JPH06335396A - 抗粘液糖タンパク質モノクローナル抗体 - Google Patents
抗粘液糖タンパク質モノクローナル抗体Info
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- JPH06335396A JPH06335396A JP5159891A JP15989193A JPH06335396A JP H06335396 A JPH06335396 A JP H06335396A JP 5159891 A JP5159891 A JP 5159891A JP 15989193 A JP15989193 A JP 15989193A JP H06335396 A JPH06335396 A JP H06335396A
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- C07K—PEPTIDES
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 ヒトの胃腺上皮型粘液の測定に使用可能な新
規なモノクローナル抗体の提供。 【構成】 ヒトの胃の腺上皮型粘液細胞が産生する粘液
糖タンパク質と特異的に反応するＩｇＭクラスモノクロ
ーナル抗体および該モノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ。
規なモノクローナル抗体の提供。 【構成】 ヒトの胃の腺上皮型粘液細胞が産生する粘液
糖タンパク質と特異的に反応するＩｇＭクラスモノクロ
ーナル抗体および該モノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ。
Description
【０００１】
【技術分野】本発明は、ヒトの胃粘膜の腺上皮粘液細
胞、すなわち、噴門腺細胞、副細胞（粘液頸細胞）、幽
門腺細胞およびヒトの胃粘膜の腺上皮型粘液を産生する
粘液細胞、例えば、十二指腸のＢｒｕｎｎｅｒ腺、胃腺
上皮型化生細胞、胃腺上皮型腫瘍細胞の染色に有用なモ
ノクローナル抗体に関する。更に本発明は、上記の胃の
腺上皮型粘液細胞が分泌する粘液糖タンパク質の測定に
有用なモノクローナル抗体に関する。詳しくは、本発明
のモノクローナル抗体または本発明のモノクローナル抗
体の標識誘導体を用いて免疫組織染色を行うことによ
り、ヒトの胃の腺上皮型粘液細胞およびそれら細胞の分
泌粘液を特異的に染色することができ、また、ＥＬＩＳ
Ａ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒ
ｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を行なうことにより、ヒトの体
液、例えば、胃液、膵液、血液、喀痰中に含まれる胃の
腺上皮型粘液細胞由来の粘液糖タンパク質を質的、量的
に分析することができる。本発明のモノクローナル抗体
は癌の検診または診断に利用できる。
胞、すなわち、噴門腺細胞、副細胞（粘液頸細胞）、幽
門腺細胞およびヒトの胃粘膜の腺上皮型粘液を産生する
粘液細胞、例えば、十二指腸のＢｒｕｎｎｅｒ腺、胃腺
上皮型化生細胞、胃腺上皮型腫瘍細胞の染色に有用なモ
ノクローナル抗体に関する。更に本発明は、上記の胃の
腺上皮型粘液細胞が分泌する粘液糖タンパク質の測定に
有用なモノクローナル抗体に関する。詳しくは、本発明
のモノクローナル抗体または本発明のモノクローナル抗
体の標識誘導体を用いて免疫組織染色を行うことによ
り、ヒトの胃の腺上皮型粘液細胞およびそれら細胞の分
泌粘液を特異的に染色することができ、また、ＥＬＩＳ
Ａ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒ
ｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を行なうことにより、ヒトの体
液、例えば、胃液、膵液、血液、喀痰中に含まれる胃の
腺上皮型粘液細胞由来の粘液糖タンパク質を質的、量的
に分析することができる。本発明のモノクローナル抗体
は癌の検診または診断に利用できる。
【０００２】
【背景技術】胃を含む消化管粘膜の上皮に存在する粘液
産生細胞は粘液を合成、分泌することで消化管の機能維
持に寄与していると考えられる。とくに胃粘液は胃酸や
ペプシンなどの攻撃因子から胃の粘膜を保護するための
重要な防御因子の一つとして位置づけられている。
産生細胞は粘液を合成、分泌することで消化管の機能維
持に寄与していると考えられる。とくに胃粘液は胃酸や
ペプシンなどの攻撃因子から胃の粘膜を保護するための
重要な防御因子の一つとして位置づけられている。
【０００３】ヒトの胃の粘液産生は胃粘膜表層上皮に存
在する表層粘液細胞（被蓋上皮細胞）と胃腺の底部に存
在する腺上皮粘液細胞で行なわれているが、近年、これ
らの粘液細胞が産生する粘液を個々に識別する試みがな
されている。組織化学的には表層粘液細胞と腺上皮粘液
細胞それぞれの粘液に固有の糖成分に対して特異的な染
色法が開発され、両者を識別することが可能となってい
る。すなわち、表層粘液細胞はガラクトースオキシダー
ゼ・コールドチオニン・シッフ（ＧＯＣＴＳ）反応で特
異的に染色される粘液をもち、腺上皮粘液細胞にはコン
キャナバリンＡパラドキシカル染色法（Ｋａｔｓｕｙａ
ｍａ，Ｔ．ａｎｄ Ｓｐｉｃｅｒ，Ｓ．Ｓ．（１９７
８）Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２
６，２３３−２５０）によりＩＩＩ型に分類される粘液
（ＩＩＩ型粘液）が特異的に存在することが認められて
いる（Ｏｔａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｈｉｓｔ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．２３，２２−２８）。また、
胃粘膜表層上皮を覆っている粘液ゲル層はＧＯＣＴＳ反
応陽性粘液とＩＩＩ型粘液が交互に積み重なった層状構
造をとっていることが証明され、粘液ゲル層には表層粘
液細胞と腺上皮粘液細胞から産生された粘液が含まれて
いることが認められている（Ｏｔａ，Ｈ．ｅｔａｌ．
（１９９１）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．２３，
２２−２８）。
在する表層粘液細胞（被蓋上皮細胞）と胃腺の底部に存
在する腺上皮粘液細胞で行なわれているが、近年、これ
らの粘液細胞が産生する粘液を個々に識別する試みがな
されている。組織化学的には表層粘液細胞と腺上皮粘液
細胞それぞれの粘液に固有の糖成分に対して特異的な染
色法が開発され、両者を識別することが可能となってい
る。すなわち、表層粘液細胞はガラクトースオキシダー
ゼ・コールドチオニン・シッフ（ＧＯＣＴＳ）反応で特
異的に染色される粘液をもち、腺上皮粘液細胞にはコン
キャナバリンＡパラドキシカル染色法（Ｋａｔｓｕｙａ
ｍａ，Ｔ．ａｎｄ Ｓｐｉｃｅｒ，Ｓ．Ｓ．（１９７
８）Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２
６，２３３−２５０）によりＩＩＩ型に分類される粘液
（ＩＩＩ型粘液）が特異的に存在することが認められて
いる（Ｏｔａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｈｉｓｔ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．２３，２２−２８）。また、
胃粘膜表層上皮を覆っている粘液ゲル層はＧＯＣＴＳ反
応陽性粘液とＩＩＩ型粘液が交互に積み重なった層状構
造をとっていることが証明され、粘液ゲル層には表層粘
液細胞と腺上皮粘液細胞から産生された粘液が含まれて
いることが認められている（Ｏｔａ，Ｈ．ｅｔａｌ．
（１９９１）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．２３，
２２−２８）。
【０００４】一方、勝山らはＩＩＩ型粘液が正常組織で
は食道噴門腺から胃の噴門腺、副細胞、幽門腺、十二指
腸のＢｒｕｎｎｅｒ腺、Ｖａｔｅｒ乳頭部の粘液腺、膵
頭部膵管の粘液腺におよぶ消化管の限られた範囲の腺上
皮にだけしか見いだされないのに対して、胆嚢腺腫、胆
嚢癌、膵管癌等の腫瘍組織では高頻度に証明されること
を明らかにした（勝山ら（１９８９）病理と臨床７、１
２１７−１２２４）。また、Ｍａｔｓｕｚａｗａらは胃
粘膜に認められるような組織形態、すなわち、粘膜の表
層上皮にＧＯＣＴＳ反応に強陽性な粘液が存在し、深層
部にＩＩＩ型粘液が局在するといった形態は正常な膵管
組織では見られないが、化生や癌化した膵管組織の中に
このような胃粘膜型の形態を呈するものが多いことを見
いだし、化生と癌との関係について言及している（Ｍａ
ｔｓｕｚａｗａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ
ａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２３，９２５−９３３）。
これらの研究成果は、体液中に分泌された胃型の粘液、
特に胃の腺上皮型の粘液（胃腺上皮型粘液）を測定する
ことにより、癌疾患、もしくは、癌になる可能性につい
ての診断のためのデータの提供が可能となることを示し
ている。
は食道噴門腺から胃の噴門腺、副細胞、幽門腺、十二指
腸のＢｒｕｎｎｅｒ腺、Ｖａｔｅｒ乳頭部の粘液腺、膵
頭部膵管の粘液腺におよぶ消化管の限られた範囲の腺上
皮にだけしか見いだされないのに対して、胆嚢腺腫、胆
嚢癌、膵管癌等の腫瘍組織では高頻度に証明されること
を明らかにした（勝山ら（１９８９）病理と臨床７、１
２１７−１２２４）。また、Ｍａｔｓｕｚａｗａらは胃
粘膜に認められるような組織形態、すなわち、粘膜の表
層上皮にＧＯＣＴＳ反応に強陽性な粘液が存在し、深層
部にＩＩＩ型粘液が局在するといった形態は正常な膵管
組織では見られないが、化生や癌化した膵管組織の中に
このような胃粘膜型の形態を呈するものが多いことを見
いだし、化生と癌との関係について言及している（Ｍａ
ｔｓｕｚａｗａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ
ａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２３，９２５−９３３）。
これらの研究成果は、体液中に分泌された胃型の粘液、
特に胃の腺上皮型の粘液（胃腺上皮型粘液）を測定する
ことにより、癌疾患、もしくは、癌になる可能性につい
ての診断のためのデータの提供が可能となることを示し
ている。
【０００５】従来、ヒトの胃腺上皮型粘液を特異的に検
出するための方法としては前記のコンキャナバリンＡパ
ラドキシカル染色法以外には知られていない。しかし、
その検出法は、試料が固定標本に限られるため、分泌粘
液または可溶化した粘液の測定に対しては適用すること
ができず、また、染色の再現性を期待することができな
いという欠点があるため、これまで胃腺上皮型粘液を定
量的に測定することはできなかった。
出するための方法としては前記のコンキャナバリンＡパ
ラドキシカル染色法以外には知られていない。しかし、
その検出法は、試料が固定標本に限られるため、分泌粘
液または可溶化した粘液の測定に対しては適用すること
ができず、また、染色の再現性を期待することができな
いという欠点があるため、これまで胃腺上皮型粘液を定
量的に測定することはできなかった。
【０００６】
【発明の開示】本発明は、ヒトの胃腺上皮型粘液の測定
に使用可能な新規なモノクローナル抗体を提供するもの
である。すなわち、本発明は、胃の腺上皮粘液細胞およ
びその分泌粘液と強い親和性を有し、かつ、表層粘液細
胞およびその分泌粘液と交差性を有しない新規なモノク
ローナル抗体を提供するものである。
に使用可能な新規なモノクローナル抗体を提供するもの
である。すなわち、本発明は、胃の腺上皮粘液細胞およ
びその分泌粘液と強い親和性を有し、かつ、表層粘液細
胞およびその分泌粘液と交差性を有しない新規なモノク
ローナル抗体を提供するものである。
【０００７】本発明者らはヒトの胃腺上皮型粘液を認識
するモノクローナル抗体について鋭意研究を重ねた結
果、粘液の主要成分である粘液糖タンパク質（ムチン）
