WO1994027975A1 - 3-(mercaptoalkyl)- bzw. 3-(alkylthioalkyl)-pyrimidin-2,4 (1h, 3h)-dione - Google Patents

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WO1994027975A1
WO1994027975A1 PCT/CH1994/000089 CH9400089W WO9427975A1 WO 1994027975 A1 WO1994027975 A1 WO 1994027975A1 CH 9400089 W CH9400089 W CH 9400089W WO 9427975 A1 WO9427975 A1 WO 9427975A1
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WO
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compounds
phenyl
general formula
pyrimidine
dione
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PCT/CH1994/000089
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Siegfried Leistner
Karl DRÖSSLER
Kurt Stocker
Helmut Vieweg
Original Assignee
Pentapharm Ag
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46—Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/52—Two oxygen atoms
    • C07D239/54—Two oxygen atoms as doubly bound oxygen atoms or as unsubstituted hydroxy radicals
    • C07D239/545—Two oxygen atoms as doubly bound oxygen atoms or as unsubstituted hydroxy radicals with other hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/557—Two oxygen atoms as doubly bound oxygen atoms or as unsubstituted hydroxy radicals with other hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms, e.g. orotic acid

Definitions

  • the invention relates to 3- (mercaptoalkyl) - or 3- (alkylthioalkyl) pyrimidine-2,4 (1H, 3H) -diones of the general formula I,
  • R 2 COOH, CONH 2 , CN and HR 3 H, aryl or substituted aryl
  • the compounds of general formula I are notable for advantageous immunomodulating, preferably immunostimulating, and for increasing the phagocytic activity of granulocytes and macrophages, so that they can be used favorably in human and veterinary medicine for the treatment of diseases whose cause is caused by exogenous and / or or endogenous influences or factors of decreased immune status or reduced phagocytosis activity of granulocytes or macrophages.
  • Defects of the immune system in humans and (useful) animals can be congenital or "acquired" in the course of development by internal and / or external factors.
  • biological response modifiers have so far been tested for their immunomodulating effectiveness. These include various heterocyclic compounds, of which mainly inosine benzoate and levamisole hydrochloride were marketed as medicinal products. Other substances such as azimexone, dithiocarbum and erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) hypoxanthine (NPT 15 392) also have immunostimulating and / or immune restorative effects. However, these latter compounds have not yet been introduced as medicinal products.
  • Levamisole hydrochloride works e.g. predominantly immune restorative in immunosuppressed organisms. This drug mainly stimulates T cells. The influence on the humoral immune response is comparatively small. Activation of non-specific defense mechanisms is achieved by stimulating phagocytosis and the proliferation and bactericidal activity of macrophages. Inosine benzoate, on the other hand, primarily shows an immunostimulating effect, above all by increasing the humoral immune response. The proliferation and differentiation of T lymphocytes are increased, as is the macrophage function mediated by induction of lymphokines.
  • the few medicinal products used with the appropriate indication have disadvantages.
  • the optical isomer levamisole hydrochloride which can be represented by diastereomer separation of the racemic tetramisole hydrochloride, causes a bitter metallic taste in humans after oral administration and can lead to leukopenia, agranulocytosis, nausea and vomiting.
  • this drug is the dependency of
  • Inosine benzoate can lead to hyperuricaemia, vomiting and an increase in haematocrit.
  • the object of the invention is to find new chemical compounds which have immunostimulating or immunomodulating properties and / or which have an effect which increases the phagocytic performance of human granulocytes when they are administered intravenously, rectally or preferably orally to human or animal organisms. It is a further object of this invention to develop processes for the preparation of such compounds and also corresponding medicaments which have such substances as active constituents.
  • the task is solved according to the requirements.
  • the 3- (mercaptoalkyl) - or 3- (alkylthioalkyl) pyrimidine-2,4 (1H, 3H) -diones according to the invention have the general formula I.
  • R H aryl or substituted aryl
  • the compounds of the general formula I can advantageously be used as new chemical substances in human and veterinary medicine because of their immunomodulating effect and the phagocytic activity of human granulocytes.
  • these compounds of the general formula I can be present in the lactam form shown in the formula as well as in the tautomeric lactim form, and also as salts, in particular pharmaceutically acceptable alkali metal or ammonium salts.
  • R 3 and Alk have the meanings given above, with dilute mineral acids, such as hydrochloric acid and / or sulfuric acid, but preferably with mixtures of these dilute mineral acids with glacial acetic acid and / or formic acid under reflux to give the compounds of the general formula I or their tautomers, wherein R 1 corresponds to an H atom and
  • R 2 , R 3 and n have the above meanings.
  • Formula II or III with R 2 ' COOH, CONH or CN form the compounds of the general formula I or their tautomers under the aforementioned conditions, where R 2 each has the same meaning as R 2' - of the above-mentioned compounds of the general formula II or III has.
  • R 4 CH 2 COOH, CH (CH 3 ) COOH or CH 2 COOAlk or CH (CH 3 ) COOAlk;
  • Alk lower alkyl, C 1 to C 3 mean, in the presence of alkali metal hydroxides in aqueous or aqueous-alcoholic solution or in the presence of alkali metal oxides, preferably sodium ethylate, in a temperature range of 10-60 ° C., advantageously under an inert gas atmosphere.
  • the compounds of the general formula I or their tautomers can be converted into their alkali metal or ammonium salts in a manner known per se.
  • Another aspect of the present invention consists in pharmaceutical preparations for the treatment of immune diseases and such diseases, the cause of which is due to a reduced phagocytosis activity of granulocytes and macrophages in humans and animals, which one or more compounds of general formula I and / or their tautomers and / or containing their pharmaceutically acceptable alkali or ammonium salts and inert, pharmaceutically customary auxiliaries and / or carriers.
  • Human granulocytes were carried out in a concentration of 200 ⁇ g / ml once by that carried out in a known manner using lucigenin and opsonized zymosan
  • phagocytosis index a numerical expression of the average number of phagocytosed zymosan particles per granulocyte.
  • DNFB 2,4-dinitrofluorobenzene
  • DNFB lymphoecins are released by reaction with the T DTH -Ly of this area of the skin and thus a locally limited, easily evaluable inflammatory reaction. 7 d after the immunization with 1 percent. DNFB solution. the flanks of the test animals were depilated and by applying one drop (10 ⁇ l) of 0.5, 0.1, 0.05, 0.025 and 0.01 percent each. DNFB solution. tested. The still positive concentration is inversely proportional to the level of awareness. The test results are determined from the number and extent of the positive skin reactions. The stimulation index (SD is determined by comparison between test and control animals.
  • the compounds of the general formula I were administered orally using a pharyngeal tube. On the days +1 (one day after the immunization) to +6, the active ingredient was administered from 1x10 -5 mol / kg body mass in micronized form as an aqueous suspension, which as a rule contained up to four times the weight of the immunologically indifferent lactose was attached. The control animals received only an aqueous lactose solution.
  • guinea pigs After immunization with 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB), guinea pigs have also for the formation of TNB-specific antibodies, which mainly belong to the IgG1 subclass. 14 days after primary epicutaneous application of DNFB solution. blood was taken from the test animals by cardiac puncture. The serum antibody concentration was determined using a method described by Takatsy
  • TNP Antitrinitrophenyl
  • Percutaneous (ear) application of DNFB causes i.a. histological changes in the draining (auricular) lymph nodes.
  • TNP-specific cells are transformed into blasts, the number of which correlates with the intensity of a cell-mediated immune response and reaches the maximum on day 4.
