カルボ二ルイミダゾール法、 酸化還元法、 酵素法、 ウッ ドワード試薬 Kを 用いる方法等を例示することができる。 なお、 固相法での縮合反応は上記した方 法のうち、 酸無水物法、 カルポジイミ ド法、 及び活性エステル法が主な方法とし て挙げられる。
さらに、 固相法でペプチド鎖を延長するときは、 そのペプチド鎖の C末端アミ ノ酸を、 使用する有機溶媒に対して不溶な樹脂等の支持体に結合する。 ここでは 、 アミノ酸を樹脂に結合させる目的で官能基を導入した樹脂や、 樹脂と官能基の 間にスぺーサーを揷入したもの、 更に条件によって種々の箇所で切断できるハン ドル （handl e) と称する鎖を導入した樹脂を目的に応じて用いることもできる。 このような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂などのハロメチル樹脂、 ォ キシメチル樹脂、 4- ( ォキシメチル）-フヱニルァセトアミ ドメチル樹脂、 4- ( ォ キシメチル） -フユノキシメチル樹脂、 C末端アミ ド化用樹脂などを挙げることが できる。
なお、 これらの縮合反応を行なう前に、 通常公知の手段によって当該縮合反応 に関与しないカルボキシル基ゃァミノ基ゃアルギニン残基中のグァニジノ基、 セ リン残基中の水酸基等に保護手段を施すことができる。 また逆に当該縮合反応に 直接関与するカルボキシル基ゃァミノ基を活性化することもできる。
カルボキシル基の保護基としては、 例えば、 各種のメチルエステル、 ェチルェ ステル、 ベンジルエステル、 p-ニトロべンジルエステル、 t-ブチルエステル、 シ ク口へキシルエステル等の通常公知の保護基を挙げることができる。
ァミノ基の保護基としては、 例えば、 ベンジルォキシカルボニル基、 t-ブトキ シカルボニル基、 イソボルニルォキシカルボニル基、 9-フルォレニルメ トキシカ ルポ二ル基等を挙げることができる。
アルギニン残基中のグァニジノ基の保護基としては、 例えば、 ニトロ基、 トシ ル基、 メシチレンスルフォニル基、 4-メ トキシ- 2， 3， 6-トリメチルベンゼンスル フォニル基、 2， 2， 5， 7, 8-ペンタメチルク口マン- 6-スルフォ二ル基等を挙げるこ とができる。
セリン残基等の水酸基を含むァミノ酸残基中の水酸基の保護基としては、 例え ば t-ブチル基、 ベンジル基、 トリメチルシリル基、 テトラハイ ドロビラ二ル基等 を挙げることができる。
カルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 当該カルボキシル基に 対応する酸無水物； アジド；ペンタフルオロフヱノール、 2, 4-ジニトロフヱノー ル、 シァノメチルアルコール、 p-二トロフエノール、 N-ヒ ドロキシコハク酸ィミ ド、 N-ヒ ドロキシ- 5-ノルボルネン- 2, 3-ジカルボキシミ ド、 N-ヒ ドロキシフタル イミ ド、 1-'ヒ ドロキシベンゾトリアゾール等との活性エステル等が挙げられる。 ァミノ基の活性化されたものとしては、 当該ァミノ基に対応するリン酸ァミ ド 等を挙げることができる。 ペプチド合成の際の縮合反応は、 通常溶媒中で行なわれる。 当該溶媒としては
、 例えば、 クロ口ホルム、 ジクロロメタン、 酢酸ェチル、 Ν, Ν-ジメチルホルムァ ミ ド、 ジメチルスルホキシド、 ピリジン、 ジォキサン、 テトラヒ ドロフラン、 Ν - メチルピロリ ドン、 水、 メタノール等、 又はこれらの混合物を挙げることができ る。 また、 当該縮合反応の反応温度は、 通常の場合と同様に、 一 30°C〜50°Cの範 囲で行なうことができる。
グァニジノ基又はァミジノ基を有するカルボン酸のぺプチドへの導入にあたつ ては、 そのまま、 あるいは適当な保護基によりこれらの塩基性基を保護した状態 で、 上記のぺプチド結合を形成するための縮合法を用いることにより導入するこ とができる。 当該グァニジノ基又はアミジノ基の保護基としては、 上記のァミノ 基及びアルギニンのグァニジノ基の保護基等を挙げることができる。 また、 グァ ニジノ基の導入は、 予めァミノ基として導入した後にグァニジノ試薬を用いて当 該ァミノ基をグァニジノ基に変換することも可能である。 グァニジノ化試薬とし ては、 3, 5-ジメチルビラゾール- 1-カルボキサミジンニトレート、 若しくは S -メ チルイソチォ尿素等を挙げることができる。 また、 ハロゲンとして導入後に、 グ ァニジンにより当該ハロゲンをグァニジノ化することもできる。