を免疫抗原に用いることにより、ヒトの胃の腺上皮型粘
液細胞およびその分泌粘液に対して高い特異性をもつ新
規なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマなら
びにそのモノクローナル抗体を得ることに成功した。
するモノクローナル抗体について鋭意研究を重ねた結
果、粘液の主要成分である粘液糖タンパク質（ムチン）
を免疫抗原に用いることにより、ヒトの胃の腺上皮型粘
液細胞およびその分泌粘液に対して高い特異性をもつ新
規なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマなら
びにそのモノクローナル抗体を得ることに成功した。
【０００８】本発明に係るモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマは以下に述べるとおり、ケラーとミル
シュタインの方法（Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉ
ｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５
６，４９５−４９７）によって得られる。すなわち、好
適な方法で調製された粘液糖タンパク質を用いて、マウ
スを免疫した後、このマウスの膵臓細胞をマウスミエロ
ーマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマから目的
とする抗体を産生し分泌するハイブリドーマを選別し、
単離することができる。以下に本発明に係る上記のハイ
ブリドーマならびにモノクローナル抗体の調製法および
同モノクローナル抗体の特性について詳述する。
るハイブリドーマは以下に述べるとおり、ケラーとミル
シュタインの方法（Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉ
ｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５
６，４９５−４９７）によって得られる。すなわち、好
適な方法で調製された粘液糖タンパク質を用いて、マウ
スを免疫した後、このマウスの膵臓細胞をマウスミエロ
ーマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマから目的
とする抗体を産生し分泌するハイブリドーマを選別し、
単離することができる。以下に本発明に係る上記のハイ
ブリドーマならびにモノクローナル抗体の調製法および
同モノクローナル抗体の特性について詳述する。
【０００９】Ａ．抗原の単離、精製：免疫抗原としては
ヒトあるいはヒト以外の哺乳動物の胃粘膜またはＢｒｕ
ｎｎｅｒ腺からの抽出物を用いることができる。好適に
はそれら抽出物から得られる粘液糖タンパク質を精製し
て用いる。例えば、ラットの胃粘膜から小原らの方法
（Ｏｈａｒａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃｏｍ
ｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８３Ｂ，２７３
−２７５）により抽出、精製した粘液糖タンパク質が用
いられる。後記の実施例では、ラット胃粘膜抽出物から
ゲルろ過によって分子量１５０００００以上の画分を
得、この画分からセシウムクロライド密度勾配遠心法に
よって糖タンパク質画分（粘液糖タンパク質含有画分）
を得た。このようにして得られた粘液糖タンパク質を免
疫抗原として使用した。
ヒトあるいはヒト以外の哺乳動物の胃粘膜またはＢｒｕ
ｎｎｅｒ腺からの抽出物を用いることができる。好適に
はそれら抽出物から得られる粘液糖タンパク質を精製し
て用いる。例えば、ラットの胃粘膜から小原らの方法
（Ｏｈａｒａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃｏｍ
ｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８３Ｂ，２７３
−２７５）により抽出、精製した粘液糖タンパク質が用
いられる。後記の実施例では、ラット胃粘膜抽出物から
ゲルろ過によって分子量１５０００００以上の画分を
得、この画分からセシウムクロライド密度勾配遠心法に
よって糖タンパク質画分（粘液糖タンパク質含有画分）
を得た。このようにして得られた粘液糖タンパク質を免
疫抗原として使用した。
【００１０】Ｂ．マウスの免疫：免疫動物として、好適
には４〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを用いることがで
きるが、他の系のマウスも使用することができる。免疫
スケジュールおよび抗原濃度は、十分な量の抗原刺激を
受けたリンパ球が形成されるよう選ばれる。例えば、マ
ウスの腹腔内に好適なアジュバンドと共に前記の粘液糖
タンパク質１００μｇ／匹を投与する。以後数日〜数週
間おきに、初回免疫に使用したものと同じ抗原を数回投
与する。２回目の免疫以後、眼底静脈より採血し、血液
中の抗体価について検討する。抗体価の測定はＥＬＩＳ
Ａ法により好適に行うことができる。
には４〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを用いることがで
きるが、他の系のマウスも使用することができる。免疫
スケジュールおよび抗原濃度は、十分な量の抗原刺激を
受けたリンパ球が形成されるよう選ばれる。例えば、マ
ウスの腹腔内に好適なアジュバンドと共に前記の粘液糖
タンパク質１００μｇ／匹を投与する。以後数日〜数週
間おきに、初回免疫に使用したものと同じ抗原を数回投
与する。２回目の免疫以後、眼底静脈より採血し、血液
中の抗体価について検討する。抗体価の測定はＥＬＩＳ
Ａ法により好適に行うことができる。
【００１１】Ｃ．細胞融合 免疫したマウスより脾臓を摘出し、これから脾臓単細胞
懸濁液を調製する。これを適当なマウス骨髄腫細胞と適
当な融合促進剤を使用して細胞融合させる。骨髄腫細胞
は脾臓細胞を得た動物と同種の動物のものを用いるのが
好ましく、また、抗体を産生しないものが好ましい。後
記実施例においては８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫
細胞Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ
ａｌ．（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７６，２６９−
２７０）が使用された。脾臓細胞と骨髄腫細胞の使用割
合は細胞数比で約２０：１〜約５：１とするのが好まし
い。好ましい融合促進剤としては例えば平均分子量が１
０００〜４０００のポリエチレングリコールを有利に使
用することができるが、この分野で知られている融合促
進剤を使用することができる。
懸濁液を調製する。これを適当なマウス骨髄腫細胞と適
当な融合促進剤を使用して細胞融合させる。骨髄腫細胞
は脾臓細胞を得た動物と同種の動物のものを用いるのが
好ましく、また、抗体を産生しないものが好ましい。後
記実施例においては８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫
細胞Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ
ａｌ．（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７６，２６９−
２７０）が使用された。脾臓細胞と骨髄腫細胞の使用割
合は細胞数比で約２０：１〜約５：１とするのが好まし
い。好ましい融合促進剤としては例えば平均分子量が１
０００〜４０００のポリエチレングリコールを有利に使
用することができるが、この分野で知られている融合促
進剤を使用することができる。
【００１２】Ｄ．融合した細胞の選択：別の容器内で前
記Ｃで得られた混合物すなわち、未融合の脾臓細胞、未
融合の骨髄腫細胞および融合した細胞の混合物を、未融
合の細胞を支持しない選択培地で適当な時間培養し、未
融合の細胞を死滅させる。培地は薬物抵抗性（例えば８
−アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持し
ないもの、例えば、ＨＡＴ培地が使用される。未融合の
脾臓細胞は非腫瘍性細胞なので、この選択培地中では未
融合の脾臓細胞と未融合の骨髄腫細胞は、ある時間後、
死滅する。融合した細胞は骨髄腫の親細胞の腫瘍性と脾
臓細胞の性質とを合わせ持つため、選択培地中で生存す
る。
記Ｃで得られた混合物すなわち、未融合の脾臓細胞、未
融合の骨髄腫細胞および融合した細胞の混合物を、未融
合の細胞を支持しない選択培地で適当な時間培養し、未
融合の細胞を死滅させる。培地は薬物抵抗性（例えば８
−アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持し
ないもの、例えば、ＨＡＴ培地が使用される。未融合の
脾臓細胞は非腫瘍性細胞なので、この選択培地中では未
融合の脾臓細胞と未融合の骨髄腫細胞は、ある時間後、
死滅する。融合した細胞は骨髄腫の親細胞の腫瘍性と脾
臓細胞の性質とを合わせ持つため、選択培地中で生存す
る。
【００１３】Ｅ．各容器中のハイブリドーマの産生する
抗体の確認（スクリーニング）：上記Ｄの培養により、
ハイブリドーマの産生が確認されたウエルの培養上清を
採取し、胃粘液糖タンパク質に対する免疫反応性の有無
を調べる。このスクリーニングは、例えば、ＥＬＩＳＡ
法により好適に行なうことができる。この免疫反応がプ
ラスのものについて、さらに、腺上皮粘液細胞およびそ
の分泌粘液を特異的に認識するか否かをスクリーニング
する。このスクリーニングは、例えば、胃粘膜固定標本
切片の免疫組織染色法により好適に行なうことができ
る。
抗体の確認（スクリーニング）：上記Ｄの培養により、
ハイブリドーマの産生が確認されたウエルの培養上清を
採取し、胃粘液糖タンパク質に対する免疫反応性の有無
を調べる。このスクリーニングは、例えば、ＥＬＩＳＡ
法により好適に行なうことができる。この免疫反応がプ
ラスのものについて、さらに、腺上皮粘液細胞およびそ
の分泌粘液を特異的に認識するか否かをスクリーニング
する。このスクリーニングは、例えば、胃粘膜固定標本
切片の免疫組織染色法により好適に行なうことができ
る。
【００１４】Ｆ．目的の抗体を産生するハイブリドーマ
のクローン化と抗体の産生：前項Ｅで得られた免疫反応
プラスの細胞懸濁液を適当な方法、例えば、限界希釈法
でクローン化した後、所望の抗体を得るには２つの方法
を用い得る。１つはハイブリドーマを一定時間、適当な
培地で培養する方法であり、その培養上清からハイブリ
ドーマの産生するモノクローナル抗体を得ることができ
る。第２の方法は、ハイブリドーマを同質遺伝子、また
は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に接種することであ
る。一定時間後、接種されたマウスの血液中および腹水
中より、ハイブリドーマの産生する所望のモノクローナ
ル抗体を得ることができる。
のクローン化と抗体の産生：前項Ｅで得られた免疫反応
プラスの細胞懸濁液を適当な方法、例えば、限界希釈法
でクローン化した後、所望の抗体を得るには２つの方法
を用い得る。１つはハイブリドーマを一定時間、適当な
培地で培養する方法であり、その培養上清からハイブリ
ドーマの産生するモノクローナル抗体を得ることができ
る。第２の方法は、ハイブリドーマを同質遺伝子、また
は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に接種することであ
る。一定時間後、接種されたマウスの血液中および腹水
中より、ハイブリドーマの産生する所望のモノクローナ
ル抗体を得ることができる。
【００１５】Ｇ．モノクローナル抗体の精製：本発明に
係るモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清、
あるいはマウスの血液中および腹水中より、広く用いら
れている生化学的精製法によって精製することができ
る。例えば、硫安塩析、イオン交換カラムクロマトグラ
フィー、分子ふるいカラムクロマトグラフィー、あるい