  • Control 100 100 -
  • the values from Table 2 show that, with one exception, the compounds of general formula I investigated by way of example compared to the control, in which only sensitization with DNFB occurred, there was a significant increase in the number of pyroninophilic lymphoblasts.
  • the Test results show that the compounds of general formula I have a clear immunostimulating effect on the cell-mediated immune response.
  • a comparison of the test results with the highly significant immunostimulatory and immunostructively active MECH reveals that some compounds of the general formula I display a comparable activity in this test and others a greater activity.
  • Integr. Integral; Area under the chemiluminescence curve.
  • Control % Control; Hatred for the stimulation of the substances, given as the quotient of the integrals of the chemiluminescence curves or the
  • PI phagocytosis index
  • the reaction mixture can be used in powdered form to 25 ml 32 percent. Given hydrochloric acid. Then the reaction mixture is up to gently warmed to complete dissolution of the substance. After cooling, the solution prepared from 2.65 g of sodium nitrite and 15.0 ml of water is added dropwise to the mixture while cooling with ice and stirring, and stirring is continued for 30 minutes. The reaction mixture is then heated to 90 ° C. and kept at this temperature for 5 min. After cooling, the mixture is stirred into 500 ml of ice water, the precipitate formed is suction filtered after 2 h, washed with plenty of water and then air-dried. 1.85 g (yield: 65%) of the almost pure crude product are obtained. Colorless crystals.

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
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  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Abstract

Es wurden 3-(Mercaptoalkyl)- bzw. 3-(Alkylthioalkyl)-pyrimidin-2,4(1H, 3H)-dione gefunden, die eine immunstimulierende und/oder immunrestaurative Wirkung aufweisen und/oder zur Behandlung von Krankheiten geeignet sind, deren Ursache ein durch exogene und/oder endogene Faktoren verminderte Phagozytoseaktivität von Granulozyten bzw. Makrophagen ist.

Description

3-(Mercaptoalkyl)- bzw. 3-(AlkyIthioalkyl)-pyrimidin-2,4(1H,3H) -dione
Die Erfindung betrifft 3-(Mercaptoalkyl)- bzw. 3-(Alkylthioalkyl)-pyrimidin-2,4(1H,3H)-dione der allgemeinen Formel I,
Figure imgf000003_0001
worin bedeuten:
R1 H, CH2COOH, CH(CH3)COOH, CH2COOAlk oder CH(CH3)COOAlk
R2 COOH, CONH2, CN und H R3 H, Aryl oder substituiert Aryl
Alk Niederalkyl, C1 bis C3 und n 2 oder 3 einschließlich ihrer Tαutomere und pharmazeutisch unbedenkliche Alkali- bzw. Ammoniumsalze, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung in pharmazeutischen Zubereitungen.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I zeichnen sich durch vorteilhafte immunmodulierende, vorzugsweise immunstimulierende, sowie die Phagozytoseaktivität von Granulozyten und Makrophagen steigernde Wirksamkeit aus, so daß sie günstig in der Human- und Veterinärmedizin zur Behandlung von Krankheiten einsetzbar sind, deren Ursache ein durch exogene und/oder endogene Einflüsse bzw. Faktoren verursachter erniedrigter Immunstatus bzw. verminderte Phagozytoseaktivität von Granulozyten bzw. Makrophagen ist. Defekte des Immunsystems bei Mensch und (Nutz)Tier können angeboren sein oder im Laufe der Entwicklung durch innere und/oder äußere Faktoren "erworben" werden. So ist seit längerem bekannt, daß u.a. häufiger Streß, fortgeschrittenes Lebensalter, spezielle Arzneimittel, virale Infektionen und Mißbrauch von Alkohol den Immunstatus bei Mensch und ggf. Tier verringern und damit die Abwehrbereitschaft der angesprochenen Organismen gegenüber viralen und bakteriellen Infektionen schwächen. Auch Krebspatienten weisen eine verminderte Fähigkeit zur immunologischen Infektabwehr auf, die - unbeabsichtigt - durch (zumeist unverzichtbare) chemotherapeutische Maßnahmen und/oder durch Bestrahlung noch zusätzlich minimiert wird. Weiterhin kann auch die unspezifische Infektabwehr z.B. durch Umweltgifte und als Folge von Nebenwirkungen einiger Arzneimittel gehemmt sein, was sich u.a. in einer verminderten Aktivität von Makrophagen und Granulozyten zeigen kann.
Aus den dargelegten Gründen wird weltweit seit einer Reihe von Jahren nach Möglichkeiten zur Steigerung nicht optimal ablaufender Immunprozesse sowie zur raschen und möglichst vollständigen Wiederherstellung einer verminderten immunologischen Leistungsfähigkeit gesucht. Zahlreiche Substanzen unterschiedlicher Herkunft - zusammengefaßt unter der
Bezeichnung "biological response modifiers" - wurden bisher auf ihre immunmodulierende Wirksamkeit geprüft. Darunter befinden sich auch verschiedene heterocyclische Verbindungen, von denen vor allem Inosin-benzoat und Levamisolhydrochlorid als Arzneimittel in den Verkehr gebracht wurden. Andere Substanzen wie Azimexon, Dithiocarbum und Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)-hypoxanthin (NPT 15 392) weisen ebenfalls immunstimulierende und/oder immunrestaurative Wirkungen auf. Als Arzneimittel sind diese letztgenannten Verbindungen bisher jedoch nicht eingeführt.
Eine Standardisierung von bekannten und neuartigen Wirk Stoffen mit immunstimaulierender und/oder -restaurativer Wirkung ist derzeit nur schwer möglich. Das ergibt sich zum einen aus der Komplexizität des Immunsystems bei Mensch und Tier mit seinen vielfältigen Regulations- und Gegenregulationsmechanismen und hängt zum anderen auch mit fehlenden, international verbindlich vereinbarten Versuchsbedingungen bei Labortieren bzw. ebensolchen Bedingungen für klinische Untersuchungen am Menschen zusammen. Einer umfassenden Vergleichbarkeit immunstimulierend und/oder immunrestaurierend wirkender Verbindungen steht auch die unterschiedliche Beeinflussung der verschiedenen immunkompetenten
Zellen durch die jeweiligen (potentiellen) Wirkstoffe entgegen, woraus sich eine nicht gleichartige Einflußnahme auf spezifische und unspezifische Abwehrmechanismen ergibt.
Levamisol-hydrochlorid wirkt z.B. vorwiegend immunrestaurierend bei immunsupprimierten Organismen. Es werden von diesem Arzneimittel vorwiegend T-Zellen stimuliert. Der Einfluß auf die humorale Immunantwort ist vergleichsweise gering. Eine Aktivierung unspezifischer Abwehrmechanismen ist durch Stimulierung der Phagozytose sowie der Proliferation und Bakterizidie von Makrophagen gegeben. Inosinbenzoat zeigt dagegen vor allem eine immunstimulierende Wirkung vor allem durch Steigerung der humoralen Immunantwort. Die Proliferation und Differenzierung der T-Lymphozyten werden ebenso gesteigert wie die über eine Induktion von Lymphokinen vermittelte Makrophagenfunktion.