また、 アミジノ基の場合も、 あらかじめ二トリルとして導入した後に、 Pi nner 法等で当該二トリル基をアミジノ基に変換することも可能である。
さらに、 本発明のペプチドの製造工程における保護基の脱離反応の種類は、 ぺ プチド結合に影響を与えずに保護基を離脱させることができる限りにおいて、 用 いる保護基の種類に応じて選択することができる。 例えば、 塩化水素、 臭化水素 、 無水フッ化水素、 メタンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフ ルォロ酢酸、 又はこれらの混合物による酸処理、 水酸化ナトリウム、 水酸化カリ ゥム、 ヒ ドラジン、 ジェチルァミン、 ピぺリジン等によるアルカリ処理；液体ァ ンモニァ中におけるナトリウム処理やパラジゥム炭素による還元；及びトリメチ ルシリルトリフラート、 トリメチルシリルブロマイ ド等のシリル化処理等を用い た保護基の種類に応じて選択することができる。 なお、 上記の酸又はシリル化剤 処理による脱保護基反応においては、 ァニソール、 フヱノール、 クレゾール、 チ オアニソール、 エタンジチオールの如きカチオン捕足剤を添加することが好まし い。 これにより脱保護基反応が効率的に行われる。
なお、 固相法で合成した本発明べプチドの固相からの脱離も通常公知の方法に より行われる。 例えば、 上記の酸又はシリル化剤による処理等が当該脱離方法と して挙げられる。
このようにして製造された本発明べプチドは、 上記の一連の反応の終了後に通 常公知の分離、 精製手段を駆使することにより得られる。 例えば、 抽出、 分配、 再沈澱、 再結晶、 カラムクロマトグラフィー等によってより純粋なかたちで本発 明べプチドを取得することができる。
また、 本発明ペプチドは、 製造工程における反応条件によって塩の形で得るこ とができる。 ここで、 当該塩としては、 塩酸、 硫酸、 硝酸、 リン酸などの無機酸 塩類；ギ酸、 酢酸、 プロピオン酸、 グリコール酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 酒石酸 、 クェン酸、 トリフルォロ酢酸等の有機酸類；ナトリウム、 カリウム等のアル力 リ金属塩； カルシウム塩等のアル力リ土類金属塩類； アンモニゥム、 エタノール ァミン、 トリェチルァミン、 ジシクロへキシルァミン等の有機アミン類等を挙げ ることができる。
上記で得た本発明べプチドを血小板凝集抑制剤として用いる場合には、 その有 効成分として本発明べプチド又はその薬学的に許容できる塩を、 固体若しくは液 体の医薬用担体又は希釈剤と共に、 すなわち賦形剤や安定剤等と共に製剤とする のが好ましい。 当該医薬製剤において、 前記有効成分の担体成分に対する割合は
、 1〜90重量％の間で変動させることができる。 当該製剤の剤形及び投与形態と しては、 顆粒剤、 細粒剤、 散剤、 錠剤、 カプセル剤、 丸剤若しくは液剤等の剤形 にして用いることができる。 またさらに、 原末のまま経口投与することも可能で あり、 さらに、 注射剤として、 静脈内投与、 筋肉内投与、 又は皮下投与すること もできる。 なお、 注射剤として用いる場合には、 本発明ペプチドを注射用の粉末 として、 用時調製することもできる。
経口、 経腸もしくは非経口投与に適した有機又は無機の、 さらに固体又は液体 の医薬用に用いられる担体か希釈剤を、 本発明血小板凝集抑制剤を調製するため に用いることができる。 水、 ゼラチン、 乳糖、 デンプン、 ステアリン酸マグネシ ゥム、 タルク、 動植物油脂、 ベンジルアルコール、 ガム、 ポリアルキレングリコ W 5/ 71 ール、 石油樹脂、 やし油、 ラノリンその他医薬に用いられる他の担体は全て、 本 発明の血小板凝集抑制剤の担体若しくは希釈剤として用いることができる。 また
、 安定剤や湿潤剤や乳化剤を加えたり、 浸透圧調整剤又は PH調整剤として塩を補 助薬として、 適宜用いることができる。
さらに、 本発明血小板凝集抑制剤は、 種々の疾患の治療において、 前記有効成 分の他に、 必要に応じて他の医薬として有効な成分、 例えば他の種類の血小板凝 集抑制成分、 あるいは血液凝固抑制成分を含有させることもできる。
顆粒剤、 細粒剤、 散剤、 錠剤、 またはカプセル剤の形態をとる場合には、 前記 有効成分を 5〜80重量％含有させるのが好ましい。 液剤の場合には、 前記有効成 分を 1〜30重量％の割合で含有させるのが好ましい。 さらに、 非経口投与剤のう ち、 注射剤として用いる場合には、 前記有効成分を 1〜10重量％の割合で含有さ せるのが好ましい。
