WO1994028158A1 - Anticorps monoclonal antimucoglycoproteine - Google Patents

Description

明 細 書

抗粘液糖夕 ンパ ク質モ ノ ク ロ ーナル抗体 技術分野

本発明は、 ヒ 卜 の胃腺上皮型粘液の測定に使用可能な 新規なモ ノ ク ロ ーナル抗体を提供する ものであ る。 すな わち、 本発明は、 ヒ 卜の胃の腺上皮粘液細胞およびその 分泌粘液と強い親和性を有 し、 かつ、 表層粘液細胞およ びその分泌粘液と交差反応性を有 しない新規なモ ノ ク ロ ーナル抗体を提供する ものであ る。

背景技術

胃を含む消化管粘膜の上皮に存在する粘液産生細胞は 粘液を合成、 分泌する こ とで消化管の機能維持に寄与 し ている と考え られる。 と く に胃粘液は胃酸やペプシ ンな どの攻撃因子から胃の粘膜を保護するための重要な防御 因子の一つと して位置づけ られている。

ヒ 卜の胃の粘液産生は胃粘膜表層上皮に存在する表層 粘液細胞 （被蓋上皮細胞） と胃腺の底部に存在する腺上 皮粘液細胞で行なわれてい 'るが、 近年、 これらの粘液細 胞が産生する粘液を個々 に識別する試みがな されている 組織化学的には表層粘液細胞と腺上皮粘液細胞それぞれ の粘液に固有の糖成分に対 して特異的な染色法が開発さ れ、 両者を識別する こ とが可能とな っている。 すなわち 表層粘液細胞はガラ ク トースォキシダーゼ ， コール ドチ ォニン · シ ッ フ （G0CTS ) 反応で特異的に染色される粘液 をもち、 腺上皮粘液細胞にはコ ンキヤ ナパ リ ン Aパラ ド キシカル染色法 （Katsuyama, T. and Spicer, S. S.

(1978) J. Histochem. Cytochem. 26, 233-250) によ り m型に分類される粘液 （ m型粘液） が特異的に存在する こ とが認め られている （Ota， H. et al. (1991) Histo- chemical J. 23, 22-28)。 また、 胃粘膜表層上皮を覆つ ている粘液ゲル層は G O C T S反応陽性粘液と m型粘液 が交互に積み重な っ た層状構造をと っている こ とが証明 され、 粘液ゲル層には表層粘液細胞と腺上皮粘液細胞か ら産生された粘液が含まれている こ とが認め られている (Ota, H. et al. (1991) Histochemical J. 23, 22 -

28) 。

—方、 勝山らは m型粘液が正常組織では食道噴門腺か ら胃の噴門腺、 副細胞、 幽門腺、 十二指腸の Brunner腺、 Vater乳頭部の粘液腺、 睇頭部睇管の粘液腺におよぶ消 化管の限られた範囲の腺上皮にだけ しか見いだされない のに対 して、 胆囊腺腫、 胆囊癌、 脖管癌等の腫瘍組織で は高頻度に証明 さ れ る こ と を明 ら かに した （勝山 ら ( 1989) 病理と臨床 7、 1217-1224) 。 また、 Matsuzawa らは胃粘膜に認められるよ う な組織形態、 すなわち、 粘 膜の表層上皮に GOCTS反応に強陽性な粘液が存在し、 深 層部に ΙΠ型粘液が局在する といつた形態は正常な脖管組 織では見られないが、 化生や癌化 した膝管組織の中にこ のよ う な胃粘膜型の形態を呈する ものが多いこ とを見い だ し 、 化 生 と 癌 と の 関 係 に つ い て 言 及 し て い る ( atsuzawa, K. et al. (1992) Human Pathology 23， 925 - 933)。 こ れ らの研究成果は、 体液中に分泌さ れた胃 型の粘液、 特に胃の腺上皮型の粘液 （胃腺上皮型粘液） を測定する こ と に よ り 、 癌疾患、 も し く は、 癌にな る可 能性についての診断のためのデー タ の提供が可能 とな る こ とを示 している。

従来、 ヒ 卜 の胃腺上皮型粘液を特異的に検出する ため の方法と しては前記の コ ンキ ヤ ナバ リ ン Aノ ラ ドキ シ力 ル染色法以外には知 られていない。 しか し、 その検出法 は、 染色の再現性が良好でな く 、 ま た試料が固定標本に 限 られる ため、 分泌粘液ま たは可溶化 した粘液の測定に 対 しては適用する こ とができ ない とい う 欠点があ り 、 こ れに よ り 胃腺上皮型粘液を定量的に測定する こ と はでき なカヽつ た。

発明の開示

本発明者 らは ヒ ト の胃腺上皮型粘液を認識するモノ ク ロ ーナル抗体について鋭意研究を重ねた結果、 該粘液の 主要成分であ る粘液糖タ ンパク 質 （ムチ ン） を免疫抗原 に用いる こ と に よ り 、 ヒ ト の胃の腺上皮型粘液細胞およ びその分泌粘液に対 して高い特異性を もつ新規なモ ノ ク ロ ーナル抗体を産生する ノヽイ ブ リ ドー マな らびにそのモ ノ ク ロ ーナル抗体を得る こ と に成功 した。

すなわち、 本発明は下記 1 〜 5 の新規なモノ ク ロ ーナ ル抗体およびハイ プ リ ドーマを提供する ものであ り 、 ま た ヒ ト の体液中に含まれる 胃の腺上皮型粘液細胞由来の 粘液糖タ ンパク 質の分析に該モ ノ ク ロ ーナル抗体を利用 する方法を提供する ものであ る。

1 . ヒ ト の 胃 の腺上皮型粘液細胞が産生する粘液糖タ ン ノ、' ク 質 と特異的に反応する I gMク ラ スモ ノ ク ロ ーナル 抗体

2. 前記の I gMク ラ スモ ノ ク ロ ー ナル抗体が工業技術院 生命工学工業技術研究所 ： 受託番号 P- 13622のハイ ブ リ ド一マか ら得 られる ものであ る 1 に記載のモ ノ ク ロ ー ナ ル抗体。

3. ヒ ト の胃の腺上皮型粘液細胞が産生する粘液糖タ ン パク質 と特異的に反応する IgMク ラ スモノ ク ロ ーナル 抗体を産生するハイ プ リ ドーマ。