Trotz der erzielten Fortschritte auf dem Gebiet der Entwicklung von immunstimulierend und/oder immunrestaurativ wirkenden Substanzen weisen die wenigen bei entsprechender Indikation verwendeten Arzneimittel Nachteile auf. So ruft z.B. das durch Diastereomerentrennung des racemischen Tetramisolhydrochlorids darstellbare optische Isomer Levamisolhydrochlorid beim Menschen nach oraler Applikation einen bitter-metallischen Geschmack hervor und kann zu Leukopenie, Agranulozytose, Nausea und Erbrechen führen. Auch ist bei diesem Arzneimittel die Abhängigkeit der
Wirkung von Alter, Geschlecht und genetischen Faktoren zu beachten. Das in realtiv hohen Dosen zu applizierende
Inosin-benzoat kann zu Hyperurikämie, Erbrechen und Anstieg von Haematokrit führen. Als Nebenwirkung beim Azimexon werden Kopfschmerz, Erbrechen, Hb- und Erythrozyten-Abnahme registriert.
Als Gründe für die Nachteile der genannten Arzneimittel bzw. in klinischer Testung befindlichen Substanzen sind in der Art der bisher verwendeten Wirkstoffe zu suchen.
Aus den dargelegten Gründen resultiert daher ein Bedürfnis nach Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen, die sich aus einem defizitären Immunstatus bzw. verminderter Phagozytoseaktivität von Granulozyten bzw. Makrophagen ergibt.
Die Erfindung hat die Aufgabe, neue chemische Verbindungen aufzufinden, die immunstimulierende bzw. immunmodulierende Eigenschaften aufweisen und/oder eine die Phagozytoseleistung menschlicher Granulozyten verstärkende Wirkung hervorrufen, wenn sie menschlichen oder tierischen Organismen intravenös, rektal oder vorzugsweise peroral zugeführt werden. Es ist weiterhin die Aufgabe dieser Erfindung, Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen als auch entsprechender Arzneimittel zu entwickeln, die derartige Substanzen als wirksame Bestandteile aufweisen.
Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.
Die erfindungsgemäßen 3-(Mercaptoalkyl)- bzw. 3-(Alkylthioalkyl)-pyrimidin-2,4(1H,3H)-dione besitzen die allgemeine Formel I.
Figure imgf000006_0001
worin bedeuten:
R1 H, CH2COOH, CH(CH3)COOH' CH2COOAlk oder CH(CH3)COOAlk
R2 COOH, CONH2 , CN und H
3
R H, Aryl oder substituiert Aryl
Alk Niederalkyl (C1 bis C3) n 2 oder 3.
Unter den erfindungsgemäßen Verbindungen werden auch
pharmakologisch geeignete Alkali- und Ammoniumsalze sowie auch ihre Tautomeren verstanden.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I sind als neue chemische Substanzen vor allem aufgrund ihrer immunmodulierenden und die Phagozytoseaktivität menschlicher Granulozyten aktivierenden Wirkung vorteilhaft in der Human- und Veterinärmedizin einsetzbar.
Von den Verbindungen der allgemeinen Formel I sind als besondere Ausführungsform der Erfindung folgende Substanzen besonders hervorzuheben: - 3(2-Mercaptoethyl)-6-phenyl-pyrinidin-2,4(1H,3H)dion-5-carbonitril (R1 = H, R2 = CN, R3 = C6H5, n = 2); - 3(3-Mercaptoprop-1-yl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)-dion-5-carbonitril (R1 = H, R2 = CN, R3 = C6H5, n = 3);
3(3-Mercaptoprop-1-yl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)- dion-5-carbonsäureamid (R1 = H, R2 = CONH2, R3 = C6H5, n = 3);
3(3-Mercaptoprop-1-yl)pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5-carbonsäure (R1 = H, R2 = COOH, R3 = H, n = 3) 3[(2-Carboxymethylthio)ethyl]-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5-carbonitril (R1 = CH2COOH, R2 = CN,
R3 = C6H5, n = 2)
3[(3-Carboxymethylthio)prop-1-yl]-6-phenyl-pyrimidin- 2,4(1H,3H)dion-5-carbonsäureamid (R1 = CH2COOH, R2 = CONH2,
R3 = C6H5, n = 3)
Entsprechend vorliegender Erfindung können diese Verbindungen der allgemeinen Formel I in der formelmäßig ausgewiesenen Lactamform als auch in der tautomeren Lactimform vorliegen, ferner auch als Salze, insbesondere pharmazeutisch unbedenkliche Alkali- oder Ammoniumsalze.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I ist durch folgende Verfahrensweisen gekennzeichnet:
Erhitzen von 2,3-Dihydrothiazolo[3,2-a]pyrimidin-5-onen der allgemeinen Formel II bzw. von 3,4-Dihydro-2H-pyrimido- [2,3-b][1,3]thiazin-6-onen der allgemeinen Formel III,
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000008_0002
worin jeweils
R2' COOH, COOAlk, CONH, und CN bedeutet und
R3 und Alk die oben genannten Bedeutungen aufweisen, mit verdünnten Mineralsäuren, wie Salzsäure und/oder Schwefelsäure, vorzugsweise jedoch mit Mischungen dieser verdünnten Mineralsäuren mit Eisessig und/oder Ameisensäure unter Rückfluß unter Erhalt der Verbindungen der allgemeinen Formel I oder ihrer Tautomeren, worin R1 einem H-Atom entspricht und
R2, R3 und n die obigen Bedeutungen aufweisen. Bei dem rückfließenden Erhitzen der Verbindungen der allgemeinen Formel
II bzw. III mit R2' = COOAlk unter den vorgenannten Bedingungen bilden sich Verbindungen der allgemeinen Formel I oder ihrer Tautomeren mit R2 = COOH und R1 = H sowie n = 2 bzw.
3. Im Falle des Erhitzens der Verbindungen der allgemeinen
Formel II bzw. III mit R2' = COOH, CONH oder CN bilden sich unter den vorgenannten Bedingungen die Verbindungen der allgemeinen Formel I oder ihrer Tautomeren, wobei R2 jeweils die gleiche Bedeutung wie R2'-der oben genannten Verbindungen der allgemeinen Formel II bzw. III aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die
Verbindungen der allgemeinen Formel I oder ihre Tautomere mit R1 = CH2COOH, CHCCH3)COOH, CH2COOAlk oder CH(CH3)COOAlk in an sich bekannter Weise durch Umsetzung der Verbindungen der allgemeinen Formel I mit R1 = H mit den Halogencarbon-säuren bzw. den Halogencarbonsäurealkylestern
R4X der allgemeinen Formel IV, worin
R4 CH2COOH, CH(CH3)COOH bzw. CH2COOAlk oder CH(CH3)COOAlk;
X Cl oder Br und
Alk Niederalkyl, C1 bis C3, bedeuten, in Gegenwart von Alkalihydroxiden in wäßriger oder wäßrig-alkoholischer Lösung bzw. in Gegenwart von Alkalialkoxiden, vorzugsweise Natriumethylat, in einem Temperaturbereich von 10 - 60 ºC, vorteilhafterweise unter Schutzgasatmoshäre, gewonnen werden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die Verbindungen der allgemeinen Formel I oder ihre Tautomere in an sich bekannter Weise in ihre Alkali- oder Ammoniumsalze übergeführt werden. Ein weiterer Aspekt vorliegender Erfindung besteht in pharmazeutischen Zubereitungen zur Behandlung von Immunerkrankungen und solchen Krankheiten, deren Ursache auf eine verminderte Phagozytoseaktivität von Granulozyten und Makrophagen bei Mensch und Tier beruht, welche eine oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formel I und/oder deren Tautomere und/oder deren pharmazeutisch unbedenkliche Alkalioder Ammoniumsalze und inerte, pharmazeutisch übliche Hilfsund/oder Trägerstoffe enthalten.