はアフィニティーカラムクロマトグラフィーなどから選
ばれる種々の精製法を組み合せることによって好適に行
なうことができる。
係るモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清、
あるいはマウスの血液中および腹水中より、広く用いら
れている生化学的精製法によって精製することができ
る。例えば、硫安塩析、イオン交換カラムクロマトグラ
フィー、分子ふるいカラムクロマトグラフィー、あるい
はアフィニティーカラムクロマトグラフィーなどから選
ばれる種々の精製法を組み合せることによって好適に行
なうことができる。
【００１６】Ｈ．モノクローナル抗体の標識および標識
モノクローナル抗体の利用：上記の方法により精製した
モノクローナル抗体は、広く用いられている生化学的手
法によりペルオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、ビオチンなどを用いて、標識することができる。標
識法としては、例えば、酵素の過ヨウ素酸酸化生成物を
抗体と結合させる方法、グルタルアルデヒドを架橋剤に
用いて酵素と抗体とを結合させる方法が用いられる。こ
のようにして得られた標識モノクローナル抗体は免疫組
織染色法、あるいは、ＥＬＩＳＡ法におけるサンドイッ
チアッセイ法に好適に使用できる。ＥＬＩＳＡ法につい
ては、例えば、一次抗体として本発明に係るモノクロー
ナル抗体をＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに吸着させ、
さらに、ウエルの未吸着部位に反応に関与しない物質
（例えばスキムミルク）を吸着させた後、同ウエルに試
料溶液を添加し、洗浄した後、適当な濃度の標識モノク
ローナル抗体溶液を添加、洗浄し、次に酵素の基質溶液
を添加することにより、試料中の粘液糖タンパク質の定
量分析を行うことが可能である。
モノクローナル抗体の利用：上記の方法により精製した
モノクローナル抗体は、広く用いられている生化学的手
法によりペルオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、ビオチンなどを用いて、標識することができる。標
識法としては、例えば、酵素の過ヨウ素酸酸化生成物を
抗体と結合させる方法、グルタルアルデヒドを架橋剤に
用いて酵素と抗体とを結合させる方法が用いられる。こ
のようにして得られた標識モノクローナル抗体は免疫組
織染色法、あるいは、ＥＬＩＳＡ法におけるサンドイッ
チアッセイ法に好適に使用できる。ＥＬＩＳＡ法につい
ては、例えば、一次抗体として本発明に係るモノクロー
ナル抗体をＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに吸着させ、
さらに、ウエルの未吸着部位に反応に関与しない物質
（例えばスキムミルク）を吸着させた後、同ウエルに試
料溶液を添加し、洗浄した後、適当な濃度の標識モノク
ローナル抗体溶液を添加、洗浄し、次に酵素の基質溶液
を添加することにより、試料中の粘液糖タンパク質の定
量分析を行うことが可能である。
【００１７】Ｉ．モノクローナル抗体と抗原との反応
性：本発明に係るモノクローナル抗体の抗原認識部位
は、このモノクローナル抗体について構造既知の化合物
に対する反応性を検討することにより調査することがで
きるが、本発明者らは交差反応性が認められたブタの胃
粘液糖タンパク質（Ｓｉｇｍａ社製）を常用の生化学的
方法によって分解処理し、分解生成物から抗原活性をも
つ成分を分離し、精製し、その成分を常用の物理化学的
方法により分析した。抗原活性の測定は阻止試験法をＥ
ＬＩＳＡ法に応用したＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩ
ＳＡ法により、好適に行なうことができる。
性：本発明に係るモノクローナル抗体の抗原認識部位
は、このモノクローナル抗体について構造既知の化合物
に対する反応性を検討することにより調査することがで
きるが、本発明者らは交差反応性が認められたブタの胃
粘液糖タンパク質（Ｓｉｇｍａ社製）を常用の生化学的
方法によって分解処理し、分解生成物から抗原活性をも
つ成分を分離し、精製し、その成分を常用の物理化学的
方法により分析した。抗原活性の測定は阻止試験法をＥ
ＬＩＳＡ法に応用したＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩ
ＳＡ法により、好適に行なうことができる。
【００１８】以下、本発明を実施例によって説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
【００１９】
実施例１ （１） 免疫用抗原の調製 ＳＤラットより摘出した胃から胃粘膜を擦過剥離した
後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を２％含有させた５０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で抽出した。抽出
物をＢｉｏ−Ｇｅｌ Ａ １．５ｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社
製）カラムを用いたゲル濾過にかけ、カラムの排除限界
容量付近に溶出した画分を分取し、さらに、セシウムク
ロライド密度勾配遠心を行ない、比重１．４±０．４ｇ
／ｍｌの糖タンパク質画分（粘液糖タンパク質画分）を
フラクションコレクターによって採取した。
後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を２％含有させた５０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で抽出した。抽出
物をＢｉｏ−Ｇｅｌ Ａ １．５ｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社
製）カラムを用いたゲル濾過にかけ、カラムの排除限界
容量付近に溶出した画分を分取し、さらに、セシウムク
ロライド密度勾配遠心を行ない、比重１．４±０．４ｇ
／ｍｌの糖タンパク質画分（粘液糖タンパク質画分）を
フラクションコレクターによって採取した。
【００２０】（２） 免疫マウス脾臓細胞の調製 ４週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに対し、フロイント完全
アジュバンド５０μｌ（Ｄｉｆｃｏ社製）および上述の
方法で得られた粘液糖タンパク質抗原１００μｇ／匹を
腹腔内投与し、免疫した。以後、３週間おきにフロイン
ト不完全アジュバンド５０μｌ（Ｄｉｆｃｏ社製）およ
び初回免疫したものと同じ粘液糖タンパク質抗原１００
μｇ／匹を腹腔内投与し、２回以降の免疫とした。２回
目の免疫以後、免疫の３〜４日後に眼底静脈より採血
し、血清中の抗粘液糖タンパク質抗体を、以下のＥＬＩ
ＳＡ法にて確認した。
アジュバンド５０μｌ（Ｄｉｆｃｏ社製）および上述の
方法で得られた粘液糖タンパク質抗原１００μｇ／匹を
腹腔内投与し、免疫した。以後、３週間おきにフロイン
ト不完全アジュバンド５０μｌ（Ｄｉｆｃｏ社製）およ
び初回免疫したものと同じ粘液糖タンパク質抗原１００
μｇ／匹を腹腔内投与し、２回以降の免疫とした。２回
目の免疫以後、免疫の３〜４日後に眼底静脈より採血
し、血清中の抗粘液糖タンパク質抗体を、以下のＥＬＩ
ＳＡ法にて確認した。
【００２１】ＥＬＩＳＡ法：精製粘液糖タンパク質抗原
を、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９．６）に、２μｇ／ｍｌの濃度になるよう
に溶解した後、同じ緩衝液を用いて倍数希釈系列を作製
した。これらの希釈液をＥＬＩＳＡ用マイクロプレート
（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウエルに１００μｌずつ分
注し、４℃で一夜放置した。各ウエルをＴｗｅｅｎ２０
を０．０５％含有させたＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）
で３回洗浄した後、各ウエルにスキムミルクを２％含有
させたＰＢＳを満たし、１時間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎで３回洗浄した後、次に試料としてマウス血清の
１０００倍希釈液を各ウエルあたり１００μｌ分注し、
１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した
後、次に、二次抗体としてペルオキシダーゼで標識した
ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｔａｇｏ社製）を
ＰＢＳで１００００倍に希釈した溶液を各ウエルに１０
０μｌ加え、１時間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３
回洗浄した後、次に、ＡＢＴＳ−Ｈ２Ｏ２ペルオキシダ
ーゼ基質液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を各ウエルに１００μ
ｌ添加し、室温で３０分間反応させた後、マイクロプレ
ートリーダーで４１５ｎｍの吸光度を測定した。粘液糖
タンパク質の用量に依存して発色性を示すマウス血清を
抗体陽性と判定した。
を、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９．６）に、２μｇ／ｍｌの濃度になるよう
に溶解した後、同じ緩衝液を用いて倍数希釈系列を作製
した。これらの希釈液をＥＬＩＳＡ用マイクロプレート
（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウエルに１００μｌずつ分
注し、４℃で一夜放置した。各ウエルをＴｗｅｅｎ２０
を０．０５％含有させたＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）
で３回洗浄した後、各ウエルにスキムミルクを２％含有
させたＰＢＳを満たし、１時間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎで３回洗浄した後、次に試料としてマウス血清の
１０００倍希釈液を各ウエルあたり１００μｌ分注し、
１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した
後、次に、二次抗体としてペルオキシダーゼで標識した
ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｔａｇｏ社製）を
ＰＢＳで１００００倍に希釈した溶液を各ウエルに１０
０μｌ加え、１時間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３
回洗浄した後、次に、ＡＢＴＳ−Ｈ２Ｏ２ペルオキシダ
ーゼ基質液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を各ウエルに１００μ
ｌ添加し、室温で３０分間反応させた後、マイクロプレ
ートリーダーで４１５ｎｍの吸光度を測定した。粘液糖
タンパク質の用量に依存して発色性を示すマウス血清を
抗体陽性と判定した。
【００２２】粘液糖タンパク質抗原に対する抗体の確認
されたマウスより脾臓を摘出した後、脾臓単細胞懸濁液
を調製し、細胞融合に用いた。
されたマウスより脾臓を摘出した後、脾臓単細胞懸濁液
を調製し、細胞融合に用いた。
【００２３】（３） マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞Ｓｐ２／Ｏ−Ａ
ｇ １４を正常培地〔ＲＰＭＩ １６４０（日水製薬社
製）（１０．２ｇ／リットル）に、炭酸水素ナトリウム
（２．２ｇ／リットル）、Ｌ−グルタミン（０．３ｇ／
リットル）、ゲンタマイシン（４０ｍｇ／リットル）お
よび牛胎児血清（１０％Ｖ／Ｖ）を加えた培地〕を用い
て３７℃で、炭酸ガスインキュベーター中で培養した。
ｇ １４を正常培地〔ＲＰＭＩ １６４０（日水製薬社
製）（１０．２ｇ／リットル）に、炭酸水素ナトリウム
（２．２ｇ／リットル）、Ｌ−グルタミン（０．３ｇ／
リットル）、ゲンタマイシン（４０ｍｇ／リットル）お