4. 工業技術院生命工学工業技術研究所 ： 受託番号 P- 13622のハイ プ リ ドーマ。

5. ヒ ト の体液中に含まれる胃の腺上皮型粘液細胞由来 の粘液糖タ ンパ ク 質の分析のための 1 に記載のモ ノ ク ロ ーナル抗体の使用。

本発明は、 ヒ ト の胃粘膜の腺上皮粘液細胞、 すなわち 噴門腺細胞、 副細胞 （粘液頸細胞） 、 幽門腺細胞およ び ヒ 卜 の胃粘膜の腺上皮型粘液を産生する粘液細胞、 例え ば、 十二指腸の Brunner腺、 胃腺上皮型化生細胞、 胃腺 上皮型腫瘍細胞の染色に有用なモ ノ ク ロ ーナル抗体に関 する。 更に本発明は、 上記の胃の腺上皮型粘液細胞が分 泌する粘液糖タ ンパク質の測定に有用なモ ノ ク 口 一ナル 抗体に関する。 詳 し く は、 本発明のモ ノ ク ロ ーナル抗体 ま たは本発明のモ ノ ク ロ ーナル抗体の標識誘導体を用い て免疫組織染色を行う こ と によ り 、 ヒ ト の胃の腺上皮型 粘液細胞およびそれ ら細胞の分泌粘液を特異的に染色す る こ と力 でき、 また、 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)— を行な う こ とによ り、 ヒ トの体液、 例 えば、 胃液、 膝液、 血液、 喀痰中に含まれる 胃の腺上皮 型粘液細胞由来の粘液糖タ ンパ ク 質を質的、 量的に分析 する こ とができ る。 本発明のモ ノ ク ロ ーナル抗体は癌の 検診ま た は診断に利用でき る。

本発明に係る モ ノ ク ロ ーナル抗体を産生するハイ プ リ ドーマは好適な方法で調製された粘液糖タ ンパク 質を用 いて、 常法によ り 、 例えばケラ ー と ミ ルシ ュ タ イ ンの方 法（Koehler, G, and Milstein, C. (1975) Nature 256, 495 - 497 ) によ って得 られる。 すなわち、 上記の粘液糖 タ ンパク質を用いてマウ スを免疫 した後、 こ のマウ スの 脾臓細胞をマウ ス骨髄腫細胞と融合させ、 得 られたハイ プ リ ドーマか ら 目的 とする抗体を産生 し分泌するハイ ブ リ ドーマを選別 し、 単離する こ とができ る。 以下に本発 明に係る上記のハイ プ リ ドーマな らびにモ ノ ク ロ 一ナル 抗体の調製法および同モ ノ ク ローナル抗体の特性につい て詳述する。

A . 抗原の単離、 精製 ：

免疫抗原と しては ヒ ト あるいは ヒ ト以外の哺乳動物の 胃粘膜ま たは Brunner腺からの抽出物を用いる こ とがで き る。 好適にはそれ ら抽出物か ら得 られる粘液糖タ ンパ ク 質を精製 して用いる。 例えば、 ラ ッ ト の胃粘膜か ら小 原 らの方法 ( Ohara, S. et al. ( 1986) Comp. Biochem. Physiol. 83B, 273- 275 ) により抽出、 精製した粘液糖 タ ンパク質が用いられる。 後記の実施例では、 ラ ッ ト 胃 粘膜抽出物からゲルろ過によ って分子量 1500000以上の 画分を得、 こ の画分からセ シ ウ ム ク ロ ラ イ ド密度勾配遠 心法によ って糖タ ンパク質画分 （粘液糖タ ンパク質含有 画分） を得た。 このよ う に して得 られた粘液糖タ ンパク 質を免疫抗原と して使用 した。

B . マ ウ ス の免疫 ：

免疫動物と して、 好適には 4 〜 8週齢の BALB/cマゥ ス を用いる こ とができ るが、 他の系のマウ ス も使用する こ とができ る。 免疫スケジュールおよび抗原濃度は、 十分 な量の抗原刺激を受けた リ ンパ球が形成されるよ う選ば れる。 例えば、 マウスの腹腔内に好適なア ジュバン ドと 共に前記の粘液糖タ ンパク質 l OOiig/匹を投与する。 以 後数日〜数週間おきに、 初回免疫に使用 した ものと同 じ 抗原を数回投与する。 2回目の免疫以後、 眼底静脈よ り 採血し、 血液中の抗体価について検討する。 抗体価の測 定は ELISA法によ り好適に行う こ とができ る。

C . 細胞融合

免疫したマウスよ り脾臟を摘出 し、 これから脾臓単細 胞水性懸濁液を調製する。 これを適当なマ ウ ス骨髄腫細 胞と適当な融合促進剤を使用 して細胞融合させる。 好ま しい融合促進剤と しては、 例えば平均分子量 400〜 6000 のポ リ エチ レ ングリ コールがあげられるが、 その他、 こ の分野で知られている融合促進剤を使用する こ とができ る ( Klebe, R. J. and Mancuso, . G. (1981) Somat. Cell Genet. 7, 473— 488) 。 後言己実施例にお tヽては Merck社製ポ リ エチ レ ング リ コ一ル 4000 (Cat. No.9727) が使用 された。 骨髄腫細胞は脾臓細胞を得た動物と同種 の動物の ものを用いるのが好ま し く 、 また、 抗体を産生 しないものが好ま しい。 後記実施例においては 8 —ァザ グァニ ン耐性マウ ス骨髄腫細胞 Sp2ZO-Agl4 ( Shu 1 man, M. et al. (1978) Nature 276, 269-270) が使用 された < 脾臓細胞と骨髓腫細胞の使用割合は細胞数比で約 20 : 1 〜約 5 : 1 とするのが好ま しい。

D . 融合 した細胞の選択 ：

別の容器内で前記 Cで得られた混合物すなわち、 未融 合の脾'腺細胞、 未融合の骨髄腫細胞および融合 した細胞 の混合物を、 未融合の細胞を支持しない選択培地で適当 な時間培養 し、 未融合の細胞を死滅させる。 培地は薬物 抵抗性 （例えば 8 —ァザグァニン抵抗性） で未融合の骨 髄腫細胞を支持 しないもの、 例えば、 HAT培地が使用 さ れる。 未融合の脾臓細胞は非腫瘍性細胞なので、 こ の選 択培地中では未融合の脾臓細胞と未融合の骨髄腫細胞は ある時間後、 死滅する。 融合 した細胞は骨髄腫の親細胞 の腫瘍性と脾臓細胞の性質とを合わせ持っため、 選択培 地中で生存する。

