JPH11313669A - 抗ヒト胃ムチンモノクローナル抗体 - Google Patents
抗ヒト胃ムチンモノクローナル抗体Info
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- JPH11313669A JPH11313669A JP10134272A JP13427298A JPH11313669A JP H11313669 A JPH11313669 A JP H11313669A JP 10134272 A JP10134272 A JP 10134272A JP 13427298 A JP13427298 A JP 13427298A JP H11313669 A JPH11313669 A JP H11313669A
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- cells
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ヒトの胃表層型粘液の測定に使用可能な新規
なモノクローナル抗体の提供。 【構成】 ヒトの胃の表層型粘液細胞が産生するムチン
と特異的に反応するＩｇＧ1クラスモノクローナル抗体
および該モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ。
なモノクローナル抗体の提供。 【構成】 ヒトの胃の表層型粘液細胞が産生するムチン
と特異的に反応するＩｇＧ1クラスモノクローナル抗体
および該モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトの胃粘膜の表層粘
液細胞およびヒト胃粘膜表層型粘液を産生する粘液細
胞、例えば、胃型化生細胞、胃型腫瘍細胞の染色に有用
なモノクローナル抗体に関する。更に本発明は、上記の
ヒト胃粘膜表層型粘液を産生する粘液細胞が分泌するム
チンの測定に有用なモノクローナル抗体に関する。詳し
くは、本発明のモノクローナル抗体または本発明のモノ
クローナル抗体の標識誘導体を用いて免疫組織染色を行
うことにより、ヒトの胃の表層型粘液細胞およびそれら
の細胞が分泌する粘液を特異的に染色することができ、
また、ＥＬＩＳＡ(enzyme-linked immunosorbent assa
y)を行なうことにより、ヒトの体液、例えば、胃液、膵
液、血液、喀痰中に含まれる胃の表層型粘液細胞由来の
ムチンを質的、量的に分析することができる。本発明の
モノクローナル抗体は胃粘膜防御機構の研究の他、癌の
検診または診断に利用できる。
液細胞およびヒト胃粘膜表層型粘液を産生する粘液細
胞、例えば、胃型化生細胞、胃型腫瘍細胞の染色に有用
なモノクローナル抗体に関する。更に本発明は、上記の
ヒト胃粘膜表層型粘液を産生する粘液細胞が分泌するム
チンの測定に有用なモノクローナル抗体に関する。詳し
くは、本発明のモノクローナル抗体または本発明のモノ
クローナル抗体の標識誘導体を用いて免疫組織染色を行
うことにより、ヒトの胃の表層型粘液細胞およびそれら
の細胞が分泌する粘液を特異的に染色することができ、
また、ＥＬＩＳＡ(enzyme-linked immunosorbent assa
y)を行なうことにより、ヒトの体液、例えば、胃液、膵
液、血液、喀痰中に含まれる胃の表層型粘液細胞由来の
ムチンを質的、量的に分析することができる。本発明の
モノクローナル抗体は胃粘膜防御機構の研究の他、癌の
検診または診断に利用できる。
【０００２】
【従来の技術】消化管粘膜の上皮に存在する粘液産生細
胞は粘液を合成、分泌することで消化管の機能維持に寄
与していると考えられる。とくに胃の粘液は胃酸やペプ
シンなどの攻撃因子から胃の粘膜を保護するための防御
因子の一つとして重要な役割を担っていると考えられて
いる。
胞は粘液を合成、分泌することで消化管の機能維持に寄
与していると考えられる。とくに胃の粘液は胃酸やペプ
シンなどの攻撃因子から胃の粘膜を保護するための防御
因子の一つとして重要な役割を担っていると考えられて
いる。
【０００３】ヒトの胃の粘液産生は胃粘膜表層上皮に存
在する表層粘液細胞（被蓋上皮細胞）と胃腺の底部に存
在する腺上皮粘液細胞で行なわれているが、近年、これ
らの粘液細胞が産生する粘液を個々に識別する試みが成
されている。組織化学的には表層粘液細胞と腺上皮粘液
細胞それぞれの粘液に固有の糖成分に対して特異的な染
色法が開発され、両者を識別することが可能となってい
る。すなわち、表層粘液細胞はガラクトースオキシダー
ゼ・コールドチオニン・シッフ（ＧＯＣＴＳ）反応で特
異的に染色される粘液をもち、腺上皮粘液細胞にはコン
キャナバリンＡパラドキシカル染色法（ＰＣＳ法）(Kat
suyama, T. and Spicer, S. S. (1978)J. Histochem. C
ytochem. 26, 233-250)によりＩＩＩ型に分類される粘
液（ＩＩＩ型粘液）が特異的に存在することが認められ
ている（Ota, H. et al. (1991)Histochemical J. 23,
22-28）。また、胃粘膜の表層を覆い、胃粘膜防御の最
前線に位置している粘液ゲル層にはＧＯＣＴＳ反応陽性
粘液とＩＩＩ型粘液が交互にしかも地層を形成するよう
に存在していることが認められている（Ota, H. etal.
(1992) Histochemical J. 24, 86-92）。
在する表層粘液細胞（被蓋上皮細胞）と胃腺の底部に存
在する腺上皮粘液細胞で行なわれているが、近年、これ
らの粘液細胞が産生する粘液を個々に識別する試みが成
されている。組織化学的には表層粘液細胞と腺上皮粘液
細胞それぞれの粘液に固有の糖成分に対して特異的な染
色法が開発され、両者を識別することが可能となってい
る。すなわち、表層粘液細胞はガラクトースオキシダー
ゼ・コールドチオニン・シッフ（ＧＯＣＴＳ）反応で特
異的に染色される粘液をもち、腺上皮粘液細胞にはコン
キャナバリンＡパラドキシカル染色法（ＰＣＳ法）(Kat
suyama, T. and Spicer, S. S. (1978)J. Histochem. C
ytochem. 26, 233-250)によりＩＩＩ型に分類される粘
液（ＩＩＩ型粘液）が特異的に存在することが認められ
ている（Ota, H. et al. (1991)Histochemical J. 23,
22-28）。また、胃粘膜の表層を覆い、胃粘膜防御の最
前線に位置している粘液ゲル層にはＧＯＣＴＳ反応陽性
粘液とＩＩＩ型粘液が交互にしかも地層を形成するよう
に存在していることが認められている（Ota, H. etal.