臨床投与量は、 経口投与の場合、 成人に対し上記有効成分として、 1 日当たり 500〜1000mgを内服するのが好ましい。 しかしながら、 患者の年令、 症状等によ つて適宜投与量を増減させることもできる。 前記の本発明の血小板凝集抑制剤は 、 1日 1回投与も可能であるが、 適当な間隔を 2〜3回に分けて投与することも できる。 さらに、 注射剤として用いる場合には、 上記有効成分として、 成人に対 し 1回当たり量 1〜数 lOOmg投与するのが好ましい。 また、 その投与は 1回であ るいは、 点滴等の手段によって継続的に行うことも可能である。
なお、 体外循環用血液凝固抑制剤として本発明の化合物を用いる場合には、 上 記の注射剤あるいは点滴剤の形態で用いることができる。 投与場所及び投与量は 、 体外循環システムの違い、 及びシステムの持続時間等により異なるが、 例えば 体外循環システムへの入口の部分から 1時間当たり 1〜100 mg/kg を持続的に注 入することができる。 投与量は、 単独投与においても、 また他の薬剤との併用に おいても、 分解酵素が多量に存在する体内に比べ、 体外循環システム中では少量 で有効である。
体外循環用血液凝固抑制剤として従来から用いられているへパリンと本発明の ぺプチドとを併用することにより、 血液凝固に関係する血小板凝集 ·凝固系とい う二つの重要な経路を抑制し、 より完全に血液凝固を抑制うることができると考 えられる。 また、 両者の相乗的効果も期待できるので、 前述したような副作用が 問題になっているへパリンの使用量を減らすことができる。 更に、 クェン酸ゃ蛋 白質分解酵素阻害剤 （例えばフザン） 、 あるいは組織プラスミノーゲン活性化剤 のような血栓溶解剤と本発明のぺプチドとの併用も有効であると考えられる。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明べプチドの血漿中における安定性試験の結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明について具体的に説明する。 ただし本発明はこれら の実施例に限定されるものではない。
〔実施例 1〕 式（IV)で示されるぺプチドの合成
H2NC(=NH)NH(CH2) 5C0-Trp-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H (IV)
p-alkoxybenzyl alcohol型樹脂 （式（V) 樹脂 (水酸基の含有量： 0. 92meqZg:AB I 社製）
H0CH2-Ph(l，4)-0CH2-Ph(l， 4)- Polymer (V)
の 0. 272g(0. 25mmol)を反応容器に移し、 0. 1 当量のジメチルァミノピリジン（DMA P)の存在下に、 Fmoc- Trp- 0H(430mg)を縮合剤であるジイソプロピルカルボジィミ ド（0. 17ml)を用いて、 樹脂に導入後、 表 1に示す振遨、 瀘過ステップを繰り返し
H2NCH2 (CH2) 4 C0-Trp-Ser(Bu l )-Arg(Pmc)-Gly-Asp(0Bu ' )-Trp-0- Res in
(VI) を得た。
次に、 これを DMF 溶媒中、 ジイソプロピルェチルァミン（DIEA; 8. Oeq)の存在下 に、 3, 5- Dimethylpyrazole小 carboxamidine ni trate(8. 2eq) を加え、 48時間、 室温にてグァニジノ化反応を行い、
H2NC(=NH)NH(CH2) 5C0-Trp-Ser(Bu ' )-Arg(Pmc)-Gly-Asp(0Bu ' )- Trp- 0 - Res in
(VI I) を得た。 得られた保護べプチド樹脂を 0でのトリフルォロ酢酸中で m-クレゾール、 及び エタンジチオール、 チオア二ソ一ル存在下、 1時間処理した。 当該反応液から樹 脂をろ去した後に、 ろ液をエバポレーターで室温下で留去し、 氷冷下で残渣にジ ェチルエーテルを加え、 樹脂から切り出されたペプチドを粉末として得た。 そし て、 当該粉末をジェチルエーテルで 3回洗浄後乾燥し、 1 N酢酸中に溶解した後 、 セフアデックス G- 10 (フアルマシア社製） を支持体としたゲルクロマトグラフ ィ一に添加し、 1N酢酸で溶出することにより脱塩し、 ペプチド分画を凍結乾燥 して粗ペプチドを得た。 得られた粗ペプチドを高速液体クロマトグラフィー （HP LC) 〔カラム： 0DS 5CI 8 (^bondasphere, 20X 150誦）、 移動相：（A)0.1¾JTFA， ( B)100¾CH3CN/0.1¾TFA、 gradientは、 (A) : (B)=90:10 から（A) : (B)=70:30 、 流 速 17ml/min 〕 （ウォーターズ社製） で精製し、 更にセフアデックス G- 25 (ファ ルマシア社製） を支持体としたゲル瀘過クロマトグラフィーにより酢酸塩とし、 これを凍結乾燥することにより、