Falch und Natvig (Acta Chem.Scand. 24, (1970) 1423) haben eine Verbindung, die unter die Definition der allgemeinen Formel I (R1 = R2 = H, R3 = C6H5, n = 2) fällt, beschrieben. Die genannten Autoren haben diese Verbindung hinsichtlich ihrer massenspektrometrischen Eigenschaften untersucht.
Angaben über eine biologische Aktivität dieser Substanz wurden nicht gemacht.
Untersuchungen zur pharmakologischen Aktivität
Wie vorstehend ausgeführt, besitzen die Verbindungen der allgemeinen Formel I wertvolle immunmodulierende und die
Phagozytoseaktiviät menschlicher Granulozyten aktivierende
Eigenschaften.
Im folgenden sind die Ergebnisse über
-immunregulatorische,
-immunstimulierende und
-phagozytoseaktivitätserhöhende
Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen aufgeführt.
Der Nachweis einer immunregulatorischen Wirksamkeit wurde nach peroraler Applikation (bevorzugte Dosierung: 1,0 × 10-5
Mol/Kg Körpermasse) am Meerschweinchen (Albino-Koloniezucht) und u.a. mittels folgender Techniken geführt:
- Perkutaner Test zum Nachweis einer Kontaktüberempfind- lichkeit vom verzögerten Typ (Effektor-T-Lymphozyten- Aktivität),
- Test nach Takatsy zum Nachweis TNP-spezifischer Serumantikörper (humorale Immunantwort),
- In-vivo-Lymphoblastentransformationstest (aurikulärer
Lymphknoten).
Der Nachweis der hochsignifikanten phagozytoseaktivierenden Wirkung der Verbindungen der allgemeinen Formel I an
menschlichen Granulozyten erfolgte in einer Konzentration von 200 μg/ml einmal durch den in bekannter Weise unter Verwendung von Lucigenin und opsoniertem Zymosan durchgeführten
- Chemilumineszenztestes unter Benutzung eines "Luminometers" und von N-Formyl-Met-Phe, Firma Sigma, als
Positivkontrolle sowie einer Negativkontrolle und durch
- Bestimmung des "Phagozytoseindex" als numerischer Ausdruck der durchschnittlichen Anzahl phagozytierter Zymosanpartikel pro Granulozyt.
1. Untersuchungen zur imaunregulatorischen Wirksamkeit
1.1. Perkutaner Test zum Nachweis einer Kontaktüberempfindlichkeit
Die epikutane Applikation von 2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFB) führt bei Meerschweinchen und Maus zur Entwicklung einer verzögerten Überempfindlichkeit, eines Immunstatus, der an die klonale Vermehrung spezifischer T-Lymphozyten (auch als TDTH-Ly = T-Lymphozyten mit besonderer Rolle bei der
Entwicklung einer "delayed-type hypersensitivity" bezeichnet) gebunden ist. Erfolgt nach einer Latenzzeit von mind. 5 d eine erneute DNFB-Applikation, kommt es zu einer Freisetzung von Lymphökinen durch Reaktion mit den TDTH-Ly dieses Hautareals und dadurch zu einer lokal begrenzten, gut auswertbaren Entzündungsreaktion. 7 d nach der Immunisierung mit 1proz. DNFB-Lsg. wurden die Flanken der Versuchstiere enthaart und durch Aufbringen von je einem Tropfen (10 ul ) 0,5, 0,1, 0,05, 0,025 und 0,01proz. DNFB-Lsg. getestet. Die noch positive Konzentration ist dem Grad der Sensibilierung umgekehrt proportional. Die Testergebnisse werden aus Anzahl und Umfang der positiven Hautreaktionen ermittelt. Der Stimulationsindex (SD wird durch Vergleich zwischen Test- und Kontrolltieren bestimmt.
Die Applikation der Verbindungen der allgemeinen Formel I wurde peroral mittels Schlundsonde vorgenommen. Es erfolgte an den Tagen +1 (einen Tag nach der Immunisierung) bis +6 jeweils eine Gabe des Wirkstoffes von 1x10 -5 Mol/Kg Körpermasse in mikronisierter Form als wäßrige Suspension, der in aller Regel in bis zu vierfacher Gewichtsmenge die immunologisch indifferente Lactose beigefügt war. Die Kontrolltiere erhielten nur eine wäßrige Lactoselösung.
1.2. Takatsy-Test
Nach Immunisierung mit 2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFB) kommt es beim Meerschweinchen u.a. auch zur Bildung TNB-spezifischer Antikörper, die hauptsächlich der IgG1-Subklasse angehören. 14 Tage nach primärer epikutaner Applikation von DNFB-Lsg. wurde den Versuchstieren durch Herzpunktion Blut entnommen. Die Bestimmung der Serum-Antikörperkonzentration erfolgte nach einer von Takatsy beschriebenen Methode
(Takatsy,G.: A new method for the preparation of serial dilutions in a quick an accurate way. Kiserletes Orvostudomany 2 (1950) 263-396). Als Indikatorzellen wurden trinitrophenylierte Schaferythrozyten verwendet (Kopplung nach
Rittenberg und Pratt: Rittenberg,M.B. and Pratt,K.L.:
Antitrinitrophenyl (TNP) plaque assy. Primary response of BALB/c mice to soluble and particulate immunogen. [Proc. Soc. exp. Biol. Med. 132 (1969) 575-5791). 1.3. In-vivo-Lymphoblastentransformationstest
Eine perkutane (Ohr) Applikation von DNFB verursacht u.a. histologische Veränderungen im drainierenden (aurikulären) Lymphknoten. In den ersten Tagen nach Antigengabe kommt es zur Transformation TNP-spezifischer Zellen zu Blasten, deren Anzahl mit der Intensität einer anlaufenden zellvermittelten Immunreaktion korreliert und am Tag 4 das Maximum erreicht. [Turk.J.L. and Stone,S.H.: Implications of cellular changes in lymph nodes during the development and inhibition of delayed type hypersensitivity, Wistar Institute Press, 1963, 51-60]. In Schnitt- bzw. Ausstrichpräparaten läßt sich nach Anfärbung mit Methylgrün-Pyronin (Schulze, E. und Graupner, H. : Anleitung zum mikroskopisch-technischen Arbeiten in Biologie und Medizin, Akademische Verlagsgesellschaft Geest und Portzig KG, Leipzig, 1960) die Anzahl der pyroninophilen Lymphoblasten lichtmikroskopisch erfassen.
Weiterhin kam eine automatisierte Auswertung mittels Zellsorter (fluorescence activated cell sorter, FACS) 440 der Firma Becton Dickinson (mountain View, USA) mit dem Auswertesystem Consort 40 zum Einsatz. Alle Proben - je Test 2 × 106 Lymphknotenzellen - wurden nach den Parametern Forward scatter gegen 90°-scatter (P1:P4) vermessen. Die Abtrennung der Blasten erfolgte nach den Kriterien "Größe" und "Oberflächenbeschaffenheit" [Enzmann,V., Mehlhorn,G., Weichert,H. und Drößler,K. : Lokaler Lymphknotenassay zum Nachweis von Effekten immunmodulatorisch aktiver Verbindungen].