よび牛胎児血清（１０％Ｖ／Ｖ）を加えた培地〕を用い
て３７℃で、炭酸ガスインキュベーター中で培養した。
【００２４】（４） 細胞融合およびハイブリドーマの
培養 脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４と細
胞数比で１０：１の割合で混合し、緩やかに撹拌しなが
ら融合補助剤〔ポリエチレングリコール４０００（０．
５ｇ）、ジメチルスホキシド（０．０５ｍｌ）、ＰＢＳ
（０．５ｍｌ）〕を加えて融合させた。３７℃で９０秒
間インキュベートした後、培地〔ＲＰＭＩ １６４０
（日水製薬社製）（１０．２ｇ／リットル）に、炭酸水
素ナトリウム（２．２ｇ／リットル）、Ｌ−グルタミン
（０．３ｇ／リットル）およびゲンタマイシン（４０ｍ
ｇ／リットル）を加えた培地〕を液の全量が４０ｍｌに
なるまで徐々に加えた。遠心分離（１１００ｒｐｍ／１
０分）した後、上清を除き、ＨＡＴ培地〔ＲＰＭＩ １
６４０（日水製薬社製）（１０．２ｇ／リットル）に、
炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／リットル）、Ｌ−グル
タミン（０．３ｇ／リットル）、ゲンタマイシン（４０
ｍｇ／リットル）、牛胎児血清（２０％Ｖ／Ｖ）、ヒポ
キサンチン（１００μｍｏｌ／リットル）、アミノプテ
リン（０．４μｍｏｌ／リットル）およびチミジン（１
６μｍｏｌ／リットル）を加えた培地〕を加え、緩やか
に細胞を懸濁した。この懸濁液を９６穴培養プレートに
分注し、５％の炭酸ガスを含む培養器中で培養した。
培養 脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４と細
胞数比で１０：１の割合で混合し、緩やかに撹拌しなが
ら融合補助剤〔ポリエチレングリコール４０００（０．
５ｇ）、ジメチルスホキシド（０．０５ｍｌ）、ＰＢＳ
（０．５ｍｌ）〕を加えて融合させた。３７℃で９０秒
間インキュベートした後、培地〔ＲＰＭＩ １６４０
（日水製薬社製）（１０．２ｇ／リットル）に、炭酸水
素ナトリウム（２．２ｇ／リットル）、Ｌ−グルタミン
（０．３ｇ／リットル）およびゲンタマイシン（４０ｍ
ｇ／リットル）を加えた培地〕を液の全量が４０ｍｌに
なるまで徐々に加えた。遠心分離（１１００ｒｐｍ／１
０分）した後、上清を除き、ＨＡＴ培地〔ＲＰＭＩ １
６４０（日水製薬社製）（１０．２ｇ／リットル）に、
炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／リットル）、Ｌ−グル
タミン（０．３ｇ／リットル）、ゲンタマイシン（４０
ｍｇ／リットル）、牛胎児血清（２０％Ｖ／Ｖ）、ヒポ
キサンチン（１００μｍｏｌ／リットル）、アミノプテ
リン（０．４μｍｏｌ／リットル）およびチミジン（１
６μｍｏｌ／リットル）を加えた培地〕を加え、緩やか
に細胞を懸濁した。この懸濁液を９６穴培養プレートに
分注し、５％の炭酸ガスを含む培養器中で培養した。
【００２５】（５） スクリーニングおよびクローニン
グ 上記の９６穴培養プレートにおいて、コロニー状に生育
した融合細胞の認められたウエルから培養上清を一部採
取し、後述のＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングを行な
い、粘液糖タンパク質抗原と反応する抗体を産生するハ
イブリドーマ、ＨＩＫ−２２とＨＩＫ−１０８を選別し
た。ＨＩＫ−２２とＨＩＫ−１０８それぞれが産生する
抗体について、さらに、後述の免疫組織染色法によって
スクリーニングを行ない、腺上皮粘液細胞およびその分
泌粘液と反応する抗体を産生するハイブリドーマとして
ＨＩＫ−１０８を選択した。次に、ＨＩＫ−１０８をＨ
Ｔ培地〔ＲＰＭＩ １６４０（日水製薬社製）（１０．
２ｇ／リットル）に、炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／
リットル）、Ｌ−グルタミン（０．３ｇ／リットル）、
ゲンタマイシン（４０ｍｇ／リットル）、牛胎児血清
（１５％Ｖ／Ｖ）、ヒポキサンチン（１００μｍｏｌ／
リットル）およびチミジン（１６μｍｏｌ／リットル）
を加えた培地〕で１週間、次いで、正常培地〔ＲＰＭＩ
１６４０（日水製薬社製）（１０．２ｇ／リットル）
に、炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／リットル）、Ｌ−
グルタミン（０．３ｇ／リットル）、ゲンタマイシン
（４０ｍｇ／リットル）および牛胎児血清（１０％Ｖ／
Ｖ）を加えた培地〕で１週間継代培養した後、限界希釈
法によるクローニングを２回繰り返し、ＨＩＫ−１０８
１、ＨＩＫ−１０８２、ＨＩＫ−１０８３の３種のハイ
ブリドーマを得た。これらのハイブリドーマを個々に４
週間、正常培地を用いて継代培養した後、各ハイブリド
ーマの培養上清液を後述のＥＬＩＳＡ法で分析し、最も
高い発色性を示す培養上清液のハイブリドーマ、ＨＩＫ
−１０８３（工業技術院生命工学工業技術研究所：受託
番号Ｐ−１３６２２）を選択した。
グ 上記の９６穴培養プレートにおいて、コロニー状に生育
した融合細胞の認められたウエルから培養上清を一部採
取し、後述のＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングを行な
い、粘液糖タンパク質抗原と反応する抗体を産生するハ
イブリドーマ、ＨＩＫ−２２とＨＩＫ−１０８を選別し
た。ＨＩＫ−２２とＨＩＫ−１０８それぞれが産生する
抗体について、さらに、後述の免疫組織染色法によって
スクリーニングを行ない、腺上皮粘液細胞およびその分
泌粘液と反応する抗体を産生するハイブリドーマとして
ＨＩＫ−１０８を選択した。次に、ＨＩＫ−１０８をＨ
Ｔ培地〔ＲＰＭＩ １６４０（日水製薬社製）（１０．
２ｇ／リットル）に、炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／
リットル）、Ｌ−グルタミン（０．３ｇ／リットル）、
ゲンタマイシン（４０ｍｇ／リットル）、牛胎児血清
（１５％Ｖ／Ｖ）、ヒポキサンチン（１００μｍｏｌ／
リットル）およびチミジン（１６μｍｏｌ／リットル）
を加えた培地〕で１週間、次いで、正常培地〔ＲＰＭＩ
１６４０（日水製薬社製）（１０．２ｇ／リットル）
に、炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／リットル）、Ｌ−
グルタミン（０．３ｇ／リットル）、ゲンタマイシン
（４０ｍｇ／リットル）および牛胎児血清（１０％Ｖ／
Ｖ）を加えた培地〕で１週間継代培養した後、限界希釈
法によるクローニングを２回繰り返し、ＨＩＫ−１０８
１、ＨＩＫ−１０８２、ＨＩＫ−１０８３の３種のハイ
ブリドーマを得た。これらのハイブリドーマを個々に４
週間、正常培地を用いて継代培養した後、各ハイブリド
ーマの培養上清液を後述のＥＬＩＳＡ法で分析し、最も
高い発色性を示す培養上清液のハイブリドーマ、ＨＩＫ
−１０８３（工業技術院生命工学工業技術研究所：受託
番号Ｐ−１３６２２）を選択した。
【００２６】ＥＬＩＳＡ法：精製粘液糖タンパク質抗原
を、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９．６）に、１μｇ／ｍｌの濃度になるよう
に溶解した後、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（Ｃｏｒ
ｎｉｎｇ社製）の各ウエルに１００μｌずつ分注し、４
℃で一夜放置した。各ウエルをＴｗｅｅｎ２０を０．０
５％含有させたＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗
浄した後、各ウエルにスキムミルクを２％含有させたＰ
ＢＳを満たし、１時間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで
３回洗浄した後、次に試料としてハイブリドーマの培養
上清液を各ウエルあたり１００μｌ分注し、１時間反応
させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、次に、
二次抗体としてペルオキシダーゼで標識したヤギ抗マウ
スイムノグロブリン抗体（Ｔａｇｏ社製）をＰＢＳで１
００００倍に希釈したものを各ウエルに１００μｌ加
え、１時間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し
た後、次に、ＡＢＴＳ−Ｈ２Ｏ２ペルオキシダーゼ基質
液（Ｋｉｒｋｇａａｒｄ ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ社製）を各ウエルに１００μｌ添加し、室
温で３０分間反応させた後、マイクロプレートリーダー
で４１５ｎｍの吸光度を測定した。ハイブリドーマの培
養上清液の代りにミエローマ細胞の培養上清液を加えた
以外は同様に処理したウエルに対して強く発色するウエ
ルを選択し、発色したウエルに対応する試料を陽性と判
定した。
を、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９．６）に、１μｇ／ｍｌの濃度になるよう
に溶解した後、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（Ｃｏｒ
ｎｉｎｇ社製）の各ウエルに１００μｌずつ分注し、４
℃で一夜放置した。各ウエルをＴｗｅｅｎ２０を０．０
５％含有させたＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗
浄した後、各ウエルにスキムミルクを２％含有させたＰ
ＢＳを満たし、１時間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで
３回洗浄した後、次に試料としてハイブリドーマの培養
上清液を各ウエルあたり１００μｌ分注し、１時間反応
させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、次に、
二次抗体としてペルオキシダーゼで標識したヤギ抗マウ
スイムノグロブリン抗体（Ｔａｇｏ社製）をＰＢＳで１
００００倍に希釈したものを各ウエルに１００μｌ加
え、１時間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し
た後、次に、ＡＢＴＳ−Ｈ２Ｏ２ペルオキシダーゼ基質
液（Ｋｉｒｋｇａａｒｄ ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ社製）を各ウエルに１００μｌ添加し、室
温で３０分間反応させた後、マイクロプレートリーダー
で４１５ｎｍの吸光度を測定した。ハイブリドーマの培
養上清液の代りにミエローマ細胞の培養上清液を加えた
以外は同様に処理したウエルに対して強く発色するウエ
ルを選択し、発色したウエルに対応する試料を陽性と判
定した。
【００２７】免疫組織染色法：ヒト胃粘膜をホルマリン
で固定した後、パラフィンで包埋し、ミクロトームで切
片（厚さ４μｍ）を作製し、スライドガラス上に固定し
た。同スライドガラスをキシレンに浸して脱パラフィン
した後、過酸化水素を０．３％含有させたメタノールに
３０分間浸し、次いで、ＰＢＳに３０分間浸して洗浄し
た。次に、この洗浄後のスライドガラス上の切片に１０
％ウサギ正常血清（ニチレイ社製）を付着せしめ、１時
間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。次に、こ
の洗浄後の切片に試料としてハイブリドーマの培養上清
液を付着せしめ、１時間インキュベートした後、ＰＢＳ
で洗浄した。次に、この洗浄後の切片にビオチン標識し
たウサギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）
（ニチレイ社製）を付着せしめ、１時間インキュベート
した後、ＰＢＳで洗浄した。次に、この洗浄後の切片に
ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ニチレイ社
製）を付着せしめ、１時間インキュベートした後、ＰＢ
Ｓで洗浄した。次に、この洗浄後の切片をジアミノベン
ジジン（同仁化学研究所社製）（０．０２％）、過酸化