(1992) Histochemical J. 24, 86-92）。
【０００４】上述した２種類の粘液の同定は胃の生理機
能の研究だけでなく、病態生理学的な側面からも重要な
意義をもっている。太田らはヒト胃生検標本をＧＯＣＴ
ＳとＰＣＳの重染色法で染色し、びらん面や潰瘍辺縁の
標本ではＩＩＩ型粘液の付着がみられるのに対してＧＯ
ＣＴＳ反応陽性粘液は少ないことを報告している（太田
等、(1990) 消化性潰瘍−臨床と基礎、9、155-165)。また、
Shimizu等は"definitebiological carcinogen"とＷＨＯ
／ＩＡＲＣに指定されているHelicobacter pylori(Inte
rnational Agency for Research on Cancer, World Hea
lth Organization (1994) IARC Monogr. Eval. Carcino
g. Risks Hum. 61, 218-220)に感染している胃粘膜標本
をＧＯＣＴＳ−ＰＣＳ重染色法で染色し、Helicobacter
pyloriが粘液ゲル層、とりわけ表層粘液細胞由来の粘
液層に多量に存在していることを見出している（Shimiz
u, T. et al. (1996) Helicobacter 1, 207-218）。こ
れらの研究成果は胃表層粘液細胞と腺上皮粘液細胞由来
の粘液がそれぞれ固有の性状と機能をもつことを示して
いる。
能の研究だけでなく、病態生理学的な側面からも重要な
意義をもっている。太田らはヒト胃生検標本をＧＯＣＴ
ＳとＰＣＳの重染色法で染色し、びらん面や潰瘍辺縁の
標本ではＩＩＩ型粘液の付着がみられるのに対してＧＯ
ＣＴＳ反応陽性粘液は少ないことを報告している（太田
等、(1990) 消化性潰瘍−臨床と基礎、9、155-165)。また、
Shimizu等は"definitebiological carcinogen"とＷＨＯ
／ＩＡＲＣに指定されているHelicobacter pylori(Inte
rnational Agency for Research on Cancer, World Hea
lth Organization (1994) IARC Monogr. Eval. Carcino
g. Risks Hum. 61, 218-220)に感染している胃粘膜標本
をＧＯＣＴＳ−ＰＣＳ重染色法で染色し、Helicobacter
pyloriが粘液ゲル層、とりわけ表層粘液細胞由来の粘
液層に多量に存在していることを見出している（Shimiz
u, T. et al. (1996) Helicobacter 1, 207-218）。こ
れらの研究成果は胃表層粘液細胞と腺上皮粘液細胞由来
の粘液がそれぞれ固有の性状と機能をもつことを示して
いる。
【０００５】また、Ota等は胃幽門部に認められるよう
な組織形態、すなわち、粘膜の表層上皮にＧＯＣＴＳ反
応陽性粘液が存在し、深層部にＩＩＩ型粘液が局在する
といった形態は正常な膵臓、肺、結腸、卵巣組織では見
られないが、化生や癌化した組織ではこのような幽門粘
膜型の形態を呈するものが多いことを報告し、胃幽門粘
膜化生と癌との関係について言及している（Ota, H. et
al. (1995) Acta Histochem. Cytochem. 28, 43-5
3）。これらの研究成果は、体液中に分泌された胃型の
粘液を測定することにより、癌疾患、もしくは、癌にな
る可能性についての診断のためのデータの提供が可能と
なることを示している。
な組織形態、すなわち、粘膜の表層上皮にＧＯＣＴＳ反
応陽性粘液が存在し、深層部にＩＩＩ型粘液が局在する
といった形態は正常な膵臓、肺、結腸、卵巣組織では見
られないが、化生や癌化した組織ではこのような幽門粘
膜型の形態を呈するものが多いことを報告し、胃幽門粘
膜化生と癌との関係について言及している（Ota, H. et
al. (1995) Acta Histochem. Cytochem. 28, 43-5
3）。これらの研究成果は、体液中に分泌された胃型の
粘液を測定することにより、癌疾患、もしくは、癌にな
る可能性についての診断のためのデータの提供が可能と
なることを示している。
【０００６】ヒトの胃腺上皮型粘液を特異的に検出する
ための方法としては、前記のＰＣＳ法以外にこれと特異
的に反応するモノクローナル抗体が本発明者らによって
提供されており（特開平６−３３５３９６号公報）、胃
腺上皮型粘液の定量的な測定が可能となっている。一
方、胃の表層粘液については前記のＧＯＣＴＳ法やガラ
クトースオキシダーゼ・シッフ（ＧＯＳ）法といった酵
素化学的な方法しか知られていない。これらの検出法は
試料が固定標本に限られるため、分泌粘液または可溶化
した粘液の測定に対しては適用することができず、ま
た、染色の再現性を期待することができないという欠点
があるため、これまで胃表層型粘液を定量的に測定する
ことはできなかった。
ための方法としては、前記のＰＣＳ法以外にこれと特異
的に反応するモノクローナル抗体が本発明者らによって
提供されており（特開平６−３３５３９６号公報）、胃
腺上皮型粘液の定量的な測定が可能となっている。一
方、胃の表層粘液については前記のＧＯＣＴＳ法やガラ
クトースオキシダーゼ・シッフ（ＧＯＳ）法といった酵
素化学的な方法しか知られていない。これらの検出法は
試料が固定標本に限られるため、分泌粘液または可溶化
した粘液の測定に対しては適用することができず、ま
た、染色の再現性を期待することができないという欠点
があるため、これまで胃表層型粘液を定量的に測定する
ことはできなかった。
【０００７】
【発明の開示】本発明は、ヒトの胃表層型粘液の測定に
使用可能な新規なモノクローナル抗体を提供するもので
ある。すなわち、本発明は、胃の表層粘液細胞およびそ
の分泌粘液と強い親和性を有し、かつ、腺上皮粘液細胞
およびその分泌粘液と交差性を有しない新規なモノクロ
ーナル抗体を提供するものである。本発明者らはヒトの
胃表層型粘液を特異的に認識するモノクローナル抗体に
ついて鋭意研究を重ねた結果、ヒト胃粘液の主要成分で
あるムチン（粘液糖タンパク質）を免疫抗原に用いるこ
とにより、ヒトの胃の表層型粘液細胞およびその分泌粘
液に対して高い特異性をもつ新規なモノクローナル抗体
を得ることに成功した。さらに、本発明により、このモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが提供され
る。
使用可能な新規なモノクローナル抗体を提供するもので
ある。すなわち、本発明は、胃の表層粘液細胞およびそ
の分泌粘液と強い親和性を有し、かつ、腺上皮粘液細胞
およびその分泌粘液と交差性を有しない新規なモノクロ
ーナル抗体を提供するものである。本発明者らはヒトの
胃表層型粘液を特異的に認識するモノクローナル抗体に
ついて鋭意研究を重ねた結果、ヒト胃粘液の主要成分で
あるムチン（粘液糖タンパク質）を免疫抗原に用いるこ
とにより、ヒトの胃の表層型粘液細胞およびその分泌粘
液に対して高い特異性をもつ新規なモノクローナル抗体
を得ることに成功した。さらに、本発明により、このモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが提供され
る。
【０００８】本発明に係るモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマは以下に述べるとおり、ケラーとミル
シュタインの方法(Kohler, G. and Milstein, C. (197
5) Nature 256, 495-497)によって得られる。すなわ
ち、好適な方法で調製されたヒト胃ムチンを用いて、マ
ウスを免疫した後、このマウスの脾臓細胞をマウスミエ
ローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマから目
的とする抗体を産生し分泌するハイブリドーマを選別
し、単離することができる。以下に本発明に係る上記の
ハイブリドーマならびにモノクローナル抗体の調製法お
よび同モノクローナル抗体の特性について詳述する。
るハイブリドーマは以下に述べるとおり、ケラーとミル
シュタインの方法(Kohler, G. and Milstein, C. (197
5) Nature 256, 495-497)によって得られる。すなわ
ち、好適な方法で調製されたヒト胃ムチンを用いて、マ
ウスを免疫した後、このマウスの脾臓細胞をマウスミエ
ローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマから目
的とする抗体を産生し分泌するハイブリドーマを選別
し、単離することができる。以下に本発明に係る上記の
ハイブリドーマならびにモノクローナル抗体の調製法お
よび同モノクローナル抗体の特性について詳述する。
【０００９】Ａ．抗原の単離、精製：免疫抗原としては
ヒトの手術切除胃の正常粘膜部位からの抽出物を用いる
ことができる。好適にはそれら抽出物から得られるムチ
ンを精製して用いる。例えば、ヒト胃粘膜から小原らの
方法（Ohara, S. et al. (1986) Comp. Biochem. Physi
ol. 83B, 273-275）により抽出、精製したムチンが用い
られる。後記の実施例では、ヒト胃粘膜抽出物からゲル
ろ過によって分子量１５０００００以上の画分を得、こ
の画分からセシウムクロライド密度勾配遠心法によって
糖タンパク質画分（ムチン含有画分）を得た。このよう
にして得られたムチンを免疫抗原として使用した。
ヒトの手術切除胃の正常粘膜部位からの抽出物を用いる
ことができる。好適にはそれら抽出物から得られるムチ
ンを精製して用いる。例えば、ヒト胃粘膜から小原らの
方法（Ohara, S. et al. (1986) Comp. Biochem. Physi
ol. 83B, 273-275）により抽出、精製したムチンが用い
られる。後記の実施例では、ヒト胃粘膜抽出物からゲル
ろ過によって分子量１５０００００以上の画分を得、こ
の画分からセシウムクロライド密度勾配遠心法によって
糖タンパク質画分（ムチン含有画分）を得た。このよう
にして得られたムチンを免疫抗原として使用した。
【００１０】Ｂ．マウスの免疫：免疫動物として、好適
には４−８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを用いることがで
きるが、他の系のマウスも使用することができる。免疫
スケジュールおよび抗原濃度は十分な量の抗原刺激を受
けたリンパ球が形成されるよう選ばれる。例えば、マウ
スの腹腔内に好適なアジュバンドと共に前記のムチン１
００μｇ／匹を投与する。以後数日〜数週間おきに、初
回免疫に使用したものと同じ抗原を数回投与する。２回
目の免疫以後、眼底静脈より採血し、血液中の抗体価に
ついて検討する。抗体価の測定はＥＬＩＳＡ法により好
適に行なうことができる。
には４−８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを用いることがで
きるが、他の系のマウスも使用することができる。免疫
スケジュールおよび抗原濃度は十分な量の抗原刺激を受
けたリンパ球が形成されるよう選ばれる。例えば、マウ
スの腹腔内に好適なアジュバンドと共に前記のムチン１
００μｇ／匹を投与する。以後数日〜数週間おきに、初
回免疫に使用したものと同じ抗原を数回投与する。２回
目の免疫以後、眼底静脈より採血し、血液中の抗体価に
ついて検討する。抗体価の測定はＥＬＩＳＡ法により好
適に行なうことができる。
【００１１】Ｃ．細胞融合：免疫したマウスより脾臓を
摘出し、これから脾臓単細胞懸濁液を調製する。これを
適当なマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進剤を使用して
細胞融合させる。骨髄腫細胞は脾臓細胞を得た動物と同
種の動物のものを用いるのが好ましく、また、抗体を産
生しないものが好ましい。後記実施例においては８−ア
ザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４
（Shulman, M. et al. (1978) Nature276, 269-270）を
使用した。脾臓細胞と骨髄腫細胞の使用割合は細胞数比
で約２０：１〜約５：１とするのが好ましい。好ましい
融合促進剤としては例えば平均分子量が１０００〜４０
００のポリエチレングリコールを有利に使用することが
できるが、この分野で知られている融合促進剤を使用す
ることもできる。
摘出し、これから脾臓単細胞懸濁液を調製する。これを
適当なマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進剤を使用して
細胞融合させる。骨髄腫細胞は脾臓細胞を得た動物と同
種の動物のものを用いるのが好ましく、また、抗体を産
生しないものが好ましい。後記実施例においては８−ア
ザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４
（Shulman, M. et al. (1978) Nature276, 269-270）を
使用した。脾臓細胞と骨髄腫細胞の使用割合は細胞数比
で約２０：１〜約５：１とするのが好ましい。好ましい
融合促進剤としては例えば平均分子量が１０００〜４０
００のポリエチレングリコールを有利に使用することが
できるが、この分野で知られている融合促進剤を使用す
ることもできる。
【００１２】Ｄ．融合した細胞の選択：別の容器内で未
融合の脾臓細胞、未融合の骨髄腫細胞および融合した細
胞の混合物を、未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択培
地で未融合の細胞を死滅させるのに充分な時間培養す
る。培地は薬物抵抗性（例えば８−アザグアニン抵抗
性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しないもの、例えばＨ
ＡＴ培地が使用される。未融合の脾臓細胞は非腫瘍性細
胞なので、この選択培地中では未融合の脾臓細胞と未融
合の骨髄腫細胞は、ある時間後、死滅する。融合した細
胞は骨髄腫の親細胞の腫瘍性と脾臓細胞の性質とを併せ
もつため、選択培地中で生存する。
融合の脾臓細胞、未融合の骨髄腫細胞および融合した細
胞の混合物を、未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択培
地で未融合の細胞を死滅させるのに充分な時間培養す
る。培地は薬物抵抗性（例えば８−アザグアニン抵抗
性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しないもの、例えばＨ
ＡＴ培地が使用される。未融合の脾臓細胞は非腫瘍性細
胞なので、この選択培地中では未融合の脾臓細胞と未融
合の骨髄腫細胞は、ある時間後、死滅する。融合した細
胞は骨髄腫の親細胞の腫瘍性と脾臓細胞の性質とを併せ
もつため、選択培地中で生存する。
【００１３】Ｅ．ハイブリドーマの産生する抗体の確認
（スクリーニング）：上記の操作によってハイブリドー
マが検出された後、その培養上清を採取し、ヒト胃ムチ
ンに対する抗体についてスクリーニングする。このスク
リーニングは例えば、ＥＬＩＳＡ法により好適に行なう
ことができる。さらに、表層型粘液細胞およびその分泌
粘液を特異的に認識する抗体についてスクリーニングす
る。このスクリーニングは例えば、ヒト胃粘膜固定標本
切片の免疫組織染色法により好適に行なうことができ
る。
（スクリーニング）：上記の操作によってハイブリドー
マが検出された後、その培養上清を採取し、ヒト胃ムチ
ンに対する抗体についてスクリーニングする。このスク
リーニングは例えば、ＥＬＩＳＡ法により好適に行なう
ことができる。さらに、表層型粘液細胞およびその分泌
粘液を特異的に認識する抗体についてスクリーニングす
る。このスクリーニングは例えば、ヒト胃粘膜固定標本
切片の免疫組織染色法により好適に行なうことができ
る。
【００１４】Ｆ．目的の抗体を産生するハイブリドーマ
のクローン化と抗体の産生：目的の抗体を産生するハイ
ブリドーマを適当な方法、例えば、限界希釈法でクロー
ン化した後、所望の抗体を得るには２つの方法を用いる
ことができる。第１の方法はハイブリドーマを一定時
間、適当な培地で培養する方法であり、その培養上清か
らハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体を得る
ことができる。第２の方法は、ハイブリドーマを同質遺
伝子、または半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に接種す
る方法である。一定時間後、接種されたマウスの血液中
および腹水中より、ハイブリドーマの産生する所望のモ
ノクローナル抗体を得ることができる。