1.4. Ergebnisse
1.4.1. Sensibilisierungsindex (SI) und Serumantikörperkonzentration (AK-Titer-Differenz) nach Applikation von ausgewählten Verbindungen der allgemeinen Formel I, II und III Tabelle 1
Sensibilisierungsindex (SI) und Serumantikörperkonzentration (AK-Titer-Differenz) ausgewählter Verbindungen der allgemeinen Formel I, II und III jeweils im Vergleich zur Kontrollgruppe (Sσreening-Werte)
Verbindung Kontaktdermatitis TNP-spez.
gemäß Antikörper
Beispiel 24h-Reaktion 48h-Reaktion (Titerdifferenz)
Kontrolle 100 100 -
1a 100 110 ±0
1b 100 120 +0,7
1c 80 35 -1,3
2a 100 115 +0,3
2b 135 150 ±0
3 100 170 +1,5
4 140 100 -0,2
5 75 70 -0,2
6 120 180 ±0
7 140 160 ±0
8b 130 110 +0,7
9a 75 100 +0,7
9b 135 140 +0,3
9c 125 130 -1,2
Isoprenosine 120 130 +0,9
Aus den Werten der Tab. 1 ist ersichtlich, daß Verbindungen der allgemeinen Formel I, aber auch solche der allgemeinen Formeln II und III einen gut nachzuweisenden Effekt auf die Effektor-T-Lymphozyten-abhängige verzögerte Überempfindlichkeit haben. SI-Werte von 120 (und höher) bzw. 80 (und niedriger) sind als signifikanter Nachweis eines stimulatorischen bzw. suppressorischen Effektes anzusehen. Serumantikörpertiter-Differenzen von >+1 bzw. <-1 belegen einen stimulatorischen bzw. suppressorischen Effekt der untersuchten Verbindungen auf die humorale Immunantwort.
1.4.2. Steigerung der Anzahl pyroninophiler Lymphoblasten (pB) im aurikulären Lymphknoten nach Applikation ausgewählter Verbindungen der al lgeme inen Forme l I und von 2b
Tabelle 2
Verbindung Zunahme der Anzahl pB [%] im Vergemäß gleich zur sensibilisierten Kontrolle
Beispiel Auswertungsmethode
Lichtmikroskop FACS
1c 33,6 55,0
2b 39,6 82,1
3 31,4 n.b.*
4 3,9 n.b.*
6 30,2 59,8
9c 34,5 58,7
MECH** 25,5 78,4
* n.b.: nicht bestimmt; ** MECH: 3(2-Mercapto-ethyl)chinazolin-2,4(1H,3H)dion [EP 454060 A1;C.A. : 116, 83689u (1992);
Die Werte aus Tabelle 2 belegen, daß bis auf eine Ausnahme von den exemplarisch untersuchten Verbindungen der allgemeinen Formel I im Vergleich zur Kontrolle, bei der nur eine Sensibilisierung mit DNFB erfolgte, eine signifikante Zunahme der Anzahl pyroninophiler Lymphoblasten erfolgte. Die Testergebnisse weisen aus, daß die Verbindungen der allgemeinen Formel I eine deutliche immunstimulierende Wirkung auf die zellvermittelte Immunreaktion haben. Ein Vergleich der Testergebnisse mit dem hochsignifikant immunstimulatorisch und -immunrestaurativ wirksamen MECH ergibt, daß einige Verbindungen der allgemeinen Formel I in diesem Test eine vergleichbare und andere eine größere Aktivität entfalten.
1.4.3 Ergebnisse des Chemilumineszenztestes und Bestimmung der Phagozytoserate
Die Untersuchungen ausgewählter Verbindungen im Chemilumineszenztest ergaben, daß z.B. die nach den Beispielen 1, 3, 4, 5, 7, 8, und 9b synthetisierten Verbindungen im Vergleich zu den Negativkontrollen ausnahmslos Steigerungen aufweisen, die im Bereich zwischen 60 und 373% liegen. Die gemäß Beispiel 4 und 9b synthetisierten Verbindungen der allgemeinen Formel I erwiesen sich in diesem Test als die mit Abstand wirkungsstärksten Substanzen (s. Tab. 3). Die vergleichsweise untersuchte Substanz N-Formyl-Met-Phe
(Sigma) als Positivkontrolle erbrachte dagegen im Vergleich zur Kontrolle Steigerungen um 146 bzw. 156%.
Bei der Untersuchung des "Phagozytoseindex" (durchschnittliche Anzahl von phagozytierten Zymosanpartikeln pro Granulozyt) der nach den Beispielen 1, 3, 4, 5, 7, 8, und 9b synthetisierten Verbindungen der allgemeinen Formel I wurden im Vergleich zur Kontrolle Steigerungen um 25 bis 51% registriert. Als wirkungsstärkste Verbindungen der allgemeinen Formel I erwiesen sich die gemäß der Beispiele 3, 1 und 5 synthetisierten Substanzen mit einer Erhöhung des Phagozytoseindex um 51, 44 bzw. 40%. Nähere Einzelheiten sind in Tabelle 3 aufgeführt. Tabel le 3
Chemilumineszenz- Phagozytosetest test
Substanz Integr. %Kontr. P PI %Kontr. P
Testserie I
Kontrolle 673 100 3. 25 100
B* 3 2323 346 0.01 4. 90 151 s
B* 8 1077 160 0.01 4. .05 125 s
Pos.Kontr.** 1654 246 0.01 5. .35 165 s
Testserie II
Kontrolle 628 100 3.31 100
B* 1 2266 361 0.01 4.76 144 8
B* 4 2971 473 0.01 4.23 128 S
B* 5 2339 372 0.01 4.63 140 8
B* 7 2157 343 0.01 4.53 137 8
B* 9b 2894 461 0.01 4.14 125 S
Pos.Kontr.** 1611 256 0.01 4.24 128 s
Integr. : Integral; Fläche unter der Chemilumineszenzkurve.
KKontr. : % Kontrolle; Haß für die Stimulation der Substanzen, angegeben als Quotient der Integrale der Chemilumineszenzkurven bzw. der
PI zu denen der Negativkontrolle × 100.
PI: Phagozytoseindex.
P: Signifikanzniveau: 0.01: 99,9% signifikant.
s: signifikant.