水素水（０．００５％）を含有させた０．０５Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）中に約４分間浸し、発色さ
せた。
で固定した後、パラフィンで包埋し、ミクロトームで切
片（厚さ４μｍ）を作製し、スライドガラス上に固定し
た。同スライドガラスをキシレンに浸して脱パラフィン
した後、過酸化水素を０．３％含有させたメタノールに
３０分間浸し、次いで、ＰＢＳに３０分間浸して洗浄し
た。次に、この洗浄後のスライドガラス上の切片に１０
％ウサギ正常血清（ニチレイ社製）を付着せしめ、１時
間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。次に、こ
の洗浄後の切片に試料としてハイブリドーマの培養上清
液を付着せしめ、１時間インキュベートした後、ＰＢＳ
で洗浄した。次に、この洗浄後の切片にビオチン標識し
たウサギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）
（ニチレイ社製）を付着せしめ、１時間インキュベート
した後、ＰＢＳで洗浄した。次に、この洗浄後の切片に
ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ニチレイ社
製）を付着せしめ、１時間インキュベートした後、ＰＢ
Ｓで洗浄した。次に、この洗浄後の切片をジアミノベン
ジジン（同仁化学研究所社製）（０．０２％）、過酸化
水素水（０．００５％）を含有させた０．０５Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）中に約４分間浸し、発色さ
せた。
【００２８】（６） アイソタイプの確認 本発明に係るモノクローナル抗体のグロブリンクラスを
アイソタイピングキット（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）
を用いたＥＬＩＳＡ法で調べた。すなわち、ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ Ｉｇ
Ｇ１、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏ
ｕｓｅ ＩｇＧ２ａ、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｒａｔ ａ
ｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂ、ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ ｒａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ３、ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ Ｉｇ
Ｍ、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕ
ｓｅＩｇＡ、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｒａｔ ａｎｔｉ
−ｍｏｕｓｅ ＩｇＬ（κ）およびｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＬ（λ）の各
試薬をｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを用いて５倍希釈
した後、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎ
ｇ社製）の各ウエルにそれぞれ５０μｌずつ分注し、４
℃で一夜放置した。各ウエルをＴｗｅｅｎ２０を０．０
５％含有させたＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗
浄後、各ウエルにスキムミルクを２％含有させたＰＢＳ
を満たし、１時間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回
洗浄した後、次に、各ウエルにＨＩＫ−１０８３（寄託
番号Ｐ−１３６２２）を正常培地〔ＲＰＭＩ １６４０
（日水製楽社製）（１０．２ｇ／リットル）に、炭酸水
素ナトリウム（２．２ｇ／リットル）、Ｌ−グルタミン
（０．３ｇ／リットル）、ゲンタマイシン（４０ｍｇ／
リットル）および牛胎児血清（１０％Ｖ／Ｖ）を加えた
培地〕で３日間培養した後の培養上清液を５０μｌ分注
し、１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄
した後、次に、各ウエルにアルカリフォスファターゼで
標識したｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍ
ｏｕｓｅＩｇｓ試薬を５０μｌ加え、１時間放置した。
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、次に、各ウエル
にｐＮＰＰ錠剤１個を基質溶解液５ｍｌに溶解して調製
した基質溶液を５０μｌ添加し、室温で３０分間反応さ
せた。プレートを肉眼で観察した結果、ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ試薬と
ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ
ＩｇＬ（κ）試薬で前処理した両ウエルにだけ強い黄
色い発色が認められ、他のウエルは無色透明であった。
これらの結果から、本発明のモノクローナル抗体はＩｇ
Ｍ抗体であり、軽鎖はκ鎖であることが確認された。
アイソタイピングキット（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）
を用いたＥＬＩＳＡ法で調べた。すなわち、ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ Ｉｇ
Ｇ１、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏ
ｕｓｅ ＩｇＧ２ａ、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｒａｔ ａ
ｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂ、ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ ｒａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ３、ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ Ｉｇ
Ｍ、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕ
ｓｅＩｇＡ、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｒａｔ ａｎｔｉ
−ｍｏｕｓｅ ＩｇＬ（κ）およびｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＬ（λ）の各
試薬をｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを用いて５倍希釈
した後、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎ
ｇ社製）の各ウエルにそれぞれ５０μｌずつ分注し、４
℃で一夜放置した。各ウエルをＴｗｅｅｎ２０を０．０
５％含有させたＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗
浄後、各ウエルにスキムミルクを２％含有させたＰＢＳ
を満たし、１時間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回
洗浄した後、次に、各ウエルにＨＩＫ−１０８３（寄託
番号Ｐ−１３６２２）を正常培地〔ＲＰＭＩ １６４０
（日水製楽社製）（１０．２ｇ／リットル）に、炭酸水
素ナトリウム（２．２ｇ／リットル）、Ｌ−グルタミン
（０．３ｇ／リットル）、ゲンタマイシン（４０ｍｇ／
リットル）および牛胎児血清（１０％Ｖ／Ｖ）を加えた
培地〕で３日間培養した後の培養上清液を５０μｌ分注
し、１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄
した後、次に、各ウエルにアルカリフォスファターゼで
標識したｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍ
ｏｕｓｅＩｇｓ試薬を５０μｌ加え、１時間放置した。
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、次に、各ウエル
にｐＮＰＰ錠剤１個を基質溶解液５ｍｌに溶解して調製
した基質溶液を５０μｌ添加し、室温で３０分間反応さ
せた。プレートを肉眼で観察した結果、ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ試薬と
ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ
ＩｇＬ（κ）試薬で前処理した両ウエルにだけ強い黄
色い発色が認められ、他のウエルは無色透明であった。
これらの結果から、本発明のモノクローナル抗体はＩｇ
Ｍ抗体であり、軽鎖はκ鎖であることが確認された。
【００２９】（７） モノクローナル抗体の調製 ２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン０．５
ｍｌ／匹を６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの腹腔内に投
与（プリスタン処理）し、１０〜１４日間飼育した。そ
の後、同マウスの腹腔内に上述のハイブリドーマ株、Ｈ
ＩＫ−１０８３（寄託番号Ｐ−１３６２２）を５×１０
６個細胞／匹、注入した。１０〜２１日後に貯留した腹
水を採取し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ／２０分／４
℃）後、上清液を分取した。得られた上清液に４０％飽
和硫安濃度となるように硫安を添加して塩析した後、遠
心分離（１２０００ｒｐｍ／２０分／４℃）し、沈殿物
を分取した。得られた沈殿物をＰＢＳで溶解し、４℃で
２日間ＰＢＳに対して透析した後、透析内液を次のアフ
ィニティーカラムに付した。ブタ胃粘液糖タンパク質
（Ｓｉｇｍａ社製）をＮａＣｌを０．５Ｍ含有させた
０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解させた後、同
緩衝液にて膨潤させたＣＮＢｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）
と混和し、カラムに充填した。カラムを同緩衝液で洗浄
後、同カラムに上記の透析内液の成分を吸着させた。カ
ラムに吸着した成分をＮａＣｌを０．５Ｍ含有させた
０．２Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）で溶出し
た後、溶出液に３Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
５）を加え、下記の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識反
応に用いた。
ｍｌ／匹を６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの腹腔内に投
与（プリスタン処理）し、１０〜１４日間飼育した。そ
の後、同マウスの腹腔内に上述のハイブリドーマ株、Ｈ
ＩＫ−１０８３（寄託番号Ｐ−１３６２２）を５×１０
６個細胞／匹、注入した。１０〜２１日後に貯留した腹
水を採取し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ／２０分／４
℃）後、上清液を分取した。得られた上清液に４０％飽
和硫安濃度となるように硫安を添加して塩析した後、遠
心分離（１２０００ｒｐｍ／２０分／４℃）し、沈殿物