のクローン化と抗体の産生：目的の抗体を産生するハイ
ブリドーマを適当な方法、例えば、限界希釈法でクロー
ン化した後、所望の抗体を得るには２つの方法を用いる
ことができる。第１の方法はハイブリドーマを一定時
間、適当な培地で培養する方法であり、その培養上清か
らハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体を得る
ことができる。第２の方法は、ハイブリドーマを同質遺
伝子、または半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に接種す
る方法である。一定時間後、接種されたマウスの血液中
および腹水中より、ハイブリドーマの産生する所望のモ
ノクローナル抗体を得ることができる。
【００１５】Ｇ．モノクローナル抗体の標識および標識
モノクローナル抗体の利用：上記の方法により精製した
モノクローナル抗体は、広く用いられている生化学的手
法によりペルオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、ビオチンなどを用いて、標識することができる。標
識法としては、例えば、酵素の過ヨウ素酸酸化生成物を
抗体と結合させる方法、グルタルアルデヒドを架橋剤に
用いて酵素と抗体とを結合させる方法などが用いられ
る。このようにして得られた標識モノクローナル抗体は
免疫組織染色法、あるいは、ＥＬＩＳＡ法におけるサン
ドイッチアッセイ法に好適に使用できる。ＥＬＩＳＡ法
については、例えば、一次抗体として本発明に係るモノ
クローナル抗体をＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに吸着
させ、さらに、ウエルの未吸着部位に反応に関与しない
物質（例えばスキムミルク）を吸着させた後、同ウエル
に試料溶液を添加し、洗浄した後、適当な濃度の標識モ
ノクローナル抗体溶液を添加、洗浄し、次に酵素の基質
溶液を添加することにより、試料中のムチンの定量分析
を行うことが可能である。以下、本発明を実施例によっ
てさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に
限定されるものではない。
モノクローナル抗体の利用：上記の方法により精製した
モノクローナル抗体は、広く用いられている生化学的手
法によりペルオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、ビオチンなどを用いて、標識することができる。標
識法としては、例えば、酵素の過ヨウ素酸酸化生成物を
抗体と結合させる方法、グルタルアルデヒドを架橋剤に
用いて酵素と抗体とを結合させる方法などが用いられ
る。このようにして得られた標識モノクローナル抗体は
免疫組織染色法、あるいは、ＥＬＩＳＡ法におけるサン
ドイッチアッセイ法に好適に使用できる。ＥＬＩＳＡ法
については、例えば、一次抗体として本発明に係るモノ
クローナル抗体をＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに吸着
させ、さらに、ウエルの未吸着部位に反応に関与しない
物質（例えばスキムミルク）を吸着させた後、同ウエル
に試料溶液を添加し、洗浄した後、適当な濃度の標識モ
ノクローナル抗体溶液を添加、洗浄し、次に酵素の基質
溶液を添加することにより、試料中のムチンの定量分析
を行うことが可能である。以下、本発明を実施例によっ
てさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に
限定されるものではない。
【００１６】
【実施例】実施例１ （１）ムチン抗原の調製 北里大学東病院で胃癌と診断された女性患者（２１才：
血液型Ａ型）の切除胃（癌部の肉眼的分類：Borrmann
ＩＩ型）から非癌部粘膜を分取した。胃粘膜層を擦過剥
離した後、Triton Ｘ−１００を２％含有させた５０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で抽出した。抽出
物をBio-Gel Ａ１．５ｍ(Bio-Rad社製）カラムを用いた
ゲル濾過にかけ、カラムの排除限界容量付近に溶出した
画分を分取し、さらに、セシウムクロライド密度勾配遠
心を行ない、比重１．４±０．４ｇ／ｍｌの糖タンパク
質画分（ムチン画分）をフラクションコレクターによっ
て採取した。
血液型Ａ型）の切除胃（癌部の肉眼的分類：Borrmann
ＩＩ型）から非癌部粘膜を分取した。胃粘膜層を擦過剥
離した後、Triton Ｘ−１００を２％含有させた５０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で抽出した。抽出
物をBio-Gel Ａ１．５ｍ(Bio-Rad社製）カラムを用いた
ゲル濾過にかけ、カラムの排除限界容量付近に溶出した
画分を分取し、さらに、セシウムクロライド密度勾配遠
心を行ない、比重１．４±０．４ｇ／ｍｌの糖タンパク
質画分（ムチン画分）をフラクションコレクターによっ
て採取した。
【００１７】（２）免疫マウス脾臓細胞の調製 ４週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに対し、フロイント完全
アジュバンド５０μｌ(Difco社製）および上述の方法で
得られたムチン抗原１００μｇ／匹を腹腔内投与し、免
疫した。以後、３週間おきにフロイント不完全アジュバ
ンド５０μｌ(Difco社製）および初回免疫したものと同
じムチン抗原１００μｇ／匹を腹腔内投与し、２回以降
の免疫とした。２回目の免疫以後、免疫の３〜４日後に
眼底静脈より採血し、血清中の抗ムチン抗体を、以下の
ＥＬＩＳＡ法にて確認した。
アジュバンド５０μｌ(Difco社製）および上述の方法で
得られたムチン抗原１００μｇ／匹を腹腔内投与し、免
疫した。以後、３週間おきにフロイント不完全アジュバ
ンド５０μｌ(Difco社製）および初回免疫したものと同
じムチン抗原１００μｇ／匹を腹腔内投与し、２回以降
の免疫とした。２回目の免疫以後、免疫の３〜４日後に
眼底静脈より採血し、血清中の抗ムチン抗体を、以下の
ＥＬＩＳＡ法にて確認した。
【００１８】ＥＬＩＳＡ法：ムチン抗原を、０．０５Ｍ
炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．
６）に、２μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した後、
同じ緩衝液を用いて倍数希釈系列を作製した。これらの
希釈液をＥＬＩＳＡ用マイクロプレート(Corning社製）
の各ウエルに１００μｌずつ分注し、４℃で一夜放置し
た。各ウエルをＴｗｅｅｎ２０を０．０５％含有させた
ＰＢＳ(PBS-Tween)で３回洗浄した後、各ウエルにスキ
ムミルクを２％含有させたＰＢＳを満たし、１時間放置
した。PBS-Tweenで３回洗浄した後、次に試料としてマ
ウス血清の１０００倍希釈液を各ウエルあたり１００μ
ｌ分注し、１時間反応させた。PBS-Tweenで３回洗浄し
た後、次に、二次抗体としてペルオキシダーゼで標識し
たヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体(Tago社製)をＰＢ
Ｓで１００００倍に希釈した溶液を各ウエルに１００μ
ｌ加え、１時間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗
浄した後、次に、ＡＢＴＳ−Ｈ2Ｏ2 ペルオキシダーゼ
基質液（Kirkegaard & PerryLaboratories社製）を各ウ
エルに１００μｌ添加し、室温で３０分間反応させた
後、マイクロプレートリーダーで４１５ｎｍの吸光度を
測定した。ムチンの用量に依存して発色性を示すマウス
血清を抗体陽性と判定した。ムチン抗原に対する抗体の
確認されたマウスより脾臓を摘出した後、脾臓単細胞懸
濁液を調製し、細胞融合に用いた。
炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．
６）に、２μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した後、
同じ緩衝液を用いて倍数希釈系列を作製した。これらの
希釈液をＥＬＩＳＡ用マイクロプレート(Corning社製）
の各ウエルに１００μｌずつ分注し、４℃で一夜放置し