H2NC(=NH)NH(CH2)5C0-Trp-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H (IV)
で示される本発明ペプチドを 20mg得た。
アミノ酸分析 (6N HCl+phenol, 24hr, 110°C)
A s p 1. 0 1 (1)
S e r 1. 0 0 ( 1 )
G 1 y , 1. 2 9 ( 1 )
T r p 一 （2)
A r g 1. 1 4 ( 1 )
HP LC分析
Cosmosil 5C18- AR(4.6X200画）カラムを用い、 流速 l.Oml/min で、 0.1¾TFA 中ァセトニトリル 10〜40%(60分） の gragient溶出での分析 HPLCで、 保持時間 40.0 分の単一ピークを示した。
F AB-MS ： M + H 計算値 961.5 、 実測値 961
(以下、 余白あり） 表 1 ステツ 使用量 時、 間 回
又は溶媒 (ml /step) (分）
；··■ 1. DMF 30 1 6
！ 2. 20%piperidine/DMF 6 2 1
！ 3. 20%piperidine/DMF 6 20 1 i A. DMF 50 1 10
！ 5. ϊ moc-amino-acid と 6 2* 1
H0BT/DMF (各 3当量）
■■■■ 6. D I P CD (各 3当量） ** 6 120 1 振盪後、 除去することなく次のステップへ進む,
dsiisopropy 1 carbodiimide
〔実施例 2〕 式 (VIII) で示されるペプチドの合成
H2NC(=NH)NH(CH2)4C0-Trp-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H (VIII) 実施例 1と同様の方法によって、 式 (VIII)のべプチドを合成した。
アミノ酸分析 (6N HCl+phenol, 24hr, 110°C)
As p 0 8 4 (1 )
S e r 1 0 0 (1)
G 1 y 1 2 4 (1)
T r p (2)
A r g 1 1 6 (1 )
HPLC分析
Cosmos il 5C18- AR(4.6X200画）カラムを用い、 流速 l.Oml/min で、 0.1¾TFA 中ァセトニ卜リル 10〜40%(60分） の gragient溶出での分析 HPLCで、 保持時間 37.0 分の単一ピークを示した。
F AB-MS ： M + H 計算値 947.4 、 実測値 947
〔実施例 3〕 式（IX)で示されるぺプチドの合成
H2NC(=NH)NH(CH2)6C0-Trp-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H (IX)
実施例 1と同様の方法によって、 式（IX)のべプチドを合成した。
ァミノ酸分析 (6N HCl+phenol, 24hr, 110°C)
A s p 0. 9 4 (1 ) S e r 0 0 (1 )
G 1 y 0 7 (1)
T r p (2)
A r g 0 0 (1 )
HPLC分析
Cosmos il 5C18- AR(4.6X200mm)カラムを用い、 流速 1. Oml/min で、 0.1¾TFA 中ァセトニトリル 10〜40%(60分） の gragient溶出での分析 HPLCで、 保持時間 42.0 分の単一ピークを示した。
F AB-MS ： M+H 計算値 975.5 、 実測値 975
〔実施例 4〕 式 (X) で示されるペプチドの合成
H2NC(=NH)NHCH2C6H4C0-Trp-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H (X)
実施例 1と同様の方法によって、 式（X) のペプチドを合成した。
アミノ酸分析 （6N HCl+phenol， 24hr, 110°C)
A s p 0 9 9 (1)
S e r 1 0 0 (1)
G 1 y 1 2 3 (1)
T r p (2)
A r g 1 6 (1 )
HP L C分析
Cosmosil 5C18-AR(4.6X200mm)カラムを用い、 流速 1. Oml/min で、 0.1¾TFA 中ァセトニトリル 10〜40!¾(60分） の gragient溶出での分析 HPLCで、 保持時間 36.0 分の単一ピークを示した。