を分取した。得られた沈殿物をＰＢＳで溶解し、４℃で
２日間ＰＢＳに対して透析した後、透析内液を次のアフ
ィニティーカラムに付した。ブタ胃粘液糖タンパク質
（Ｓｉｇｍａ社製）をＮａＣｌを０．５Ｍ含有させた
０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解させた後、同
緩衝液にて膨潤させたＣＮＢｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）
と混和し、カラムに充填した。カラムを同緩衝液で洗浄
後、同カラムに上記の透析内液の成分を吸着させた。カ
ラムに吸着した成分をＮａＣｌを０．５Ｍ含有させた
０．２Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）で溶出し
た後、溶出液に３Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
５）を加え、下記の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識反
応に用いた。
【００３０】（８） モノクローナル抗体の標識 西洋ワサビペルオキシダーゼ（天野製薬社製）を蒸留水
に溶解後、０．１Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を
添加し、１０分間反応させた。反応液にエチレングリコ
ールを添加した後、反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２
５カム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて脱塩し、過
ヨウ素酸処理ペルオキシダーゼ溶液を調製した。この過
ヨウ素酸処理したペルオキシダーゼ溶液とマウス腹水か
らアフィニティーカラムを用いて精製した上記モノクロ
ーナル抗体を混合し、室温で２時間反応させた後、０．
１Ｍ水素化ホウ素ナトリウム水溶液を添加して、さら
に、２時間反応させた。この反応液をＳｅｐｈａｃｒｙ
ｌ Ｓ−２００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）カラム
を用いて３５の画分に分画した後、各画分を下記のＥＬ
ＩＳＡ法で分析し、発色が認められた４画分を合一し、
凍結保存した。
に溶解後、０．１Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を
添加し、１０分間反応させた。反応液にエチレングリコ
ールを添加した後、反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２
５カム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて脱塩し、過
ヨウ素酸処理ペルオキシダーゼ溶液を調製した。この過
ヨウ素酸処理したペルオキシダーゼ溶液とマウス腹水か
らアフィニティーカラムを用いて精製した上記モノクロ
ーナル抗体を混合し、室温で２時間反応させた後、０．
１Ｍ水素化ホウ素ナトリウム水溶液を添加して、さら
に、２時間反応させた。この反応液をＳｅｐｈａｃｒｙ
ｌ Ｓ−２００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）カラム
を用いて３５の画分に分画した後、各画分を下記のＥＬ
ＩＳＡ法で分析し、発色が認められた４画分を合一し、
凍結保存した。
【００３１】ＥＬＩＳＡ法：精製粘液糖タンパク質抗原
を、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９．６）に、１μｇ／ｍｌの濃度になるよう
に溶解した後、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（Ｃｏｒ
ｎｉｎｇ社製）の各ウエルに１００μｌずつ分注し、４
℃で一夜放置した。各ウエルをＴｗｅｅｎ２０を０．０
５％含有させたＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗
浄した後、各ウエルにスキムミルクを２％含有させたＰ
ＢＳを満たし、１時間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎｒ
で３回洗浄した後、次に、試料としてカラム溶出液（各
画分）を各ウエルあたり１００μｌ分注し、１時間反応
させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、次に、
ＡＢＴＳ−Ｈ２Ｏ２ペルオキシダーゼ基質液（Ｋｉｒｋ
ｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ社製）を各ウエルに１００μｌ添加し、室温で３０
分間反応させた後、マイクロプレートリーダーで４１５
ｎｍの吸光度を測定した。
を、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９．６）に、１μｇ／ｍｌの濃度になるよう
に溶解した後、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（Ｃｏｒ
ｎｉｎｇ社製）の各ウエルに１００μｌずつ分注し、４
℃で一夜放置した。各ウエルをＴｗｅｅｎ２０を０．０
５％含有させたＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗
浄した後、各ウエルにスキムミルクを２％含有させたＰ
ＢＳを満たし、１時間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎｒ
で３回洗浄した後、次に、試料としてカラム溶出液（各
画分）を各ウエルあたり１００μｌ分注し、１時間反応
させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、次に、
ＡＢＴＳ−Ｈ２Ｏ２ペルオキシダーゼ基質液（Ｋｉｒｋ
ｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ社製）を各ウエルに１００μｌ添加し、室温で３０
分間反応させた後、マイクロプレートリーダーで４１５
ｎｍの吸光度を測定した。
【００３２】実施例２ モノクローナル抗体の抗原特異性 （１） 免疫組織染色法による抗原特異性の確認 実施例１で得たモノクローナル抗体のヒト胃粘膜に対す
る反応性を免疫組織染色法で検討した。すなわち、ヒト
の胃および十二指腸の粘膜をホルマリンで固定した後、
パラフィンで包埋し、ミクロトームで切片（厚さ４μ
ｍ）を作製し、スライドガラス上に固定した。同スライ
ドガラスをキシレンに浸して脱パラフィンした後、過酸
化水素を０．３％含有させたメタノールに３０分間浸
し、次いでＰＢＳに３０分間浸して洗浄した。次に、こ
の洗浄後のスライドガラス上の切片に１０％ウサギ正常
血清（ニチレイ社製）を付着せしめ、１時間インキュベ
ートした後、ＰＢＳで洗浄した。次に、この洗浄後の切
片にハイブリドーマＨＩＫ−１０８３（寄託番号Ｐ−１
３６２２）を正常培地〔ＲＰＭＩ １６４０（日水製薬
社製）（１０．２ｇ／リットル）に、炭酸水素ナトリウ
ム（２．２ｇ／リットル）、Ｌ−グルタミン（０．３ｇ
／リットル）、ゲンタマイシン（４０ｍｇ／リットル）
および牛胎児血清（１０％Ｖ／Ｖ）を加えた培地〕で３
日間培養して得た培養上清液を付着せしめ、１時間イン
キュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。次に、この洗浄
後の切片にビオチン標識したウサギ抗マウスＩｇＧ＋Ｉ
ｇＡ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（ニチレイ社製）を付着せし
め、１時間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。
次に、この洗浄後の切片にペルオキシダーゼ標識ストレ
プトアビジン（ニチレイ社製）を付着せしめ、１時間イ
ンキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。次に、この洗
浄後の切片をジアミノベンジジン（同仁化学研究所社
製）（０．０２％）、過酸化水素水（０．００５％）を
含有させた０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
６）中に約４分間浸し、発色させた。結果は表−１に示
すごとくであった。
る反応性を免疫組織染色法で検討した。すなわち、ヒト
の胃および十二指腸の粘膜をホルマリンで固定した後、
パラフィンで包埋し、ミクロトームで切片（厚さ４μ
ｍ）を作製し、スライドガラス上に固定した。同スライ
ドガラスをキシレンに浸して脱パラフィンした後、過酸
化水素を０．３％含有させたメタノールに３０分間浸
し、次いでＰＢＳに３０分間浸して洗浄した。次に、こ
の洗浄後のスライドガラス上の切片に１０％ウサギ正常
血清（ニチレイ社製）を付着せしめ、１時間インキュベ
ートした後、ＰＢＳで洗浄した。次に、この洗浄後の切
片にハイブリドーマＨＩＫ−１０８３（寄託番号Ｐ−１
３６２２）を正常培地〔ＲＰＭＩ １６４０（日水製薬
社製）（１０．２ｇ／リットル）に、炭酸水素ナトリウ
ム（２．２ｇ／リットル）、Ｌ−グルタミン（０．３ｇ
／リットル）、ゲンタマイシン（４０ｍｇ／リットル）
および牛胎児血清（１０％Ｖ／Ｖ）を加えた培地〕で３
日間培養して得た培養上清液を付着せしめ、１時間イン
キュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。次に、この洗浄
後の切片にビオチン標識したウサギ抗マウスＩｇＧ＋Ｉ
ｇＡ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（ニチレイ社製）を付着せし
め、１時間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。
次に、この洗浄後の切片にペルオキシダーゼ標識ストレ
プトアビジン（ニチレイ社製）を付着せしめ、１時間イ
ンキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。次に、この洗
浄後の切片をジアミノベンジジン（同仁化学研究所社
製）（０．０２％）、過酸化水素水（０．００５％）を
含有させた０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
６）中に約４分間浸し、発色させた。結果は表−１に示
すごとくであった。
【００３３】
【表１】
【００３４】（２） 抗原活性成分の分析 実施例１で得たモノクローナル抗体が特異的に反応する
粘液糖タンパク質抗原の分析を行った。 （ａ） 粘液糖タンパク質分解物の調製 Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｄｏｎ Ｍ．（１９６８）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２４３，６１６−６２６に記載の方法に
準拠して、ブタ胃粘液糖タンパク質（Ｓｉｇｍａ社製）
を水素化ホウ素ナトリウム１Ｍを含む０．０５Ｍ水酸化
ナトリウム水溶液中で５０℃、２４時間加熱処理した。
粘液糖タンパク質抗原の分析を行った。 （ａ） 粘液糖タンパク質分解物の調製 Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｄｏｎ Ｍ．（１９６８）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２４３，６１６−６２６に記載の方法に
準拠して、ブタ胃粘液糖タンパク質（Ｓｉｇｍａ社製）
を水素化ホウ素ナトリウム１Ｍを含む０．０５Ｍ水酸化
ナトリウム水溶液中で５０℃、２４時間加熱処理した。
【００３５】（ｂ） 上記分解物の分離、精製 上記（ａ）で得られた反応液を室温まで冷却後、０．１
Ｎ酢酸で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０Ｓ
（東ソー社製）カラムに付し、０．５Ｎ酢酸で溶出、溶
出液を４０の画分に分画した。得られた各画分の抗原活