た。各ウエルをＴｗｅｅｎ２０を０．０５％含有させた
ＰＢＳ(PBS-Tween)で３回洗浄した後、各ウエルにスキ
ムミルクを２％含有させたＰＢＳを満たし、１時間放置
した。PBS-Tweenで３回洗浄した後、次に試料としてマ
ウス血清の１０００倍希釈液を各ウエルあたり１００μ
ｌ分注し、１時間反応させた。PBS-Tweenで３回洗浄し
た後、次に、二次抗体としてペルオキシダーゼで標識し
たヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体(Tago社製)をＰＢ
Ｓで１００００倍に希釈した溶液を各ウエルに１００μ
ｌ加え、１時間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗
浄した後、次に、ＡＢＴＳ−Ｈ2Ｏ2 ペルオキシダーゼ
基質液（Kirkegaard & PerryLaboratories社製）を各ウ
エルに１００μｌ添加し、室温で３０分間反応させた
後、マイクロプレートリーダーで４１５ｎｍの吸光度を
測定した。ムチンの用量に依存して発色性を示すマウス
血清を抗体陽性と判定した。ムチン抗原に対する抗体の
確認されたマウスより脾臓を摘出した後、脾臓単細胞懸
濁液を調製し、細胞融合に用いた。
【００１９】（３）マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａ
ｇ１４を正常培地［ＲＰＭＩ１６４０（日水製薬社製）
（１０．２ｇ／ｌ）に、炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ
／ｌ）、Ｌ−グルタミン（０．３ｇ／ｌ）、ゲンタマイ
シン（４０ｍｇ／ｌ）および牛胎児血清（１０％ Ｖ／
Ｖ）を加えた培地］を用いて３７℃で、炭酸ガスインキ
ュベーター中で培養した。
ｇ１４を正常培地［ＲＰＭＩ１６４０（日水製薬社製）
（１０．２ｇ／ｌ）に、炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ
／ｌ）、Ｌ−グルタミン（０．３ｇ／ｌ）、ゲンタマイ
シン（４０ｍｇ／ｌ）および牛胎児血清（１０％ Ｖ／
Ｖ）を加えた培地］を用いて３７℃で、炭酸ガスインキ
ュベーター中で培養した。
【００２０】（４）細胞融合およびハイブリドーマの培
養 脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４と細
胞数比で１０：１の割合で混合し、緩やかに撹拌しなが
ら融合補助剤〔ポリエチレングリコール４０００（０．
５ｇ）、ジメチルスルホキシド（０．０５ｍｌ）、ＰＢ
Ｓ（０．５ｍｌ）〕を加えて融合させた。３７℃で９０
秒間インキュベートした後、培地［ＲＰＭＩ１６４０
（日水製薬社製）（１０．２ｇ／ｌ）に炭酸水素ナトリ
ウム（２．２ｇ／ｌ）、Ｌ−グルタミン（０．３ｇ／
ｌ）およびゲンタマイシン（４０ｍｇ／ｌ）を加えた培
地］を液の全量が４０ｍｌになるまでを徐々に加えた。
遠心分離（１１００ｒｐｍ／１０分）した後、上清を除
き、ＨＡＴ培地［ＲＰＭＩ１６４０（日水製薬社製）
（１０．２ｇ／ｌ）に炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／
ｌ）、Ｌ−グルタミン（０．３ｇ／ｌ）、ゲンタマイシ
ン（４０ｍｇ／ｌ）、牛胎児血清（２０％ Ｖ／Ｖ）、
ヒポキサンチン（１００μｍｏｌ／ｌ）、アミノプテリ
ン（０．４μｍｏｌ／ｌ）およびチミジン（１６μｍｏ
ｌ／ｌ）を加えた培地］を加え、緩やかに細胞を懸濁し
た。この懸濁液を９６穴培養プレートに分注し、５％の
炭酸ガスを含む培養器中で培養した。
養 脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４と細
胞数比で１０：１の割合で混合し、緩やかに撹拌しなが
ら融合補助剤〔ポリエチレングリコール４０００（０．
５ｇ）、ジメチルスルホキシド（０．０５ｍｌ）、ＰＢ
Ｓ（０．５ｍｌ）〕を加えて融合させた。３７℃で９０
秒間インキュベートした後、培地［ＲＰＭＩ１６４０
（日水製薬社製）（１０．２ｇ／ｌ）に炭酸水素ナトリ
ウム（２．２ｇ／ｌ）、Ｌ−グルタミン（０．３ｇ／
ｌ）およびゲンタマイシン（４０ｍｇ／ｌ）を加えた培
地］を液の全量が４０ｍｌになるまでを徐々に加えた。
遠心分離（１１００ｒｐｍ／１０分）した後、上清を除
き、ＨＡＴ培地［ＲＰＭＩ１６４０（日水製薬社製）
（１０．２ｇ／ｌ）に炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／
ｌ）、Ｌ−グルタミン（０．３ｇ／ｌ）、ゲンタマイシ
ン（４０ｍｇ／ｌ）、牛胎児血清（２０％ Ｖ／Ｖ）、
ヒポキサンチン（１００μｍｏｌ／ｌ）、アミノプテリ
ン（０．４μｍｏｌ／ｌ）およびチミジン（１６μｍｏ
ｌ／ｌ）を加えた培地］を加え、緩やかに細胞を懸濁し
た。この懸濁液を９６穴培養プレートに分注し、５％の
炭酸ガスを含む培養器中で培養した。
【００２１】（５）スクリーニングおよびクローニング 上記の９６穴培養プレートにおいて、コロニー状に生育
した融合細胞の認められたウエルから培養上清を一部採
取し、後述のＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングを行な
い、ムチン抗原と反応する抗体を産生する７種のハイブ
リドーマを選別した。７種のハイブリドーマが産生する
それぞれの抗体について、さらに後述の免疫組織染色法
によってスクリーニングを行ない、表層粘液細胞および
その分泌粘液と反応する抗体を産生する１種のハイブリ
ドーマを選択した。次に、このハイブリドーマをＨＴ培
地［ＲＰＭＩ１６４０（日水製薬社製）（１０．２ｇ／
ｌ）に炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／ｌ）、Ｌ−グル
タミン（０．３ｇ／ｌ）、ゲンタマイシン（４０ｍｇ／
ｌ）、牛胎児血清（１５％ Ｖ／Ｖ）、ヒポキサンチン
（１００μｍｏｌ／ｌ）およびチミジン（１６μｍｏｌ
／ｌ）を加えた培地］で１週間、次いで、正常培地［Ｒ
ＰＭＩ１６４０（日水製薬社製）（１０．２ｇ／ｌ）に
炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／ｌ）、Ｌ−グルタミン
（０．３ｇ／ｌ）、ゲンタマイシン（４０ｍｇ／ｌ）お
よび牛胎児血清（１０％ Ｖ／Ｖ）を加えた培地］で１
週間継代培養した後、限界希釈法によるクローニングを
２回繰り返し、３種のハイブリドーマを得た。これらの
ハイブリドーマを個々に４週間、正常培地を用いて継代
培養した後、各ハイブリドーマの培養上清液を後述のＥ
ＬＩＳＡ法で分析し、最も高い発色性を示す培養上清液
のハイブリドーマ、ＨＧＭ７５（工業技術院生命工学工
業技術研究所：受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１６７７９）
を選択した。
した融合細胞の認められたウエルから培養上清を一部採
取し、後述のＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングを行な
い、ムチン抗原と反応する抗体を産生する７種のハイブ
リドーマを選別した。７種のハイブリドーマが産生する
それぞれの抗体について、さらに後述の免疫組織染色法
によってスクリーニングを行ない、表層粘液細胞および
その分泌粘液と反応する抗体を産生する１種のハイブリ
ドーマを選択した。次に、このハイブリドーマをＨＴ培
地［ＲＰＭＩ１６４０（日水製薬社製）（１０．２ｇ／
ｌ）に炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／ｌ）、Ｌ−グル
タミン（０．３ｇ／ｌ）、ゲンタマイシン（４０ｍｇ／
ｌ）、牛胎児血清（１５％ Ｖ／Ｖ）、ヒポキサンチン
（１００μｍｏｌ／ｌ）およびチミジン（１６μｍｏｌ
／ｌ）を加えた培地］で１週間、次いで、正常培地［Ｒ
ＰＭＩ１６４０（日水製薬社製）（１０．２ｇ／ｌ）に
炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／ｌ）、Ｌ−グルタミン
（０．３ｇ／ｌ）、ゲンタマイシン（４０ｍｇ／ｌ）お
よび牛胎児血清（１０％ Ｖ／Ｖ）を加えた培地］で１
週間継代培養した後、限界希釈法によるクローニングを
２回繰り返し、３種のハイブリドーマを得た。これらの
ハイブリドーマを個々に４週間、正常培地を用いて継代