F AB-MS ： M+H 計算値 981.4 、 実測値 981
〔実施例 5〕 式 (XI)で示されるぺプチドの合成
H2NC(=NH)NH(CH2)7C0- Pro- Ser- Arg- Gly- Asp- Trp- OH (XI) 実施例 1と同様の方法によって、 式 (XI)のべプチドを合成した。
ァミノ酸分析 (6N HCl+phenol, 24hr， 110°C)
A s p 0. 9 9 (1)
S e r 1. 0 0 (1) l 9 G 1 y 1 5 (1)
T r p (1)
A r g 23 (1)
P r o 1 8 (1)
HPLC分析
Cosmos il 5C18- AR(4.6X200mm)カラムを用い、 流速 l.Oml/minで、 0.1¾TFA 中ァセトニトリル 10〜40!¾(60分） の gragient溶出での分析 HPLCで、 保持時間 36.0 分の単一ピークを示した。
F AB-MS ： M+H 計算値 900.5、 実測値 900
〔実施例 6〕 式 (ΧΠ) で示されるペプチドの合成
H2NC(=NH)NH(CH2)5C0-Arg-Gly-Asp-Phe-0H (XII)
実施例 1と同様の方法によって、 式 (VII) のペプチドを合成した。
ァミノ酸分析 (6N HCl+phenol, 24hr, 110°C)
As p 1. 00 ( 1 )
G 1 y (K 99 (l)
P h e 1. 02 ( 1 )
A r g 1. 08 ( 1 )
HPLC分析
Cosmos il 5C18- AR(4.6 x200mm)カラムを用い、 流速 l.Oml/minで、 0.腹 A 中ァセトニトリル 10〜40¾ί(60分） の gragient溶出での分析 HPLCで、 保持時間 20.0 分の単一ピークを示した。
F AB-MS ： M + H 計算値 649.3、 実測値 649
〔実施例 7〕 式 (XIII)で示されるぺプチドの合成
H2NC(=NH)C6H4C0-Trp-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H (XIII)
実施例 1と同様の方法によって、 式 (VIII)のべプチドを合成した。
ァミノ酸分析 ( 6N HCl+phenol, 24hr, 110 °C)
As 1. 00 (1)
S e r 1. 02 (1)
G 1 y 0. 99 (1)
2 o T r p 一 （2)
A r g 1. 0 9 ( 1 )
HPLC分析
Cosmosil 5C18-ARU.6x200mm)カラムを用い、 流速 l.Oml/min で、 0.1¾TFA 中ァセトニトリル 10〜40 (60分） の gragient溶出での分析 HPLCで、 保持時間 28.4 分の単一ピークを示した。
F AB-MS ： M+H 計算値 952.4 、 実測値 952
〔実施例 8〕 式 (XIV) で示されるペプチドの合成
【化 1 8】
H2NC(=NH)NH(CH2)C0-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H (XIV)
実施例 1と同様の方法によって、 式 (XIV) のペプチドを合成した。
ァミノ酸分析 ( 6N HCl+phenol, 24hr, 110 °C)
A s p 0 9 8 (
S e r 1 0 1 (
G 1 1 1 0 (
T r p 一 （
A r g 0 8 (
HPLC分析
Cosmosil 5C18- AR(4.6x200mm)カラムを用い、 流速 1.0ml in で、 0.1¾TFA 中ァセトニトリル 10〜40¾!(60分） の gradient溶出での分析 HPLCで、 保持時間 16.4 分の単一ピークを示した。
F AB-MS 一 M + H 計算値 719.0 、 実測値 719
〔試験例 1〕 合成べプチドの活性測定 （PRPを用いた in- vitroヒト血小板凝集） 少なくとも 2週間以上いかなる薬も服用していない健康な男性を被験者とした 。 採血は、 19号の注射針と 1 /10容量の 3.8%クェン酸ナトリウム溶液を予め入れ ておいたプラスチックシリンジを用い、 空腹時に下はく部の静脈から採血を行つ た。 採血後速やかに、 シリンジを軽く攪拌して両液を混合した。 この血液を室温 で 15分間遠心分離し （llOOrpm, 250g), ブレーキをかけずに回転を止めた後、 上 清を駒込ピぺッ 卜で取り、 多血小板血漿 （PRP)とし室温で保存した。 遠心後の残 りの血液をさらに室温で 15分間遠心分離し （3500rpm， 1500g) 、 ブレーキをかけ ずに停止させた後の上清を取り、 寡血小板血漿 （PPP)とした。 PPP 調製後血小板 数を計測し、 血小板数が 2 X108 ml以上のものについてのみ以下に述べる実験 行った。