性を後述のＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ法で検
討した後、抗原活性を有し、かつ、カラムから最も遅れ
て溶出した画分を選定した。選定した画分を、さらに、
ＴＳＫｇｅｌ ＮＨ２−６０カラム（東ソー社製）を用
いたＨＰＬＣにて７０の画分に分画し、各画分の抗原活
性を後述のＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ法で検
討した。得られた７０画分の中から強い抗原活性を有す
る３画分を選択し、これら３画分を合一して、減圧乾固
した。
Ｎ酢酸で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５０Ｓ
（東ソー社製）カラムに付し、０．５Ｎ酢酸で溶出、溶
出液を４０の画分に分画した。得られた各画分の抗原活
性を後述のＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ法で検
討した後、抗原活性を有し、かつ、カラムから最も遅れ
て溶出した画分を選定した。選定した画分を、さらに、
ＴＳＫｇｅｌ ＮＨ２−６０カラム（東ソー社製）を用
いたＨＰＬＣにて７０の画分に分画し、各画分の抗原活
性を後述のＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ法で検
討した。得られた７０画分の中から強い抗原活性を有す
る３画分を選択し、これら３画分を合一して、減圧乾固
した。
【００３６】Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ法：
精製粘液糖タンパク質抗原を、０．０５Ｍ炭酸ナトリウ
ム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に、２μ
ｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した後、ＥＬＩＳＡ用
マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウエルに
１００μｌずつ分注し、４℃で一夜放置した。各ウエル
をＴｗｅｅｎ２０を０．０５％含有させたＰＢＳ（ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した後、各ウエルにスキム
ミルクを２％含有させたＰＢＳを満たし、１時間放置し
た。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、洗浄した各
ウエルに、別の容器内で試料として上述の粘液糖タンパ
ク質抗原分解物のカラム溶出液５０μｌ、ハイブリドー
マＨＩＫ−１０８３（寄託番号Ｐ−１３６２２）を正常
培地〔ＲＰＭＩ １６４０（日水製薬社製）（１０．２
ｇ／リットル）に、炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／リ
ットル）、Ｌ−グルタミン（０．３ｇ／リットル）、ゲ
ンタマイシン（４０ｍｇ／リットル）および牛胎児血清
（１０％Ｖ／Ｖ）を加えた培地〕で３日間培養して得た
培養上清液２５μｌおよびＰＢＳの４倍濃縮液２５μｌ
を混合後２時間放置したものを添加し、１時間反応し
た。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、次に、二次
抗体としてペルオキシダーゼで標識したヤギ抗マウスイ
ムノグロブリン抗体（Ｔａｇｏ社製）をＰＢＳで１００
０倍に希釈したものを各ウエルに１００μｌ加え、１時
間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、次
に、ＡＢＴＳ−Ｈ２Ｏ２ペルオキシダーゼ基質液（Ｋｉ
ｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ社製）を各ウエルに１００μｌ添加し、室温で
３０分間反応させた後、マイクロプレートリーダーで４
１５ｎｍの吸光度を測定した。試料の代わりに蒸留水を
加えて上記操作を行なったウエルの反応液の吸光度に対
して、より低値を示す試料について抗原活性を有する試
料と判定した。
精製粘液糖タンパク質抗原を、０．０５Ｍ炭酸ナトリウ
ム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に、２μ
ｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した後、ＥＬＩＳＡ用
マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウエルに
１００μｌずつ分注し、４℃で一夜放置した。各ウエル
をＴｗｅｅｎ２０を０．０５％含有させたＰＢＳ（ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した後、各ウエルにスキム
ミルクを２％含有させたＰＢＳを満たし、１時間放置し
た。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、洗浄した各
ウエルに、別の容器内で試料として上述の粘液糖タンパ
ク質抗原分解物のカラム溶出液５０μｌ、ハイブリドー
マＨＩＫ−１０８３（寄託番号Ｐ−１３６２２）を正常
培地〔ＲＰＭＩ １６４０（日水製薬社製）（１０．２
ｇ／リットル）に、炭酸水素ナトリウム（２．２ｇ／リ
ットル）、Ｌ−グルタミン（０．３ｇ／リットル）、ゲ
ンタマイシン（４０ｍｇ／リットル）および牛胎児血清
（１０％Ｖ／Ｖ）を加えた培地〕で３日間培養して得た
培養上清液２５μｌおよびＰＢＳの４倍濃縮液２５μｌ
を混合後２時間放置したものを添加し、１時間反応し
た。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、次に、二次
抗体としてペルオキシダーゼで標識したヤギ抗マウスイ
ムノグロブリン抗体（Ｔａｇｏ社製）をＰＢＳで１００
０倍に希釈したものを各ウエルに１００μｌ加え、１時
間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、次
に、ＡＢＴＳ−Ｈ２Ｏ２ペルオキシダーゼ基質液（Ｋｉ
ｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ社製）を各ウエルに１００μｌ添加し、室温で
３０分間反応させた後、マイクロプレートリーダーで４
１５ｎｍの吸光度を測定した。試料の代わりに蒸留水を
加えて上記操作を行なったウエルの反応液の吸光度に対
して、より低値を示す試料について抗原活性を有する試
料と判定した。
【００３７】（ｃ） 減圧乾固物の分析 上記（ｂ）で得られた減圧乾固物をＳｗｅｅｌｅｙらの
方法（Ｓｗｅｅｌｅｙ，Ｃ．Ｃ．（１９６３）Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２４９７−２５０７）に
従ってトリメチルシリル化した後、ガスクロマトグラフ
ィーにより分析した。すなわち、上記減圧乾固物をＨＣ
ｌを３％含有させたメタノール中で加熱処理した後、反
応液に炭酸銀を加えてｐＨを５とし、次いで、この反応
液に無水酢酸を加えて室温で一夜放置した。一夜放置後
の反応液を遠心分離（２０００ｒｐｍ／５分）し、上清
液を分取し、減圧乾固した。得られた濃縮残渣にＴｒｉ
−Ｓｉｌ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を加えて溶解、反応
後、その反応液の一部をＯＶ−１キャピラリーカラム
（ＧＬサイエンス社製）（長さ２．５ｍ、内径０．２５
ｍｍ）を備えたモデルＧＣ７Ａガスクロマトグラフ（島
津製作所社製）に導入し、ＦＩＤ（ｆｌａｍｅ−ｉｏｎ
ｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）で検出した。検出
されたピークは同一分析条件で測定した標準物質のクロ
マトグラムと比較することにより同定した。標準物質は
フコース、ガラクトース、グルコース、マンノース、Ｎ
−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン
を用い、Ｔｒｉ−Ｓｉｌ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社製）と反
応させることにより調製した。また、Ｎ−アセチルガラ
クトサミニトールはＮ−アセチルガラクトサミンを水素
化ホウ素ナトリウムを含有させた０．２Ｍホウ酸緩衝液
（ｐＨ９）中で還元処理した後、Ｔｒｉ−Ｓｉｌ試薬
（Ｐｉｅｒｃｅ社製）と反応させることにより調製し
た。その結果、上記の抗原活性画分の濃縮残渣からＮ−
アセチルガラクトサミニトール、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン、フコースおよびガラクトースが検出された。
方法（Ｓｗｅｅｌｅｙ，Ｃ．Ｃ．（１９６３）Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２４９７−２５０７）に
従ってトリメチルシリル化した後、ガスクロマトグラフ
ィーにより分析した。すなわち、上記減圧乾固物をＨＣ
ｌを３％含有させたメタノール中で加熱処理した後、反
応液に炭酸銀を加えてｐＨを５とし、次いで、この反応
液に無水酢酸を加えて室温で一夜放置した。一夜放置後
の反応液を遠心分離（２０００ｒｐｍ／５分）し、上清
液を分取し、減圧乾固した。得られた濃縮残渣にＴｒｉ
−Ｓｉｌ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を加えて溶解、反応
後、その反応液の一部をＯＶ−１キャピラリーカラム
（ＧＬサイエンス社製）（長さ２．５ｍ、内径０．２５
ｍｍ）を備えたモデルＧＣ７Ａガスクロマトグラフ（島
津製作所社製）に導入し、ＦＩＤ（ｆｌａｍｅ−ｉｏｎ
ｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）で検出した。検出
されたピークは同一分析条件で測定した標準物質のクロ
マトグラムと比較することにより同定した。標準物質は
フコース、ガラクトース、グルコース、マンノース、Ｎ
−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン
を用い、Ｔｒｉ−Ｓｉｌ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社製）と反
応させることにより調製した。また、Ｎ−アセチルガラ
クトサミニトールはＮ−アセチルガラクトサミンを水素
化ホウ素ナトリウムを含有させた０．２Ｍホウ酸緩衝液
（ｐＨ９）中で還元処理した後、Ｔｒｉ−Ｓｉｌ試薬
（Ｐｉｅｒｃｅ社製）と反応させることにより調製し
た。その結果、上記の抗原活性画分の濃縮残渣からＮ−
アセチルガラクトサミニトール、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン、フコースおよびガラクトースが検出された。
【００３８】実施例３ 糖との反応性 Ｍｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘ
ｙ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｓｉｇ
ｍａ社製）とＭｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−
２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉ
ｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）をそれぞれ１ｍｇ／ｍｌの濃度
になるように蒸留水を用いて溶解した後、蒸留水を用い
て倍数希釈系列を作製した。これらの水溶液と実施例１
で得たモノクローナル抗体との反応性を下記のＣｏｍｐ
ｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ法で検討した。その結果、
Ｍｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘ
ｙ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅは濃度依