培養した後、各ハイブリドーマの培養上清液を後述のＥ
ＬＩＳＡ法で分析し、最も高い発色性を示す培養上清液
のハイブリドーマ、ＨＧＭ７５（工業技術院生命工学工
業技術研究所：受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１６７７９）
を選択した。
【００２２】ＥＬＩＳＡ法：ムチン抗原を、０．０５Ｍ
炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．
６）に、１μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した後、
ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（Corning社製）の各ウ
エルに１００μｌずつ分注し、４℃で一夜放置した。各
ウエルをTween２０を０．０５％含有させたＰＢＳ（PBS
-Tween）で３回洗浄した後、各ウエルにスキムミルクを
２％含有させたＰＢＳを満たし、１時間放置した。PBS-
Tweenで３回洗浄した後、次に試料としてハイブリドー
マの培養上清液を各ウエルあたり１００μｌ分注し、１
時間反応させた。PBS-Tweenで３回洗浄した後、次に、
二次抗体としてペルオキシダーゼで標識したヤギ抗マウ
スイムノグロブリン抗体（Tago社製）をＰＢＳで１００
００倍に希釈したものを各ウエルに１００μｌ加え、１
時間放置した。PBS-Tweenで３回洗浄した後、次に、Ａ
ＢＴＳ−Ｈ2Ｏ2 ペルオキシダーゼ基質液（Kirkegaard
& Perry Laboratories社製）を各ウエルに１００μｌ
添加し、室温で３０分間反応させた後、マイクロプレー
トリーダーで４１５ｎｍの吸光度を測定した。ハイブリ
ドーマの培養上清液の代りにミエローマ細胞の培養上清
液を加えた以外は同様に処理したウエルに対して強く発
色するウエルを選択し、発色したウエルに対応する試料
を陽性と判定した。
炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．
６）に、１μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した後、
ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（Corning社製）の各ウ
エルに１００μｌずつ分注し、４℃で一夜放置した。各
ウエルをTween２０を０．０５％含有させたＰＢＳ（PBS
-Tween）で３回洗浄した後、各ウエルにスキムミルクを
２％含有させたＰＢＳを満たし、１時間放置した。PBS-
Tweenで３回洗浄した後、次に試料としてハイブリドー
マの培養上清液を各ウエルあたり１００μｌ分注し、１
時間反応させた。PBS-Tweenで３回洗浄した後、次に、
二次抗体としてペルオキシダーゼで標識したヤギ抗マウ
スイムノグロブリン抗体（Tago社製）をＰＢＳで１００
００倍に希釈したものを各ウエルに１００μｌ加え、１
時間放置した。PBS-Tweenで３回洗浄した後、次に、Ａ
ＢＴＳ−Ｈ2Ｏ2 ペルオキシダーゼ基質液（Kirkegaard
& Perry Laboratories社製）を各ウエルに１００μｌ
添加し、室温で３０分間反応させた後、マイクロプレー
トリーダーで４１５ｎｍの吸光度を測定した。ハイブリ
ドーマの培養上清液の代りにミエローマ細胞の培養上清
液を加えた以外は同様に処理したウエルに対して強く発
色するウエルを選択し、発色したウエルに対応する試料
を陽性と判定した。
【００２３】免疫組織染色法：ヒト胃体部粘膜をホルマ
リンで固定した後、パラフィンで包埋し、ミクロトーム
で切片（厚さ４−μｍ）を作製し、スライドガラス上に
固定した。同スライドガラスをキシレンに浸して脱パラ
フィンした後、過酸化水素を０．３％含有させたメタノ
ールに３０分間浸し、次いで、ＰＢＳに３０分間浸して
洗浄した。次に、この洗浄後のスライドガラス上の切片
に１０％ウサギ正常血清（ニチレイ社製）を付着せし
め、１時間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。
次に、この洗浄後の切片に試料としてハイブリドーマの
培養上清液を付着せしめ、１時間インキュベートした
後、ＰＢＳで洗浄した。次に、この洗浄後の切片にビオ
チン標識したウサギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ
（Ｈ＋Ｌ）（ニチレイ社製）を付着せしめ、１時間イン
キュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。次に、この洗浄
後の切片にペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン
（ニチレイ社製）を付着せしめ、１時間インキュベート
した後、ＰＢＳで洗浄した。次に、この洗浄後の切片を
ジアミノベンジジン（同仁化学研究所社製）（０．０２
％）、過酸化水素水（０．００５％）を含有させた０．
０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）中に約４分間
浸し、発色させた。
リンで固定した後、パラフィンで包埋し、ミクロトーム
で切片（厚さ４−μｍ）を作製し、スライドガラス上に
固定した。同スライドガラスをキシレンに浸して脱パラ
フィンした後、過酸化水素を０．３％含有させたメタノ
ールに３０分間浸し、次いで、ＰＢＳに３０分間浸して
洗浄した。次に、この洗浄後のスライドガラス上の切片
に１０％ウサギ正常血清（ニチレイ社製）を付着せし
め、１時間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。
次に、この洗浄後の切片に試料としてハイブリドーマの
培養上清液を付着せしめ、１時間インキュベートした
後、ＰＢＳで洗浄した。次に、この洗浄後の切片にビオ
チン標識したウサギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ
（Ｈ＋Ｌ）（ニチレイ社製）を付着せしめ、１時間イン
キュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。次に、この洗浄
後の切片にペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン
（ニチレイ社製）を付着せしめ、１時間インキュベート
した後、ＰＢＳで洗浄した。次に、この洗浄後の切片を
ジアミノベンジジン（同仁化学研究所社製）（０．０２
％）、過酸化水素水（０．００５％）を含有させた０．
０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）中に約４分間
浸し、発色させた。
【００２４】（６）アイソタイプの確認 本発明に係るモノクローナル抗体のグロブリンクラスを
アイソタイピングキット（PharMingen社製）を用いたＥ
ＬＩＳＡ法で調べた。すなわち、monoclonal rat anti-
mouse IgG1、 monoclonal rat anti-mouse IgG2a、 monoc
lonal rat anti-mouse IgG2b、monoclonal rat anti-mou
se IgG3、 monoclonal rat anti-mouse IgM、monoclonal
rat anti-mouse IgA、 monoclonal rat anti-mouse IgL
（κ）およびmonoclonal rat anti-mouse IgL（λ）の
各試薬をcoating bufferを用いて５倍希釈した後、ＥＬ
ＩＳＡ用マイクロプレート（Corning社製）の各ウエル
にそれぞれ５０μｌずつ分注し、４℃で一夜放置した。
各ウエルをＴｗｅｅｎ２０を０．０５％含有させたＰＢ
Ｓ（PBS-Tween）で３回洗浄後、各ウエルにスキムミル
クを２％含有させたＰＢＳを満たし、１時間放置した。
PBS-Tweenで３回洗浄した後、次に、各ウエルにＨＧＭ
７５（寄託番号 ＰＥＲＭ Ｐ−１６７７９）を正常培
地［ＲＰＭＩ１６４０（日水製薬社製）（１０．２ｇ／
ｌ）に炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／ｌ）、Ｌ−グル
タミン（０．３ｇ／ｌ）、ゲンタマイシン（４０ｍｇ／