E . 各容器中のハイ プ リ ドーマの産生する抗体の確認 (スク リ ーニング） ： 上記 Dの培養に よ り 、 ハイ プ リ ドーマの産生が確認さ れた ゥエルの培養上清を採取 し、 胃粘液糖タ ンパク 質に 対する免疫反応性の有無を調べる。 こ のス ク リ ーニ ング は、 例えば、 E L I S A法に よ り 好適に行な う こ とができ る。 こ の免疫反応がプラ スの ものについて、 さ らに、 胃腺上 皮粘液細胞およ びその分泌粘液を特異的に認識するか否 かをス ク リ ーニ ン グする。 こ のス ク リ ーニ ングは、 例え ば、 胃粘膜固定標本切片の免疫組織染色法に よ り 好適に 行な う こ とができ る。

F . 目的の抗体を産生するハイ プ リ ドーマの ク ロ ー ン化 と抗体の産生 ：

前項 E で得 られた免疫反応プラ スの細胞懸濁液を適当 な方法、 例えば、 限界希釈法でク ロー ン化 した後、 所望 の抗体を得る には 2 つの方法を用い得る。 1 っはハイ ブ リ ドーマを一定時間、 適当な培地で培養する方法であ り その培養上清か らハイ プ リ ドーマの産生するモノ ク ロ一 ナル抗体を得る こ とができ る。 第 2 の方法は、 ハイ プ リ ドーマを同質遺伝子、 ま たは半同質遺伝子を持つマウ ス の腹腔に接種する こ とであ る。 一定時間後、 接種された マウ スの血液中および腹水中よ り 、 ハイ プ リ ドーマの産 生する所望のモノ ク 口 一ナル抗体を得る こ とができ る。

G . モノ ク ロ ーナル抗体の精製 ：

本発明に係る モノ ク ロ ーナル抗体は、 前項 F で得 られ たパイ ブ リ ドーマ培養上清、 あ るいはマウ スの血液中お よび腹水中よ り 、 広 く 用い られている生化学的精製法に よ っ て精製する こ とができ る。 例えば、 硫安塩析、 ィ ォ ン交換カ ラ ム ク ロ マ ト グラ フ ィ ー、 分子ふる いカ ラ ム ク 口 マ ト グラ フ ィ ー 、 あ る いはァ フ ィ 二テ ィ 一カ ラ ム ク ロ マ ト グラ フ ィ 一な どか ら選ばれる種々 の精製法を組み合 せる こ と に よ っ て好適に行な う こ とができ る。

H . モ ノ ク ロ ーナル抗体の標識および標識モ ノ ク ロ ーナ ル抗体の利用 ：

上記の方法によ り 精製 したモ ノ ク ロ ーナル抗体は、 広 く 用い られている生化学的手法によ り ペルォキ シダーゼ、 アルカ リ フ ォ スフ ァ タ ーゼ、 ピオチ ンな どを用いて、 標 識する こ とができ る。 標識法と しては、 例えば、 酵素の 過 ヨ ウ素酸酸化生成物を抗体と結合させる方法、 グルタ ルアルデヒ ドを架橋剤に用いて酵素と抗体とを結合させ る方法が用い られる。 こ のよ う に して得 られた標識モノ ク ロ ーナル抗体は免疫組織染色法、 あるいは、 ELISA法 におけるサ ン ドイ ッ チア ツ セィ 法に好適に使用でき る。

ELISA法については、 例えば、 一次抗体と して本発明に 係るモ ノ ク ロ ーナル抗体を ELISAプレー 卜 の各ゥエルに 吸着させ、 さ らに、 ゥエルの未吸着部位に反応に関与 し ない物質 （例えばスキム ミ ルク ） を吸着させた後、 同ゥ エルに試料溶液を添加 し、 洗浄 した後、 適当な濃度の標 識モ ノ ク ロ ーナル抗体溶液を添加、 洗浄 し、 次に ELISA 法に使用 された酵素の基質溶液を添加する こ と によ り 、 試料中に含まれる 胃の腺上皮型粘液細胞由来の粘液糖タ ンパク 質の定量分析を行う こ とが可能であ る。 I . モ ノ ク ロ ー ナル抗体 と抗原 との反応性 ：

本発明に係るモ ノ ク ロ ー ナル抗体の抗原認識部位は、 こ のモ ノ ク ロ ーナル抗体について構造既知の化合物に対 する反応性を検討する こ と に よ り 調査する こ とができ る が、 本発明者 らは交差反応性が認め られたブタ の胃粘液 糖タ ンパク 質（Sigma社製） を常用の生化学的方法に よ つ て分解処理 し、 分解生成物か ら抗原活性を もつ成分を分 離 し、 精製 し、 そ の成分を常用の物理化学的方法に よ り 分析 した。 抗原活性の測定は阻止試験法を E L I S A法に応 用 した Competitive ELISA法によ り、 好適に行なう こ と ができ る。

以下、 本発明を実施例によ って説明するが、 本発明は これらの実施例に限定される ものではない。 実施例 1

(1) 免疫用抗原の調製

SDラ ッ ト 〔メ ス、 体重 250〜 300 g、 SLC (曰本エスエル シ ー（株）） 〕 よ り摘出 した胃か ら胃粘膜を擦過剥離 した 後、 Triton X-100を 2 %含有させた 50mMト リ スー塩酸緩 衝液（PH7.2)で抽出 した。 抽出物を Bio-Gel A 1.5m (Bio -Bad社製） カ ラ ムを用いたゲル濂過にかけ、 溶出 した画 分（分子量 1500000以上） を分取 し、 さ らに、 セ シ ウ ム ク 口 ラ イ ド密度勾配遠心（後記註参照） を行ない、 比重 1.4 ±0.4g Zmlの精製糖タ ンパク質抗原（粘液糖タ ンパ ク質 画分） をフ ラ ク シ ョ ンコ レ ク タ ーによ って採取 した。

註 ： 「セ シ ウ ム ク ロ ラ イ ド密度勾配遠心」 遠心力 ： 1.5x 10⁵ g

温度 ： 10°C

時間 ： 85時間

装置 ： Model 72P； ローター ： RPS-4 OT (H i tach i ,

Ltd. )