血小板の凝集は、 8チャンネルの血小板凝集測定機 （Hematracer, Nikoh Bios cience, Tokyo, Japan) を用いて PRP の光の透過度の変化から測定した。 まず、 200 lの PPP，PRP をガラスキュべッ トにいれ、 37°Cでインキュベート後、 透過度 を測定し PPPの透過度を 100%、 PRP の透過度を 0 %とした。 次に、 生理食塩水ま たはサンプルを含む生理食塩水を PR Pに 10 z 1加え 37°Cで 1分間ィンキュベー トした後、 さらに 100 zg Zmlのコラーゲン溶液を 10〃 1加え （終濃度 5 g / ml) 凝集を誘発し、 以後 7分間透過度を測定した。 実験は、 最初にコラーゲンと ADP を用いて凝集が起こることを確認し、 コラーゲンの最大凝集率が 70%以上の ものについてのみ、 実験に用いた。
サンプルは 2.2X10— 2M になるように生理食塩水に溶解し、 これを基に 2倍の 希釈系列を調製し実験に用いた。 生理食塩水に不溶のサンプルについては 10%の D S0 (Dimethyl sulfoxide) を含む生理食塩水に溶解した。
結果は次のように計算する。
^^^^ , サンプル添加時の最大凝集率 、
凝集抑制率 = ( 1 ] X 100
生食のみ添加時の最大凝集率 サンプルの濃度に対し凝集抑制率をプロッ 卜した図を作図し、 この図から凝集 を 50%抑制する濃度 （I C5。） を計算した。 表 2に各サンプルの I C5。を示す。
(以下、 余白あり） O 95/01371 表 2 化 合 物 I C50
H2NC(=NH)NH(CH2 ) 5CO-Trp-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-OH (実施例 1 ) 5.0X10— 7
H2NC(=NH) H(CH2 ) 4C0-Trp-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H (実施例 2 ) 3.0X10— 6
H2NC(=NH)NH(CH2 ) 6 CO-Trp-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-OH (実施例 3 ) 3.0X10— 6
H2NC -NH) HCH2CeHtCO-Trp-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-OH (実施例 4 ) 4.2X10
H2NC(=NH)NH(CH2 ) 7CO-Pro-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-OH (実施例 5 ) 3.9X10 6
H2NC(=NH) H(CH2 ) 5CO-Arg-Gly-Asp-Phe-OH (実施例 6 ) 2.2X10 -5
H2NC(=NH) C6Ht CO-Trp-Se r-Arg-Gl y-As -Trp-OH (実施例 7 ) 2.4X10— 5
H2NC( =NH)NH( CH2 ) CO-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-OH (実施例 8 ) 2.7X10— 6
Arg-G 1 y-Asp-Ser-OH (比較例） 5.0-X10"5
比較例 1として表 2に挙げたフィプリノ一ゲン分子中のァミノ酸配列である RG DS-0H (ペプチド研究所 （箕面市） により購入した） に比べて、 本発明ペプチド の血小板凝集抑制能力が著しく向上していることが判明した。
〔試験例 2〕 合成べプチドの血漿中での安定性の評価 （全血及び血 中での安 定性評価）
少なくとも 2週間以上いかなる薬も服用していない健康な男性を被験者とし、 採血を行った。 予め 1ノ 10容量の 3.8%クェン酸ナトリウム溶液を入れておいた プラスチックシリ ンジを用い、 空腹時に下はく部の静脈から血液を採取した。 採 血後速やかにシリ ンジを撹拌して両液を混合した。 全血中の安定性は、 この血液 をそのまま用いて実験を行った。 一方、 血漿中での安定性は、 この血液を 10分間 遠心分離し（800g：)、 ブレーキをかけずに回転を止めた後の上清を血娥画分とし、 実験を行った。