ｌ）および牛胎児血清（１０％ Ｖ／Ｖ）を加えた培
地］で３日間培養した後の培養上清液を５０μｌ分注
し、１時間反応させた。PBS-Tweenで３回洗浄した後、
次に、各ウエルにアルカリフォスファターゼで標識した
polyclonal rat anti-mouse Igs試薬を５０μｌ加え、
１時間放置した。PBS-Tweenで３回洗浄した後、次に、
各ウエルにｐＮＰＰ錠剤１個を基質溶解液５ｍｌに溶解
して調製した基質溶液を５０μｌ添加し、室温で３０分
間反応させた。プレートを肉眼で観察した結果、monocl
onal rat anti-mouse IgG1試薬とmonoclonal ratanti-m
ouse IgL（κ）試薬で前処理した両ウエルにだけ強い黄
色い発色が認められ、他のウエルは無色透明であった。
これらの結果から、本発明のモノクローナル抗体はＩｇ
Ｇ1抗体であり、軽鎖はκ鎖であることが確認された。
アイソタイピングキット（PharMingen社製）を用いたＥ
ＬＩＳＡ法で調べた。すなわち、monoclonal rat anti-
mouse IgG1、 monoclonal rat anti-mouse IgG2a、 monoc
lonal rat anti-mouse IgG2b、monoclonal rat anti-mou
se IgG3、 monoclonal rat anti-mouse IgM、monoclonal
rat anti-mouse IgA、 monoclonal rat anti-mouse IgL
（κ）およびmonoclonal rat anti-mouse IgL（λ）の
各試薬をcoating bufferを用いて５倍希釈した後、ＥＬ
ＩＳＡ用マイクロプレート（Corning社製）の各ウエル
にそれぞれ５０μｌずつ分注し、４℃で一夜放置した。
各ウエルをＴｗｅｅｎ２０を０．０５％含有させたＰＢ
Ｓ（PBS-Tween）で３回洗浄後、各ウエルにスキムミル
クを２％含有させたＰＢＳを満たし、１時間放置した。
PBS-Tweenで３回洗浄した後、次に、各ウエルにＨＧＭ
７５（寄託番号 ＰＥＲＭ Ｐ−１６７７９）を正常培
地［ＲＰＭＩ１６４０（日水製薬社製）（１０．２ｇ／
ｌ）に炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／ｌ）、Ｌ−グル
タミン（０．３ｇ／ｌ）、ゲンタマイシン（４０ｍｇ／
ｌ）および牛胎児血清（１０％ Ｖ／Ｖ）を加えた培
地］で３日間培養した後の培養上清液を５０μｌ分注
し、１時間反応させた。PBS-Tweenで３回洗浄した後、
次に、各ウエルにアルカリフォスファターゼで標識した
polyclonal rat anti-mouse Igs試薬を５０μｌ加え、
１時間放置した。PBS-Tweenで３回洗浄した後、次に、
各ウエルにｐＮＰＰ錠剤１個を基質溶解液５ｍｌに溶解
して調製した基質溶液を５０μｌ添加し、室温で３０分
間反応させた。プレートを肉眼で観察した結果、monocl
onal rat anti-mouse IgG1試薬とmonoclonal ratanti-m
ouse IgL（κ）試薬で前処理した両ウエルにだけ強い黄
色い発色が認められ、他のウエルは無色透明であった。
これらの結果から、本発明のモノクローナル抗体はＩｇ
Ｇ1抗体であり、軽鎖はκ鎖であることが確認された。
【００２５】実施例２ モノクローナル抗体の抗原特異性 （１）免疫組織染色法による抗原特異性の確認 実施例１で得たモノクローナル抗体のヒト正常臓器組織
に対する反応性を免疫組織染色法で検討した。ホルマリ
ンで固定後パラフィン包埋された組織標本をミクロトー
ムを用いて薄切、厚さ４−μｍの切片を作製し、スライ
ドガラス上に固定した。同スライドガラスをキシレンに
浸して脱パラフィンした後、過酸化水素を０．３％含有
させたメタノールに３０分間浸し、次いで、ＰＢＳに３
０分間浸して洗浄した。次に、この洗浄後のスライドガ
ラス上の切片に１０％ウサギ正常血清（ニチレイ社製）
を付着せしめ、１時間インキュベートした後、ＰＢＳで
洗浄した。次に、この洗浄後の切片にハイブリドーマＨ
ＧＭ７５（寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１６７７９）を正
常培地［ＲＰＭＩ１６４０（日水製薬社製）（１０．２
ｇ／ｌ）に炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／ｌ）、Ｌ−
グルタミン（０．３ｇ／ｌ）、ゲンタマイシン（４０ｍ
ｇ／ｌ）および牛胎児血清（１０％ Ｖ／Ｖ）を加えた
培地］で３日間培養して得た培養上清液を付着せしめ、
４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。
次に、この洗浄後の切片にビオチン標識したウサギ抗マ
ウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（ニチレイ社
製）を付着せしめ、１時間インキュベートした後、ＰＢ
Ｓで洗浄した。次に、この洗浄後の切片にペルオキシダ
ーゼ標識ストレプトアビジン（ニチレイ社製）を付着せ
しめ、１時間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し
た。次に、この洗浄後の切片をジアミノベンジジン（同
仁化学研究所社製）（０．０２％）、過酸化水素水
（０．００５％）を含有させた０．０５Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．６）中に約４分間浸し、発色させた。
結果は表−１に示すごとくであった。
に対する反応性を免疫組織染色法で検討した。ホルマリ
ンで固定後パラフィン包埋された組織標本をミクロトー
ムを用いて薄切、厚さ４−μｍの切片を作製し、スライ
ドガラス上に固定した。同スライドガラスをキシレンに
浸して脱パラフィンした後、過酸化水素を０．３％含有
させたメタノールに３０分間浸し、次いで、ＰＢＳに３
０分間浸して洗浄した。次に、この洗浄後のスライドガ
ラス上の切片に１０％ウサギ正常血清（ニチレイ社製）
を付着せしめ、１時間インキュベートした後、ＰＢＳで
洗浄した。次に、この洗浄後の切片にハイブリドーマＨ
ＧＭ７５（寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１６７７９）を正
常培地［ＲＰＭＩ１６４０（日水製薬社製）（１０．２
ｇ／ｌ）に炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／ｌ）、Ｌ−
グルタミン（０．３ｇ／ｌ）、ゲンタマイシン（４０ｍ
ｇ／ｌ）および牛胎児血清（１０％ Ｖ／Ｖ）を加えた
培地］で３日間培養して得た培養上清液を付着せしめ、
４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。
次に、この洗浄後の切片にビオチン標識したウサギ抗マ
ウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（ニチレイ社
製）を付着せしめ、１時間インキュベートした後、ＰＢ
Ｓで洗浄した。次に、この洗浄後の切片にペルオキシダ
ーゼ標識ストレプトアビジン（ニチレイ社製）を付着せ
しめ、１時間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し
た。次に、この洗浄後の切片をジアミノベンジジン（同
仁化学研究所社製）（０．０２％）、過酸化水素水
（０．００５％）を含有させた０．０５Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．６）中に約４分間浸し、発色させた。
結果は表−１に示すごとくであった。
【００２６】
【表１】 註：染色が認められるものを＋、染色が認められないも
のを−で表す。
のを−で表す。
【００２７】（２）ヒト以外の動物種の胃ムチンに対す
る反応性 実施例１で得たモノクローナル抗体のブタ、ウサギ、ラ
ットの各胃精製ムチンに対する反応性をＥＬＩＳＡ法で
検討した。ブタ胃は屠殺直後のブタから摘出された胃を
屠殺所から入手し、ウサギ胃は日本白色種のウサギか
ら、ラット胃はretired ＳＤラットからそれぞれ摘出
し、各胃粘膜から後述のムチン調製法によりムチンを精
製した。各精製ムチンおよび陽性コントロールとしてム