(2) 免疫マウス脾臓細胞の調製

4週齢の BALB/c雌マウ スに対 し、 フ ロ イ ン ト完全ア ジ ュバン ド50//1(01 0社製） および上述の方法で得 られた 精製粘液糖タ ンパク質抗原 （以下精製粘液糖タ ンパク質 抗原と記す） lOOltgZ匹を腹腔内投与 し、 免疫 した。 以後 , 3週間おきにフ ロイ ン ト不完全ア ジュバ ン ド 50/l(Difco 社製） および初回免疫 した ものと同 じ精製粘液糖タ ンパ ク質抗原 匹を腹腔内投与し、 2回以降の免疫と した。 2回目の免疫以後、 免疫の 3〜 4 曰後に眼底静脈 よ り採血し、 血清中の抗粘液糖タ ンパク質抗体を、 以下 の ELISA法にて確認した。

ELISA法 ： 精製粘液糖タ ンパク質抗原を、 0. 05M炭酸 ナ ト リ ゥム—炭酸水素ナ ト リ ウム緩衝液（PH9.6) に、 2 pgZ mlの濃度になる よ う に溶解した後、 同 じ緩衝液を用 いて倍数希釈系列を作製 した。 これらの希釈液を ELISA 用マイ ク ロプレー ト （Corning社製） の各ゥエルに 100 |il ずつ分注し、 4 °Cで一夜放置 した。 各ゥエルを Tween 20 を 0.05%含有させた PBS ( PBS-Tween) で 3回洗浄 した後 各ゥエルにスキム ミ ルク を 2 %含有させた PBSを満た し 1 時間放置 した。 PBS-Tweenで 3回洗浄した後、 次に試 料と してマウ ス血清の 1000倍希釈液を各ゥエルあた り 100/(1分注 し、 1 時間反応させた。 PBS- Tweenで 3 回洗浄 した後、 次に、 二次抗体と してペルォキシダ一ゼで標識 したャギ抗マウ スィ ムノ グロブ リ ン抗体 （ Tago社製） を PBSで 10000倍に希釈した溶液を各ゥエルに 100// 1加え、 1 時間放置 した。 PBS-Tweenで 3回洗浄した後、 次に、 ABTS— H ₂0₂ぺ ノレオキシダ一ゼ基質液 (Kirkegaard & Perry Laboratories社製：） を各ウ エ ノレ iこ 100 /11添加 しヽ 室温で 30分間反応させた後、 マイ ク ロプレー ト リ ーダー で各ゥエルについて 415nraの吸光度を測定 した。 粘液糖 タ ンパク質の用量に依存 して発色性を示すマウス血清を 抗体陽性と判定 した。

このよ う に して精製粘液糖タ ンパク質抗原に対する抗 体陽性と判定されたマウスよ り脾臓を摘出 した後、 脾臓 単細胞水性懸濁液を調製 し、 細胞融合に用いた。

(3) マウス骨髄腫細胞の調製

8 —ァザグァニ ン耐性マウス骨髄腫細胞 Sp 2/0-Ag 14 を正常培地 〔RPMI 1640 (日水製薬社製） （10.2g Z リ ッ トル） に、 炭酸水素ナ ト リ ウム（2.2 g / リ ツ トル） 、 L 一グルタ ミ ン （ 0.3 g / リ ツ トル） 、 ゲンタマイ シ ン（40 mgZリ ッ トル） および牛胎児血清 （ 10% V Z V ) を加え た培地〕 を用いて で、 炭酸ガスイ ンキュベータ一中 で培養した。

(4) 細胞融合およびハイ プリ ドーマの培養

上述のよ う に調製された脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞 Sp2/0-Agl4と細胞数比で 10 ： 1 の割合で混合 し、 緩やか に撹拌 しな が ら融合補助剤 〔 ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル 4000 ( 0.5 g ) 、 ジ メ チ ルスルホ キ シ ド （ 0.05ml) 、 PBS (0.5ml) 〕 を加えて融合させた。 37°Cで 90秒間イ ンキュ ペー ト した後、 培地 [RPMI 1640 (日水製薬社製） （10.2 gノ リ ッ ト ル） に、 炭酸水素ナ ト リ ウ ム（2.2 g Z リ ッ ト ル） 、 L — グルタ ミ ン（ 0.3 g リ ッ ト ル） およびゲ ン タ マイ シ ン （ 40mg_ リ ツ ト ル） を加えた培地〕 を液の全量 が 40mlにな る まで徐々 に加えた。 遠心分離（llOOrpmZ 10 分） した後、 上清を除き 、 HAT培地 [RPMI 1640 (日水製 薬社製） （ 10.2 g / リ ッ ト ル） に、 炭酸水素ナ ト リ ウ ム (2.2g Zリ ッ ト ル）、 L — グルタ ミ ン（0.3g リ ッ ト ル）. ゲ ンタ マイ シ ン OmgZリ ッ ト ル） 、 牛胎児血清 （20% V / V ) 、 ヒ ポキサ ンチ ン（IOO OI/ リ ッ ト ル） 、 ア ミ ノ プテ リ ン （0.4<imolZリ ツ トル） およびチ ミ ジ ン （16 pmolノ リ ツ ト ル） を加えた培地〕 を加え、 緩やかに細胞 を懸濁 した。 こ の懸濁液を 96穴培養プ レー ト に分注 し、 5 %の炭酸ガスを含むィ ンキュベー タ 一中で培養 した。

(5) ス ク リ ーニ ングおよびク ロ ーニ ング

上記の 96穴培養プ レー ト において、 コ ロニー状に生育 した融合細胞の認め られたゥエルか ら培養上清を一部採 取 し、 後述の ELISA法によ り ス ク リ ーニ ン グを行ない、 精製粘液糖タ ンパク質抗原 と反応する抗体を産生するハ イブリ ドーマ、 HIK-22と HIK-108を選 SIJした。 HIK-22と HIK- 108それぞれが産生する抗体について、 さ らに、 後 述の免疫組織染色法に よ っ てス ク リ 一二ングを行ない、 胃腺上皮粘液細胞およびそ の分泌粘液 と反応する抗体を 産生するハイ プ リ ドーマ と して HI K- 108を選択 した。 次 に、 HIK- 108を HT培地 〔RPMI 1640 (日水製薬社製）（10.2 gノ リ ツ ト ル） に、 炭酸水素ナ ト リ ウ ム（2.2 g Z リ ツ ト ル）、 L 一 グルタ ミ ン（0.3 g リ ッ ト ノレ）、 ゲ ン 夕 マイ シ ン（40mgZ リ ッ ト ル） 、 牛胎児血清（15% V / V ) 、 ヒ ポ キサ ンチ ン （ 100 /i mol Z リ ッ ト ノレ） およびチ ミ ジ ン（ ] 6 /imol/ リ ツ ト ル） を加えた培地〕 で 1 週間、 次いで、 正 常培地 [RPMI 1640 (日水製薬社製）（ 10.2 g リ ッ ト ル） に、 炭酸水素ナ ト リ ウ ム（2.2 g リ ッ ト ル） 、 L — グル タ ミ ン （ 0.3 g Z リ ツ ト ル） 、 ゲ ン タ マ イ シ ン（40ragZ リ ッ ト ル）および牛胎児血清（10% V Z V ) を加えた培地〕 で 1 週間継代培養 した後、 限界希釈法によ る ク ロ ーニ ン グを 2回繰 り返 し、 HIK- 1081、 HIK-1082. HIK- 1083の 3 種のハイ ブ リ ドーマを得た。 こ れらのハイ ブ リ ドーマを 個 々 に 4週間、 正常培地を用いて継代培養 した後、 各ハ イ ブ リ ドーマの培養上清液を後述の ELISA法で分析 し、 最 も高い発色性を示す培養上清液のハ イ プ リ ドーマ、 HIK-1083 (工業技術院生命工学工業技術研究所 ： 受託番 号 P-13622) を選択 した。