B*: hergestellt nach Beispiel ... Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert
Beispiel 1
3(3-Mercaptoprop-1-yl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5-carbonsäure (Formel I; R1 = H, R2 = COOH, R3 = C6H5, n = 3) a) 8-Phenyl-3,4-dihydro-2H-pyrimido[2,3-b][1,3]thiazin-6-on- 7-carbonsäureamid (Formel III; R2 = CONH2, R3 = C6H5)
2,69 g (10 mmol) 8-Phenyl-3,4-dihydro-2H-pyrimido[2,3-b]-[1,3]thiazin-6-on-7-carbonitril (Formel III; R2 = CN, R3 = C6H5) werden unter Rühren in 15 ml konz. Schwefelsäure eingetragen und anschließend vorzugsweise unter weiterem Rühren und Feuchtigkeitsausschluß am Rückflußkühler 2h bei einer Temperatur von ca. 100 °C erhitzt. Nach dem Erkalten wird der Ansatz in ca. 200 ml Eiswasser gegossen und mit 10proz. Natronlauge ein pH-Wert von etwa 7 eingestellt. Nach 2stdg. Aufbewahrung bei Zimmertemperatur wird der gebildete Niederschlag abgesaugt, gründlich mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Es werden 2,18 g (Ausbeute: 81%) nahezu de reines Rohprodukt erhalten. Farblose Kristalle. C14H13N3O2S (287,3). Schmb. 265-268 °C (1-Propanol). IR(KBr) : CO-Bande bei 1650 cm-1. MS (70 eV) : m/e 286 (14%) [M+'-1]. UV/VIS
(Ethanol):λ max [nm1 lg (ε) 250 (4.28), 258 (4.27), 337
(4.14). b) 8-Phenyl-3,4-dihydro-2H-pyrimido[2,3-b][1,3]thiazin-6-on- 7-carbonsäure (Formel III; R2 = COOH, R3 = C6H5 )
2,87 g (10 mmol) des nach a) erhaltenen Pyrimidothiazin-carbonsäureamid-Derivates, ggf. auch als Rohprodukt
einsetzbar, werden in gepulverter Form zu 25 ml 32proz. Salzsäure gegeben. Anschließend wird der Reaktionsansatz bis zur vollständigen Auflösung der Substanz gelinde erwärmt. Nach dem Erkalten wird unter Eiskühlung und Rühren die aus 2,65 g Natriumnitrit und 15,0 ml Wasser bereitete Lösung tropfenweise dem Ansatz hinzugefügt, und das Rühren wird 30 min fortgeführt. Anschließend wird die Reaktionsmischung auf 90 °C erwärmt und 5 min bei dieser Temperatur gehalten. Nach dem Erkalten wird der Ansatz in 500 ml Eiswasser eingerührt, der gebildete Niederschlag nach 2 h abgesaugt, mit reichlich Wasser gewaschen und anschließend an der Luft getrocknet. Es werden 1,85 g (Ausbeute: 65%) de nahezu reines Rohprodukt erhalten. Farblose Kristalle. C14H12N2O3S (288,3). Schmb. 228-231 °C (nach Umfällung aus 5% NaHCO3/verd. Salzsäure). IR (KBr): 1740 (-COOH) und 1595 cm-1 (-CO) asymm. breit. MS
(70 eV) : m/e 288 (100%; Basispeak). UV/VIS (Ethanol):λmax
[nm] 1g (ε) 256 (4.31), 319 (4.05). c) 3(3-Mercaptoprop-1-yl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion- 5-carbonsäure (Formel I; R1 = H, R2 = COOH, R3 = C6H5, n = 3)
1.5 g (5,2 mmol) des nach b) gewonnenen Pyrimidothiazin-carbonsäure-Derivat-Rohproduktes werden zu einer aus 3 ml konz. Schwefelsäure, 9 ml Eisessig und 115 ml Wasser bereiteten Lösung gegeben und der Ansatz danach, vorzugsweise unter Stickstoff-Begasung 8 h rückfließend erhitzt. Nach dem Erkalten wird der gebildete Niederschlag abgesaugt, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Es werden
1.06 g (Ausbeute: 66%) fast de reines Rohprodukt erhalten.
Farblose Kristalle. C14H14N2O4S (306,3). Schmb. >170 °C Zers.
(nach Umfällung aus 5% NaHCO3/verd. Salzsäure). IR(KBr):
1740(-COOH) und 1590 cm-1 (-CO)asymm. breit.UV/VIS (Ethanol): λmax (nm] 1g (ε) 220 (4.20), 283 (4.03). Beispiel 2
3(2-Mercaptoethyl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5-carbonsäure (Formel I; R1 = H, R2 = COOH, R3 = C6H5, n = 2) a) 7-Phenyl-2,3-dihydrothiazolo[3,2-a]pyrimidin-5-on-6-carbonsäureamid (Formel II; R2 = CONH2, R3 = C6H5)
Aus 2,55 g (10 mmol) 7-Phenyl-2,3-dihydrothiazolo[3,2-a]pyrimidin-5-on-6-carbonitril (Formel II; R2 = CN, R3 = C6H5) und 15 ml konz. Schwefelsäure analog der in Beispiel 1 unter a) aufgeführten Verfahrensweise. Es werden 2,24 g (Ausbeute 82%) de fast reines Rohprodukt erhalten. Farblose Kristalle. C13H11N3O2S (273,3). Schmb. 262-265 °C (Ethanol). IR (KBr): CO-Banden bei 1640 und 1660 cm-1. MS (70 eV) : m/e 272 (53%)
[M+. -1]. UV/VIS (Ethanol) :λmax [nm] 1g (ε) 248 (4.33), 308
(4.02). b) 7-Phenyl-2,3-dihydrothiazolo[3,2-a]pyrimidin-5-on- 6-carbonsäure (Formel II; R2 = COOH, R3 = C6H5)
Aus 2,73 g (10 mmol) des nach a) gewonnenen Thiazolopyrimidincarbonsäureamid-Derivates, eingesetzt als Rohprodukt, analog der in Beispiel 1 unter b) aufgeführten Verfahrensweise. Es werden 1,64 g (Ausbeute: 60%) de nur geringfügig verunreinigtes Rohprodukt erhalten. Farblose Kristalle.
C13H10N2O3S (274,3). Schmb. 211-215 °C (nach Umfällen aus 5% NaHCO3/verd. Salzsäure). IR(KBr) : 1740 (-CO) und 1610 nm (-CO asymm. breit). MS(70eV): M+ . m/e 274 (100%; Basispeak).
UV/VIS (Ethanol):λmax [nm](1g ε) 247 (4.19), 307 (3.90). c) 3(2-Mercaptoethyl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5- carbonsäure (Formel I; R1 = H, R2 = COOH, R3 = C6H5, n = 2) Aus 1,5 g des nach b) erhaltenen Thiazolopyrimidincarbonsäure-Derivates, eingesetzt als Rohprodukt, analog der in Beispiel 1 unter c) aufgeführten Verfahrensweise. Es werden 1,1 g (Ausbeute: 70%) de nahezu reines Rohprodukt erhalten. Farblose Kristalle. C13H12N2O4S (292,3). Schmb. ab 185 °C Braunfärbung/Zers. bis 240 °C sintern (nach Umfällen aus 5% NaHCO3/verd. Salzsäure). IR(KBr) : CO bei 1730 und 1610 nm
(asymm . breit ) . MS (70eV) : m/e 189 (52%) [M+ . -C6H5CN] .
UV/VIS (Ethanol ) : λ max [ nm] ( 1g ε ) 220 ( 4. 17) , 282 (4.01 ) .
Beispiel 3
3 (3-Mercaptoprop-1-yl )-6-phenyl-pyrimidin-2, 4(1H,3H)dion-5-carbonsäureamid ( Formel I ; R1 = H, R2 = CONH2 , R3 = C6H5, n = 3)
Aus 1,5 g des nach Beispiel 1 a) synthetisierten 8-Phenyl- 3,4-dihydro-2H-pyrimido[2,3-b][1,3]thiazin-6-on-7-carbonsäureamids analog der in Beispiel 1 unter c) angegebenen
Verfahrensweise. Es werden 1,3 g (Ausbeute: 78%) de reines
Rohprodukt erhalten. Farblose Kristalle. C14H15N3O3S
(305,4). Schmb. 199-201 °C (Ethanol). IR(KBr) [cm-1]: 2570
(-SH), 1680 und 1640 (-CO). MS(70eV) : M+. m/e 305 (100%;
Basispeak). UV/VIS (Ethanol):λmax [nm](1gε) 283 (4.08).
Beispiel 4
3(2-Mercaptoethyl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5-carbonitril (Formel I; R1 = H, R2 = CN, R3 = C6H5, n = 2)
Aus 1,5 g 7-Phenyl-2,3-dihydrothiazolo[3,2-a]pyrimidin-5-on- 6-carbonitril (Formel II; R2 = CN, R3 = C6H5) analog der in
Beispiel 1 unter c) angegebenen Vorschrift. Es werden 1,35 g (Ausbeute: 84%) nahezu de reines Rohprodukt erhalten. Färb lose Kristalle. C13H11N3O2S (273,3). Schmb. 236-241 °C
(1-Propanol). IR(KBr) [cm-1]: 2570 (-SH), 2245 (-CN), 1610 und 1640 (-CO). MS(70eV) : M+. m/e 273 (5% B). UV/VIS
(Ethanol) :λ max [nm] (1g ε ) 238 (4.04), 307 (4.36).