チン抗原（ヒト胃精製ムチン）を、０．０５Ｍ炭酸ナト
リウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に、
それぞれ１μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した後、
ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（Corning社製）の各ウ
エルに１００μｌずつ分注し、４℃で一夜放置した。各
ウエルをＴｗｅｅｎ２０を０．０５％含有させたＰＢＳ
（PBS-Tween）で３回洗浄した後、各ウエルにスキムミ
ルクを２％含有させたＰＢＳを満たし、１時間放置し
た。PBS-Tweenで３回洗浄した後、次にハイブリドーマ
ＨＧＭ７５（寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１６７７９）を
正常培地［ＲＰＭＩ１６４０（日水製薬社製）（１０．
２ｇ／ｌ）に炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／ｌ）、Ｌ
−グルタミン（０．３ｇ／ｌ）、ゲンタマイシン（４０
ｍｇ／ｌ）および牛胎児血清（１０％ Ｖ／Ｖ）を加え
た培地］で３日間培養して得た培養上清液を各ウエルあ
たり１００μｌ分注し、１時間反応させた。PBS-Tween
で３回洗浄した後、次に、二次抗体としてペルオキシダ
ーゼで標識したヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（Ta
go社製）をＰＢＳで１００００倍に希釈したものを各ウ
エルに１００μｌ加え、１時間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎで３回洗浄した後、次に、ＡＢＴＳ−Ｈ2Ｏ2 ペ
ルオキシダーゼ基質液（Kirkegaard & Perry Laborator
ies社製）を各ウエルに１００μｌ添加し、室温で３０
分間反応させた。プレートを肉眼で観察した結果、ヒト
胃ムチンで前処理したウエルは青色に呈色したが、ブ
タ、ウサギ、ラットの各胃ムチンで前処理したウエルで
はいずれも呈色反応が認められなかった。
る反応性 実施例１で得たモノクローナル抗体のブタ、ウサギ、ラ
ットの各胃精製ムチンに対する反応性をＥＬＩＳＡ法で
検討した。ブタ胃は屠殺直後のブタから摘出された胃を
屠殺所から入手し、ウサギ胃は日本白色種のウサギか
ら、ラット胃はretired ＳＤラットからそれぞれ摘出
し、各胃粘膜から後述のムチン調製法によりムチンを精
製した。各精製ムチンおよび陽性コントロールとしてム
チン抗原（ヒト胃精製ムチン）を、０．０５Ｍ炭酸ナト
リウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に、
それぞれ１μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した後、
ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（Corning社製）の各ウ
エルに１００μｌずつ分注し、４℃で一夜放置した。各
ウエルをＴｗｅｅｎ２０を０．０５％含有させたＰＢＳ
（PBS-Tween）で３回洗浄した後、各ウエルにスキムミ
ルクを２％含有させたＰＢＳを満たし、１時間放置し
た。PBS-Tweenで３回洗浄した後、次にハイブリドーマ
ＨＧＭ７５（寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１６７７９）を
正常培地［ＲＰＭＩ１６４０（日水製薬社製）（１０．
２ｇ／ｌ）に炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／ｌ）、Ｌ
−グルタミン（０．３ｇ／ｌ）、ゲンタマイシン（４０
ｍｇ／ｌ）および牛胎児血清（１０％ Ｖ／Ｖ）を加え
た培地］で３日間培養して得た培養上清液を各ウエルあ
たり１００μｌ分注し、１時間反応させた。PBS-Tween
で３回洗浄した後、次に、二次抗体としてペルオキシダ
ーゼで標識したヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（Ta
go社製）をＰＢＳで１００００倍に希釈したものを各ウ
エルに１００μｌ加え、１時間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎで３回洗浄した後、次に、ＡＢＴＳ−Ｈ2Ｏ2 ペ
ルオキシダーゼ基質液（Kirkegaard & Perry Laborator
ies社製）を各ウエルに１００μｌ添加し、室温で３０
分間反応させた。プレートを肉眼で観察した結果、ヒト
胃ムチンで前処理したウエルは青色に呈色したが、ブ
タ、ウサギ、ラットの各胃ムチンで前処理したウエルで
はいずれも呈色反応が認められなかった。
【００２８】ムチン調製法：胃を大弯切開後ＰＢＳ中で
軽く洗浄し、内容物を除去した。胃粘膜層を擦過剥離し
た後、Triton Ｘ−１００を２％含有させた５０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で抽出した。抽出物を
Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａ１．５ｍ（Bio-Rad社製）カラムを
用いたゲル濾過にかけ、カラムの排除限界容量付近に溶
出した画分を分取し、さらに、セシウムクロライド密度
勾配遠心を行ない、比重１．４±０．４ｇ／ｍｌの糖タ
ンパク質画分（ムチン画分）をフラクションコレクター
によって採取した。
軽く洗浄し、内容物を除去した。胃粘膜層を擦過剥離し
た後、Triton Ｘ−１００を２％含有させた５０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で抽出した。抽出物を
Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａ１．５ｍ（Bio-Rad社製）カラムを
用いたゲル濾過にかけ、カラムの排除限界容量付近に溶
出した画分を分取し、さらに、セシウムクロライド密度
勾配遠心を行ない、比重１．４±０．４ｇ／ｍｌの糖タ
ンパク質画分（ムチン画分）をフラクションコレクター
によって採取した。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 岡安 勲 神奈川県相模原市相模大野６−23−11− 507 (72)発明者 内山 宏美 神奈川県伊勢原市鈴川21番地 関東化学株 式会社伊勢原研究所内
Claims (2)
- 【請求項１】 ヒトの胃の表層型粘液細胞が産生するム
チンと特異的に反応するＩｇＧ1クラスモノクローナル
抗体。 - 【請求項２】 ヒトの胃の表層型粘液細胞が産生するム
チンと特異的に反応するＩｇＧ1クラスモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10134272A JPH11313669A (ja) | 1998-04-30 | 1998-04-30 | 抗ヒト胃ムチンモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10134272A JPH11313669A (ja) | 1998-04-30 | 1998-04-30 | 抗ヒト胃ムチンモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11313669A true JPH11313669A (ja) | 1999-11-16 |
Family
ID=15124415
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10134272A Pending JPH11313669A (ja) | 1998-04-30 | 1998-04-30 | 抗ヒト胃ムチンモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11313669A (ja) |
-
1998
- 1998-04-30 JP JP10134272A patent/JPH11313669A/ja active Pending
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