ELISA法 ： 精製粘液糖タ ンパク質抗原を、 0. 05M炭酸 ナ ト リ ウ ムー炭酸水素ナ ト リ ゥ ム緩衝液（pH9.6) に、 1 /i g Z ni lの濃度 に な る よ う に溶解 した後、 そ の溶液を ELISA用マイ ク ロ プレー ト （Corning社製） の各ゥエルに 100 /( 1ずつ分注 し、 4 °Cで一夜放置 した。 各ゥエルを Tween20を 0.05%含有させた PBS (PBS-Tween ) で 3 回洗浄 した後、 各ゥエルにスキム ミ ルク を 2 %含有させた PBS を満た し、 1 時間放置 した。 PBS- Tweenで 3回洗浄した 後、 次に試料と して前記 （ 5 ) で得たハイ プリ ドーマの 培養上清液を各ゥエルあた り 100 /11分注 し、 1 時間反応 させた。 PBS- Tweenで 3 回洗浄した後、 次に、 二次抗体 と してペルォキシダーゼで標識 したャギ抗マウ スィ ムノ グロプ リ ン抗体 （Tago社製） を PBSで 10000倍に希釈 した ものを各ゥエルに 100 /i l加え、 1 時間放置 した。 PBS - Tweenで 3回洗浄 した後、 次に、 ABTS-H ₂0₂ペルォキ シダ 一ゼ基質液 ( irkegaard & Perry Laboratories社製） を各ゥエルに 100/11添加し、 室温で 30分間反応させた後、 マイ ク ロプレー ト リ ーダーで各ゥエルについて 415nmの 吸光度を測定した。 ハイ プリ ドーマの培養上清液の代り に前記 （ 3 ) で得た骨髄腫細胞の培養上清液を加えた以 外は同様に処理 したゥエルに対して強 く 発色するゥエル を選択 し、 発色したゥエルに対応する試料を陽性と判定 した。

免疫組織染色法 ： ヒ ト胃粘膜をホルマ リ ンで固定 した 後、 パラ フ ィ ンで包埋 し、 ミ ク ロ ト ームで切片 （厚さ 4 iim) を作製 し、 スライ ドガラ ス上に固定 した。 同スライ ドガラ スをキシ レンに浸 して脱パラ フ ィ ン した後、 過酸 化水素を 0. 3%含有させたメ タ ノ ールに 30分間浸 し、 次 いで、 PBSに 30分間浸 して洗浄 した。 次に、 こ の洗浄後 のスラ イ ドガラ ス上の切片に 10%ゥサギ正常血清 （ニチ レイ社製） を付着せ しめ、 1 時間イ ンキ ュベー ト した後 PBSで洗浄 した。 次に、 こ の洗浄後の切片に試料と して ハイ プ リ ドーマの.培養上清液を付着せ しめ、 1 時間イ ン キ ュ ペー ト した後、 P B Sで洗浄 した。 次に、 こ の洗浄後 の切片に ビォチ ン標識 した ゥサギ抗マウ ス IgG + IgA + IgM(H + L ) (ニチ レイ社製） を付着せ しめ、 1 時間ィ ンキ ュ ペー ト した後、 PBSで洗浄 した。 次に、 こ の洗浄 後の切片にペルォ キ シ ダーゼ標識ス ト レブ ト ァ ビ ジ ン (ニチ レイ社製） を付着せ しめ、 1 時間イ ンキ ュ ベー ト した後、 PBSで洗浄 した。 次に、 こ の洗浄後の切片を ジ ァ ミ ノ べン ジ ジ ン （同仁化学研究所社製）（0.02% ) 、 過 酸化水素水 （0. 005%) を含有させた 0. 05M ト リ ス一塩 酸緩衝液 （PH7.6) 中に約 4分間浸 し、 発色させた。

(6) ァイ ソ タ イ プの確認

本発明に係るモ ノ ク ロ ーナル抗体のグロ プ リ ン ク ラ ス をァイ ソ タ イ ピ ングキ ッ ト （PharMingen社製） を用いた ELISA法で調べた o すなわ " 、 monoclonal rat a n t i - mouse IgG,、 monoclonal rat anti-mouse IgG2«、 monoclonal rat anti-mouse IgG 2 _b ^ monoclonal rat anti-mouse IgG₃、 monoclonal rat anti-mouse IgM monoclonal rat anti-mouse IgA、 monoclonal rat anti-mouse IgL( /c )および monoclonal rat anti-mouse IgL( ;i )の各試薬を coating bufferを用いて 5倍希釈し た後、 ELISA用マイ ク ロプ レー ト （Corning社製） の各ゥ エルに それぞれ 50 ίί 1ずつ分注 し、 4 °Cで一夜放置 した。 各ウ エノレを Tween20を 0.05%含有させた PBS (PBS-Tween ) で 3回洗浄後、 各ゥエルにスキム ミ ルク を 2 %含有させ た PBSを満た し、 1 時間放置 した。 PBS-Tweenで 3回洗浄 した後、 次に、 各ゥエルに HIK-1083 (寄託番号 P- 13622) を正常培地 [RPMI 1640 (日水製薬社製） （10.2gノ リ ツ トル） に、 炭酸水素ナ ト リ ウ ム（2.2 g Zリ ツ トル） 、 L — グノレ夕 ミ ン （ 0.3 g / リ ッ ト ノレ） 、 ゲ ンタマイ シ ン （ 40 ragZリ ッ ト ル） および牛胎児血清 （ 10% Vノ V ) を加え た培地〕 で 3 日間培養 した後の培養上清液を 50/il分注 し 1 時間反応させた。 PBS-Tweenで 3 回洗浄 した後、 次に、 各 ゥ エ ル に ァ ノレ 力 リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ で標識 し た polyclonal rat anti-mouse I g s試薬を 50 /ι 1加え、 1時 間放置 した。 PBS-Tweenで 3回洗浄した後、 次に、 各ゥ エルに pNPP錠剤 1 個を基質溶解液 5 mlに溶解して調製 し た基質溶液を 50ί(1添加 し、 室温で 30分間反応させた。 プ レー トを肉眼で観察した結果、 monoclonal rat anti- mouse IgM 薬と monoclonal rat ant i -mouse IgL( c )試 薬で前処理 した両ゥエルにだけ強い黄色い発色が認めら れ、 他のゥエルは無色透明であった。 これらの結果から 本発明のモノ ク ローナル抗体は IgM抗体であ り 、 軽鎖は AC鎖である こ とが確認された。