Beispiel 5
3(3-Mercaptoprop-1-yl)pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5-carbonsäure (Formel I; R1 = R3 = H, R2 = COOH, n = 3) a) 3,4-Dihydro-2H-pyrimido[2,3-b][1,3]thiazin-6-on-7-carbonsäureethylester (Formel III; R2 = COOC2H5, R3 = H)
4,0 g (20 mmol) 4-Oxo-2-thioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-carbonsäureethylester werden in 60 ml abs. Dimethylformamid gelöst und dem Ansatz 4,04 g (bzw. 2,04 ml) 1,3-Dibrompropan und 2,8 g getr. Kaliumcarbonat hinzugefügt. Anschließend wird der Reaktionsansatz unter Ausschluß von Feuchtigkeit 6 h am Rückflußkühler erhitzt. Nach dem Erkalten wird die Reaktionslösung in 400 ml Eiswasser eingegossen, bis zum pH von etwa 11 mit verd. Natronlauge versetzt und bis zur Sättigung unter Rühren Natriumchlorid hinzugefügt. Die filtrierte Reaktionslösung wird anschließend dreimal mit je 100 ml Essigsäureethylester ausgeschüttelt, die vereinigten und getrockneten Essigester-Lösungen werden im Vakuum bis zur Trockene gebracht und der verbleibende Rückstand aus wenig 1-Propanol umkristallisiert. Es werden 1,6 g (Ausbeute: 40%) Reinprodukt erhalten. Farblose Kristalle. C10H12N2O3S (240,3). Schmb.108,5-109 °C (1-Propanol).
IR(KBr) [cm-1]: 1670 und 1740 (CO). UV/VIS (Ethanol) :λ max
[nm](1g ε ) 239 (3.86), 323 (4.28). b) 3(3-Mercaptoprop-1-yl)pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5-carbonsäure (Formel I; R1 = R3 = H, R2 = COOH, n = 3) Aus 2,4 g des nach a) synthetisierten Pyrimidothiazincarbonsäureethylester-Derivates analog der in Beispiel 1 unter c) angegebenen Verfahrensweise. Verwendung einer aus 2 ml konz. Schwefelsäure, 6 ml Essigsäure und 78 ml Wasser bereiteten Lösung. Rückfließendes Erhitzen: 5 h. Es werden 1,84 g (Ausbeute: 80 %) de nahezu reines Rohprodukt erhalten. Farblose Kristalle. Positiver Nachweis auf SH-Gruppen mit wäßr. Natriumpentacyanonitrosylferrat (III) -Lsg./verd. Natronlauge. C8H10N2O4S (230,2). Schmb. 167-171 °C (Zers.) (nach Umfällen aus 5proz. NaHCO3-Lsg. /verd. Salzsäure). IR(KBr) [cm-1]:
1770, 1740, 1630 (-CO); 1600 (-C=C-). MS(70 eV) : m/e = 186 (27%) [M+.-CO2]. UV/VIS (Ethanol):λmax. [nm](1g ε) 218 (4.10), 276 (3.96).
Beispiel 6
3(2-Mercaptoethyl)-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5-carbonsäure
(Formel I : R1 = R3 = H, R2 = COOH)
Aus 2,26 g 6-Ethoxycarbonyl-2,3-dihydrothiazolo[3,2-a]-pyrimidin-5-on analog der in Beispiel 5 b) beschriebenen
Verfahrensweise. Es werden 1,52 g
(Ausbeute: 70%) nahezu de reines Rohprodukt erhalten.
Farblose Kristalle. C7H8N2O4S (216,2). Schmb.: >179 °C
Braunfärbung, zwischen 183-186 °C sintern (5proz. NaHCO3- Lsg./verd.Salzsäure). IR(KBr) [cm-1] : 2570 (-SH), 1740, 1710,
1630 (-CO), 1595 (-C=C-). UV/VIS (Ethanol):λmax. [nm](1g ε )
218 (4.12), 277 (3.98). Beispiel 7
[3(5-Aminocarbonyl-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-3-yl)- prop-1-yl]thioessigsäure (Formel I; R1 = CH2COOH, R2 =
CONH2, R3 = C6H5, n = 3)
3,05 g (10 mmol) des nach Beispiel 3 synthetisierten 3(3- Mercapto-prop-1-yl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5-carbonsäureamides werden unter N2-Begasung in einer aus 15 ml Ethanol und 30 ml verd. Natronlauge (0,5 Mol/1) bestehenden Mischung gelöst. Unter Rühren und weiterer N2-Begasung wird dem Reaktionsansatz die aus 1,05 g (11 mmol) Chloressigsäure und 10 ml Wasser hergestellte Lösung hinzugefügt. Nach 6 h Rühren unter inerten Bedingungen wird zu dem filtrierten Reaktionsansatz bis zur deutlich saueren Reaktion verd.
Salzsäure hinzugefügt. Nach dem Absaugen wird der gebildete Niederschlag mit reichlich Wasser gespült und anschließend an der Luft getrocknet. Es werden 2,05 g (Ausbeute: 56 %) geringfügig mit dem entsprechenden Disulfan-Derivat der Ausgangsverbindung verunreinigtes Rohprodukt erhalten. Für die Reindarstellung des Finalproduktes wird aus 5proz.
NaHCO3-Lsg. /verd. Salzsäure umgefällt. Farblose Kristalle. C15H13N3O4S (363,4). Schmb. >220 °C Zers. IR(KBr) [cm-1] : 1720, 1670, 1650 (-CO); 1620 (-C=C-). UV/VIS (Ethanol): λmax. [nm) (1gε): 212 (4.22), 282 (4.01).
Beispiel 8
[2(5-Cyan-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-3-yl)ethyl]thioessigsäure (Formel I; R1 = CH2COOH, R2 = CN, R3 = C6H5, n = 2) a) [2(5-Cyan-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-3-yl)ethyl]- thioessigsäureethylester (Formel I; R1 = CH2COOC2H5, R2 = CN, R3 = C6H5, n = 2)
Aus 2,73 g (10 mmol) des nach Beispiel 4 synthetisierten 3(2-Mercaptoethyl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5-carbonitrils und 1,35 g (11 mmol) Chloressigsäureethylester analog Beispiel 6 unter Verzicht auf Zugabe von verd. Salzsäure. Statt dessen werden dem Ansatz nach beendeter Umsetzung 75 ml Wasser zugefügt. Es werden 1,9 g (Ausbeute: 52 %) mit dem entsprechenden Disulfan-Derivat der Ausgangs- verbindung verunreinigtes Rohprodukt erhalten. Für die Gewinnung eines Reinproduktes wird aus 1-Propanol umkristallisiert. Farblose Kristalle. C17H17N3O4S (359,4). Schmb. 163-165 °C (1-Propanol). IR(KBr) [cm-1] : 2240 (-CN), 1730, 1650,
1630 (-CO). UV/VIS (Ethanol):λmax. [nm] (1gε): 218 (4.24),
244 (4.04), 292 (4.05). b) [2(5-Cyan-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-3-yl)ethyl]- thioessigsäure (Formel I ; R1 = CH2COOH, R2 = CN,
R3 = C6H5, n = 2)
1,8 g (5 mmol) des nach a) erhaltenen Pyrimidinylethylthioessigsäureethylester-Derivates, ggf. auch als Rohprodukt einsetzbar, werden in 30 ml verd. Natronlauge (0,5 Mol/l) 150 min am Rückflußkühler erhitzt. Die filtrierte Reaktionslösung wird mit verd. Salzsäure angesäuert, der gebildete Niederschlag abgesaugt und umgefällt (5proz. Natriumhydrogencarbonat-Lsg./verd. Salzsäure). Nach dem Trocknen bei etwa 35 °C werden 1,15 g (Ausbeute: 70%) reines Finalprodukt erhalten. Farblose Kristalle. C15H13N3O4S (331,3). Schmb.