存的に吸光度を低下させ、反応性が認められたが、Ｍｅ
ｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−
β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅで濃度依存的
な吸光度の変化は認められなかった。
ｙ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｓｉｇ
ｍａ社製）とＭｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−
２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉ
ｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）をそれぞれ１ｍｇ／ｍｌの濃度
になるように蒸留水を用いて溶解した後、蒸留水を用い
て倍数希釈系列を作製した。これらの水溶液と実施例１
で得たモノクローナル抗体との反応性を下記のＣｏｍｐ
ｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ法で検討した。その結果、
Ｍｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘ
ｙ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅは濃度依
存的に吸光度を低下させ、反応性が認められたが、Ｍｅ
ｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−
β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅで濃度依存的
な吸光度の変化は認められなかった。
【００３９】Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ法：
精製粘液糖タンパク質抗原を、０．０５Ｍ炭酸−ナトリ
ウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に、２
μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した後、ＥＬＩＳＡ
用マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウエル
に１００μｌずつ分注し、４℃で一夜放置した。各ウエ
ルをＴｗｅｅＢ２０を０．０５％含有させたＰＢＳ（Ｐ
ＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した後、各ウエルにスキ
ムミルクを２％含有させたＰＢＳを満たし、１時間放置
した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、洗浄した
各ウエルに、別の容器内で試料として上記の水溶液５０
μｌ、ハイブリドーマＨＩＫ−１０８３（寄託番号Ｐ−
１３６２２）を正常培地〔ＲＰＭＩ １６４０（日水製
薬社製）（１０．２ｇ／リットル）に、炭酸水素ナトリ
ウム（２．２ｇ／リットル）、Ｌ−グルタミン（０．３
ｇ／リットル）、ゲンタマイシン（４０ｍｇ／リット
ル）および牛胎児血清（１０％Ｖ／Ｖ）を加えた培地〕
で３日間培養して得た培養上清液２５μｌおよびＰＢＳ
の４倍濃縮液２５μｌを混合後２時間放置したものを添
加し、１時間反応した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄
した後、次に、二次抗体としてペルオキシダーゼで標識
したヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｔａｇｏ社
製）をＰＢＳで１００００倍に希釈したものを各ウエル
に１００μｌ加え、１時間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎで３回洗浄した後、次に、ＡＢＴＳ−Ｈ２Ｏ２ペルオ
キシダーゼ基質液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒ
ｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を各ウエルに１
００μｌ添加し、室温で３０分間反応させた後、マイク
ロプレートリーダーで４１５ｎｍの吸光度を測定した。
精製粘液糖タンパク質抗原を、０．０５Ｍ炭酸−ナトリ
ウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に、２
μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した後、ＥＬＩＳＡ
用マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウエル
に１００μｌずつ分注し、４℃で一夜放置した。各ウエ
ルをＴｗｅｅＢ２０を０．０５％含有させたＰＢＳ（Ｐ
ＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した後、各ウエルにスキ
ムミルクを２％含有させたＰＢＳを満たし、１時間放置
した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、洗浄した
各ウエルに、別の容器内で試料として上記の水溶液５０
μｌ、ハイブリドーマＨＩＫ−１０８３（寄託番号Ｐ−
１３６２２）を正常培地〔ＲＰＭＩ １６４０（日水製
薬社製）（１０．２ｇ／リットル）に、炭酸水素ナトリ
ウム（２．２ｇ／リットル）、Ｌ−グルタミン（０．３
ｇ／リットル）、ゲンタマイシン（４０ｍｇ／リット
ル）および牛胎児血清（１０％Ｖ／Ｖ）を加えた培地〕
で３日間培養して得た培養上清液２５μｌおよびＰＢＳ
の４倍濃縮液２５μｌを混合後２時間放置したものを添
加し、１時間反応した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄
した後、次に、二次抗体としてペルオキシダーゼで標識
したヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｔａｇｏ社
製）をＰＢＳで１００００倍に希釈したものを各ウエル
に１００μｌ加え、１時間放置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎで３回洗浄した後、次に、ＡＢＴＳ−Ｈ２Ｏ２ペルオ
キシダーゼ基質液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒ
ｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を各ウエルに１
００μｌ添加し、室温で３０分間反応させた後、マイク
ロプレートリーダーで４１５ｎｍの吸光度を測定した。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 田中 宏美 神奈川県伊勢原市鈴川21番地 関東化学株 式会社伊勢原工場内 (72)発明者 島内 四郎 神奈川県伊勢原市鈴川21番地 関東化学株 式会社伊勢原工場内
Claims (2)
- 【請求項１】 ヒトの胃の腺上皮型粘液細胞が産生する
粘液糖タンパク質と特異的に反応するＩｇＭクラスモノ
クローナル抗体。 - 【請求項２】 ヒトの胃の腺上皮型粘液細胞が産生する
粘液糖タンパク質と特異的に反応するＩｇＭクラスモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
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|---|---|---|---|
| JP15989193A JP3581160B2 (ja) | 1993-05-26 | 1993-05-26 | 抗粘液糖タンパク質モノクローナル抗体 |
| EP94916400A EP0654532B1 (en) | 1993-05-26 | 1994-05-26 | Antimucoglycoprotein monoclonal antibody |
| US08/373,220 US5576182A (en) | 1993-05-26 | 1994-05-26 | Anti-mucus glycoprotein monoclonal antibody |
| CA002141025A CA2141025C (en) | 1993-05-26 | 1994-05-26 | Anti-mucus glycoprotein monoclonal antibody |
| PCT/JP1994/000838 WO1994028158A1 (fr) | 1993-05-26 | 1994-05-26 | Anticorps monoclonal antimucoglycoproteine |
| DE69427850T DE69427850T2 (de) | 1993-05-26 | 1994-05-26 | Monoklonaler antikörper gegen mucoglykoprotein |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP15989193A JP3581160B2 (ja) | 1993-05-26 | 1993-05-26 | 抗粘液糖タンパク質モノクローナル抗体 |
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| JP3581160B2 JP3581160B2 (ja) | 2004-10-27 |
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| CN113899896A (zh) * | 2021-08-16 | 2022-01-07 | 南京理工大学 | 用于识别硒糖的微芯片和硒糖的定性分析方法及应用 |
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|---|---|---|---|---|
| US5183756A (en) * | 1988-08-19 | 1993-02-02 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Monoclonal antibody (D612) having selective reactivity for gastrointestinal caricinomas and method for employing the same |
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-
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- 1994-05-26 DE DE69427850T patent/DE69427850T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-26 US US08/373,220 patent/US5576182A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-26 EP EP94916400A patent/EP0654532B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-26 WO PCT/JP1994/000838 patent/WO1994028158A1/ja active IP Right Grant
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| DE69427850D1 (de) | 2001-09-06 |
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| WO1994028158A1 (fr) | 1994-12-08 |
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