(7) モ ノ ク ロ ーナル抗体の調製

2， 6， 10, 14—テ ト ラ メ チルペンタデカ ン 0.5mlZ匹を 6 週齢の BALB/c雌マウ ス （体重 19〜21 g ) の腹腔内に投与 (プ リ ス タ ン処理）し、 10〜 14日間飼育 した。 その後、 同 マウ スの腹腔内に上述のハイ プ リ ドー マ株、 HI K- 1083 (寄託番号 P- 13622) を 5 X 10⁶個細胞 匹、 注入 した。

10〜21日後に貯留 .した腹水を採取 し、 遠心分離 （ 12000r 111 20分 4で） 後、 上清液を分取 した。 得られた上清 液に 40%飽和硫安濃度となる よ う に硫安を添加 して塩析 した後、 遠心分離 （ ΟΟθΓριηΖΖΟ分 4 °C ) し、 沈殿物 を分取 した。 得 られた沈殿物を PBSで溶解 し、 4 °Cで 2 日間 PBSに対 して透析 した後、 透析内液を次のァフ ィ 二 テ ィ 一 カ ラ ム に 付 し た 。 ブ タ 胃 粘液糖 タ ン パ ク 質 (Sigma社製） を Na (^を 0.5M含有させた 0.1M燐酸緩衝液 (pH7. 8 ) に溶解させた後、 同緩衝液にて膨潤させた

CNBr - Activated Sepharose 4B (； Pharmacia社製） と混和 し、 カラ ムに充填した。 カ ラムを同緩衝液で洗浄後、 同 カ ラ ムに上記の透析内液の成分を吸着させた。 カ ラ ムに 吸着 した成分を NaC を 0.5M含有させた 0.2Mグリ シ ン一 塩酸緩衝液（PH2.0) で溶出 した後、 溶出液に 3 M ト リ ス 一塩酸緩衝液（pH8.5) を加え、 下記の西洋ヮサビペルォ キシダーゼ標識反応に用いた。

(8) モノ ク ローナル抗体の標識

西洋ヮサビペルォキシダーゼ （天野製薬社製） を蒸留 水に溶解後、 0. 1 Mメ タ過ヨ ウ素酸ナ ト リ ウム水溶液を 添加 し、 10分間反応させた。 反応液にエチ レ ングリ コー ルを添加 した後、 反応液を S e p h a d e x G - 25カ ラ ム (Pharmacia社製） を用いて脱塩し、 過ヨ ウ素酸処理ペル ォキ シ ダーゼ溶液を調製 した。 こ の過 ヨ ウ素酸処理 した ペルォキ シダ一ゼ溶液 と マウ ス腹水か らァ フ ィ 二テ ィ 一 カ ラ ムを用 いて精製 した上記モ ノ ク ロ ーナル抗体を混合 し、 室温で 2 時間反応させた後、 0. 1 M水素化ホウ素ナ ト リ ウ ム水溶液を添加 して、 さ らに、 2時間反応させた < こ の反応液を Sephacryl S-200 HR (Pharmacia社製：） カ ラ ム を 用 い て 35の 画分 に 分画 し た 後、 各画分 を下記 の ELISA法で分析 し、 発色が認め られた 4 画分を合一 し、 凍結保存 した。

ELISA法 ： 精製粘液糖タ ンパク質抗原を、 0. 05M炭酸 ナ ト リ ウ ム一炭酸水素ナ ト リ ウ ム緩衝液（PH9.6) に、 1 iigZ mlの濃度になる よ う に溶解 した後、 ELISA用マイ ク 口 プ レー ト （Corning社製） の各ゥエルに 100 /( 1ずつ分注 し、 4 °Cで一夜放置 した。 各ウエノレを Tween20を 0. 05% 含有させた PBS (PBS-Tween) で 3 回洗浄 した後、 各ゥェ ルにスキム ミ ルク を 2 %含有させた PBSを満た し、 1 時 間放置 した。 PBS-Tweenで 3回洗浄 した後、 次に、 試料 と して カ ラ ム溶出液 （各画分） を各ゥエルあた り l OO p l 分注 し、 1 時間反応 させた。 PBS-Tweenで 3 回洗浄 し た 後 、 次 に 、 A B T S - H ₂0₂ ペルォ キ シ ダー ゼ基質液 (Kirkegaard & Perry し aboratories社製） を各ウ エノレに 100 /i l添加 し、 室温で 30分間反応させた後、 マイ ク ロプ レー ト リ ー ダーで各ゥエルについて 415 n mの吸光度を測 定 した。