>183 °C (Zers.). IR(KBr) [cm-1] : 2240 (-CN), 1720, 1650, 1630
(-CO). UV/VIS (Ethanol) :λmax. [nm] (1gε): 218 (4.24), 244
(4.02), 291 (4.05).
Beispiel 9
Analog Beispiel 1 c) wurden u.a. noch folgende Verbindungen hergestellt: a) 3(2-Mercaptoethyl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5- carbonsäureamid (Formel I; R1 = H, R2 = CONH2,
R3 = C6H5, n = 2)
Farblose Kristalle. Ausbeute: 80%. C13H13N3O3S (291,3).
Schmb. 226-229 °C (Ethanol). IR(KBr) [cm-1]: 2570 (-SH),
1640 und 1680 (CO). MS(70eV): M+. m/e 291 (100%; Basispeak).
UV/VIS (Ethanol):λmax [nm](1g ε) 283 (4.02). b) 3(3-Mercaptopropyl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion- 5-carbonitril (Formel I; R1 = H, R2 = CN, R3 = C6H5, n = 3)
Farblose Kristalle. Ausbeute: 84%. C14H13N3O2S (287,3).
Schmb. 197-201 (1-Propanol). IR(KBr) [cm- 1 ] : 2570 ( -SH) ,
2245 ( -CN) , 1610 und 1640 ( -CO ) . UV/VIS (Ethanol) :λmax
[n,] (1g ε) 237 (4.09), 307 (4.40). c) 3(3-Mercaptopropyl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion (Formel I; R1 = R2 = H, R3 = C6H5, n = 3)
Farblose Kristalle. Ausbeute: 79%.C13H14N2O2S (262,3).
Schmb. 211-213 (1-Propanol/H2O 1:2). IR(KBr) [cm-1]: 2570
(-SH), 1615 und 1650 (-CO). UV/VIS (Ethanol):λmax [nm] (1gε)
224[S] (4.14), 287 (4.09).

Claims

Patentansprüche
1. 3-(Mercaptoalkyl)- bzw. 3-(AlkyIthioalkyl)-pyrimidin- 2,4(1H,3H)-dione der allgemeinen Formel I,
Figure imgf000027_0001
worin bedeuten
R1 H, CH2COOH, CH(CH3)COOH, CH2COOAlk oder
CH(CH3)COOAlk R2 COOH, CONH2, CN und H R3 H, Aryl oder substituiert Aryl
Alk Niederalkyl, C1 bis C3, und n 2 oder 3, einschließlich ihrer Tautomere und pharmazeutisch unbedenkliche Alkali- bzw. Ammoniumsalze.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I mit R1 = H nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensweise:
Erhitzen von 2,3-Dihydrothiazolo[3,2-a]pyrimidin-5-onen der allgemeinen Formel II bzw. von 3,4-Dihydro-2H-pyrimido-[2,3-b][1,3]thiazin-6-onen der allgemeinen Formel III,
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000028_0002
worin R2 ' COOH, COOAlk , CONH oder CN bedeutet und R3 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat , mit verdünnten Mineralsäuren, wie Salzsäure und/oder Schwefelsäure , vorzugsweise jedoch mit Mischungen dieser verdünnten Mineralsäuren mit Eisess ig und/oder Ameisensäure bzw . mit verdünnten Alkalilaugen in wäßrig oder wäßrig-alkoholischer C1-C3 - Lösung , vorzugsweise unter Schutzgasatmosphäre , jewei ls unter Rückfluß unter Erhalt der Verbindungen der allgemeinen Formel I oder ihrer Tautomeren mit R1 = H. 3. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I mit R1 = H nach den Ansprüchen 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß bei rückfließendem Erhitzen der Verbindungen der allgemeinen Formel II bzw. III mit
R2' = COOAlk sich Verbindungen der allgemeinen Formel I oder ihren Tautomeren mit R2 = COOH sowie n = 2 bzw.
3 bilden.
4. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I mit R1 = CH2COOH, CH(CH2)COOH, CH2COOAlk oder CH(CH2)COOAlk nach den Ansprüchen 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß in prinzipiell bekannter Weise die Mercapto-Verbindungen der allgemeinen Formel I mit R1 = H, mit den Halogencarbonsäuren bzw. den Halogencarbonsäurealkylestern
R4X (IV)
der allgemeinen Formel IV, worin
R4 CH2COOH, CH(CH3)COOH bzw. CH2COOAlk oder
CH(CH2)COOAlk; Cl oder Br und
Alk Niederalkyl, C1 bis C3,
bedeuten, in Gegenwart von Alkalihydroxiden in wäßriger oder wäßrig-alkoholischer Lösung bzw. in Gegenwart von Alkalialkoxiden, vorzugsweise Natriumethylat, in einem Temperaturbereich von 10 - 60 °C, vorteilhafterweise unter Schutzgasatmosphäre gewonnen werden.
5. 3(3-Mercaptoprop-1-yl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)-dion-5carbonsäureamid,
3(3-Mercaptoprop-1-yl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5-carbonsäure,
3(3-Mercaptoprop-1-yl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5-carbonitril,
3(2-Mercaptoethyl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5-carbonsäureamid,
3(2-Mercaptoethyl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5-carbonsäure,
3(2-Mercaptoethyl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5-carbonitril,
3(2-Mercaptoethyl)-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5-carbonsäure, 3(3-Mercaptoprop-1-yl)-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5-carbonsäure,
3(3-Mercaptoprop-1-yl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion [2(5-Cyan-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-3-yl)ethyl]-thioessigsäure,
[2(5-Carboxamido-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-3-yl)-ethyl]thioessigsäure,
[3(5-Carboxamido-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-3-yl)-propyll]thioessigsäure,
oder [3(5-Cyan-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-3-yl)propyll]thioessigsäure und/oder ihre Tautomeren und/oder pharmazeutisch geeignete Salze dieser Verbindungen.
6. Pharmazeutische Zubereitungen, gekennzeichnet durch eine oder mehrere Verbindungen gemäss Anspruch 1 oder 5 sowie inerte, pharmazeutisch geeignete Hilfs- und/oder Trägerstoffe.
7. Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, dass man eine oder mehrere Verbindungen nach Anspruch 1 oder 5 mit pharmazeutisch üblichen Hilfs- und/oder Trägerstoffen in an sich bekannter Weise in eine für die medizinische Applikation geeignete Darreichungsform, wie Tabletten, Dragees, Kapseln, Suppositorien, Lösungen oder Ampullen bringt.
8. Verwendung der Verbindungen gemäss Anspruch 1 oder 5 oder der pharmazeutischen Zubereitung gemäss Anspruch 6 zur Behandlung von Immunerkrankungen, insbesondere zur Erzielung einer immunstimulierenden und/oder immunrestaurativen Wirkung und/oder zur Behandlung von Krankheiten, deren Ursache ein durch exogene und/oder endogene Faktoren verminderte Phagozytoseaktivität von Granulozyten bzw. Makrophagen ist, in der Human- bzw. Veterinärmedizin.
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