試験管に全血又は血漿を 225^1 入れ、 37°Cに加温した。 合成ペプチドは生理 食塩水（PH7.4) に溶解し ImMの溶液とした。 この合成ペプチドの溶液を全血また は血漿に 25 1 添加し（ 最終濃度 ΙΟΟ^Μ：)、 一定時間インキュベートした。 イン キュベ一ト後、 溶液を氷冷し分解反応を停止した。 血漿はこのまま一 20°Cで凍結 保存した。 一方、 全血は 2000g で 4 °Cで 5分間遠心分離し、 上清のみを凍結保存 した。
サンプルは、 逆相 HPLCで分析を行った。 各合成ペプチドのピーク面積を計算し 、 ピーク面積の変化を指標に血液又は血漿中での安定性を評価した。
図 1は、 前記実施例 1及び実施例 4の化合物について、 さらに比較例 1の化合 物を比較して、 血漿中の安定性について調べた結果である。 比較例 1の化合物の 場合は、 血漿中で非常に速い分解を受け、 その半減期は 3. 1分であった。 これに 対し、 実施例 1の化合物及び実施例 4の化合物では共に血漿中での安定性が、 比 較例 1の化合物と比べ格段に高まり 120分後でも、 70%以上が分解を受けずに残 つていた。
また、 全血中の安定性についても、 血漿中での安定性と同等の結果が得られた
—般式中の Aであらわされるグァニジノ基又はァミジノ基を有する脂肪族カル ボン酸、 芳香族カルボン酸、 若しくは脂肪族堇及び芳香族基の両者を含むカルボ ン酸の存在は、 本発明のぺプチドの血小板凝集抑制機能を強化するのみならず、 血液中での安定性も飛躍的に向上させた。 このことは、 経口、 点滴、 静脈内投与 等の方法で当該化合物を投与したときに、 より効果的に体内で血小板凝集を抑制 することを示しており、 血小板凝集抑制剤の有効成分としての本発明の有用性を 裏付けるものである。
〔試験例 3〕 合成ペプチドの経口投与による血小板凝集抑制活性 （マウス血栓 性致死モデルを用いた血小板凝集抑制効果）
16時間絶食処理を施した、 I C R系マウス （雄， 6週令） を使用した。 マウス は 5匹を一群とし、 実施例 1に示す本発明のぺプチド投与群、 比較例 1のべプチ ド投与群、 又は血小板凝集抑制剤として経口的に用いられているァスピリンの投 与群 2群、 及びコントロール群の計 5群に分けた。 各薬剤は 5 %のアラビアガム 溶液に懸濁して用い、 またコントロールとしては 5 %のアラビアガム溶液を用い た。
各薬剤あるいはコントロールをそれぞれの群のマウスに経口投与した。 1時間 後に血小板凝集惹起剤 （コラーゲン ·ェピネフリン混合液；投与量は 400 / gZKg コラーゲン， 50 gZKgェピネフリン） を尾静脈より投与した。 血小板凝集惹起剤 投与 15分後に生存しているマウスの数より血栓性致死回避率 （生存マウス数 Z 1 群のマウス数 X 100)を求めた。
その結果を表 3に示す。
表 3
Figure imgf000027_0001
血小板凝集抑制作用が良く知られている比較例 1のべプチドを実施例 1の化合 物の倍量を経口投与したときも実施例 1の化合物とほぼ同量ァスピリンを投与し たときにも、 本アツセィ系では血栓性致死の回避は起こらなかったが、 実施例 1 の化合物を経口投与した場合は有意に血栓性致死の回避を誘導することが示唆さ れた。
これは、 比較例 1はアミノ酸 4個によりなるペプチドであるため、 経口投与で 消化管内のプロテアーゼで速やかにアミノ酸に加水分解され、 血小板凝集抑制作 用を失ったためと思われる。 しかし、 実施例 1の化合物はグァニジノ基を有する 脂肪酸を導入したことで、 消化管内で分解の抑制がかかり、 さらにカルボン酸部 分の疎水性度の上昇に伴う腸管吸収性の向上によって、 経口投与において効果的 に作用できたものと考えられる。
このように実施例 1のごときグァニジノ基のような塩基性基を導入した血小板 凝集抑制物質は投薬経路が経口であっても効果的な物質であり、 経口型血小板凝 集抑制剤として有用である。
〔試験例 4〕 急性毒性試験
本発明のペプチドの急性毒性試験に関しては、 マウスに対して、 100mg/kgの 静脈投与では、 何等毒性は観察されなかった。
〔製剤例 1〕
実施例 1で得られた本発明べプチド lOOmgを生理的食塩水 100mlに溶解し、 得ら れた溶液を無菌的に 2. 5ml容のアンプルに充塡、 封入し、 注射液製剤とした。 〔製剤例 2〕
実施例で得られた本発明ペプチド 500mg、 結晶セルロース 50mg、 乳糖 450mgから なる混合物に、 エタノールと水の混液 l mlを加え練合した。 この練合物を常法に 従って造粒して、 顆粒剤とした。