実施例 2 モ ノ ク ロ ーナル抗体の抗原特異性

(1) 免疫組織染色法によ る抗原特異性の確認

実施例 1 で得たモ ノ ク ロ ーナル抗体の ヒ ト 胃粘膜に対 する反応性を免疫組織染色法で検討 した。 すなわち、 ヒ ト の胃および十二指腸の粘膜をホルマ リ ンで固定 した後、 パラ フ ィ ンで包埋 し、 ミ ク ロ ト ームで切片 （厚さ 4 /im) を作製 し、 ス ラ イ ドガラ ス上に固定 した。 同スラ イ ドガ ラ スをキ シ レ ンに浸 して脱パラ フ ィ ン した後、 過酸化水 素を 0.3%含有させたメ タ ノ ールに 30分間浸 し、 次いで、 PBSに 30分間浸 して洗浄 した。 次に、 こ の洗浄後のスラ ィ ドガラ ス上の切片に 10%ゥサギ正常血清 （ニチ レイ社 製）を付着せ しめ、 1 時間イ ンキュベー ト した後、 PBSで 洗浄 した。 次に、 こ の洗浄後の切片にハイ プ リ ドーマ HIK-1083(寄託番号 P-13622) を正常培地 〔RPMI 1640(日 水製薬社製） （ 10.2g Z リ ッ ト ル） に、 炭酸水素ナ ト リ ゥ ム （ 2.2 g Zリ ツ ト ル） 、 L一グルタ ミ ン （ 0.3 g / リ ッ ト ル） 、 ゲ ンタ マイ シ ン （ 40mgZ リ ッ ト ル） および牛 胎児血清 （ 10% V Z V ) を加えた培地〕 で 3 日間培養 し て得た培養上清液を付着せ しめ、 1 時間イ ンキュベー ト した後、 P B Sで洗浄 した。 次に、 こ の洗浄後の切片に ビ ォチ ン標識 したゥサギ抗マウ ス IgG+ IgA+ IgM(H + L ) (ニチ レイ社製） を付着せ しめ、 1 時間イ ンキュベー ト した後、 PBSで洗浄 した。 次に、 こ の洗浄後の切片にぺ ルォキ シダーゼ標識ス ト レプ ト ア ビジ ン（ニチ レイ社製） を付着せ しめ、 1 時間イ ンキュベー ト した後、 PBSで洗 浄 した。 次に、 こ の洗浄後の切片を ジァ ノ べ ン ジ ジ ン

(同仁化学研究所社製）（0.02% ) 、 過酸化水素水 （ 0.005 % ) を含有 させた 0.05M ト リ ス -塩酸緩衝液（pH7, 6) 中 に約 4 分間浸 し、 発色させた。 結果は表一 1 に示すごと く であ っ た。

こ の結果は、 実施例 1 で得たモ ノ ク ロ ーナル抗体によ り ヒ ト の胃腺上皮型粘液 （ ΙΠ型粘液） を特異的に検出す る こ とが可能であ る こ と を示 している。

表一 1

註 ： 染色が認め られる ものを十、 染色が認め られない も のを一 で表す。

(2) 抗原活性成分の分析

実施例 1 で得たモ ノ ク ロ ーナル抗体が特異的に反応す る粘液糖タ ンパ ク 質抗原の分析を行っ た。

(a) 粘液糖タ ンパク質分解物の調製

Carlson, Don M. (1968) J. Biol. Chem. 243, 616 - 626に記載の方法に準拠 して、 ブタ 胃粘液糖タ ンパク質 (Sigma社製） を水素化ホウ素ナ ト リ ゥム 1 Mを含む 0.05 M水酸化ナ ト リ ゥ ム水溶液中で 50°C、 24時間加熱処理 し

(b) 上記分解物の分離、 精製

上記（a)で得られた反応液を室温まで冷却後、 0.1N酢 酸で平衡化 した Toyopearl HW-50S (東ソ一社製） カ ラ ム に付 し、 0. 5 N酢酸で溶出、 溶出液を 40の画分に分画 し た。 得られた各画分の抗原活性を後述の Compet i t i ve ELISA法で検討 した後、 抗原活性を有する画分でカ ラ ム から最も遅れて溶出 した画分を選定 した。 選定 した画分 を、 さ らに、 TSKgel NH₂-60力 ラ ム（東ソ一社製） を用い た HPLCにて 70の画分に分画 し、 各画分の抗原活性を後述 の Competitive ELISA法で検討した。 得られた 70画分の 中から強い抗原活性を有する 3画分を選択し、 これら 3 画分を合一して、 減圧乾固 した。

Competitive ELISA法 ： 精製粘液糖タ ンパク質抗原を、 0.05M炭酸ナ ト リ ウム一炭酸水素ナ ト リ ウム緩衝液 （pH 9. 6 )に、 2 /t g/ m lの濃度にな る よ う に溶解 した後、 ELISA用マイ ク ロプレー ト （Corning社製） の各ゥエルに 100 // 1ずつ分注 し、 4 ^で一夜放置 した。 各ゥエルを Tween20を 0.05%含有させた PBS (PBS-Tween) で 3回洗 浄—した後、 各ゥエルにスキム ミ ルク を 2 %含有させた PBSを満た し、 1 時間放置 した。 PBS-Tweenで 3回洗浄 し た後、 洗浄した各ゥエルに、 別の容器内で試料と して上 述の粘液糖タ ンパク質抗原分解物のカ ラム溶出液 50 、 ノヽイブリ ドーマ HI K_ 1083 (寄託番号 Ρ - 13622 ) を正常培 地 [RPMI 1640 (日水製薬社製） （10.2 g Ζリ ッ ト ル） に、 炭酸水素ナ ト リ ウ ム（2.2 gノ リ ッ ト ル） 、 Lー グルタ ミ ン （ 0.3 g Zリ ッ ト ル） 、 ゲ ン タ マイ シ ン（40π^Ζリ ッ ト ル） および牛胎児血清 （ 10% V / V ) を加えた培地〕 で 3 日間培養 して得た培養上清液 25 // 1および PBSの 4倍濃 縮液 25/ί1を混合後 2 時間放置 した ものを添加 し、 1 時間 反応した。 PBS- Tweenで 3回洗浄した後、 次に、 二次抗 体と してペルォキシダーゼで標識したャギ抗マウスィ ム ノ グロブリ ン抗体 （Tago社製） を PBSで 10000倍に希釈 し た ものを各ゥエルに ΙΟΟίί Ι加え、 1時間放置 した。 PBS- Tweenで 3回洗浄した後、 次に、 ABTS-H ₂0₂ペルォキシダ 一ゼ基質液 (Kirkegaard & Perry laboratories社製) を 各ゥエルに 100/i l添加 し、 室温で 30分間反応させた後、 マイ ク ロプレー ト リ ーダーで各ゥエルについて 415nraの 吸光度を測定した。 試料の代わり に蒸留水を加えて上記 操作を行なったゥエルの反応液の吸光度に対 して、 よ り 低値を示すゥエルに対応する試料を抗原活性を有する試 料と判定した。