〔製剤例 3〕
実施例 1で得られた本発明べプチド lOOmgを生理的食塩水 100mlに溶解し、 得ら れた溶液を無菌的に 2. 5 ml容のアンプルに充塡、 封入し、 体外循環用注射液製剤 とした。 産業上の利用可能性
本発明により、 血小板凝集抑制力に優れ、 かつ天然ペプチドに可能な限り近い 構造と体内において吸収され易い構造を併せ持ち、 生体内に投与した場合、 適度 な薬効時間を示し、 その後は速やかに代謝され消失するという、 安全性に優れた 特性を持つぺプチド、 及び当該べプチドを有効成分とする優れた血小板凝集抑制 能を有する血小板凝集抑制剤が提供される。 なお、 本発明血小板凝集抑制剤は、 通常の生体内に投与する形態のみならず、 体外循環用の血小板凝集抑制剤として も ¾用でめ 。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 式（I)に示されるアミノ酸配列を有する.ぺプチド又はその塩
A- (B) m - Ar g-G l y-As p-C-D (I)
〔式中、 Aはグァニジノ基又はアミジノ基を有する脂肪族カルボン酸、 芳香族 カルボン酸、 若しくは脂肪族基及び芳香族基の両者を含むカルボン酸由来のァ シル基； Bはアミノ酸残基； Cは疎水性基を有するアミノ酸残基；及び Dは- 0 H又は- NH2を示す、 また、 m は 0〜3の整数を示し、 Bにおけるアミノ酸残 基の個数を示す〕 。
2. Aが、 式（II)に示す構造であることを特徴とする、 請求項 1に記載されたべ プチド又はその塩。
NH ― II
H2N-C-NH— (Y) )
〔式中、 Yは- (CH2)PC0-若しくは- (CH2)qC6H4C0- (式中、 p及び
qは、 それぞれ 0〜 8の整数であることを示す） 〕 。
3. Bのアミノ酸が、 Tr p— Z (式中、 Zはセリン残基、 グリシン残基、 バリ ン残基、 又は /3—ァラニン残基であることを示す。 ） で示される、 請求項 1に 記載されたべプチド若しくはその塩。
4. Bのアミノ酸が、 Tr p— Z (式中、 Zはセリン残基、 グリシン残基、 バリ ン残基、 又は ーァラニン残基であることを示す。 ） で示される、 請求項 2に 記載されたべプチド若しくはその塩。
5. 疎水性基を有するアミノ酸残基じが、 Tr p若しくは Ph eであることを特 徴とする、 請求項 1に記載されたペプチド又はその塩。
6. 疎水性基を有するアミノ酸残基じが、 Tr p若しくは Ph eであることを特 徴とする、 請求項 2に記載されたペプチド又はその塩。
7. 疎水性基を有するアミノ酸残基じが、 T r p若しくは Ph eであることを特 徴とする、 請求項 3に記載されたペプチド又はその塩。
8. 疎水性基を有するアミノ酸残基 Cが、 T r p若しくは P h eであることを特 徵とする、 請求項 4に記載されたペプチド又はその塩。
9 . 式（Π Ι) に示されるアミノ酸配列を有するペプチド又はその塩。
N =
H h2N- C -NH— (Y)— Trp- Ser-Arg-Gly- AsD-Trp-D (in)
〔式中、 Yは- (CH2) PC0-若しくは- (CH2) qC6H4 C0 - (式中、 p 及び
qは、 それぞれ 0〜 8の整数であることを示す） 、 及び Dは- 0H又は- NH2を 示す〕 。
10. 請求項 1に記載された、 ペプチド若しくはその塩を有効成分としてなる血小 板凝集抑制剤。
11. 請求項 2に記載された、 ペプチド若しくはその塩を有効成分としてなる血小 板凝集抑制剤。
12. 請求項 3に記載された、 ペプチド若しくはその塩を有効成分としてなる血小 板凝集抑制剤。
13. 請求項 4に記載された、 ペプチド若しくはその塩を有効成分としてなる血小 板凝集抑制剤。
14. 請求項 5に記載された、 ペプチド若しくはその塩を有効成分としてなる血小 板凝集抑制剤。
15. 請求項 6に記載された、 ペプチド若しくはその塩を有効成分としてなる血小 板凝集抑制剤。
16. 請求項 7に記載された、 ペプチド若しくはその塩を有効成分としてなる血小 板凝集抑制剤。
17. 請求項 8に記載された、 ペプチド若しくはその塩を有効成分としてなる血小 板凝集抑制剤。
18. 請求項 9に記載された、 ペプチド若しくはその塩を有効成分としてなる血小 板凝集抑制剤。
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