(c) 減圧乾固物の分析

上記（ b)で得 られた減圧乾固物を Sweel ey らの方法 (Sweeley, C. C. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85, 2497- 2507) に従って ト リ メ チルシ リ ル化した後、 ガス ク ロマ ト グラ フ ィ 一によ り分析した。 すなわち、 上記減圧乾固 物を HCiを 3 %含有させたメ タ ノ ール中で加熱処理 した 後、 反応液に炭酸銀を加えて pHを 5 と し， 次いで、 こ の 反応液に無水酢酸を加えて室温で一夜放置 した。 一夜放 置後の反応液を遠心分離（2000rpmZ 5分） し、 上清液を 分取 し、 減圧乾固 した。 得 られた濃縮残渣に Tri-Si l試 薬 （Pierce社製） を加えて溶解、 反応後、 その反応液の 一部を 0V-1キ ヤ ビラ リ 一力 ラ ム（GLサイ エ ンス社製） （長 さ 2. 5m、 内径 0. 25mra) を備えたモデル GC7Aガスク ロマ ト グ ラ フ （島津製作所社製） に導入 し、 FI D ( f l ame- ionization detector) で検出 した。 検出されたピーク は同一分析条件で測定 した標準物質の ク ロ マ ト グラ ム と 比較する こ と によ り 同定 した。 標準物質はフ コ ース、 ガ ラ ク ト ース、 グルコ ース、 マ ンノ ース、 N— ァセチルガ ラ ク トサ ミ ン、 N—ァセチルダルコサ ミ ンを用い、 それ らを Tri- Si 1試薬（Pierce社製） と反応させる こ と によ り 調製 した。 ま た、 N—ァセチルガラ ク トサ ミ ニ ト ールは N—ァセチルガラ ク トサ ミ ンを水素化ホウ素ナ ト リ ウ ム を含有させた 0.2Mホウ酸緩衝液（pH9 ) 中で還元処理 し た後、 Tri-Sil試薬（Pierce社製） と反応させる こ と によ り調製 した。 その結果、 上記の抗原活性画分の濃縮残渣 か ら N—ァセチルガラ ク ト サ ミ ニ ト ール、 N—ァセチル ダルコサ ミ ン、 フ コ ースおよびガラ ク ト 一スが検出 され

2«- o

実施例 3

糖との反応性

Methyl 2— acetamido— 2— deoxy— a— D— luco- pyranoside(Sigma社製 ) と Methyl 2 — acetamido— 2 ― deoxy― β ― D — glucopyranoside(Sigma社製 ) をそれぞ れ 1 mgZ mlの濃度にな る よ う に蒸留水を用いて溶解 した 後、 蒸留水を用いて倍数希釈系列を作製 した。 これらの 水溶液と実施例 1 で得たモノ ク ローナル抗体との反応性 を下記の Compet i t ive ELISA法で検討した ₀ その結果、 Methyl 2 — acetamido— 2 — deo y— a — D — gl uco- py ratios i deは濃度依存的に吸光度を低下させ、 反応性が 認められたが、 ethyl 2 - acetamido - 2 - deoxy - β — D — gl ucopyranosideで濃度依存的な吸光度の変化は 認め られなかった。

Competitive ELISA法 ： 精製粘液糖タ ンパク質抗原を、 0.05M炭酸ナ ト リ ウム -炭酸水素ナ ト リ ウム緩衝液 （pH 9. 6 ) に、 2 ii g / m lの濃度になる よ う に溶解 した後、 ELISA用マイ ク ロプレー ト （Corning社製） の各ゥエルに 1 00 /1 1ずつ分注 し、 4 でで一夜放置 した。 各ゥエルを Tween20を 0.05%含有させた PBS(PBS-Tween) で 3 回洗浄 した後、 各ゥエルにスキム ミ ルク を 2 %含有させた PBS を満た し、 1 時間放置した。 PBS- Tweenで 3回洗浄した 後、 洗浄 した各ゥエルに、 別の容器内で試料と して上記 の水溶液 50 ίί 1、 ノヽイブリ ドーマ HI K- 1083 (寄託番号 Ρ- 13622) を正常培地 C RPMI 1640 (日水製薬社製）（10. 2 g Zリ ツ トル）に、 炭酸水素ナ ト リ ウム（2.2 g Zリ ツ トル） L — グノレタ ミ ン（ 0. 3 gノ リ ッ トル） 、 ゲ ンタマイ シ ン ( 40mgZリ ッ トル） および牛胎児血清 （ 10% V Z V ) を 加えた培地〕 で 3 日間培養 して得た培養上清液 25/11およ び PBSの 4 倍濃縮液 25iilを混合後 2時間放置 した も のを 添加 し、 1 時間反応 した。 PBS-Tweenで 3 回洗浄 した後、 次に、 二次抗体と してペルォキシダーゼで標識 したャギ 抗マウ スィ ム ノ グロ ブ リ ン抗体 （Tago社製） を PBSで 10000倍に希釈 した ものを各ゥエルに 100 pi加え、 1 時間 放置 した。 PBS-Tweenで 3回洗浄した後、 次に、 ABTS- H a 02 ぺゾレオキシダ一ゼ基質液 (Ki rkegaard & Perry Laboratories社製） を各ウ エノレに 100/il添加し、 室温で 30分間反応させた後、 マイ ク ロプレー ト リ ーダーで各ゥ エルについて 415nmの吸光度を測定 した。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . ヒ ト の胃の腺上皮型粘液細胞が産生する粘液糖タ ン パ ク 質 と特異的に反応する IgMク ラ スモ ノ ク ロ ーナル 抗体 o

5 2. 前記の I gMク ラ スモ ノ ク ロ ーナル抗体が工業技術院 生命工学工業技術研究所 ： 受託番号 P- 13622のハイ ブ リ ドーマか ら得 られる ものであ る請求項 1 に記載のモ ノ ク ロ 一ナル抗体。

3. ヒ ト の胃の腺上皮型粘液細胞が産生する粘液糖タ ン 0 パク 質 と特異的に反応する IgMク ラ スモ ノ ク ロ ーナル 抗体を産生するハイ プ リ ドー マ 。

4. 工業技術院生命工学工業技術研究所 ： 受託番号 P - 13622のハイ プ リ ドーマ。

5. ヒ ト の体液中に含まれる胃の腺上皮型粘液細胞由来 5 の粘液糖タ ンパク質の分析のための請求項 1に記載の 〜 モノ ク ロ ーナル抗体の使用。

0

5 «式 7

iffl 知 S 号 ： 5 生 ¾文 第 770号 迎知年月 曰 ：平成 5年 4月 2 8曰 閱東化学株式会社

代表取 社 β ？ 俊太郎 殿 t